KR20020065575A - Ｒｇ1 폴리펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RG1으로 명명된 신규 인간 세포외 간질 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리펩티드의 제조 방법, 이 폴리펩티드를 발현시키는 발현 벡터 및 유전적으로 조작된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연구, 진단 및 치료 목적으로 이러한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＲＧ1 폴리펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 {Polynucleotide Encoding the RG1 Polypeptide}

본 출원은 본원에 전체가 참고로 도입되는, 1999년 12월 16일 출원된 미국 가출원 제60/172,370호를 우선권으로 주장한다.

전립선암은 45세 이상 남성의 약 3분의 1에서 발견되는 점에서 남성에서 흔히 발병하는 질환이다. 이에 대한 원인으로는 유전적 및 환경적 원인이 둘 다 있으며, 주요 원인은 아마도 이 두가지 요인이 복합된 결과일 수 있다. 가족성 암에 대한 연구 결과는 유전적 경향이 모든 전립선 암의 약 5 내지 10%, 55세 미만의 남성의 경우 약 45%에서 나타난다는 사실을 시사한다.

전립선 암은 다단계 질환으로서 발병하며, 그의 전구 병소의 하나는 전립선 상피내 종양 (PIN)이라는 증거가 있다. 이 질환의 초기 단계는 안드로겐 의존성이지만, 후기 단계는 호르몬 비의존성이다. 양성 전립선 증식증으로 알려져 있는 증식성 전립선 질환은 임상적으로 흔히 검출되지만, 암 발생 단계는 아닐 수 있다. 그러나, 증식성 전립선 질환은 종종 전립선 암과 관련된다. 전립선에서의 암은 흔히 다병소성으로, 일반적으로 서서히 증식하며 이종성이다. 말기 암은 종종 림프절 및 뼈로 전이한다.

전립선 암은 일반적으로 물리적 검사 및 전립선 특이적 항원 (PSA)의 혈청 수준에 의해 진단된다. 근치적 전립선절제술은 국소성 질환에 선택되는 치료법이다. 현재, 진행되는 전이성 질환은 고환적출술 또는 GnRH (성선자극호르몬 방출 호르몬)을 사용하는 치료, 및 항-안드로겐 치료법에 의해 유도되는 안드로겐 제거에 의해 치료되고 있다. 그러나, 진행된 질환은 거의 변함없이 호르몬 내성으로 되며, 악화된 질환에 대한 치료법은 없다. 또한, 근치적 전립선절제술 및 안드로겐 제거 요법은 둘 다 심각한 부작용을 수반한다. 이러한 부작용으로는 근치적 전립선절제술 및 골절과 관련된 요실금 및 발기부전, 및 안드로겐 제거 요법과 관련된 골절 및 골다공증의 발병 위험 증가가 포함된다.

따라서, 초기 및 말기 전립선 암 둘 다에 대한 새로운 치료 방법에 대한 상당한 요구가 있다. 또한, 새로운 진단제, 특히 질환의 단계를 구별할 수 있는 진단제에 대한 상당한 요구가 있는데, 이들은 치료 선택에 상당한 영향을 준다. 예를 들어, 질환이 전립선 외부로 진행되어 림프절로 전이되었다면, 근치적 전립선절제술은 진행에 영향을 주지 않기 때문에 수행되지 않지만, 원치 않는 상당한 부착용을 줄 수 있다. 생체내에서 전이를 검출할 수 있는 물질은 상당한 가치를 갖는다.

전립선 암에서는 말기 전립선 암에서의 p53의 비정상적 발현, TGF-베타 수용체의 수준 감소, E-카드헤린, C-Cam (세포 부착 분자) 및 여러 인테그린의 수준 감소를 비롯한 특정 단백질의 발현 변화가 입증되었다. 종양유전자 bcl-2의 발현은 말기 안드로겐 의존성 종양에서 두드러지게 증가하며, bcl-2를 증가된 수준으로 발현시키는 환자의 예후는 비교적 불량하다. 유전자 발현에서 상기 언급된 변화는 문헌에 충분히 기록되어 있지만, 질환을 유발시키는 것으로 입증된 발현의 변화는 확인된 바 없다. 따라서, 전립선 암의 진단 및 치료에 대한 분자 표적으로 작용할 수 있는 전립선 종양의 존재 또는 발생과 관련하여 발현되는 새로운 단백질을 찾아내는 것은 유용할 것이다.

본 발명은 세포외 간질 단백질의 거대족에 대한 새로운 동족체를 개시한다. RG1으로 명명된 이 동족체는 전립선 조직에서 발현되며, 전립선 종양에서 과다발현될 수 있다.

세포외 간질은 프로테오글리칸 및 당단백질로 구성된 점탄성 기부 물질 중에 묻혀있는, 콜라겐 및 엘라스틴으로 구성된 복잡한 망상조직이다. 세포외 간질은 조직 부분을 분리하고, 세포 부착을 매개하며, 조직 구조를 결정하는 3차원 지지형 골격으로서 존재한다 (Bissel et al., J. Theor. Biol. 99:31-68, 1982; Carlsonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2403-2406, 1981). 세포외 간질은 거대분자 필터로 작용하며 (Hay, E. D., Cell Biology of Extracellular Matrix, New York, Plenum Press, 1982), 세포분화, 체세포분열 및 형태형성에도 영향을 준다 (Gospodarowiczs, D., Cancer Res. 38:4155-171, 1978). 정상 세포와 세포외 간질 사이의 생화학적 상호작용은 종양에서 변화될 수 있으며, 이는 종양 증식에 영향을 줄 수 있다. 종양 세포는 세포외 간질과 다양한 방식으로 상호작용할 수 있다. 첫째, 종양 세포는 특정 원형질막 수용체를 통해 세포외 간질에 부착할 수 있다 (Terranova et al., Cancer Res. 42:2265-2269, 1982). 둘째, 세포외 간질의 분해는 종양 세포 및 숙주에 의해 제공되는 효소 캐스케이드에 의해 매개된다 (Eisen et al., Bioch. Biophys. Acta 151:637-645, 1968). 셋째, 종양의 분화된 부위에서, 종양 세포는 세포외 간질을 합성하여 축적하거나, 또는 숙주 세포가 과량의 세포외 간질을 축적시키도록 유도할 수 있다 (Brownstein et al., Cancer 40: 2979-2986, 1977).

RG1은 민딘 (Mindin)/F-스폰딘 (Spondin) 유전자에 의해 코딩되는 세포외 간질 단백질의 거대족에 대해 상동성을 나타낸다. 이 유전자 족은 아미노 말단 근처의 두개의 보존된 스폰딘 도메인인 FS1 및 FS2, 및 카르복시 말단의 하나 이상의 트롬보스폰딘 타입 1 반복부 (TSR1)에 의해 연관된다 (Shimeld, S. M., Mol. Biol. Evol. 15(9): 1218-1223, 1998). TSR 모티프는 본래 척추동물의 세포외 간질 단백질에서 발견되었으며 (Bornstein, P., J. Cell Biol. 130:503-506, 1995), 이후에 여러 다른 세포외 간질 단백질에서 발견되었다. TSR 모티프가 세포 부착을 매개하며 종양발생에서 중요한 역할을 한다는 여러 증거가 있다. 예를 들어, TSR 모티프를 포함하는 트롬보스폰딘의 단백질분해 단편 및 트롬보스폰딘의 TSR 영역에 상응하는 서열을 갖는 합성 펩티드가 종양 세포 부착 및 전이를 촉진시키고 (Prater et al., J. Cell Biol. 112:1031-1040, 1991; Tuszynski and Nicosia, BioEssays 18:71-76, 1996), 항-혈관신생 활성을 가지며 (Tolsma et al., J. Cell Biol. 122:497-511, 1993), 혈소판 응집 및 흑색종 전이를 억제한다는 것이 (Tuszynski et al., J. Cell Biol. 116:209-217, 1992) 입증되었다.

현재, 이러한 거대족의 구성원으로는 캐노해비티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans)의 유전자, 초파리 (Drosophila)의 단일 유전자 및 척추동물의 다수의 유전자가 포함된다. 씨. 엘레간스 (C. elegans)에서, 유전자 F10E7.4는 5개의 TSR 도메인 이외에도 FS1 및 FS2 도메인을 코딩한다 (Higashijima et.al., Dev. Biol. 192:211-227, 1997). 초파리에서, M-스폰딘 (mspo)라고 명명되는 족 구성원은 FS1 및 FS2 도메인, 및 단일 TSR을 포함한다 (Umemiya et al., Dev. Biol. 186:165-176, 1997). M-스폰딘 유전자는 근육 부착 부위에 위치하는 분비 단백질을 코딩하며, 근육-근육부착점의 부착을 지지하는 세포외 간질 단백질로서 작용하는 것으로 보인다. 척추동물의 족 구성원으로는 제브라다니오 (zebrafish)(민딘1 및 민딘2, F-스폰딘1, 및 F-스폰딘2), 래트 F-스폰딘, 제노푸스 (Xenopus) F-스폰딘 및 래트 민딘으로부터 단리된 유전자가 포함된다. 민딘1 및 민딘2는 서로 밀접하게 관련되어 있으며, 초파리 M-스폰딘의 것과 유사한 유전자 구조를 갖는다. 민딘1 및 민딘2 유전자는 둘 다 FS1 및 FS2 도메인 이외에 단일TSR을 코딩한다 (Higashijima et.al., Dev. Biol. 192:211-227, 1997). 제브라다니오 F-스폰딘1 및 F-스폰딘2, 래트 F-스폰딘 (Klar et al., Cell 69:95-110, 1992) 및 제노푸스 F-스폰딘 (Altaba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8268-8272) 유전자는 모두 유사한 구조를 가지며, FS1 및 FS2 도메인 이외에도 TSR 도메인 6 카피를 코딩한다. 척추동물에서, 민딘/F-스폰딘 거대족은 두 그룹으로 분류될 수 있는데, 한 그룹의 유전자는 원래의 래트 F-스폰딘 및 민딘 유전자와 밀접하게 관련되며, 다른 그룹의 유전자는 초파리 M-스폰딘 유전자와 밀접하게 관련된다. 척추동물 민딘 및 F-스폰딘 유전자는 둘 다 배발생 동안 신경관의 저판에 의해 주로 발현되는 단백질을 코딩한다.

최근, 단일 F-스폰딘 관련 유전자인 앰피(Amphi)F-스폰딘이 활유어 (amphioxus)로부터 단리되었다 (Shimeld, S. M., Mol. Biol. Evol. 15(9): 1218-1223,1998). 분자 계통발생학을 기초로, 앰피F-스폰딘은 6개의 TSR 도메인을 코딩하는 척추동물 F-스폰딘 유전자의 특정 서브그룹과 밀접하게 관련된다. 앰피F-스폰딘은 3개의 TSR 도메인 및 2개의 피브로넥틴 타입 III 반복부를 코딩하며, 이들 중 하나는 결실성 결장직장암 (DCC)으로부터의 피브로넥틴 타입 III 반복부와 강한 동일성을 갖는다. 단백질의 발현은 중추신경계의 대부분을 통해 나타나며, 척추동물 민딘 및 F-스폰딘 단백질에 대해 기재된 바와 같은 중심선으로 한정되지 않는다.

상기 자료는 민딘/F-스폰딘 거대족의 동족체인 신규 RG1 단백질과 같은 세포외 간질 단백질이 암 진단 및 치료 개입에 사용되는 우수한 후보임을 시사한다.

<발명의 개요>

본 발명은 본원에서 RG1으로 명명된 신규 단백질을 특이적으로 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. RG1 폴리펩티드는 래트 민딘 세포외 간질 단백질과의 상동성을 나타낸다. RG1 폴리펩티드는 N-말단의 소수성 신호 서열, 두 스폰딘 도메인 (FS1 및 FS2), 및 C-말단의 트롬보스폰딘 타입 1 반복부를 포함한다. RG1은 래트 민딘과 89.7%의 유사성을 나타낸다. 본원의 도 1 (서열 1)에 기재된, 본원에서 rg1으로 명명되는 폴리뉴클레오티드 서열은 도 2에 나타낸 RG1에 대한 아미노산 서열 (서열 2)을 코딩한다.

이러한 목적 및 다른 목적에 대해, 본 발명의 목적은 특히, 도 2에 나타낸 아미노산 서열 (서열 2)과 다른 세포외 간질 단백질의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 나타낸 바와 같이, 세포외 간질 단백질 중 민딘 족과 상동성을 갖는 신규 단백질로 확인된 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 특히 본원에서 RG1으로 명명되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 이러한 측면에 따라, mRNA, cDNA, 및 본 발명의 상기 측면의 추가의 실시양태에서 그의 생물학적, 진단학적, 임상학적 또는 치료적으로 유용한 변이체, 유사체 또는 유도체, 또는 이들 변이체, 유사체 및 유도체의 단편을 비롯한 이들의 단편을 포함하는, RG1을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 이러한 측면의 특히 바람직한 실시양태 중에는 본원에서 RG1으로명명되는 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 자연 발생적인 대립유전자 변이체가 포함된다.

본 발명의 이러한 측면에 따라, 본원에서 RG1으로 언급되는 인간 기원의 신규 폴리펩티드뿐 아니라 그의 생물학적, 진단학적 또는 치료적으로 유용한 단편, 변이체 및 유도체, 이들 단편의 변이체 및 유도체, 및 이러한 것들의 유사체가 제공된다.

본 발명의 이러한 측면의 특히 바람직한 실시양태 중에는 rg1 폴리뉴클레오티드의 자연 발생적인 대립유전자 변이체에 의해 코딩되는 RG1의 변이체가 포함된다.

본 발명의 다른 목적은 상기 언급한 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 변이체 및 유도체, 이들 변이체 및 유도체의 단편, 및 이러한 것들의 유사체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시양태에서, 외생 유래의 RG1-코딩 폴리뉴클레오티드를 내부에 발현가능하게 혼입시킨 숙주 세포가 인간 RG1을 발현시키는 조건하에 상기 숙주 세포를 배양시키고, 이후에 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 언급된 RG1 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 목적에 따라, 특히 연구, 생물학적, 임상 및 치료 목적을 위해 상기 언급한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 이용하는 생성물, 조성물, 공정 및 방법이 제공된다.

본 발명의 이러한 측면의 어떤 바람직한 실시양태에 따라, 특히 RG1 폴리펩티드 또는 RG1-코딩 mRNA를 측정하고 rg1 유전자에서 결손과 같은 유전자 변화 및 변이를 분석하여 세포에서 RG1 발현을 평가하기 위한 생성물, 조성물 및 방법이 제공된다.

본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면의 어떤 바람직한 실시양태에 따라, rg1 서열과 혼성화하는 프로브가 제공된다.

본 발명의 다른 목적은 RG1 폴리펩티드에 대해 고도로 선택적이며, 전립선 암과 관련될 수 있는 RG1 발현의 진단 및(또는) 검출을 위한 방법에 사용될 수 있는 항체 또는 그의 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 이러한 측면의 어떤 바람직한 실시양태에 따라, 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 방식으로 항체를 표지한다. 항체는 방사성표지, 효소, 발색단 (chromophore) 또는 형광물질 (fluorescer)로 표지하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 추가의 측면으로, 시험관내 세포, 생체외 세포 및 생체내 세포, 또는 다세포 생물 투여용 치료제와 결합시킨 항체가 제공된다. 이러한 점에서 특히 바람직한 것은 세포독성인 치료제이다. 이러한 점으로 특히 바람직한 실시양태에서, 이러한 결합된 항체는 RG1 활성 또는 발현을 특징으로 하는 질병 증상, 예를 들어 전립선 암의 치료를 위해 인간 환자에게 투여된다.

본 발명의 다른 측면으로, 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있는 펩티드 및 항-이디오타입 항체가 제공된다.

본 발명의 다른 측면으로, 시험관내 세포, 생체외 세포 및 생체내 세포, 또는 다세포 생물 투여용 rg1 폴리뉴클레오티드 (즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드)와상보적인 리보자임 및 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이러한 점에서, 안티센스 분자는 RG1 활성 수준의 감소에 의해 완화되는 전립선암 또는 양성 전립선 증식증과 같은 질병 증상의 치료를 위해 인간 환자에게 투여되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 목적, 특징, 이점 및 측면은 하기 설명으로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 그러나, 하기 설명 및 특정 예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내고 있지만, 단지 설명을 위한 것일 뿐이다. 당업자라면, 개시된 본 발명의 범위 및 사상을 벗어남 없이 하기 설명 및 본 발명의 다른 개시 부분을 숙지하여 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있음을 보다 잘 알 것이다.

본 발명은 새로 확인된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 이들의 변이체, 이들의 제조 방법, 이러한 폴리펩티드, 그의 변이체 및 유도체에 대해 지시되는 항체, 및 상기 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 항체의 용도에 관한 것이다. 특히, 이러한 사항 및 다른 사항에서, 본 발명은 신규 인간 세포외 간질 폴리펩티드 (RG1으로 명명), 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리펩티드에 대해 지시되는 항체, 및 RG1 발현을 차단하는 안티센스 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

도 1은 RG1의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 형태를 코딩하는 rg1의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타낸다.

도 2는 단선 밑줄로 나타낸 F-스폰딘 도메인 및 이중선 밑줄로 나타낸 트롬보스폰딘 도메인을 갖는 RG1의 추정 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다.

도 3은 래트 민딘 서열을 갖는 RG1의 아미노산 배열을 나타낸다. RG1의 서열은 윗쪽에 나타나 있다.

도 4는 RG1의 폴리뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다.

도 5는 Taqman계 PCR 분석에 의한 인간 조직 중의 rg1 mRNA의 발현을 나타낸다. 인간의 종양 조직 및 정상 조직 둘 다로부터의 RNA를 표준 기술에 의해 단리하였다. 퍼킨 엘머 프라이머 익스프레스 (Perkin Elmer's Primer Express) 소프트웨어를 사용하여 rg1 mRNA 발현을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 설계하고,유전자 합성 방법에 의해 합성하였다. rg1 mRNA는 인간 전립선 조직에서 검출된다. 훨씬 낮은 수준의 rg1 mRNA의 발현은 간과 같은 다른 조직에서 검출될 수 있다.

도 6은 LNCaP 세포에 의해 분비되는 천연 RG1 단백질의 정제를 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 합성 RG1 펩티드 서열 (3C, 서열 10; 실시예 4 참조)에 대해 생성된 항혈청을 사용하여 LNCaP 세포로부터 분비된 천연 RG1 단배질을 검출하였다. 농축된 LNCaP 세포 조정 배지의 Q-세파로스 크로마토그래피로부터의 용출 분획: (L) 칼럼 로딩, (F) 칼럼 통과 흐름, (1-12) 염 농도 구배를 통과한 용출 분획. RG1의 예상 분자량은 약 36 kD이지만, 세균에 의해 발현되는 RG1, BHK-발현되는 RG1 및 LNCaP-발현되는 RG1 단백질은 모두 PAGE 상에서 약 45 kD으로 이동하는 것으로 관찰되었다 (L, 분획 6-9).

도 7은 인간 전립선 조직에서 RG1 발현에 대한 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 전립선 조직은 스탠포드 대학 의과대학의 비뇨기과로부터 입수하였다. 벡터 (Vector) ABC-AP 키트 (AK5002)를 사용하여 염색을 수행하였다. 벡터 레드 (Vector Red) 기질 키트 (SK-5100)를 사용하여 염색을 시각화하고, 헤마톡실린 (Hematoxylin)으로 반대 염색하였다. 결과는 선 형성에 있어서 관 주변의 막의 강한 염색을 나타낸다.

<정의>

본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 하기 용어는 지시된 의미를 갖는다.

"RG1"은 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드, 그의 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 이들 변이체, 유사체 및 유도체의 단편을 의미한다. "단편", "유도체" 및 "유사체"라는 용어는, 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)를 의미하는 경우, 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)와 본질적으로 동일한 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.

"rg1"은 도 1에 기재된 서열 (서열 1)을 갖는 폴리뉴클레오티드, 도 2에 기재된 RG1의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 RG1 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 이들 변이체, 유사체 및 유도체의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. Rg1은 또한 RNA로 구성되는 상기 폴리뉴클레오티드뿐 아니라 도 2에 기재된 폴리펩티드 (서열 2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보체인 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

"폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. 즉, 예를 들어, 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 다른 것들 중에서 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 일반적으로는 이중 가닥이거나 또는 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 의미한다. 또한, 본원에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA를 둘 다 포함하는 삼중 가닥 영역을 의미한다. 이러한 영역들의 가닥은 단일 분자 유래이거나 또는 여러 분자 유래의 것일 수 있다. 이 영역은 1종 이상의 분자의 전체를 포함할 수 있지만, 보다 일반적으로는 분자의 일부 영역만을 포함한다. 삼중 나선 영역으로 된 분자들 중의 하나로 흔히 올리고뉴클레오티드가 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 1종 이상의 변형된 염기를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 즉, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본 (backbone)을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도된 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 이노신 등의 특이적 염기, 또는 트리튬-표지된 염기 등의 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는, 이들 두가지만을 예로 들었지만, 본원에 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오티드이다.

당업자라면 알려져 있는 많은 유용한 목적을 위해 이들 DNA 및 RNA를 다양하게 변형시킬 수 있음을 알 것이다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 폴리뉴클레오티드의 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 특히 바이러스, 및 단순한 세포 및 복잡한 세포를 비롯한 세포의 특징인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 하기 기재된 모든 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 기본 구조는 잘 알려져 있으며, 당업계의 셀수 없이 많은 문헌 및 간행물에 기재되어 있다. 이들 문헌에서, 본원에 사용된 용어는 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 선형 사슬을 형성하는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 또한당업계에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 통상적으로 언급되는 짧은 사슬 및 당업계에서 많은 유형의 단백질로서 일반적으로 언급되는 더 긴 사슬 둘 다를 의미한다.

당업자라면 폴리펩티드가 흔히 20개의 천연 아미노산으로 통상적으로 언급되는 20개의 아미노산 이외의 아미노산을 포함하고, 주어진 폴리펩티드내에서 말단의 아미노산을 포함한 많은 아미노산이 글리코실화 및 다른 번역후 변형 등의 자연적인 반응 또는 당업자에게 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있음을 알 것이다. 폴리펩티드에서 자연적으로 발생하는 통상의 변형은 너무 많아서 본원에 그 모두를 나열할 수는 없지만, 이들은 기초 문헌 및 보다 상세한 논문뿐 아니라 큰 연구 문헌에 잘 기재되어 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 폴리펩티드 중에 존재할 수 있는 공지된 변형 중에서 예를 들어 몇가지만을 언급하자면, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합 부착, 헴 잔기의 공유결합 부착, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 공유결합 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유결합 부착, 가교결합, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리케이션 (glycation), 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 트랜스퍼-RNA가 매개되는 아미노산의 단백질로의 부가, 예를 들어 아르기닐화, 및 유비퀴틴화가 있다.

이러한 변형은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 과학 문헌에 보다 상세하게 기재되어 있다. 특히 여러 통상의 변형, 예를 들어 글리코실화, 지질 부착, 황화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화는 예를 들어 문헌 (I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York, 1993)과 같은 가장 기초적인 문헌에 기재되어 있다. 이러한 주제에 대하여, 예를 들어 문헌 (Wold, F., in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990 and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992)과 같은 많은 상세한 문헌을 이용할 수 있다.

당업자라면 공지된 바와 같이, 그리고 상기에 언급된 바와 같이, 폴리펩티드가 항상 전체적으로 선형인 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로 분지형일 수 있으며, 일반적으로는 자연적인 프로세싱 반응 및 자연적으로 일어나지 않는 인간의 조작에 의해 초래된 반응을 비롯한 번역후 반응의 결과로 인해 분지형이거나 분지형이 아닌 원형일 수 있다. 원형, 분지형 및 분지된 원형 폴리펩티드는 물론 번역후의 자연적인 반응 및 전체적으로 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.

변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복실 말단을 비롯하여 폴리펩티드의 어느 부위에서나 일어날 수 있다. 실제로, 폴리펩티드에서 공유결합 변형에 의한 아미노 또는 카르복실기, 또는 이들 둘 다의 차폐는 자연 발생적인 폴리펩티드 및 합성 폴리펩티드에서 통상적이며, 이러한 변형은 본 발명의 폴리펩티드 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 단백질분해 프로세싱 이전에 대장균에서 만들어진 폴리펩티드의 아미노 말단 잔기는 거의 항상 N-포르밀메티오닌일 것이다.

폴리펩티드 중에서 발생하는 변형은 흔히 그가 만들어지는 작용일 것이다. 예를 들어, 숙주에서 클로닝된 유전자를 발현시킴으로써 만들어지는 폴리펩티드의 경우, 변형의 특성 및 정도는 대부분 숙주 세포의 번역후 변형 능력 및 폴리펩티드 아미노산 서열 중에 존재하는 변형 신호에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 잘 알려진 바와 같이, 글리코실화는 흔히 대장균과 같은 박테리아 숙주에서 일어나지 않는다. 따라서, 글리코실화가 요구되는 경우, 폴리펩티드는 글리코실화 숙주, 일반적으로 진핵생물 숙주에서 발현되어야만 한다. 곤충 세포는 흔히 포유동물 세포와 동일한 번역후 글리코실화를 수행하며, 이러한 이유로 인해 곤충 세포 발현계는 특히 천연 글리코실화 패턴을 갖는 포유동물 단백질을 효과적으로 발현시키도록 발전되었다. 다른 변형에 대하여도 이와 유사한 고려를 할 수 있다.

당업자라면 동일한 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드내의 여러 부위에 동일한 정도 또는 다른 정도로 존재할 수 있음을 알 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드라는 용어는 이러한 모든 변형, 특히 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 합성되는 폴리펩티드 중에 존재하는 변형을 포함한다.

본원에 사용된 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 RG1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 폴리펩티드를 코딩하는 단일한 연속 영역 또는 비연속 영역 (예를 들어, 인트론이 사이에 개재되어 있는)을 다른 영역과 함께 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

"생물학적 활성"이란 자연 발생적인 RG1 폴리펩티드의 구조적, 조절적 또는 생화학적 기능을 의미한다.

"면역학적 활성"이란 적절한 동물 또는 세포에서 특이적 면역 반응을 유도하고 특정 항체와 결합하는 천연, 재조합 또는 합성 RG1, 또는 이들의 어떤 단편의 능력을 의미한다.

"올리고뉴클레오티드"란 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 종종 이 용어는 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드를 의미하지만, 또한 다른 것들 중에서 단일 가닥 또는 이중 가닥 리보뉴클레오티드, RNA-DNA 하이브리드 및 이중 가닥 DNA를 의미할 수도 있다. 단일 가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드는 흔히 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기상에서 수행되는 것과 같은 화학적 방법에 의해 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 포함한 여러 다른 방법 및 세포 및 생물에서 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다. "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머" 또는 폴리뉴클레오티드 "단편", "일부" 또는 "절편"이란 약 10개 이상 내지 약 60개, 바람직하게는 약 15개내지 약 30개, 보다 바람직하게는 약 20 개 내지 약 25개의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"자연 발생적인 RG1"은 유전적으로 조작되지 않은 인간 세포에 의해 생산되는 RG1을 의미하며, 구체적으로는 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화, 아실화 및 절단을 포함하지만 이에 한정되지 않는 폴리펩티드의 번역후 변형으로부터 발생하는 여러 RG1 형태를 포함한다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 "변이체"라는 용어는 본원에 사용된 바와 같이 각각 대조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상이한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다. 이러한 의미의 변이체는 본원의 상기 및 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.

(1) 폴리뉴클레오티드 서열에서 다른 대조 폴리뉴클레오티드와 다른 폴리뉴클레오티드. 일반적으로, 차이는 한정적이어서, 대조 및 변이체 폴리뉴클레오티드 서열은 전체적으로 아주 유사하며, 많은 영역에서 동일하다.

하기 언급된 바와 같이, 변이체의 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변화는 사일런트일 수 있다. 즉, 이러한 변화는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산을 변형시킬 수 없다. 변형이 이러한 유형의 사일런트 변화로 한정되는 경우, 변이체는 대조 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 또한 하기 언급된 바와 같이, 변이체의 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변화는 대조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변화는 하기 논의된 바와 같이 대조 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에서 아미노산의 치환, 부가, 결실, 융합 및 말단절단을 일으킬 수 있다.

(2) 아미노산 서열에서 다른 대조 폴리펩티드와 차이가 있는 폴리펩티드. 일반적으로, 차이는 한정적이어서, 대조 및 변이체의 서열은 전체적으로 아주 유사하며, 많은 영역에서 동일하다. 변이체 및 대조 폴리펩티드는 임의 조합으로 존재할 수 있는 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가, 결실, 융합 및 말단절단에 의해 아미노산 서열에서 차이가 있을 수 있다. 이러한 동일 또는 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 변이체는 유전자 코드에서 "다의성"을 이용하여 합성되거나 선택될 수 있다. 다양한 제한 부위를 생성하는 사일런트 변화와 같은 다양한 코돈 치환을 도입하여 플라스미드 또는 바이러스 벡터로의 클로닝 또는 특정 원핵생물 또는 진핵생물계에서의 발현을 최적화할 수 있다. 또한, 돌연변이를 도입함으로써 폴리펩티드의 특성을 변경하여, 리간드 결합 친화성, 쇄간 친화성, 또는 폴리펩티드의 분해 또는 턴오버 속도를 변화시킬 수도 있다.

"대립유전자 변이체"는 rg1 폴리뉴클레오티드의 다른 형태를 의미한다. 대립유전자는 돌연변이, 즉 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변화로부터 형성되며, 일반적으로 구조 또는 기능이 바뀌거나 바뀌지 않을 수 있는 변형된 mRNA 또는 폴리펩티드를 생성시킨다. 임의 주어진 유전자는 대립유전자 형태를 전혀 가지지 않거나, 하나 갖거나 또는 많이 가질 수 있다. 대립유전자를 생성시키는 통상의 돌연변이 변화는 일반적으로 뉴클레오티드의 자연적인 결실, 부가 또는 치환으로 인한 것이다. 이러한 유형의 각각의 변화는 주어진 서열에서 단독으로 일어나거나 또는다른 것과 함께, 또는 1회 이상 일어날 수 있다.

"유도체"란 화학적 변형, 예를 들어 유비퀴틴화, 표지화 (예를 들어, 방서성핵종, 각종 효소에 의한 변형), 페길화 (폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화), 또는 인간 단백질 중에는 일반적으로 존재하지 않는 오르니틴과 같은 아미노산의 삽입 또는 치환 (또는 아미노산 등을 코딩하는 뉴클레오티드의 치환)에 의해 자연 발생적인 rg1 또는 RG1 각각으로부터 유도되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.

"결실"은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 각각 없는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서의 변화로서 정의된다.

"삽입" 또는 "부가"는 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 각각 부가시키는, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.

"치환"은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이 각각 다른 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산에 의해 대체됨으로써 수행된다.

바람직하게는, 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 그와 유사한 구조적 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체한 결과, 예를 들어 루이신을 이소루이신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 또는 쓰레오닌을 세린으로 대체한 결과, 즉 보존적 아미노산 대체의 결과이다. 삽입 또는 결실은 통상적으로 아미노산 약 1개 내지 5개의 범위이다. 허용되는 변화는 재조합 DNA 기술을 이용하여 폴리펩티드내의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고, 생성되는 재조합 변이체를 활성에 대해 분석하여 실험적으로 결정할 수 있다.

"단편"은 부분적으로는 완전히 동일하지만, 상기 언급한 RG1 폴리펩티드 및 그의 변이체 또는 유도체의 아미노산 서열의 전부는 아닌 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.

폴리펩티드 "단편", "일부" 또는 "절편"은 아미노산 약 5개 이상, 흔히 아미노산 약 7개 이상, 통상적으로 아미노산 약 9개 내지 13개 이상, 여러 실시양태에서 아미노산 약 17개 이상으로 이루어진 아미노산 잔기의 스트레치이다.

"재조합" 또는 "재조합 DNA 분자"란 자연적으로 발생되지 않거나 또는 두개의 분리된 다른 서열 단편의 인공적인 조합에 의해 만들어지는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. "재조합적으로 생산되는"이란 화학적 합성 방법 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 절편의 인공적인 조작, 예를 들어 유전자 조작 기술에 의해 흔히 달성되는 인공적인 조합을 의미한다. 이러한 조작은 일반적으로는 하나의 코돈을 동일 또는 보존적 아미노산을 코딩하는 다의성 코돈으로 대체하여 수행되지만, 통상적으로는 서열 인식 부위를 도입하거나 또는 제거한다. 또는, 이러한 조작은 목적하는 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드 절편을 함께 연결하여, 통상의 천연 형태에는 존재하지 않는 기능들의 바람직한 조합을 포함하는 단일한 유전적 실체를 생성시키도록 수행된다. 제한 효소 인식 부위, 조절 서열, 제어 서열 또는 다른 유용한 특징을 의도적으로 도입할 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "재조합"은 폴리펩티드를 코딩하며 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수도 있다.

"단리된"은 대상이 천연 상태로부터 "사람 손에 의해" 변형되는 것, 즉 자연에 존재하는 경우 대상이 원래의 환경으로부터 변형 또는 제거되는 것 또는 이들 둘 다가 수행되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물내에서 원래 천연 상태로 존재하는 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 공동으로 존재하는 그의 천연 상태의 물질로부터 분리되는 경우에는 본원에 사용된 바와 같이 "단리된" 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 대해, 단리된이라는 용어는 그가 자연적으로 존재하는 염색체 및 세포로부터 분리되는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 배지 조성물과 같은 조성물, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 예를 들어 세포에 도입하기 위한 용액, 화학 또는 효소 반응을 위한 조성물 또는 용액 중에 존재할 수 있는데, 예를 들어 이들은 자연 발생적인 조성물이 아니며, 이들 중에는 본원에 사용된 바와 같은 의미내의 용어인 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 존재할 수 있다.

"실질적으로 순수한" 및 "실질적으로 균일한"은 서로 바꾸어 쓸 수 있는 말이며, RG1 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 절편을 의미하며, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 본래 이들을 포함하는 성분들로부터 분리된다. RG1 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 이들을 코딩하는 DNA 절편은 이들을 천연 상태로 포함하는 천연 오염원으로부터 분리되는 경우 자연적으로 결합된 성분들이 실질적으로 없다고 말한다. 즉, 화학적으로 합성되거나 또는 자연적으로 발생되는 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 폴리펩티드는 자연적으로 결합된 성분이 실질적으로 없을 것이다. 유사하게, 화학적으로 합성되거나 또는 자연적으로 발생되는 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 결합된 성분이 실질적으로 없을 것이다.

폴리뉴클레오티드를 설명하기 위해 사용되는 "상동성"이라는 용어는 적절한 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 갖는 두 폴리뉴클레오티드 또는 그의 명명된 서열이 최적으로 배열되어 비교되었을 때 뉴클레오티드가 70% 이상, 일반적으로 약 75% 내지 99%, 보다 바람직하게는 약 98 내지 99% 이상 동일한 것을 의미한다.

폴리펩티드를 설명하기 위해 사용되는 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교하여 결정한다.

"폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 1987년 7월 28일에 허여된 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 특정 DNA 조각이 증폭되는 방법을 의미한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록 대상 폴리펩티드 단편의 말단 또는 그 이외로부터의 서열 정보를 이용할 필요가 있는데, 이러한 프라이머들은 서로에 대해 지시할 것이며, 증폭되는 템플레이트의 반대쪽 가닥에 대해 서열에서 동일하거나 또는 유사할 것이다. 상기 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 말단들과 일치할 것이다. PCR을 이용하여 전체 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 전체 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 플라스미드 서열 등을 증폭시킬 수 있다 (일반적으로 문헌 (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol., 51: 263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY,1989)을 참조).

"엄격도"는 약 T_m(융점) - 5 ℃ (프로브의 T_m미만 5 ℃), 내지 T_m미만 약 20 ℃ 내지 25 ℃의 범위에서 통상적으로 나타난다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 엄격 혼성화를 이용하여 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 확인 또는 검출하거나, 또는 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 확인 또는 검출할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "엄격 조건"이라는 용어는 서열 사이의 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상에서만 혼성화가 일어나는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이 "혼성화"란 폴리뉴클레오티드 가닥이 "염기쌍형성을 통해 상보적인 가닥과 결합하는 어떤 과정"을 포함할 것이다 (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994).

"치료 유효 투여량"이란 질병 상태의 징후 또는 증상을 개선시키는 폴리펩티드 또는 그의 항체, 길항제, 또는 안티센스 분자 및 리보자임을 포함한 저해제의 양을 의미한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 방법에 의해, 예를 들어 ED₅₀(집단의 50%에서 치료 효과가 있는 투여량) 및 LD₅₀(집단의 50%에 대해 치명적인 투여량)로 결정할 수 있다. 치료 및 독성 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이며, ED₅₀/LD₅₀비율로서 표현될 수 있다.

본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 사람 환자에서 전립선 종양 증식과 관련된 질병 증상의 치료를 포괄하며, RG1의 수준 저하를 필요로 하는환자의 질병 증상을 포함한다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은 하기에 보다 상세히 설명된 바와 같이 신규 RG1 폴리펩티드, rg1 폴리뉴클레오티드, 및 RG1 폴리펩티드에 대해 지시되는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신규 RG1 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 특히 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 RG1 및 도 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 갖는 rg1에 관한 것이다. 본 발명은 또한 RG1 변이체에 관한 것이다. 바람직한 RG1 변이체는 도 2에 나타낸 폴리펩티드 (서열 2)와의 유사성이 약 70% 이상 (바람직하게는 동일성이 70% 이상), 보다 바람직하게는 90% 이상 (보다 바람직하게는 동일성이 90% 이상), 보다 더 바람직하게는 95% 이상 (보다 더 바람직하게는 동일성이 95% 이상)인 것이며, 또한 일반적으로 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 갖는 폴리펩티드의 일부를 포함한다.

예상 RG1 폴리펩티드의 코딩 서열은 도 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열 (서열 1)의 5' 말단으로부터 염기쌍이 296개 떨어진 곳에서 시작된다. RG1은 세포외 간질 단백질의 민딘/F-스폰딘 거대족의 특징인 3개의 구조 도메인, 즉 아미노산 31 내지 103, 및 아미노산 138 내지 221을 각각 포함하는 2개의 스폰딘 도메인 (FS1 및 FS2), 및 아미노산 278 내지 330을 포함하는 트롬보스폰딘 도메인을 포함한다.

본 발명은 부분적으로는 도 3에 나타낸 세포외 간질 단백질 족의 다른 요소인 RG1 및 래트 민딘 사이의 구조적 상동성을 기초로 한다. RG1의 아미노산 서열은 래트 민딘의 것과 약 89.7% 유사하다.

본 발명은 또한 전립선 조직 라이브러리에서의 발현 및 전립선 종양 라이브러리에서의 과다 발현에 의해 입증된 바와 같이 부분적으로는 RG1의 발현 프로필을 기초로 한다. 이러한 조직 프로필은 PCR계 Taqman 분석에 의한 정상 및 종양 조직으로부터의 조직 샘플 중의 mRNA 발현 분석에서 나타난다. 이 분석 방법에 의해 RG1을 코딩하는 mRNA가 다른 조직에 비해 전립선 조직에서 과다 발현됨을 입증하였다.

폴리뉴클레오티드

본 발명의 한 측면에 따라, 도 2의 추정 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 RG1 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

도 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 1)과 같은 본원에 제공된 정보를 이용하여, 출발 물질로서 인간 조직의 세포로부터의 mRNA를 이용하여 cDNA를 클로닝하는 것과 같은 표준 클로닝 및 스크리닝 방법에 의해, RG1 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다. 본 발명의 예로서, 도 1의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 1)이 인간 전립선 조직으로부터 얻어진 cDNA 클론에서 발견되었다. 인사이트 라이프세크 (Incyte's LifeSeq) 데이타베이스를 조사하여 rg1이 전립선에서 발현되는 유전자임을 확인하였다. 데이타베이스를 조사할 목적으로 인사이트 (Incyte)사에 의해 제공된 "단백질 기능 (Protein Function)" 수단을 이용하여 데이타베이스의 주석 (annotation) 검색에 의해 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 뉴클레오티드 서열은 주석을 단 데이타베이스의 세포 부착 분자의 카테고리에서 확인되었으며, f-스폰딘의 동족체로 기재되었다. 데이타베이스의 라이브러리 세트에서 rg1 폴리뉴클레오티드 서열의 분포에 대한 일렉트로닉 노던 분석은 rg1이 정상 및 종양 조직으로부터의 라이브러리를 포함하여 전립선 라이브러리에서 높은 수준으로 발현되며 다수의 다른 조직 라이브러리에서는 더 낮은 수준으로 발현되었음을 밝혔다.

데이타베이스의 rg1 클론의 세트를 인접하는 폴리뉴클레오티드 서열로 조립하고, 인접하는 서열을 편집한 후, 전장 코딩 서열을 예상되는 조립된 폴리뉴클레오티드에서 확인하였다. 이 서열은 래트 민딘과 상동성을 갖는 단백질을 코딩하였다.

실험 수행을 위해 인사이트 (Incyte)사로부터 인사이트 (Incyte) 클론 1640796, 1712252 및 1880265를 구입하였으며, 클론 3360733은 대부분의 5' 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. 이 클론은 완전히 시퀀싱되었으며, 예상 RG1 단백질의 전체 코딩 서열을 포함하였다. 이 서열은 도 1 (서열 1)에 나타나 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 mRNA와 같은 RNA 형태이거나, 또는 화학 합성 기술들에 의하거나 이들을 병용하여, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 클로닝하거나 제조하여 얻은 cDNA 및 게놈 DNA를 비롯한 DNA 형태일 수 있다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 센스 가닥으로 알려져 있는 코딩 가닥이거나, 또는 안티센스 가닥으로도 언급되는 비-코딩 가닥일 수 있다.

폴리펩티드를 코딩하는 서열은 도 1에 나타낸 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열(서열 1)과 동일할 수 있다. 또한, 서열은 유전자 코드의 다의성 (축퇴성)으로 인해 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)를 코딩하는, 다른 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다.

도 2의 폴리펩티드 (서열 2)를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로는 폴리펩티드 그 자체의 코딩 서열; 및 예를 들어 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열, 예를 들어 전사, mRNA 프로세싱 (예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호)에서 작용하는 전사되는 비번역 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 추가의 비코딩 서열이나 또는 다른 관능성을 제공하는 것과 같은 다른 아미노산을 코딩하는 다른 코딩 서열을 함께 포함하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩티드는 펩티드 등의 마커 서열에 융합될 수 있으며, 이는 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 한다. 본 발명의 이러한 측면의 어떤 바람직한 실시양태에서, 마커 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예를 들어 pTrcHisB 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)에서 제공되는 태그이며, 이들 중 많은 것들은 상업적으로 이용가능하다. 문헌 (Gentz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824, 1989))에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 정제를 편리하게 한다.

폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드에 다른 아미노산 또는 카르복시 말단 아미노산이 부가되어 있거나 폴리펩티드 내부에 아미노산이 추가된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다 (예를 들어, 활성 형태가 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 갖는 경우). 이러한 서열은 전구체로부터 최종 형태로의 폴리펩티드의 프로세싱에서 작용하거나, 폴리펩티드의 이동 (trafficking)을 촉진시키거나, 폴리펩티드의 반감기를 연장 또는 단축시키거나, 또는 분석 또는 제조를 위한 폴리펩티드의 조작을 용이하게 할 수 있다. 일반적으로 이러한 경우에서와 같이, 추가의 아미노산은 단백질분해 효소에 의해 폴리펩티드로부터 프로세싱되어 제거될 수 있다.

본 발명은 또한 도 2의 추정 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 본원의 상기에 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 자연 발생적인 대립유전자 변이체와 같은 자연 발생적인 변이체이거나 또는 자연적으로 발생되지 않는 것으로 알려진 변이체일 수 있다. 이러한 비-자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 변이체는 폴리뉴클레오티드, 세포 또는 생물에 적용되는 것을 비롯하여 돌연변이유발 기술에 의해 제조될 수 있다.

이러한 변이체에는 폴리뉴클레오티드 치환, 결실 또는 부가에 의해 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와는 다른 변이체가 포함된다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변이체는 코딩 또는 비-코딩 영역, 또는 이들 둘 다에서 변형될 수 있다. 코딩 영역에서의 변화는 보존적 또는 비-보보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 생성시킬 수 있다.

이에 대한 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에는 도 2에 기재된 RG1의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 이들 변이체, 유사체 및 유도체의 단편이 포함된다.

임의 조합으로 치환, 결실 또는 부가되는 아미노산 잔기가 여러개, 몇개, 5개 내지 10개, 1개 내지 5개, 1개 내지 3개, 2개, 1개이거나 또는 전혀 없는 도 2의 RG1 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 RG1 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 단편의 변이체, 유사체 및 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 특히 더 바람직하다. 이들 중에서 RG1 폴리펩티드의 특성 및 활성을 변화시키지 않는 사일런트 치환, 부가 및 결실이 특히 바람직하다. 또한, 이러한 점에서는 보존적 치환이 특히 바람직하다. 치환되지 않은 도 2의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 RG1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또는, RG1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 가장 바람직하다. 이러한 점에서, 상기 폴리뉴클레오티드와의 동일성이 90% 이상인 폴리뉴클레오티드가 특히 바람직하며, 이들 중에서 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 또한, 95% 이상의 동일성을 갖는 것들 중에서 97% 이상의 동일성을 갖는 것이 매우 바람직하며, 이들 중에서 98% 이상 및 99% 이상의 동일성을 갖는 것이 매우 특히 바람직하며, 99% 이상의 동일성을 갖는 것이 보다 바람직하다.

또한, 이러한 측면에서 특히 바람직한 실시양태는 도 1의 폴리뉴클레오티드서열 (서열 1)에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명은 본원에서 상기 설명된 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 점에서, 본 발명은 특히 엄격 조건하에 본원에서 상기 설명된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본원에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분석에 대하여 추가로 논의된 바와 같이, 예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 혼성화 프로브로 사용하여 RG1을 코딩하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리하고, rg1 유전자에 대하여 높은 서열 유사성을 갖는 다른 유전자의 cDNA 및 게놈 클론을 단리할 수 있다. 이러한 프로브는 일반적으로 15개 이상의 염기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 이러한 프로브는 30개 이상의 염기를 가질 것이며, 50개 이상의 염기를 가질 수 있다.

예를 들어, rg1 유전자의 코딩 영역은 공지된 DNA 서열을 사용하여 설계한 합성 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 서열 상보성을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 프로브에 혼성화하는 클론을 찾아낼 수 있다.

요컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드, 리더 서열을 갖는 폴리펩티드 (프리폴리펩티드로 언급되기도 함)를 코딩할 수 있다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 특히 엄격 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는데 사용되는 PCR 프라이머와 같은 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 점에서, 바람직한 폴리뉴클레오티드는 하기 논의된 바와 같은 바람직한 폴리펩티드 단편에 상응하는 것들이다.

폴리펩티드

본 발명은 또한 도 2의 추정 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 RG1 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다. 단편, 유도체 및 유사체라는 용어는 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)를 언급하는데 사용되는 경우 상기 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 어떤 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다.

도 2의 폴리펩티드 (서열 2)의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 치환된 아미노산 잔기가 상기 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있는 것이거나, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것이거나, (iii) 폴리펩티드가 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것이거나, 또는 (iv) 다른 아미노산이 리더 또는 분비 서열 또는 폴리펩티드의 정제를 위해 사용되는 서열과 같은 폴리펩티드에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 개시로부터 당업자의 기술 범위내에 있는 것으로 생각된다.

이에 대한 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에는 도 2에 기재된 RG1의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드, 그의 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 이들 단편의 변이체, 유사체 및 유도체가 포함된다.

바람직한 변이체로는 보존적 아미노산 치환에 의해 대조물과 차이가 있는 것들이 포함된다. 이러한 치환으로는 폴리펩티드내의 주어진 아미노산을 유사한 특징을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 들 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환으로 알려져 있는 것은 한 아미노산을 지방족 아미노산인 Ala, Val, Leu 및 Ile 중의 다른 것으로 대체하는 것, 히드록실 잔기인 Ser과 Thr을 교환하는 것, 산성 잔기인 Asp와 Glu를 교환하는 것, 아미드 잔기인 Asn과 Gln 사이를 치환하는 것, 염기성 잔기인 Lys와 Arg를 교환하는 것, 및 방향족 잔기인 Phe와 Tyr을 대체하는 것이다.

이러한 점에 대하여 특히 더 바람직한 것은 임의 조합으로 치환, 결실 또는 부가되는 아미노산 잔기가 여러개, 몇개, 5개 내지 10개, 1개 내지 5개, 1개 내지 3개, 2개, 1개이거나 또는 전혀 없는 도 2의 RG1 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 단편의 변이체, 유사체 및 유도체이다. 이들 중에서 RG1 폴리펩티드의 특성 및 활성을 변화시키지 않는 사일런트치환, 부가 및 결실이 특히 바람직하다. 또한, 이러한 점에서는 보존적 치환이 특히 바람직하다. 치환되지 않은 도 2의 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드가 가장 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 균일하게 정제된다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)뿐 아니라 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)와의 유사성이 70% 이상 (바람직하게는 동일성이 70% 이상), 보다 바람직하게는 유사성이 90% 이상 (보다 바람직하게는 동일성이 90% 이상), 보다 더 바람직하게는 유사성이 95% 이상 (보다 더 바람직하게는 동일성이 95% 이상)인 폴리펩티드를 포함하며, 일반적으로 아미노산 30개 이상, 보다 바람직하게는 아미노산 50개 이상을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 갖는 폴리펩티드의 일부를 포함한다.

당업게에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교하여 결정한다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 일부를 이용하여 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 제조할 수 있으며, 따라서 단편은 전장 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 사용될 수 있다.

단편

또한, 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시양태에는 RG1의 단편, 가장 바람직하게는 도 2의 RG1 (서열 2)의 단편, 및 도 2의 RG1 (서열 2)의 변이체 및 유도체의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다.

이러한 점에서, 단편은 부분적으로는 완전히 동일하지만, 상기 언급된 RG1 폴리펩티드 및 그의 변이체 또는 유도체의 아미노산 서열의 전체는 아닌 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.

상기 단편은 "프리-스탠딩 (free-standing)", 즉 다른 아미노산 또는 폴리펩티드의 부분이 아니며 그에 융합되지 않거나, 또는 이 단편들은 그들이 어떤 부분 또는 영역을 형성하는 더 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있다. 더 큰 폴리펩티드내에 포함되는 경우, 상기 설명된 단편은 가장 바람직하게는 단일한 연속 영역을 형성한다. 그러나, 여러 단편들이 단일한 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 어떤 바람직한 실시양태는 숙주에서 발현을 위해 설계된 전구체 폴리펩티드내에 포함되며, RG1 단편의 아미노 말단에 융합된 이종 프리폴리펩티드 및 프로폴리펩티드 영역 및 단편의 카르복실 말단에 융합된 다른 영역을 갖는 본 발명의 RG1 폴리펩티드의 단편에 관한 것이다. 따라서, 본원에서 의도되는 의미의 한 측면에서의 단편은 RG1으로부터 유도된 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 일부 또는 일부들을 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드 단편의 대표적인 예로서, 약 25 내지 약 331개의 아미노산을 갖는 것을 언급할 수 있다.

본원에서, "약 (about)"이라는 의미에는 각 끝값 또는 양 끝값에서 아미노산 여러개, 몇개, 5, 4, 3, 2 또는 1개가 더 많거나 더 적은, 구체적으로 언급된 범위및 범위들이 포함된다. 예를 들어, 아미노산 약 331개는 아미노산 25개에다가 아미노산 여러개, 몇개, 5, 4, 3, 2 또는 1개 더 더하거나 뺀 것 내지 아미노산 331개에다가 아미노산 여러개, 몇개, 5, 4, 3, 2 또는 1개 더 더하거나 뺀 것, 즉 아미노산 25개에서 여러개의 아미노산을 뺀 것 내지 아미노산 331개에다가 여러개의 아미노산을 더한 것과 같은 넓은 범위로부터 아미노산 25개에다가 여러개의 아미노산을 더한 것 내지 아미노산 331개에서 여러개의 아미노산을 뺀 것과 같은 좁은 범위에 이르기까지의 폴리펩티드 단편을 의미한다.

이러한 점에서는 각 끝값 또는 양 끝값에서 인용된 범위로부터 아미노산 5개를 더하거나 빼는 것이 매우 바람직하다. 각 끝값 또는 양 끝값에서 인용된 범위로부터 아미노산 3개를 더하거나 빼는 것이 매우 특히 바람직하다. 부가 또는 결실되지 않은 양 끝값 또는 인용된 범위에다가 아미노산 1개를 더하거나 빼는 것이 매우 특히 더 바람직하다. 이러한 점에서 아미노산 약 25개 내지 약 331개의 단편이 매우 가장 바람직하다.

본 발명의 단편 중에서 RG1의 말단절단 변이체가 특히 바람직하다. RG1의 말단절단 변이체는 도 2에 나타낸 서열 (서열 2)의 아미노산 말단을 포함하는 연속되는 일련의 잔기 (즉, 연속 영역, 부분 또는 일부), 또는 카르복실 말단을 포함하는 연속되는 일련의 잔기의 결실, 또는 이중 말단절단 변이체에서는 연속되는 두 일련의 잔기, 즉 아미노 말단을 포함하는 것 및 카르복실 말단을 포함하는 것의 결실을 제외한, 도 2의 서열 (서열 2)의 변이체 또는 유도체가 포함된다. 상기 기재된 크기 범위를 갖는 단편은 단편들 중에서 일반적으로 특히 바람직한 말단절단 단편의 바람직한 실시양태이다.

본 발명의 이러한 측면에서 RG1의 생물학적 및(또는) 면역학적 특성을 특징으로 하는 단편이 특히 바람직하다. 이러한 단편은 적어도 아미노산 31 내지 103개, 138 내지 221개, 및 278개 내지 330개를 포함하는, RG1의 예상되는 구조 도메인을 포함하는 것들 또는 실시예 4에 기재된 것과 같은 항체를 생성하는데 사용되는 단편들이 포함된다.

이러한 점에서 몇몇 바람직한 영역들은 도 2 (서열 2)에 기재되어 있으며, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 분석에 의해 확인된 상기 언급된 유형의 영역을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

이러한 점에서 매우 바람직한 단편으로는 상기 기재된 특징과 같은 여러 구조적 특징들을 조합한 RG1의 영역을 포함하는 것들이 포함된다. 이러한 점에서, 세포외 간질 단백질들 중 민딘/스폰딘 거대족의 특징인 각각 아미노산 약 31 내지 103개, 138 내지 221개, 및 278 내지 330개를 포함하는 두 스폰딘 도메인 및 하나의 트롬보스폰딘 도메인은 특히 바람직한 영역이다. 이러한 영역은 더 큰 폴리펩티드내에 포함되거나 또는 상기 설명된 바와 같이 그들 스스로 본 발명의 바람직한 단편일 수 있다. 상기 구절에서 사용된 "약"이라는 용어는 일반적으로 단편에 대하여 상기 기재된 의미를 갖는다.

더 바람직한 영역은 RG1의 활성을 매개하는 것들이다. 이러한 점에서, 유사한 활성 또는 향상된 활성을 갖는 것들 또는 바람직하지 못한 활성이 감소된 것들을 포함하여 RG1의 화학, 생물 또는 기타 활성을 갖는 단편이 매우 가장 바람직하다. 이러한 점에서, RG1을 포함하는 민딘 족의 다른 단백질과 같은 관련된 폴리펩티드의 활성 영역에 대하여 서열 또는 위치, 또는 서열과 위치 둘 다에서 동족체인 영역을 포함하는 단편이 매우 바람직하다.

벡터, 숙주 세포 및 발현계

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 기술은 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989 and Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989)에 기재되어 있다.

숙주 세포에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 혼입시켜 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키도록 유전적으로 조작할 수 있다. 예를 들어, 감염, 트랜스덕션, 형질감염, 트랜스벡션 및 형질전환의 잘 알려진 기술을 이용하여 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 도입할 수 있다. 이러한 다른 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 독립적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 함께, 또는 본 발명의 폴리뉴크레오티드에 연결시켜 도입할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 포유동물 세포에서 공동-형질감염 및 선별에 대한 표준 기술을 이용하여, 숙주 세포를 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 함께 선택적 마커를 코딩하는 다른 별도의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 경우,폴리뉴클레오티드는 일반적으로 숙주 세포 게놈에 안정하게 혼입될 것이다.

또는, 숙주에서의 증식을 위해 선택적 마커를 포함하는 벡터에 폴리뉴클레오티드를 연결시킬 수 있다. 벡터 구조물은 상기 언급된 기술에 의해 숙주 세포내에 도입할 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 칼슘 포스페이트 침전물과 같은 침전물 중 또는 하전된 지질과의 복합체 중의 DNA로서 도입된다. 또한, 전기천공법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 숙주로 도입할 수도 있다. 벡터가 바이러스인 경우, 벡터는 시험관내에서 패키지화되거나 또는 패키지화 셀로 도입될 수 있으며, 패키지화된 바이러스는 세포내로 도입될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라 폴리뉴클레오티드를 제조하고 이 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하는데 적합한 폭넓은 다양한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 이들에게 통상적인 것이다. 이러한 기술은 이들 기술을 상술하는 많은 실험 매뉴얼의 예가 되는 상기 인용된 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌에 기재되어 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 벡터는 예를 들어 플라스미드 벡터, 단일 또는 이중 가닥 파지 벡터, 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 DNA 및 RNA를 세포내로 도입하는 잘 알려진 기술에 의해 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA로서 세포내로 도입될 수 있다. 벡터는, 파지 및 바이러스 벡터의 경우, 감염 및 트랜스덕션에 대해 잘 알려진 기술에 의해 패키지화 또는 캡슐화된 바이러스로서 세포내로 도입될 수도 있고 바람직하게는 도입된다. 바이러스 벡터는 복제 가능성 또는 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 숙주 세포를 보충하는데 있어서만 일어날 것이다.

어떤 측면에서, 벡터로는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현을 위한 것들이 바람직하다. 일반적으로, 이러한 벡터는 발현되는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 숙주에서의 발현에 대해 효과적인 시스-작용성 조절 영역을 포함한다. 적절한 트랜스-작용성 인자는 숙주에 의해 제공되거나, 보충용 벡터에 의해 제공되거나 또는 숙주로 도입될 때 벡터 자체에 의해 제공된다.

이러한 면에서 어떤 바람직한 실시양태에서, 벡터는 특이적인 발현을 제공한다. 이러한 특이적 발현은 유도가능한 발현이거나 또는 몇가지 유형의 세포에서만 발현될 수 있거나, 또는 유도가능하면서 세포-특이적이기도 할 수 있다. 유도가능한 벡터 중에서는 온도 및 영양 첨가제와 같이 조작하기 쉬운 환경 인자에 의한 발현에 있어서 유도될 수 있는 벡터가 특히 바람직하다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주에 사용되는 구성적이고 유도가능한 발현 벡터를 포함하여 본 발명의 이러한 측면에 적합한 다양한 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이들에 의해 통상적으로 이용된다.

조작된 숙주 세포는 특히 프로모터를 활성화하고, 형질전환체를 선별하고, 유전자를 증폭시키는데 적합한 것으로 변형될 수 있는 통상의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 미리 사용되는 온도 및 pH 등과 같은 배양 조건은 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위해 적합할 것이며, 당업자에게 분명할 것이다.

매우 다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터로는 염색체, 에피좀 및 바이러스-유래의 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드 유래의 벡터, 박테리오파지 유래의 벡터, 효모 에피좀 유래의 벡터, 효모 염색체 구성원 유래의 벡터, 바이러스 유래의 벡터, 예를 들어 바쿨로바이러스, 파포바 바이러스, 예를 들어 SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 슈도래비스 바이러스, 레트로바이러스, 및 알파바이러스, 예를 들어 신드비스 (Sindbis) 바이러스 유래의 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유도된 벡터, 예를 들어 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 구성원으로부터 유도된 벡터, 예를 들어 코스미드 및 파지미드가 포함되며, 이들 모두는 본 발명의 이러한 측면에 따라 발현을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩티드를 발현시키는 폴리뉴클레오티드를 유지하거나, 증식시키거나 또는 발현시키는데 적합한 어떤 벡터를 이러한 면에서의 발현을 위해 사용할 수 있다.

잘 알려진 통상의 다양한 기술 중 어떤 것에 의해 적절한 DNA 서열을 벡터내에 삽입시킬 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 DNA 서열 및 발현 벡터를 절단한 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여 제한 단편을 함께 연결시킴으로써 발현을 위한 DNA 서열을 발현 벡터에 연결시킨다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 제한 및 라이게이션 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 통상적인 것이다. 이러한 면에 적합한 방법 및 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 다른 기술을 이용하여 발현 벡터를 구성하는데 적합한 방법은 본원에 인용된 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌에 보다 상세히 기재되어 있다.

발현 벡터내의 DNA 서열은 예를 들어 mRNA 전사를 지시하는 프로모터를 포함하여 적절한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 프로모터의 대표적인 것들로서 잘 알려진 프로모터의 몇가지만을 들자면, 파지 람다 PL 프로모터, 대장균 lac, trp, tac 및 trc 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 및 레트로바이러스 LTR 프로모터를 들 수 있다. 언급되지 않은 많은 프로모터들도 본 발명의 이러한 측면에 사용하기에 적합하고, 잘 알려져 있으며, 본원에 논의 및 실시예에 의해 예시된 방식으로 당업자에 의해 용이하게 이용될 수 있다.

일반적으로, 발현 구조물은 전사 개시 부위, 종결 부위 및, 전사되는 영역에서, 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 포함할 것이다. 구조물에 의해 발현되는 전사체의 코딩 부위는 개시 코돈으로 번역 개시 AUG 및 번역되는 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치하는 종결 코돈을 포함할 것이다.

또한, 구조물은 발현을 조절 및 개시하는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 통상적으로 수행되는 많은 방법에 따라, 리프레서 결합 부위 및 인핸서와 같은 이러한 영역은 전사를 조절하는 작동을 할 것이다.

증식 및 발현을 위한 벡터는 일반적으로 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는 또한 증폭에 있어서 적합하거나 또는 벡터는 이러한 목적을 위해 다른 마커를 포함할 수 있다. 이러한 점에서, 발현 벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특질을 제공하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 바람직한 마커로는 진핵세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 리덕타제, 네오마이신, 푸로마이신 또는 히그로마이신 내성 유전자, 및 대장균 및 다른 박테리아의 배양을 위한 테트라사이클린, 테오마이신, 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자가 포함된다.

숙주에서 목적하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 잘 알려진 다양한 기술을 이용하여 본원에 기재된 바와 같은 적절한 DNA 서열, 적절한 프로모터, 및 다른 적절한 조절 서열을 포함하는 벡터를 적절한 숙주내에 도입할 수 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예로는 박테리아 세포, 예를 들어 대장균, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예를 들어 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들어 초파리 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS 및 보웨스 (Bowes) 흑색종 세포; 및 식물 세포, 바람직하게는 곤충 세포 BTI-TN-5B1-4가 포함된다. 매우 다양한 발현 구조물을 위한 숙주는 잘 알려져 있으며, 당업자라면 본 발명의 개시에 의해 본 발명의 이러한 측면에 따른 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.

뿐만 아니라, 발현을 위해 다양한 포유동물 세포 배양계를 이용할 수 있다. 포유동물 발현계의 예로는 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주가 포함된다 (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1991). 적합한 벡터를 발현시킬 수 있는 다른 세포주로는 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa, 인간 신장 293 및 BHK 세포주가 포함된다. 포유동물 숙주 세포에서, 많은 바이러스계 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, RG1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 후기 프로모터 및 세부분으로 된 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/번역 복합체내에 라이게이션할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역내의 삽입은 감염된 곤충 세포에서 RG1을 발현시킬 수 있는 생존성 바이러스를형성시킬 것이다 (Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-59, 1984). 또한, 전사 인핸서, 예를 들어 로우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서를 사용하여 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시킬 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 또한 상기 기재된 서열의 하나 이상을 포함하는, 발현 구조물과 같은 재조합 구조물을 포함한다. 이 구조물로는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 포함되며, 이들 내부에는 본 발명의 서열이 삽입되어 있다. 서열은 정방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있다. 이러한 면에서 어떤 바람직한 실시양태에서, 구조물은 예를 들어 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 비롯한 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명에 사용하기에 적합한 시판되는 많은 벡터가 있다.

상업적으로 이용되는 하기 벡터가 그러한 예로서 제공된다. 박테리아에 사용하기에 바람직한 벡터로는 pQE7O, pQE6O 및 pQE-9 (Qiagen USA (Valencia, Calif.)에서 판매), pBS 벡터, Phagescript(등록상표) 벡터, Bluescript(등록상표) 벡터, pNH8A, pNHI6a, pNHI8A, pNH46A (Stratagene (LaJolla, Calif.)에서 판매); 및 ptrc99a, pK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech (Piscataway, N.J.)에서 판매)가 포함된다. 가장 바람직한 것은 Invitrogen사에서 판매되는 pTrcHisB 벡터이다. 바람직한 진핵세포 벡터로는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTI 및 pSG (Stratagene에서 판매); 및 PSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia Biotech에서 판매)이 포함된다. 가장 바람직한 것은 Promega에서 판매하는 pCIneo 벡터이다. 이러한 벡터는 본 발명의 상기 측면에 따라 당업자가 이용할 수 있는 시판되는 잘 알려진 많은 벡터의 예로서 나열하였을 뿐이다. 숙주에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 도입, 유지, 증식 또는 발현에 적합한 임의 다른 플라스미드 또는 벡터가 본 발명의 이러한 측면에 이용될 수 있을 것으로 이해된다.

후보 프로모터 단편, 즉 프로모터를 포함할 수 있는 단편을 도입하기 위한 제한 부위 또는 부위들의 하류에 있는, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 ("cat") 전사 유닛과 같은 프로모터 영역이 결여된 리포터 전사 유닛을 포함하는 벡터를 사용하여 임의 목적하는 유전자로부터 프로모터 영역을 선택할 수 있다. 잘 알려져 있는 바와 같이, 프로모터를 포함하는 단편을 벡터내의 cat 유전자의 상류에 있는 제한 부위에 도입하는 것은 표준 CAT 분석에 의해 검출될 수 있는 CAT 활성을 나타내도록 만든다. 이러한 목적에 적합한 벡터는 잘 알려져 있으며, 용이하게 이용가능하다. 이러한 벡터의 두가지는 pKK232-B 및 pCM7이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터로는 잘 알려져 있는 쉽게 이용가능한 프로모터뿐만 아니라 리포터 유전자를 이용하여 상기 기술에 의해 쉽게 얻을 수 있는 프로모터도 포함된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 적합한 공지된 박테리아 프로모터로는 대장균 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, T5 tac 프로모터, 람다 PR, PL 프로모터, trp 프로모터, 및 trp 및 lac 프로모터로부터 유도된 trc 하이브리드 프로모터가 포함된다. 이러한 면에 적합한 공지된 진핵세포 프로모터로는 CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들어 로우스 육종 바이러스 ("RSV")의 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터, 예를 들어 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터가 포함된다.

숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 잘 알려져 있는 과정이며, 발현 벡터의 구성, 벡터의 숙주로의 도입 및 숙주에서의 발현은 당업계에서 통상적인 기술이다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점, 하류의 구조 서열의 전사를 지시하는 고도로 발현되는 유전자로부터 유도되는 프로모터, 및 벡터에 대한 노출 이후에 벡터를 포함하는 세포의 단리를 허용하는 선택가능한 마커를 포함할 것이다.

본 발명은 또한 상기 논의된 구조물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 또는 하등 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포이거나, 또는 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포일 수 있다. 숙주 세포에서 구조물은 재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 구조물을 생성하는 통상의 방식으로 사용될 수 있다.

폴리펩티드는 포유동물 세포, 효모, 박테리아, 또는 적절한 프로모터의 조절하의 다른 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 구조물로부터 유도되는 RNA를 사용하여 상기 단백질을 생산하기 위해서는 세포 무함유 번역계를 이용할 수도 있다. 원핵세포 및 진핵세포 숙주와 함께 사용되는 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 본원에 인용된 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌에 기재되어 있다.

인핸서 서열을 벡터내에 삽입하여 고등 진핵생물에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 증가시킬 수 있다. 인핸서는 주어진 숙주 세포 유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 작용을 하는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp의 시스-작용성 DNA 구성원이다. 인핸서의 예로는 복제 기점 뒷쪽의 100 내지 270 bp에 위치하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒤쪽의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드의 이종 구조 서열을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 표준 기술을 사용하여 벡터내에서 그가 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 삽입될 것이다. 폴리뉴클레오티드는 전사 개시 부위가 리보좀 결합 부위에 대해 5'에 적절하게 위치하도록 배치될 것이다. 리보좀 결합 부위는 발현되는 폴리펩티드의 번역을 개시하는 AUG에 대해 5'에 위치할 것이다. 일반적으로, 개시 코돈, 대개는 AUG로 시작하며 리보좀 결합 부위와 개시 AUG 사이에 존재하는 다른 오픈 리딩 프레임은 없을 것이다. 또한, 일반적으로, 폴리펩티드의 말단에는 번역 종결 코돈이 존재할 것이며, 전사되는 영역의 3' 말단에 적절하게 위치하는 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 신호가 존재할 것이다.

전사되는 단백질이 소포체의 루멘, 원형질막 주변의 공간, 또는 세포외 환경으로 분비되도록 하기 위해, 발현되는 폴리펩티드내에 적절한 분비 신호를 도입할 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 대해 내생적이거나 또는 이종 신호일 수 있다. 폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가의 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 다른 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역을 폴리펩티드의 N-말단에 부가하여 정제 또는이후의 취급 및 저장 동안에 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 특정 영역을 폴리펩티드에 부가하여 정제를 용이하게 할 수도 있다. 이러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조에 앞서 제거될 수 있다. 분비 또는 배출을 가능하게 하고, 안정성을 향상시키며, 정제를 촉진시키기 위해 폴리펩티드에 펩티드 잔기를 부가하는 것은 당업계에 잘 알려진 통상의 기술이다. 예를 들어, 항체의 유도를 위해 다량의 RG1이 요구되는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질의 발현을 높은 수준으로 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 다기능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들어 하이브리드 단백질이 생산되도록 rg1 코딩 서열이 벡터내의 프레임내에서 베타-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 이후의 7개의 잔기에 대한 서열과 함께 라이게이션된 Bluescript(등록상표) (Stratagene); 및 pIN 벡터 (Van Heede and Shuster, J. Biol. Chem. 264-5503-5509, 1989) 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. PTrcHis 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)는 빠른 정제를 위해 폴리히스티딘 (6 x His)을 포함하는 융합 단백질로서 외부 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서 만들어진 단백질은 관심있는 클로닝된 폴리펩티드를 융합 펩티드 잔기로부터 마음대로 방출시킬 수 있도록 엔테로키나제 절단 부위와 같은 절단 부위를 포함하도록 고안한다.

적당한 숙주 균주를 형질전환시키고 숙주 균주를 적당한 세포 밀도까지 생장시킨 후, 적당한 수단으로 유도성 프로모터 (존재한다면)를 유도하고 (예를 들어, 온도 변환 또는 화학적 유도제에의 노출), 세포를 추가 기간 동안 배양할 수 있다.

그 다음, 세포를 전형적으로 원심분리하여 모으고, 물리적 또는 화학적 방법으로 파괴하고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보관하였다.

단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 주기 반복, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용 (이러한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있음)을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파괴할 수 있다.

RG1 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 레시틴 크로마토그래피를 비롯한 잘 공지된 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액상 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제에 사용할 수 있다. 단백질을 리폴딩하는 잘 공지된 기술을 사용하여 폴리펩티드가 단리되고(되거나) 정제되는 동안 변성될 경우 활성 입체구조를 재생시킬 수 있다. 당분야에 잘 공지된, 단백질을 정제하는 다른 다양한 방법에는 문헌 (Deutscher, M., Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, San Diego, 1982; and Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice Springer-Verlag, New York, 1982)에 기재된 것이 포함된다.

별법으로, 본 발명의 폴리펩티드는 고상 기술을 사용하는 직접적인 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다 (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). 시험관내에서, 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어, 제조자가 제공하는 설명서에 따라 어플라이드 바이오시스템 431A 펩티드 합성기 (Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 사용하여 달성할 수 있다. RG1의 다양한 단편을 각각 화학적으로 합성하고 화학적 방법을 사용하여 모아 전장 분자를 생성할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 방법으로 얻은 생성물, 및 재조합 기술을 사용하여 예를 들어, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 원핵 또는 진핵 숙주로부터 생산한 생성물이 포함된다. 재조합 생산 방법에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드를 글리코실화 또는 비-글리코실화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에는 몇몇 경우 숙주-매개 프로세스에 의한 초기 변형된 메티오닌 잔기가 포함될 수도 있다.

RG1 폴리펩티드, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도

rg1 폴리뉴클레오티드 및 RG1 폴리펩티드는 본 발명에 따라 다양한 분야, 특히 RG1의 화학적 및 생물학적 성질을 이용하는 분야에 사용할 수 있다. 다른 적용분야는 전립선암과 같은 세포 증식의 진단 및 치료에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면은 하기 토의 단락에 더 기술되어 있고 본 명세서에 더 자세히 기재되어 있다

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 사용 원리는 부분적으로 본원에 개시된 RG1과 다른 세포외 간질 분자 사이의 화학적 및 구조적 상동성, 및 다른 조직과 비교할 때 전립선 조직에서의 RG1의 우세한 발현을 기초로 한다. RG1은 전립선 조직의 부적절한 생장과 관련된 증상, 장애 또는 질환의 진단 및 치료에 사용할 수 있다. 이들에는 암 및 전이성 종양 생장이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

rg1 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 프로브, 및 안티센스와 리보자임 요법을 위한 표적, 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 생성을 위한 템플레이트로 사용할 수 있다.

RG1 폴리펩티드는, 세포 및 조직에서 RG1 폴리펩티드의 농도를 검출하고 약물을 원발성 및 전이성 종양에 표적화시키는 데 사용할 수 있는 RG1에 대한 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다.

RG1 폴리펩티드는 RG1 함유 세포에 대한 면역반응을 자극하는 데 사용할 수 있다.

RG1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 및 조직에서 RG1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 검출하기 위한 진단 분석에 유용할 수 있다.

전립선암과 같은, RG1의 발현과 관련된 증상에 있어서, RG1의 발현 또는 활성을 억제하는 것이 유리할 수 있다. RG1의 발현은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임의 투여에 의해 억제될 수 있다. 별법으로, RG1 폴리펩티드의 활성을 나타내는 RG1 폴리펩티드의 영역을 특이적으로 인식하는 항체를 투여하여 RG1의 활성과 관련된 질환 또는 증상을 치료할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 분석

본 발명은 예를 들어, 진단 시약과 같은, 상보적 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 rg1-관련 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이기도 하다. 질환의 상태와 관련된 rg1 폴리뉴클레오티드의 검출은 RG1의 조직 특이적 발현으로부터 발생되는질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단을 덧붙이거나 정의할 수 있는 시험관내 및 생체내 진단제의 개발을 위한 수단을 제공할 것이다.

RG1을 코딩하는 유전자에 돌연변이가 있는 개체는 다양한 기술을 사용하여 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단용 폴리뉴클레오티드 샘플은 혈액, 소변, 침, 조직 생검 및 부검 물질과 같은 환자의 세포로부터 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접 사용할 수 있거나, 분석 전에 PCR을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다 (Saiki et al., Nature, 324 163-166, 1986). RNA 또는 cDNA도 동일한 방식으로 사용할 수 있다. 예를 들어, RG1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 rg1의 발현 및 돌연변이를 확인하고 분석할 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상 유전자형과 비교할 때 증폭된 생성물의 크기 변화로 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 방사성표지 rg1 RNA 또는 방사성표지 rg1 안티센스 DNA 서열과 혼성화시킴으로써 확인할 수 있다. 완벽하게 일치된 서열은 RNase A 분해 또는 융점의 차이에 의해 일치되지 않은 이중가닥으로부터 구별할 수 있다.

대조 유전자와 돌연변이를 갖는 유전자의 서열 차이는 직접적인 DNA 시퀀싱에 의해서도 나타날 수 있다. 또한, 클로닝된 DNA 단편은 특정한 DNA 단편을 검출하기 위한 프로브로 사용할 수 있다. 이러한 방법의 민감성은 PCR 또는 또 다른 증폭 방법의 적절한 사용에 의해 상당히 상승될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱 프라이머는 이중-가닥 PCR 생성물, 또는 변형된 PCR에 의해 생성된 단일-가닥 템플레이트 분자와 함께 사용한다. 서열 결정은 방사성표지 폴리뉴클레오티드를 사용한 통상적 방법 또는 형광 태그를 사용한 자동 시퀀싱 방법으로 수행한다.

DNA 서열 차이를 기초로 한 유전자 시험은 변성제가 있거나 없는 겔에서 DNA 단편의 전기영동적 이동의 변화를 검출하여 달성할 수 있다. 작은 서열 결실 및 삽입은 고해상 겔 전기영동에 의해 가시화될 수 있다. 다른 서열의 DNA 단편은 다른 DNA 단편의 운동이 그들의 특정 융점 또는 부분 융점에 따라 겔 상의 다른 위치에서 지연되는 변성 포름아미드 구배 겔 상에서 구별할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Myers et al., Science, 230: 1242, 1985) 참조).

특정한 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호 또는 화학적 절단 방법과 같은 뉴클레아제 보호 분석에 의해 나타날 수도 있다 [예를 들어, 문헌 (Catton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401, 1985) 참조].

따라서, 특정한 DNA 서열의 검출은 혼성화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접적인 DNA 시퀀싱 또는 제한효소의 사용 (예를 들어, 게놈 DNA의 제한효소 단편 길이 다형성 ("RFLP") 및 서던 블로팅)과 같은 방법으로 달성할 수 있다.

통상적인 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱 외에, 돌연변이는 원위치 분석에 의해 분석할 수도 있다.

폴리펩티드 분석

본 발명은 정상 및 비정상 농도의 측정을 비롯한, 세포, 조직 및 체액에서의 RG1 폴리펩티드의 농도를 검출하기 위한 정량 및 진단 분석과 같은 진단 분석에 관한 것이다. 따라서, 예를 들어, 정상 대조구 조직 샘플과 비교할 때 RG1 폴리펩티드의 과발현을 검출하기 위한, 본 발명에 따른 진단 분석은 종양, 예를 들어, 전립선암의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있다. 이러한 진단 시험은 전이성 종양 생장을 검출하는 데 사용할 수도 있다. 숙주로부터 유래된 샘플에서 본 발명의 RG1 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드의 농도를 측정하기 위해 사용할 수 있는 분석 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 분석 방법에는 방사성면역분석 (RIA), 경쟁-결합 분석, 웨스턴 블롯 분석 및 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)가 포함된다. 이러한 방법들 중에서, ELISA가 종종 바람직하다. ELISA 분석은 우선 RG1에 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함한다. 또한, 일반적으로 모노클로날 항체에 결합하는 레포터 항체를 제조한다. 레포터 항체는 방사성 시약, 형광 시약 또는 효소 시약 (본 실시예에서는 호스라디쉬 퍼록시다제 효소)과 같은 검출가능한 시약에 부착시킨다.

ELISA를 수행하기 위해, 숙주로부터 샘플을 얻고, 샘플 중의 폴리펩티드가 결합하는 고상 지지체, 예를 들어, 폴리스티렌 디쉬 상에서 샘플을 인큐베이션한다. 그 다음, 디쉬 상에 있는 임의의 자유 폴리펩티드 결합 부위는 소 혈청 알부민과 같은 비-특이적 단백질과 인큐베이션시킴으로써 커버한다. 다음으로, 모노클로날 항체가 폴리스티렌 디쉬에 부착된 임의의 RG1 폴리펩티드에 부착되는 시간 동안 디쉬에서 모노클로날 항체를 인큐베이션한다. 결합되지 않은 모노클로날 항체는 완충액으로 세척하여 제거한다. 호스라디쉬 퍼록시다제에 결합된 레포터 항체를 디쉬에 넣는데, 이 디쉬에서 레포터 항체는 RG1에 결합된 임의의 모노클로날 항체와 결합한다. 그 다음으로, 부착되지 않은 레포터 항체는 세척하여 제거한다. 이어서, 비색 기질을 비롯한 퍼록시다제 활성용 시약을 상기 디쉬에 첨가한다. 일차 항체 및 이차 항체를 통해 RG1에 결합된 고정화된 퍼록시다제는 착색된 반응 생성물을 생성한다. 주어진 시간 동안 발생된 컬러의 양은 샘플에 존재하는 RG1 폴리펩티드의 양을 나타낸다. 표준 곡선에 대하여 정량적인 결과를 얻는다

RG1에 특이적인 항체를 고상 지지체에 부착시키고, 숙주로부터 유래된 표지된 RG1 및 샘플을 상기 고상 지지체 상에 통과시키고, 고상 지지체에 부착된 검출되는 표지의 양이 샘플 중의 RG1의 양과 상호관련될 수 있는 경쟁 분석을 이용할 수 있다.

이러한 분석 및 기타 분석은 무엇보다도 문헌 [Hampton et al. (Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn., 1990) and Maddox et al. (J. Exp. Med. 158:12111, 1983)]에 기재되어 있다.

항체

본 발명은 본원에서 RG1 항체로 불리는, RG1에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 전립선 조직 및 그의 세포 표면 위치에서의 RG1의 과발현은 스크리닝, 진단, 예후, 추적 분석 및 영상화 방법에 있어서 우수한 마커의 특징을 나타낸다. 또한, 이러한 특징은 RG1가 표적화된 항체요법, 면역요법 및 유전자요법과 같은 치료 방법에 있어서 우수한 표적일 수 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "...에 특이적으로 결합하는"은 항체와 폴리펩티드의 상호작용을 말하는데, 상기 상호작용은 특정한 구조 (즉, 항원성 결정인자 또는 에피토프)가 폴리펩티드에 존재하는지에 달려 있다. 다시 말해, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정한 폴리펩티드 구조를 인식하여 결합한다.

RG1 폴리펩티드, 그의 단편 또는 다른 유도체, 그의 유사체, 또는 그를 발현하는 세포는 그에 대한 항체의 생성을 위한 면역원으로 사용할 수 있다 (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). 이러한 항체는 예를 들어, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 키메라, 단일쇄, 인간화 및 인간 항체뿐 아니라 Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물도 포함한다. 당분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 이러한 항체 및 단편을 생산할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 폴리펩티드를 동물에 직접 주입하거나, 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비-인간에게 투여함으로써 얻을 수 있다. 그 다음으로, 이렇게 얻은 항체는 그 자체가 폴리펩티드에 결합할 것이다. 이 방식으로 심지어 폴리펩티드의 단편만을 코딩하는 서열도 전장 천연 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시키는 데 사용할 수 있다. 이어서, 이러한 항체는 그 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩티드를 단리하는 데 사용할 수 있다.

모노클로날 항체를 제조하기 위해, 연속 세포주 배양으로부터 생산된 항체를 제공하는 임의의 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술의 예에는 하이브리도마 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al, Immunology Today 4: 72, 1983) 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77-96, 1985)이 포함된다.

또한, "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술인, 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻기 위해 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자로 스플라이싱하는 기술을 사용할 수 있다 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314: 452-454, 1985). 별법으로, 단일쇄 항체를 생산하기 위해 기재된 기술 (미국 특허 제4,946,778호)을 RG1-특이적 단일쇄 항체의 생산에 적용할 수 있다.

더욱이, "인간" 항체는 미국 특허 제5,877,397호 및 제5,569,825호 (본 명세서에 참고로 도입됨)에 기재된 방법을 이용하여 생산할 수 있다.

또한, 항체는 림프구 집단에서 생체내 생산을 유도하거나, 문헌 [Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989) and Winter and Milstein (Nature 349: 293-299, 1991)]에 개시된 재조합 이뮤노글로불린 라이브러리, 또는 고특이성 결합 시약으로 만들어진 판넬을 스크리닝함으로써 생산할 수 있다.

RG1에 특이적인 결합 부위를 함유하는 항체 단편도 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편에는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시켜 발생시킬 수 있는 Fab 단편이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 쉬운 동정이 가능하도록 Fab 발현 라이브러리를 제작할 수 있다 (Huse et al., Science 256: 1270-1281, 1989).

본원에서 제공된 RG1의 아미노산 서열을 사용하여 항체를 생성시키기 위한RG1 폴리펩티드의 특정 영역을 선별할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 항체가 유도되는 RG1 폴리펩티드의 영역 또는 에피토프는 목적하는 용도에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 전립선 세포에 대한 막-결합 RG1의 검출을 위한 면역분석에 사용하기 위한 항체는 RG1 폴리펩티드 상의 접근가능한 에피토프에 대해 유도되어야 한다. 면역원성 구조를 나타내는 RG1 폴리펩티드의 영역뿐 아니라 다른 영역 및 도메인도 쵸우-파스만 (Chou-Fasman), 가니에르-로브손 (Garnier-Robson) 또는 자메슨-울프 (Jameson-Wolf) 분석과 같은 당분야에 공지된 다양한 다른 방법을 사용하여 쉽게 확인할 수 있다. 이들 잔기를 함유하는 단편은 특히 항-RG1 항체를 발생시키는 데 적합하다. 특히 유용한 단편에는 서열 PLGGESICSAGAPAKYSIT (서열 8); HSSDYSMWRKNQYVS (서열 10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (서열 11); 및 NEIVDSASVPET (서열 12)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이들 영역에 대한 폴리클로날 항체의 생성은 실시예 4에 기재되어 있다.

본 발명의 RG1 항체는 전립선암의 관리를 위한 진단 분석, 영상화 방법 및 치료 방법에 특히 유용할 수 있다. 본 발명은 RG1 폴리펩티드의 검출 및 전립선암의 진단에 유용한 다양한 면역학적 분석을 제공한다. 이러한 분석은 일반적으로 RG1 폴리펩티드를 인식하고 이 폴리펩티드에 결합할 수 있는 1종 이상의 RG1 항체를 포함한다. 가장 바람직한 항체는 RG1에는 선별적으로 결합하지만 비-RG1 폴리펩티드에는 결합하지 않을 것이다 (또는 약하게 결합할 것이다). 분석에는 다양한 타입의 방사성면역분석, 효소-결합 면역흡착 분석 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당분야에 잘 공지된 다양한 면역학적 분석 포맷이 포함된다. 또한, 본 발명은표지된 RG1 항체를 사용하는 방사성신티그래피 영상화 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는, 전립선암을 검출할 수 있는 면역학적 영상화 방법도 제공한다. 이러한 분석은 임상학적으로 전립선암의 검출, 모니터링 및 예후에 유용할 수 있다.

상기 항체는 친화 크로마토그래피에 의한 단리 및(또는) 정제를 위한 고상 지지체와 항체의 부착에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 클론을 단리하거나 동정하는 데, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 정제하는 데 사용할 수 있다.

추가로, RG1 항체는 세포 분류 및 정제 기술을 사용하여 RG1 양성 세포를 단리하는 데 사용할 수 있다. 특히, RG1 항체는 항체-기재 세포 분류 또는 친화 정제 기술을 이용하여 이종이식 종양 조직, 배양물 중의 세포 등으로부터 전립선암 세포를 단리하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 RG1 항체의 다른 용도에는 RG1 폴리펩티드를 모방하는 항-이디오타입 항체의 생성이 포함된다.

RG1 항체는 전립선암 또는 악성종양 전이의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있다. 혈청, 전립선 및 기타 조직 생검 표본을 비롯한 다양한 생물학적 샘플 내의 상기 RG1-함유 세포의 존재는 RG1 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, RG1 항체는 Tc-99m (또는 다른 동위원소)에 결합된 항체를 사용한 면역신티그래피와 같은 다양한 영상화 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, In-111에 결합된 항-PSMA 항체를 사용하는, 최근에 기재된 프로토콜과 유사한 영상화 프로토콜을 사용하여 재발성 및 전이성 전립선암종을 검출할 수 있다 (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997).

본 발명의 RG1 항체는 검출가능한 마커로 표지하거나 세포독성제와 같은 제2분자에 결합시킬 수 있고, 상기 제2 분자를 RG1 양성 세포에 표적화시키는 데 사용할 수 있다 (Vitetta, E. S. et al., Immunotoxin Therapy, in DeVita, Jr, V. T. et al., eds, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636, 1993). 세포독성제의 예에는 리신, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티듐 브로마이드, 마이토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 (PE) A, PE40, 아브린 및 글루코코르티코이드 및 기타 화학요법제뿐 아니라, 방사성동위원소가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 검출가능한 적당한 마커에는 방사성동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 적당한 방사성동위원소에는 안티몬-124, 안티몬-125, 아르세닉-74, 바륨-103, 바륨-140, 베릴륨-7, 비스무쓰-j206, 비스무쓰-207, 카디뮴-109, 카디뮴-115m, 칼슘-45, 세륨-139, 세륨-141, 세륨-144, 세슘-137, 크로뮴-51, 코발트-56, 코발트-57, 코발트-58, 코발트-60, 코발트-64, 에르븀-169, 유로퓸-152, 가돌리늄-153, 금-195, 금-199, 하프늄-175, 하프늄-181, 인듐-11, 요오드-123, 요오드-131, 이리듐-192, 철-55, 철-59, 크립톤-85, 납-210, 망간-54, 수은-197, 수은-203, 몰리브데늄-99, 네오디뮴-147, 넵튜늄-237, 니켈-63, 니오븀-95, 오스뮴-185+191, 팔라듐-103, 백금-195m, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-147, 프로택티늄-233, 라듐-2226, 레늄-186, 루비듐-86, 루테늄-103, 루테늄-106, 스칸듐-44, 스칸듐-46, 셀레늄-75, 은-110m, 은-11, 소듐-22, 스트론튬-85, 스트론튬-89, 스트론튬-90, 황-35,탄탈륨-182, 테크네튬-99m, 텔루륨-125, 텔루륨-132, 탈륨-170, 탈륨-204, 토륨-228, 토륨-232, 주석-113, 티타늄-44, 텅스텐-185, 바나듐-48, 바나듐-49, 이테르븀-169, 이트륨-88, 이트륨-90, 이트륨-91, 아연-65 및 지르코늄-95가 포함된다.

전립선암을 위한 면역요법

본 발명은 항체요법, 생체내 백신 및 생체외 면역요법 방법을 비롯한, 전립선암을 치료하기 위한 다양한 면역치료법을 제공한다. 한 방법에서, 본 발명은 전립선암을 치료하기 위해 전신적으로 사용할 수 있는 RG1 항체를 제공한다. 예를 들어, 비-결합된 RG1 항체를 환자 내에 도입함으로써, 상기 항체가 전립선암 세포 상의, 전립선암 세포 내의, 또는 전립선암 세포와 관련된 RG1와 결합하고, 보체-매개 세포용해, 항체-의존성 세포성 세포독성, RG1의 생리학적 기능의 변화, 및(또는) 리간드 결합 또는 신호전달 경로의 억제를 포함할 수 있는 메카니즘에 의해 세포 및 종양의 파괴를 매개하도록 할 수 있다. 리신 또는 방사성동위원소와 같은 독성제에 결합된 RG1 항체도 치료적으로 사용함으로써 독성제를 RG1-보유 전립선 악성종양 세포에 직접 전달하여 악성종양 세포를 파괴할 수 있다.

RG1 항체를 사용한 전립선암 면역요법은 결장암 (Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138, 1998), 다발성 골수종 (Ozaki et al., Blood 90: 3179-3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90: 2437-2444, 1997), 위암 (Kasprzyk et al, Cancer Res. 52: 2771-2776, 1992), B-세포 림프종 (Funakoshi et al., Immunther. Emphasis Tummor Immunol., 19: 93-101, 1996), 백혈병 (Zhong et al., Leuk. Res. 20: 581-589, 1996), 결장직장암 (Moun et al., Cancer Res. 54 6160-6166, 1994; Velders et al., Cancer Res. 55-4398-4403, 1995) 및 유방암 (Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11: 117-127, 1991)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 유형의 암의 치료에 성공적으로 사용되고 있는 다양한 방법으로부터 만들어진 교시를 따를 수 있다.

본 발명은 RG1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 함유하도록 제형화된 백신을 추가로 제공한다. 항암요법에 사용하기 위한 체액성 면역 및 세포-매개 면역을 발생시키기 위한 백신에 있어서의 종양 항원의 사용은 당분야에 잘 공지되어 있고 인간 PSMA 및 설치류 PAP 면역원을 사용하는 전립선암에 사용된 바 있다 (Hodge et al., Int. J. Cancer 63: 231-237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159: 3113-3117, 1997). 이러한 방법은 RG1 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 RG1 면역원을 발현할 수 있고 적절히 제시할 수 있는 RG1-코딩 핵산 분자 및 재조합 벡터를 사용하여 용이하게 실시할 수 있다.

예를 들어, 바이러스 유전자 전달 시스템을 사용하여 RG1-코딩 핵산 분자를 전달할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면을 실시하는 데 사용할 수 있는 다양한 바이러스 유전자 전달 시스템에는 백시니아, 계두 바이러스 (fowlpox), 카나리아두 (canarypox) 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자, 폴리오바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스 및 신드비스 바이러스가 포함되나, 이에 제한되지 않는다 (Restifo, in Curr. Opin, Immunol. 8: 658-663, 1996). 환자 내로 (예를 들어, 근육 내로) 도입된, RG1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 네이키드 (naked) DNA를 사용하여 항-악성종양 반응을 유도함으로써 비-바이러스 전달 시스템도 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 전장 인간 rg1 cDNA를 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 인간 rg1 cDNA 단편을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, T 림프구 (CTL) 에피토프를 코딩하는 rg1 핵산 분자를 사용할 수 있다. CTL 에피토프는 특정한 알고리즘 (예를 들어, 에피머, 브라운 유니버시티)를 사용하여 특정화된 HLA 대립유전자에 최적으로 결합할 수 있는 RG1 폴리펩티드 내의 펩티드를 확인함으로써 결정할 수 있다.

다양한 생체외 방법도 사용할 수 있다. 한 방법은 항원으로서 RG1 폴리펩티드를 환자의 면역계에 제시하는 수상세포 (dendritic cell)의 사용을 수반한다. 수상세포는 MHC 클래스 I 및 II, B7 보조자극제 및 IL-12를 발현하므로, 매우 전문화된 항원 제시 세포이다. 전립선암에서, 전립선-특이적 막항원 (PSMA)의 펩티드로 자극된 자가유래 수상세포는 전립선암 환자의 면역계를 자극하기 위한 임상 시험 I기에 사용한다 (Tjoa et al., Prostate 28: 65-69, 1996; Murphy et al., Prostate 29: 371-380, 1996). 수상세포는 MHC 클래스 I 및 II 분자와 함께 RG1 폴리펩티드를 T 세포에 제시하는 데 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 자가유래 수상세포는 MHC 분자에 결합할 수 있는 RG1 폴리펩티드로 자극한다. 또 다른 실시양태에서, 수상세포는 완전한 RG1 폴리펩티드로 자극한다. 또 다른 실시양태는 아데노바이러스 (Arthur et al., Cancer Gene Ther. 4:17-25,1997), 레트로바이러스 (Henderson et al., Cancer Res. 56: 3763-3770,1996), 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스, DNA 형질감염 (Ribas et al., Cancer Res. 57: 2865-2869, 1997) 및 악성종양-유래의 RNA 형질감염 (Ashley et al., J. Exp. Med. 186: 1177-1182, 1997)과 같은, 당분야에 공지된 다양한 실행 벡터를 사용하여 수상세포에서 rg1 유전자를 과발현시키는 유전자조작을 수반한다.

항-이디오타입 항-RG1 항체도 RG1 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신으로서 항암요법에 사용할 수 있다. 구체적으로, 항-이디오타입 항체의 생성은 당분야에 잘 공지되어 있고, RG1 폴리펩티드 상의 에피토프를 모방하는 항-이티오타입 항-RG1 항체를 생성시키는 데 용이하게 적용할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Wagner et al., Hybridoma 16: 33-40, 1997; Foon et al., J. Clin. Invest. 96: 334-342, 1995; Herlyn et al., Cancer Immunol Immunother 43: 65-76, 1996) 참조]. 이러한 항-이디오타입 항체는 종양 항원에 대해 유도된 다른 항-이디오타입 항체를 사용하여 현재 실시되고 있는 항-이디오타입 요법에 사용할 수 있다.

유전적 면역화 방법을 사용하여 RG1을 발현하는 암세포에 대해 유도된 예방학적 또는 치료적 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응을 일으킬 수 있다. 본원에 기재된 RG1-코딩 DNA를 사용하여, RG1 폴리펩티드/면역원을 코딩하는 DNA 및 적절한 조절 서열을 포함하는 제작물을 개체의 근육 또는 피부에 직접 주사함으로써 근육 또는 피부의 세포가 상기 제작물을 받아들여 코딩된 RG1 폴리펩티드/면역원을 발현하도로록 할 수 있다. RG1 폴리펩티드/면역원은 세포 표면 폴리펩티드로서 발현되거나 분비될 수 있다. RG1 폴리펩티드/면역원의 발현은 전립선암에 대한 예방학적 또는 치료적 체액성 및 세포성 면역을 일으킨다. 당분야에 공지된 다양한 예방학적 및 치료적 유전면역화 기술을 사용할 수 있다 (검토를 위해서는 인터넷 주소 www.genweb.com에 공개된 정보 및 참조문헌을 참고함).

안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 벡터 및 라이보자임

rg1에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 합성 제조할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포 내로 들어가도록 보조할 수 있는 지질과 함께, 또는 상기 지질 없이 세포 내로 전달할 수 있다.

별법으로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 또는 백시니아 바이러스로부터, 또는 다양한 박테리아 플라스미드로부터 유래된 발현 벡터도 안티센스 rg1을 발현할 재조합 벡터의 제작 및 전달에 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Sambrook et al. (상기) and Ausubel et al. (상기))에 기재된 기술을 참조한다.

전장 cDNA 서열 및(또는) 그의 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 연구자로 하여금 유전자 기능의 조절을 위한 센스 가닥 (Youssoufian and Lodish, Mol. Cell. Biol. 13: 98-104, 1993) 및 안티센스 가닥 (Eguchi, et al., Annu. Rev. Biochem. 60: 631-652, 1991)에서 rg1 폴리뉴클레오티드를 연구 수단으로 사용할 수 있도록 한다. 이러한 기술은 현재 당분야에 잘 공지되어 있고, 센스 또는 안티센스 올리고머, 또는 보다 큰 단편은 코딩 또는 조절 영역을 따라 다양한 위치로부터 고안될 수 있다.

RG1을 코딩하는 유전자는 고농도의 원하는 rg1 폴리뉴클레오티드 단편을 발현하는 발현 벡터로 세포 또는 조직을 형질감염시킴으로써 턴오프 (turn off)시킬 수 있다. 이러한 제작물은 세포를 번역되지 않는 센스 또는 안티센스 서열로 충전시킬 수 있다. DNA 내로 삽입되지 않는 상태에서 조차도, 이러한 벡터는 모든 카피가 내생 뉴클레아제에 의해 분해될 때까지 RNA 분자를 계속 전사할 수 있다. 일시적 발현은 복제불능 벡터로 한달 이상 동안 지속시킬 수 있고, 적당한 복제 요소가 벡터 시스템의 일부인 경우에는 훨씬 더 오래 지속시킬 수 있다.

상술한 바와 같이, 유전자 발현의 변형은 rg1의 조절 영역, 즉, 프로모터, 인핸서 및 인트론에 대한 안티센스 분자, DNA 또는 RNA를 고안함으로써 달성할 수 있다. 전사 개시 부위, 예를 들어, 리더 서열의 -10과 +10 영역 사이로부터 유래된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 안티센스 분자는 전사체가 리보좀에 결합하지 못하도록 함으로써 mRNA의 번역을 막도록 고안할 수도 있다. 유사하게, 억제는 "삼중나선구조" 염기쌍형성 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 삼중나선구조 염기쌍형성은 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자의 결합을 위해 충분히 개방되는 이중나선구조의 능력을 떨어뜨린다. 삼중가닥 DNA를 사용한 최근 치료 방법은 문헌 [Gee, J. E. et al. (In Huber and Car, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994)]을 참조한다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다 (미국 특허 제4,987,071호; WO 93/23057). 리보자임 작용의 메카니즘은 리보자임 분자와 상보적 표적 RNA의 서열 특이적 혼성화 후, 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 수반한다. RG1를 코딩하는 RNA의 엔도뉴클레아제 절단을 특이적 및 효율적으로 촉매할 수 있는, 유전공학적으로 조작된 햄머헤드 모티프 (hammerhead motif) 리보자임 분자가 본 발명의 범위 내에 있다. 먼저, 임의의 잠재적 RNA 표적 내의 특정한 리보자임 절단 부위는 GUA, GUU 및 GUC 서열을 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 표적 분자를 스캐닝함으로써 확인한다. 일단 확인되면, 상기 절단 부위를 함유하는 표적 유전자의 영역에 상응하는 15 내지 20개의 리보뉴클레오티드로 구성된 짧은 RNA 서열은 올리고뉴클레오티드를 실시불가능하게 만들 수 있는 2차 구조적 특징에 대해 평가할 수 있다. 후보 표적의 적합성은 리보뉴클레아제 보호 분석을 사용하여 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 접근가능성을 시험함으로써 평가할 수도 있다 (Irie et al., Advance. Pharmacol. 40:207-257, 1997).

본 발명의 안티센스 분자 및 리보자임은 RNA 분자의 합성을 위한, 당분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법에는 고상 포스포르아미다이트 화학 합성과 같은, 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하기 위한 기술이 포함된다. 별법으로, RNA 분자는 시험관내 및 생체내 전사, 또는 RG1를 코딩하는 DNA 서열에 의해 생성될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 폴리머라제 프로모터를 사용하여 매우 다양한 벡터 내로 도입시킬 수 있다. 별법으로, 안티센스 RNA를 기본으로 또는 유도적으로 합성하는 안티센스 cDNA 제작물을 세포주, 세포 또는 조직 내로 도입할 수 있다.

RNA 분자는 세포내 안정성 및 반감기가 증가되도록 변형시킬 수 있다. 가능한 변형에는 플랭킹 서열을 분자의 5' 및(또는) 3' 말단에 부가하는 방법, 또는 포스포디에스터라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸을 분자의 골격 내에 사용하는 방법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 증가된 안정성은 이노신 및 쿠에오신과 같은 통상적이지 않은 염기뿐만 아니라, 내생 엔도뉴클레아제에 의해 용이하게 인식되지 않는 아세틸-, 메틸-, 티오-, 및 아데닌, 시티딘, 구아닌,티민 및 유리딘의 유사한 변형 형태를 포함시켜 달성할 수도 있다.

안티센스 벡터를 세포 또는 조직 내로 도입하는 방법에는 하기 논의되어 있고 생체내, 시험관내 및 생체외 요법에 동일하게 적합한 방법들이 포함된다. 생체외 요법의 경우, 안티센스 벡터는 환자로부터 얻은 세포 내로 도입하고 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,399,493호 및 제5,437,994호에 제시된 바와 같이 상기 환자 내로 다시 동종 이식하기 위해 클론 증식시킨다. 형질감염, 및 리포좀 또는 다른 지질 기재 또는 비-지질 기재 물질에 의한 전달은 당분야에 잘 공지되어 있다.

RG1에 결합하는 물질의 확인을 위한 분석

본 발명은 RG1에 결합하는 물질을 확인하는 데 사용할 수 있는 분석 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, RG1에 결합하는 물질은 RG1 리간드 또는 RG1에 결합하는 다른 물질이나 구성성분의 능력 및(또는) RG1의 활성을 억제/자극하는 능력에 의해 확인할 수 있다.

별법으로, RG1 폴리펩티드에 결합하는 물질은 효모 2-하이브리드 시스템 또는 결합 포획 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 효모 2-하이브리드 시스템에서, 두 개의 서브유닛 전사 인자 중 하나의 서브유닛 및 RG1 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 단위를 효모 세포에 도입하여 발현시킨다. 또한, 세포는 (1) 발현을 위해 두 가지 서브유닛 전사 인자를 필요로 하는 검출가능한 마커를 코딩하는 발현 단위 및 (2) 전사 인자의 제2 서브유닛 및 클로닝된 DNA 단편으로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 발현 단위를 함유하도록 변형시킨다. 클로닝된 DNA단편이 RG1 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 코딩하는 경우, 발현은 RG1과 코딩된 단백질을 상호작용시킨다. 이것은 전사 인자의 두 서브유닛이 근접 결합할 수 있게 하여 전사 인자를 재구성시킨다. 이는 검출가능한 마커를 발현시킨다. 효모 2-하이브리드 시스템은 RG1의 세포성 결합 파트너에 대한 cDNA 코딩 단편의 라이브러리를 스크리닝하는 데 특히 유용하다.

상기 분석에 사용할 수 있는 RG1 폴리펩티드에는 단리된 RG1 폴리펩티드, RG1 폴리펩티드의 단편, RG1 폴리펩티드를 발현하도록 변형시킨 세포, 및 RG1 폴리펩티드를 발현하도록 변형시킨 세포의 분획이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, RG1 폴리펩티드는 전체 RG1 폴리펩티드이거나 RG1 폴리펩티드의 특정 단편일 수 있다. 예를 들어, 결합하는 물질에 대해 RG1 폴리펩티드를 분자량 또는 활성에 있어서의 변동에 의해 분석할 수 있는 한, 본 발명의 분석을 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

물질/세포 성분이 RG1 폴리펩티드에 결합하는지를 확인하는 데 이용하는 방법은 주로, 사용된 RG1 폴리펩티드의 성질을 기초로 할 것이다. 예를 들어, 겔 지연 분석을 이용하여 물질이 RG1 또는 그의 단편에 결합하는지를 확인할 수 있다. 별법으로, 면역보호 및 바이오칩 기술을 채택하여 RG1 폴리펩티드와 함께 이용할 수 있다. 당업자는 특정한 물질이 RG1 폴리펩티드에 결합하는지를 확인하기 위한, 당분야에 공지된 수많은 기술을 쉽게 사용할 수 있다.

또한, 세포 무함유 분석 시스템 또는 세포 분석 시스템을 사용하여 RG1 폴리펩티드의 활성을 조절하는 능력에 대해 물질 및 세포 성분을 시험할 수 있다. RG1폴리펩티드의 활성이 더 많이 정의되기 때문에, 확인된 활성을 기초로 한 기능적 분석을 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 물질이 RG1 활성을 감소시키는 경우, 이 물질은 RG1 활성을 길항한다고 말한다. 바람직한 길항제는 임의의 다른 세포 단백질에 영향을 주지 않으면서 RG1을 선택적으로 길항할 것이다. 또한, 바람직한 길항제는 50% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 모든 RG1 활성을 제거함으로써 RG1 활성을 감소시킬 것이다.

상기 방법에서 분석되는 물질은 무작위적으로 선택되거나 합리적으로 선별되거나 또는 고안될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 물질이 RG1 폴리펩티드의 특정한 서열을 고려하지 않고 무작위적으로 선택되는 경우, 이 물질은 무작위적으로 선택된다고 말한다. 무작위적으로 선택된 물질의 예는 화학적 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리, 또는 유기체 또는 식물 추출물의 생장 브로쓰의 사용이다.

본원에 사용된 바와 같이, 물질이 물질의 작용과 관련하여 특정 부위의 서열 및(또는) 그의 입체구조를 고려하는 비-무작위적 기준을 기초로 하여 선택되는 경우, 이 물질은 합리적으로 선별되거나 고안된다고 말한다. RG1 폴리펩티드를 구성하는 펩티드 서열을 사용함으로써 물질을 합리적으로 선별하거나 합리적으로 고안할 수 있다. 예를 들어, 합리적으로 선별된 펩티드 물질은 아미노산 서열이 RG1 폴리펩티드의 단편과 동일한 펩티드일 수 있다.

본 발명의 방법에서 시험된 물질은 예를 들어, 펩티드, 항체, 올리고뉴클레오티드, 소분자 및 비타민 유도체뿐 아니라 탄수화물일 수 있다. 당업자는 본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 물질의 구조적 성질에 대한 제한이 없다는 것을 쉽게 인식할 수 있다. 본 발명의 물질들 중 한 클래스는 아미노산 서열이 RG1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기준으로 선택된 펩티드 물질이다.

펩티드 물질은 당분야에 공지된 바와 같이 표준 고상 (또는 용액상) 펩티드 합성 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 이들 펩티드를 코딩하는 DNA는 시판되는 올리고뉴클레오티드 합성 수단을 사용하여 합성하고 표준 재조합 생산 시스템을 사용하여 재조합 생산할 수 있다. 고상 펩티드 합성을 이용한 생산은 유전자에의해 코딩되지 않은 아미노산을 포함시켜야 할 경우 필요하다.

본 발명의 또 다른 클래스의 물질은 RG1 폴리펩티드의 임계적 위치와 면역반응하는 항체이다. 상술한 바와 같이, 항체는 항체가 표적으로 삼고자 한 RG1 폴리펩티드의 부위를 항원성 영역으로서 함유하는 펩티드로 적당한 포유동물 대상체를 면역화시킴으로써 수득한다. 이러한 물질은 제2 생성 억제제를 확인하기 위해서 일뿐 아니라 RG1 활성을 차단하기 위한 경쟁 결합 연구에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 시험된 세포 추출물은 예를 들어, 세포 또는 조직의 수성 추출물, 세포 또는 조직의 유기 추출물, 또는 부분 정제된 세포 분획일 수 있다. 당업자는 본 발명의 스크리닝 방법에 사용된 세포 추출물의 공급원에 대한 제한이 없음을 용이하게 인식할 수 있다.

RG1 항체와 같은, RG1 폴리펩티드에 결합하는 물질은 RG1의 활성을 조절하는 데, 항암제를 적당한 포유동물 세포에 표적화시키는 데, 또는 RG1과의 상호작용을차단하는 물질을 확인하는 데 사용할 수 있다. RG1을 발현하는 세포는 RG1에 결합하는 물질을 사용하여 표적화하거나 확인할 수 있다.

RG1 결합제를 사용하는 방법은 RG1 결합제의 성질에 달려 있다. 예를 들어, RG1 결합제는 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 리신 또는 슈도모나스 외독소와 같은 결합되어 있는 독소를 RG1 발현 세포에 전달하는 데; RG1의 활성을 조절하는 데; RG1 발현 세포를 직접 사멸시키는 데; 또는 경쟁적 결합제를 동정하기 위한 스크리닝에 사용할 수 있다. 예를 들어, RG1 억제제는 RG1 발현 세포의 생장을 직접 억제하는 데 사용할 수 있는 반면, RG1 결합제는 진단제로서 사용할 수 있다.

제약 조성물 및 투여

본 발명은 rg1 폴리뉴클레오티드, RG1 폴리펩티드, 항체, 아고니스트, 길항제, 또는 억제제를 단독으로, 또는 생리식염수, 완충된 생리식염수, 덱스트로스 및 물을 포함하나 이에 제한되지 않은 임의의 생체적합성 제약학적 멸균 담체 중에서 투여될 수 있는 안정화 화합물과 같은 1종 이상의 다른 물질과 함께 포함할 수 있는 제약 조성물에 관한 것이다. 이들 임의의 분자가 부형제(들) 또는 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합된 제약 조성물 중의 상기 분자를 단독으로, 또는 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 함께 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약학적으로 허용되는 담체는 제약학적으로 불활성이다.

또한, 본 발명은 제약 조성물의 투여에 관한 것이다. 이러한 투여는 경구 또는 비경구적으로 달성한다. 비경구 전달 방법에는 국소, 동맥내 (종양으로 직접 투여), 근육내, 피하, 수질내, 초내, 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여가포함된다. 활성 성분 이외에, 이들 제약 조성물은 활성 화합물을 제약학적으로 사용할 수 있는 제제 내로 용이하게 가공시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 제약학적으로 허용되는 적당한 담체를 함유할 수 있다. 제형화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가 정보는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)의 최종 개정판에서 찾을 수 있다.

경구 투여용 제약 조성물은 당분야에 잘 공지된 제약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 경구 투여에 적합한 투여량으로 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물이 환자가 섭취할 수 있는 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액상제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액제 등으로 제형화되도록 한다.

경구 사용을 위한 제약 제제는 활성 화합물을 고상 부형제와 배합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공한 후, 원하는 경우 적당한 보조제를 투여하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 얻을 수 있다. 적당한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예를 들어, 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당; 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물로부터 얻은 전분; 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스; 및 아라비아 검 및 트라가칸스를 비롯한 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질이다. 원하는 경우, 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어, 알긴산나트륨과 같은 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.

당의정 코어는 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및(또는) 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매혼합물도 함유할 수 있는 농축된 당용액과 같은 적당한 코팅제와 함께 제공된다. 염료 또는 색소를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가하여 생성물을 확인하거나 활성 화합물의 양, 즉 투여량의 특징을 규명할 수 있다.

경구 사용할 수 있는 제약 제제에는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트 (push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅제로 만들어진 밀봉된 캡슐이 포함된다. 푸쉬-피트 캡슐은 락토스 또는 전분과 같은 충전제 또는 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐의 경우, 활성 화합물은 안정화제와 함께, 또는 안정화제 없이 지방유, 액상 파라핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 액체에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.

비경구 투여용 제약 제제에는 활성 화합물 수용액이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 제약 조성물은 수용액, 바람직하게는 행크액 (Hank's solution), 링거액 (Ringer's solution) 또는 생리학적으로 완충된 생리식염수와 같은 생리학적으로 상용가능한 완충액 중에서 제형화할 수 있다. 주사용 수성 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 경우에 따라 주사용 유성 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적당한 친지질성 용매 또는 비히클에는 참깨유와 같은 지방유, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르 및 리포좀이 포함된다. 임의로, 현탁액은 적당한 안정화제 또는, 매우 농축된 용액의 제조가 가능하도록 화합물의 용해도를 증가시키는 물질을 함유할 수도 있다.

국소 또는 비강 투여의 경우, 투과될 특정한 장벽에 적합한 침투제를 제형화에 사용한다. 이러한 침투제는 당분야에 일반적으로 공지되어 있다.

키트

본 발명은 상기 본 발명의 조성물의 성분 중 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 및 키트에 관한 것이다. 제약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기관이 정하는 형태의 통지 (인간 투여용 제품의 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영함)가 이러한 용기(들)에 부착되어 있을 수 있다.

제조 및 저장

본 발명의 제약 조성물은 당분야에 공지된 방식, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 수파 (빻기), 유화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조 과정을 통해 제조할 수 있다.

제약 조성물은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지 않은 산으로 형성시킨 염으로서 제공할 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 기타 양성자성 용매 중에서 더 잘 용해되는 경향이 있다. 다른 경우, 바람직한 제제는 사용전 완충액과 혼합되는 1 mM - 50 mM 히스티딘, 0.1% - 2% 수크로스, 2% - 7% 만니톨 (pH 범위: 4.5 내지 5.5) 중의 동결건조 분말일 수 있다.

허용되는 담체 중에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을제조한 후, 조성물을 적당한 용기에 넣고 표시된 증상의 치료에 사용할 수 있다는 표지를 붙일 수 있다. RG1을 투여하는 경우, 이러한 표지는 투여량, 투여 빈도 및 투여 방법을 포함할 것이다.

치료 유효량

본 발명에 사용하기에 적합한 제약 조성물에는 의도한 목적, 즉, RG1 발현을 특징으로 하는 특정한 질환 상태의 치료를 달성하기에 효과적인 양으로 활성 성분을 함유하는 조성물이 포함된다. 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다.

임의의 화합물의 경우, 먼저, 치료 유효량은 세포 배양 분석, 예를 들어, 종양 세포, 또는 동물 모델, 통상적으로 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 측정할 수 있다. 또한, 동물 모델은 바람직한 투여 농도 범위 및 투여 경로를 달성하는 데 사용한다. 그 다음으로, 이러한 정보는 인간에 있어서 유용한 투여량 및 투여 경로를 결정하는 데 사용할 수 있다.

치료 유효량이란 증상 또는 상태를 호전시키는 단백질 또는 그의 항체, 길항제 또는 억제제의 양을 말한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성, 예를 들어, ED₅₀(집단의 50%에서 치료 효과가 있는 투여량) 및 LD₅₀(집단의 50%에 치명적인 투여량)는 세포 배양물 또는 실험용 동물에서 표준 제약학적 방법으로 측정할 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이고, 비율 ED₅₀/LD₅₀로 표현할 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간이 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 사용한다. 이러한 화합물의 투여량은 독성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않으면서 ED₅₀를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 제형, 환자의 민감도 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 것이다.

정확한 투여량은 치료할 환자의 관점에서 주치의가 선택할 것이다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 잔기를 제공하거나 원하는 효과를 유지하도록 조절한다. 고려할 수 있는 다른 인자에는 질환 상태의 심각도, 예를 들어, 악성종양 크기 및 위치; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식사, 투여 시간 및 투여 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도, 및 치료요법에 대한 내성/반응이 포함된다. 장기간 작용하는 제약 조성물제약 조성물반감기 및 제거율에 따라 3 내지 4일마다, 매주마다, 또는 2주마다 투여한다.

정상 투여량은 투여 경로에 따라, 0.1 내지 100,000 마이크로그램, 최대 총 투여량 약 1 g으로 다양할 수 있다. 특정한 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌 (예를 들어, 미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 또는 제5,225,212호)에 기재되어 있다. 당업자는 단백질 또는 그의 억제제보다는 폴리뉴클레오티드의 경우 다양한 제제를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정한 세포, 증상, 위치 등에 특이적일 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 기재된다. 실시예는 특정한 실시양태와 관련하여 본 발명을 설명하기 위해서만 제공된다. 본 발명의 일부 특정한 측면을설명하는 이들 예시는 개시된 본 발명의 범위를 제한하거나 한정하지 않는다.

모든 실시예는 달리 상세히 기재하지 않는 한 당업자에 잘 공지되어 있는 관례적인 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 하기 실시예의 관례적인 분자 생물학 기술은 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)과 같은 표준 실험실 메뉴얼에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.

<실시예 1>

인간 rg1 폴리뉴클레오티드의 동정

rg1은 인사이트 라이프세크 (Incyte's LifeSeq) 데이타베이스를 스크리닝함으로써 전립선에서 발현되는 유전자로서 동정하였다. 뉴클레오티드 서열은 이 데이타베이스를 찾기 위해 인사이트 (Incyte)에 의해 제공된 "단백질 기능" 수단을 사용하여 데이타베이스의 주석을 검색함으로써 확인하였다. 뉴클레오티드 서열은 주석을 달은 데이타베이스 중 세포 부착 분자의 카테고리에서 발견하였고 f-스폰딘의 상동체로서 기재하였다. 데이타베이스의 라이브러리 셋트에서 rg1 폴리뉴클레오티드 서열의 분포에 대한 전자 노던 분석은 rg1이 전립선 라이브러리에서 고농도로 발현되고 정상 및 악성종양 조직으로부터의 라이브러리를 비롯한 다른 수많은 조직 라이브러리에서 저농도로 발현됨을 나타내었다.

데이타베이스에서 rg1 클론 셋트를 인접하는 폴리뉴클레오티드 서열로 조립하고 인접하는 서열을 편집한 후, 전장 코딩 서열을 예상된 조립 폴리뉴클레오티드에서 확인하였다. 이 서열은 f-스폰딘 및 민딘-2에 상동성인 단백질을 코딩한다.

실험용 인사이트 클론 1640796, 1712252 및 1880265은 인사이트로부터 얻었고, 클론 3360733은 대부분의 5' 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것으로 확인되었다. 이 클론은 완전히 시퀀싱되었고 예상된 RG1 단백질에 대한 완전 코딩 서열을 함유하였다. 이 서열은 도 1 (서열 1)에 기재되어 있다.

<실시예 2>

Rg1 mRNA 발현

정상 및 악성종양 조직으로부터 얻은 다양한 샘플 및 세포주에서의 rg1 mRNA의 발현은 택만 (Taqman) 분석 (Perkin-Elmer)을 사용하여 반-정량 PCR에 의해 측정하였다. 변형된 글리슨 (Gleason) 분립 시스템에 따라 분립된 전립선 정상 조직 샘플, 양성종양 조직 샘플 및 악성종양 조직 샘플은 스탠포드 의과 대학의 비뇨기과로부터 얻었다. RNA는 표준 방법에 의해 이들 조직으로부터 단리하였다. 다른 악성종양 및 정상 조직으로부터 단리된 RNA는 클론텍 (Clonetech) 및 바이오카인 (Biochain)을 비롯한 시판회사로부터 구입하였다. 전립선 악성종양 세포주 (PC-3, LNCaP 및 DU145)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 얻었고 혈청 함유 배지를 사용하여 표준 방법으로 배양물 중에서 증식시켰다. 이들 세포주로부터 유래된 이종이식 악성종양은 누드 마우스에서 확립하였고 착상한지 대략 4 내지 6주 후 마우스로부터 모았다. RNA는 표준 방법으로 악성종양으로부터 단리하였다.

택만 기재 PCR 분석은 프라이머 CGC GCA TAG CTC CGA CTA C (서열 3)와 GCCGCG TCC GCA AAG (서열 4), 및 택만 프로브: 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (서열 5)를 사용하여 수행하였다.

이들 프라이머 및 프로브는 퍼킨 엘머의 프라이머 발현 소프트웨어를 사용하여 설계하고 합성 유전학에 의해 합성하였다. PCR 반응은 30-40 주기 동안 수행하고 전립선 RNA를 사용하여 정량함으로써 상대적인 비교를 위한 표준 곡선을 만들었다. 이 분석은 rg1 mRNA가 전립선에서 가장 풍부하고 여러 다른 조직에서 상당히 낮은 수준으로 검출된다는 것을 입증하였다 (도 5 참조).

<실시예 3>

BHK 세포에서의 RG1의 클로닝 및 발현

RG1 코딩 영역은 인사이트 플라스미드 3360733로부터 얻었다. 코딩 서열은 1 x Pfu 터보 폴리머라제 완충액 (Stratagene, La Jolla, CA)/200 μM dNTP/0.2 μM 올리고뉴클레오티드 프라이머/2.5 U Pfu 터보 폴리머라제 (Strategene)를 사용하여 표준 PCR 반응에서 프라이머 SST115 (5'-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3') (서열 6) 및 SST113 (5'-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3') (서열 7)로 PCR 증폭시켰다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분, (95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분) X 35, 72℃에서 7분. 생성된 PCR 증폭 생성물은 QIAquick PCR 컬럼 (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 정제하고, Xbal 및 PmlI 제한효소로 절단하여 1010 bp 단편을 얻고, BIO 101 진클린 키트 (GeneClean Kit; Vista, CA)를 사용하여 상기 1010 bp 단편을 1% 아가로스 겔로부터 정제하였다. 정제된 단편은 XbaI 및 PmII으로 절단된 세포변성 신드비스 발현 벡터 pSINrep21 (Agapov et al, 1998, PNAS 95: 12989-12994)에 라이게이션시키고 (에피시엔트리 패스트 링크 키트 (Epicientre Fast Link Kit; Epicenter, Madison, WI)를 사용함), DH5 알파 컴피턴트 (competent) 세포 (Life Technologies, Gaithersburg, CA)내로 형질전환시키고, 앰피실린 (100 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 한 개의 앰피실린 내성 콜로니를 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생장시키고 서열 분석한 결과, 상기 콜로니는 삽입된 RG1 코딩 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 플라스미드를 pPEG6로 지칭하였다.

2 마이크로그램의 pPEG6은 제조자의 설명서에 따라 리포펙타민 플러스 시약 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하여 1-3 x 10⁵소 햄스터 신장 세포 (BHK)를 형질감염시키는 데 사용하였다. 형질감염 후, 세포를 24시간 내지 48시간 동안 DMEM + 태아 혈청 중에서 인큐베이션하고, 24-48시간이 지난 시점에서 세포를 1 내지 10회 분할시키고, 푸로마이신 (최종 농도 2.5 ㎍/ml) 및 혈청 함유 DMEM을 첨가하여 플라스미드 함유 세포의 선별을 개시하였다. 세포가 전면생장한 후 (푸로마이신을 첨가한지 4-5일 후), 세포를 PBS로 세척하고 1 내지 10회 분할하고, 혈청 및 5 ㎍/ml의 푸로마이신이 함유된 DMEM 배지를 첨가하였다. 추가 2-3일 후, 배지를 혈청이 없는 DMEM 및 5 ㎍/ml 푸로마이신으로 바꾸고, 2-3일 동안 생장시키고, RG1 항체를 사용한 웨스턴 분석으로 배지 중의 RG1 단백질의 존재를 검출하였다. RG1 단백질은 1 ㎍/ml의 농도로 검출되었다.

<실시예 4>

항체 생성

RG1 단백질 서열로부터 유래된 5 가지 합성 폴리펩티드 서열에 대한 토끼 폴리클로날 항혈청을 생성시켰다. 표면 에피토프를 인식할 수 있는 항혈청을 생성시키기 위해 상기 서열을 선택하였는데, 이는 상기 서열의 예상된 위치가 단백질 표면이기 때문이다. 합성을 보조하기 위해 시스테인 잔기를 아미노부티르산 (Abu)으로 대체하였다. 상기 5가지 펩티드의 특정한 아미노산 서열, RG1 단백질 상의 위치 및 명칭은 아래에 나열되어 있다.

명칭위치아미노산 서열

1C28-46PLGGESICSAGAPAKYSIT (서열 8)

2C 46-64 TFTGKWSQTAFPKQYPLFR (서열 9)

3C 77-91 HSSDYSMWRKNQYVS (서열 10)

4C 188-210 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (서열 11)

5C 263-274 NEIVDSASVPET (서열 12)

펩티드를 면역원으로 사용하기 위해, 추가 카르복실-말단 시스테인을 통해 펩티드를 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH)에 공유결합 커플링시켰다. 유사하게, ELISA를 통해 항혈청 역가를 분석하기 위해 소 혈청 알부민 (BSA) 컨쥬게이트를 제조하였다.

두 마리 동물을 각 펩티드로 면역화시켰다. 초기 면역화는 프로인트 완전 면역보강제 (0.5 mg/동물) 중에서 수행한 후, 근육내 투여된 프로인트 불완전 면역보강제 중의 0.25 mg/동물로 3주 간격으로 부스팅하였다. 정기적 시험 채혈을 수행하고, 특정한 BSA-펩티드 컨쥬게이트에 대한 항체 역가를 ELISA로 측정하고 면역화 전의 혈청과 비교하였다. 펩티드 1C 및 3C에 대한 항혈청은 활성인 것으로 밝혀졌다. 펩티드 2C에 대한 항혈청은 RG1 폴리펩티드를 인식하지 못하였다. 펩티드 4C 및 5C에 대한 항혈청은 시험하지 않았다.

RG1에 대한 인간 모노클로날 항체는 형질전환 마우스를 대장균 (E. coli)에서 발현된 RG1 펩티드 및 6-히스티딘-태깅 RG1 융합 단백질로 면역화시킴으로써 생성시켰다. 이들 동물의 비장세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 만들었다. RG1 펩티드 및 단백질에 대해 유도된 항체를 생산하는 하이브리도마를 ELISA로 스크리닝하였다.

<실시예 5>

항체의 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯팅을 통해 항혈청을 RG1 특이성에 대해 시험하였다. RG1 특이적 항혈청 (상기 서열 1C 및 3C에 대해 생성된 항혈청)은 COS 세포에서 일시적으로 발현된 RG1, LNcaP 세포로부터 분비된 천연 RG1, 및 형질감염된 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK)로부터 생산된 RG1에 대해 시험하였다. RG1-특이적 항혈청은 LNCaP 악성종양, LNCaP 세포, PC3 악성종양, PC3 세포 및 인간 전립선 악성종양의 여러 임상적 샘플로부터 제조된 세포용해물에 대해 시험하였다. 세포 및 조직을 디터전트 완충액 중에서 용해시켰다. 세포용해물을 5분 동안 끓인 후, 상기 각 세포용해물 10 ㎕를 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하여 단백질을 분석하였다. 이어서, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. RG1 항체의 결합 특이성은 동종 및 이종 펩티드의 존재하의 결합에 의해 검증되었다. RG1-특이적 항혈청은 PC-3 세포 및 PC-3 악성종양을 제외한 모든 샘플에서 단백질을 검출할 수 있었다.

<실시예 6>

LNCaP 세포로부터 분비된 천연 RG1 단백질의 정제

배지에서 생장된 LNCaP 세포를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과 상기 LNCaP 세포가 천연 RG1 단백질을 분비하는 것으로 밝혀졌다. 천연 단백질을 정제하기 위해, 세포를 혈청이 없는 배지에서 48시간 동안 생장시켰다. 이 혈청이 없는 컨디셔닝 배지를 모으고 원심분리하여 임의의 세포를 제거하고, 초여과하여 대략 50배까지 농축하였다. 그 다음으로, 농축된 배지를 20 mM의 아세트산나트륨 완충액 (pH 6.5)으로 10배 희석하고 Q-세파로스 음이온 교환 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼 용출액은 2.0 ml의 분획을 모으면서 염화나트륨 구배 (분당 0.5%)로 구성되어 있었다. 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE로 측정시 RG1 단백질은 대략 75 mM NaCl에서 용출되었다. 천연 RG1 단백질은 박테리아에서 발현된 6-히스티딘-RG1 융합 단백질보다 다소 더 낮은 분자량에서 이동하였는데, 이는 천연 RG1 단백질에 융합 펩티드가 없기 때문인 것으로 추측된다.

<실시예 7>

RG1 발현의 면역조직화학적 염색

RG1 단백질의 발현은 신장, 폐, 췌장, 근육, 뇌 및 전립선을 비롯한 다양한 인간 조직에서 라이프스판 바이오사이언스 인크. (LifeSpan Biosciences, Inc.)에의해 측정하였다. 전립선 조직은 스탠포드 의과 대학 비뇨기과로부터 추가로 얻었고, 버렉스 (Berlex)에서 시험하였다. 표준 방법을 사용하여 조직 절편으로부터 파라핀을 제거하였다. 폴리클로날 항체 RG1-3C는 일차 항체로서 사용하였고, 검출 시스템은 벡터 적색 기질 키트 (Sk5002)와 함께 벡터 ABC-AP 키트 (AK5002)를 사용하는 것으로 구성되어 있었다. 음성 대조구로서, 일차 항체의 부재하에 염색을 수행하였다.

상기 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허는 본원에 참고로 도입되어 있다. 본 발명이 그의 특정 실시양태에 대해 기재되어 있지만, 당업자는 본 발명의 진정한 진의 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양하게 변화시킬 수 있고 동등물로 대체할 수 있다. 또한, 특정한 상황, 물질, 생성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목표, 진의 및 범주에 적용하도록 많이 변형시킬 수 있다. 이러한 모든 변형은 본원에 첨부된 청구범위 내에 있는 것이다.

Claims (43)

1. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

   (b) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

   (c) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및

   (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드

   로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항에 있어서, 게놈 DNA인 폴리뉴클레오티드.
5. 제2항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 1 내지 331을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제2항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제2항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제1항에 있어서, 도 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 (서열 1)의 1 내지 1770을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제1항에 있어서, 도 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 (서열 1)의 296 내지 1291을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
10. 제1항에 있어서, 도 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 (서열 1)의 356 내지 1291을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
11. 제1항에 있어서, 도 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 (서열 1)의 374 내지 1291을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
12. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
13. 제12항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
14. 제13항의 숙주 세포로부터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
15. 제14항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 1 내지 331을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
16. 제14항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
17. 제14항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
18. (a) 제13항의 숙주 세포를 도 2에 나타낸 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 배양하는 단계, 및

    (b) 상기 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계

    를 포함하는, 상기 폴리펩티드의 제조 방법.
19. 제12항의 벡터를 사용하여 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 유전적으로 조작하는 것을 포함하는, 상기 세포의 생산 방법.
20. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편,

    (b) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드,

    (c) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드,

    (d) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 28 내지 46을 포함하는 폴리펩티드,

    (e) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 77 내지 91을 포함하는 폴리펩티드, 및

    (f) 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리펩티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리펩티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
21. 제20항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 1 내지 331을 포함하는 폴리펩티드.
22. 제20항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드.
23. 제20항에 있어서, 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드.
24. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편,

    (b) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 28 내지 46을 포함하는 폴리펩티드,

    (c) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 77 내지 91을 포함하는 폴리펩티드,

    (d) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 188 내지 210을 포함하는 폴리펩티드,

    (e) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 263 내지 274를 포함하는 폴리펩티드, 및

    (f) 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리펩티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리펩티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로결합하는 단리된 항체 또는 항체 단편.
25. 제24항에 있어서, 아미노산 서열 PLGGESICSAGAPAKYSIT (서열 8)에 특이적으로 결합하는 항체.
26. 제24항에 있어서, 아미노산 서열 HSSDYSMWRKNQYVS (서열 10)에 특이적으로 결합하는 항체.
27. 제24항에 있어서, 아미노산 서열 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (서열 11)에 특이적으로 결합하는 항체.
28. 제24항에 있어서, 아미노산 서열 NEIVDSASVPET (서열 12)에 특이적으로 결합하는 항체.
29. 제24항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
30. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
31. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편,

    (b) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드,

    (c) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드,

    (d) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 28 내지 46을 포함하는 폴리펩티드,

    (e) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 77 내지 91을 포함하는 폴리펩티드,

    (f) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 188 내지 210을 포함하는 폴리펩티드,

    (g) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 263 내지 274를 포함하는 폴리펩티드, 및

    (h) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)의 폴리펩티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리펩티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항체 단편과 이에 결합된 치료제를 포함하는 면역결합체.
32. 제31항에 있어서, 치료제가 세포독성제인 면역결합체.
33. 제32항에 있어서, 세포독성제가 리신, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티듐 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE) A, PE40, 리신, 아브린, 글루코코르티코이드 및 방사성동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역결합체.
34. 제31항에 있어서, 항체 단편이 Fv, F(ab') 및 F(ab')₂단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역결합체.
35. 제31항의 면역결합체의 치료제가 도 2의 폴리펩티드 (서열 2)를 발현시키는 세포를 파괴시킬 수 있도록 상기 면역결합체를 상기 세포와 반응시키는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 선택적으로 파괴하는 방법.
36. 치료 유효량의 제31항의 면역결합체를 RG1의 발현과 관련된 질병 증상이 있는 사람 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병 증상의 치료 방법.
37. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편, 및

    (b) 상기 (a) 폴리펩티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리펩티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 수준을 저하시킬 필요가 있는, RG1의 부적절한 발현과 관련된 질병 증상이 있는 사람 환자에게 상기 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 특이적으로 절단하는 치료 유효량의 리보자임을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병 증상의 치료 방법.
38. 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 갖는 폴리펩티드의 수준을 저하시킬 필요가 있는, RG1의 부적절한 발현과 관련되는 질병 증상이 있는 사람 환자에게 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부와 상보적인 치료 유효량의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병 증상의 치료 방법.
39. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편,

    (b) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 21 내지 331을 포함하는 폴리펩티드,

    (c) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 27 내지 331을 포함하는 폴리펩티드,

    (d) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 28 내지 46을 포함하는 폴리펩티드,

    (e) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 77 내지 91을 포함하는 폴리펩티드,

    (f) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 188 내지 210을 포함하는 폴리펩티드,

    (g) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)의 263 내지 274를 포함하는 폴리펩티드, 및

    (h) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)의 폴리펩티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리펩티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 존재에 대해 숙주로부터 유도되는 샘플을 분석하는 것을 포함하는 진단 방법.
40. 제39항에 있어서, 샘플을 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제24항의 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계 및 샘플 중의 항체와 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
41. (a) 도 2에 기재된 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적 또는 면역학적으로 활성인 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및

    (b) 상기 (a) 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와의 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 존재에 대해 분석하는 것을 포함하는 진단 방법.
42. (a) 대상으로부터 조직 및(또는) 체액 샘플을 얻는 단계,

    (b) 상기 샘플을 제24항의 항체와 접촉시키는 단계, 및

    (c) 샘플 중의 상기 항체와 도 2 (서열 2)의 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계

    를 포함하는, 대상에서 상기 폴리펩티드와 관련된 전이를 진단하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성하도록 항체를 방사성표지, 효소, 발색단 (chromophore) 및 형광물질 (fluorescer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물로 표지하는 방법.