SK286384B6

SK286384B6 - Izolované protilátky alebo fragmenty protilátok špecificky viažucich polypeptidy RG1, ich imunokonjugát a ich použitie

Info

Publication number: SK286384B6
Application number: SK848-2002A
Authority: SK
Inventors: Richard Harkins; Deborah Parkes; Gordon Parry; Douglas W. Schneider; Renate Steinbrecher
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2008-08-05
Also published as: CA2394574A1; HRP20020549B1; RO122543B1; HUP0204224A3; PT1237915E; RS50831B; US20090292112A1; EP1237915B1; EE05293B1; KR20020065575A; WO2001044291A3; US7307154B2; HU229001B1; RU2283130C2; LT2002070A; NO20022836L; US6682902B2; MXPA02005914A; US20040152139A1; ZA200205638B

Abstract

Sú opísané protilátky vysoko selektívne pre polypeptidy RG1 alebo fragmenty týchto protilátok, ktoré je možné využiť na diagnostiku a/alebo detekciu expresie RG1, ktorá by mohla byť spojená s rakovinou prostaty. Ďalej sú opísané imunokonjugáty zahrnujúce izolovanú protilátku alebo jej fragment konjugovaný s terapeuticky účinnou látkou určené na selektívnu deštrukciu bunky, ako aj terapeutické a diagnostické použitie uvedených protilátok a imunokonjugátov.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka jednak novo identifikovaných polynukleotidov a polypeptidov; variantov a derivátov týchto polynukleotidov a polypeptidov; spôsobov prípravy týchto polynukleotidov a polypeptidov, ich variantov a derivátov; protilátok proti týmto polypeptidom, ich variantom a derivátom a tiež použitia týchto polynukleotidov a polypeptidov, ich variantov, derivátov a protilátok proti nim. Predkladaný vynález sa konkrétne týka nových ľudských polypeptidov extracelulámeho matrixu (označených ako RG1), polynukleotidov, ktoré tieto polypeptidy kódujú, protilátok proti týmto polypeptidom aprotismemým („antisense“) polynukleotidom blokujúcim expresiu RG1.

Doterajší stav techniky

Rakovina prostaty je často sa vyskytujúce ochorenie u mužov, ktorým je postihnutá asi tretina mužov do 45 rokov. Dokázalo sa, že jej vznik súvisí tak s genetickými vplyvmi, ako aj s vplyvmi prostredia, pričom väčšina prípadov je výsledkom kombinácie oboch týchto faktorov. Štúdie rodinného výskytu tejto choroby naznačili, že genetická predispozícia má úlohu asi u 5 - 10 % všetkých prípadov rakoviny prostaty a u okolo 45 % prípadov u mužov mladších ako 55 rokov.

Dokázalo sa, že k vzniku rakoviny prostaty dochádza vo viacerých krokoch, pričom jednou z prekurzorových lézií je prostatická intraepitelová neoplázia (PIN). Skoré štádiá choroby sú závislé od androgénu, zatiaľ čo neskoršie fázy sú od tohto hormónu nezávislé. Často je klinicky zistená proliferačná porucha prostaty známa ako benígna prostatická hyperplázia, ale zrejme nie je jedným z vývojových Štádií rakoviny. S výskytom rakoviny prostaty je však často spojená. Pri rakovine prostaty je častý výskyt viacerých ložísk, obvyklý je pomalý rast a heterogenita nádorov. V neskorších štádiách dochádza k častému výskytu metastáz v lymfatických uzlinách a v kostiach.

Rakovina prostaty sa obvykle diagnostikuje pri bežnom fyzikálnom vyšetrení a ďalej na základe zvýšenej hladiny prostatického špecifického antigénu (PSA) v sére. Pri lokalizovanej chorobe je optimálnou liečbou radikálna prostatektómia. Pokročilá metastatická choroba sa obvykle lieči potlačením výskytu androgénu orchektómiou alebo liečbou pomocou GnRH (hormón uvoľňujúci gonadotropín), alebo antiandrogénnou liečbou. V pokročilých štádiách sa však choroba stáva rezistentnou na tento hormón a rozvinutá choroba nie je liečiteľná. Navyše tak radikálna prostatektómia, ako liečba potlačením výskytu androgénu má závažné vedľajšie účinky. Medzi ne patrí vysoké riziko inkontinencie a impotencie spojené s radikálnou prostatektómiou a lámavosť kostí a osteoporóza spojená s androgénovou ablačnou liečbou.

Je preto potrebné nájsť nové terapeutické spôsoby na liečbu včasných aj neskorých štádií rakoviny prostaty. Je tiež potrebné získať nové diagnostické prostriedky, najmä prostriedky, ktorými by bolo možné rozpoznať rôzne štádiá tejto choroby, pretože je tým výrazne ovplyvnený výber liečebných spôsobov. Napr. pokiaľ choroba prekročí hranice prostaty a metastázuje do lymfatických uzlín, radikálna prostatektómia sa neuskutočňuje, pretože spôsob choroby nezastaví, ale môže mať nežiaduce vedľajšie účinky. Prostriedok, ktorým by bolo možné zistiť výskyt metastáz in vivo, by teda bol veľmi významný.

Pri rakovine prostaty boli zaznamenané zmeny v expresii špecifických proteínov, vrátane expresie p53 v neskorších štádiách tejto choroby, znížené hladiny receptorov pre TGF-0, znížené hladiny E-cadherinu, C-Cam (bunková adhezívna molekula) a niekoľkých rôznych integrínov. Expresia onkogénu bcl-2 je pri neskorých nádoroch závislých od androgénu výrazne zvýšená a prognóza pacientov so zvýšenou expresiou bcl-2 je pomerne nepriaznivá. Zatiaľ čo uvedené zmeny génovej expresie boli dobre doložené, nedokázalo sa žiadne príčinné spojenie týchto zmien s danou chorobou. Bolo by teda užitočné identifikovať nové proteíny, ktorých expresia je spojená s výskytom či vývojom prostatických nádorov, a ktoré by mohli slúžiť ako molekulárne ciele na diagnostiku a liečbu rakoviny prostaty.

Predkladaný vynález opisuje nový homológ vyššej rodiny proteínov extracelulámeho matrixu. Tento homológ, nazývaný RG1, je exprimovaný v prostatickom tkanive a jeho expresia môže byť v prostatických nádoroch zvýšená.

Extracelulámy matrix je komplexný sieťovitý útvar, tvorený kolagénom a elastínom, uložený vo viskózne-elastickej základnej hmote z proteoglykánov a glykoproteínov. Matrix tvorí trojrozmernú podpornú konštrukciu, ktorá oddeľuje jednotlivé bunkové kompartmenty, sprostredkováva bunkové väzby a určuje štruktúru tkaniva (Bissel et al., J. Theor. Biol. 99:31-68, 1982; Carlson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2403-2406, 1981). Matrix funguje ako makromolekulámy filter (Hay, E. D., Celí Biology of Extracellular Matrix, New York, Plénum Press, 1982) a má tiež vplyv na bunkovú diferenciáciu, mitogenézu amorfogenézu (Gospodarowiczs, D., Cancer Res. 38:4155-171, 1978). Biochemické interakcie medzi normálnymi bunkami a matrixom môžu byť pri neoplázii pozmenené a môžu tak ovplyvňovať nádorový rast. Nádorové bunky môžu s matrixom interagovať rôznym spôsobom. Buď sa môžu prichytiť na matrix prostredníctvom špecifických plazmatických membránových receptorov (Terranova et al., Cancer Res.

42:2265-2269, 1982), alebo môže byť matrix degradovaný kaskádou enzýmov dodávaných nádorovými aj hostiteľskými bunkami (Eisen et al., Biochem. Biophys. Acta 151:637-645, 1968). A nakoniec môžu nádorové bunky v diferencovaných častiach nádoru syntetizovať a hromadiť matrix alebo vyvolávať hromadenie nadbytočného matrixu v hostiteľských bunkách (Brownstein et al., Cancer 40: 2979-2986, 1977).

RG1 má homológiu s vyššou rodinou proteínov extracelulámeho matrixu, ktoré sú kódované génmi MindinZF-spondin. Táto génová rodina má spoločné dve konzervatívne spodínové domény FS1 aFS2 blízko N-konca a najmenej jeden opakujúci sa úsek trombospondínu typu 1 (TSR1) na C-konci (Shimeld, S.M., Mol. Biol. Evol. 15(9):1218-1223, 1998). Motív TSR sa pôvodne našiel v proteínoch extracelulámeho matrixu stavovcov (Bomstein, P., J. Celí. Biol. 130:503-506,1995) a potom sa našiel aj v niekoľkých ďalších proteínoch extracelulámeho matrixu. Existuje rad dôkazov, že oblasti TSR sprostredkujú bunkovú adhéziu a majú kľúčovú úlohu pri vzniku nádorov. Bolo napr. dokázané, že proteolytické fragmenty trombospondínu obsahujúce oblasť TSR a syntetické peptidy so sekvenciami, ktoré zodpovedajú TSR oblasti trombospondínu podporujú adhéziu nádorových buniek a vytváranie metastáz (Prater et al., J. Celí Biol. 112:1031-1040, 1991; Tuszynski and Nicosia, BioEssays 18:71-76, 1996), majú antiangiogénnu aktivitu (Tolsma et al., J. Celí Biol. 122:497-511, 1993) a inhibujú zhlukovanie krvných doštičiek a metastázovaníe melanómov (Tuszynski et al., J. Celí Biol. 116:209-217, 1992).

V súčasnej dobe patrí do tejto vyššej rodiny génov jeden gén Caenorhabditis elegans, jeden gén Drozofily a niekoľko génov stavovcov. V C. elegans gén F10E7.4 kóduje okrem FS1 a FS2 päť oblastí TSR (Higashijima et al., Dev. Biol. 192:211-227, 1997). Člen tejto rodiny pri Drozofile nazývaný M-spondin (mspo) obsahuje domény FS1 aFS2 ajedinú oblasť TSR (Umemiya et al., Dev. Biol. 186:165-176, 1997). Gén pre M-sponodín kóduje sekretovaný proteín, ktorý sa nachádza v miestach svalových úponov a slúži ako proteín extracelulámeho matrixu, ktorý podporuje pripojenie svalov kapodému. Členovia tejto rodiny génov u stavovcov zahŕňajú gény izolované z Danio rerio (zebrafish) (Mindinl a Mindin2, F-spondinl a F-spondin2), potkaní F-spondín, F-spondín žiab Xenopus a potkaní Mindin. Mindinl a Mindin2 sú navzájom blízko príbuzné a ich génová štruktúra je podobná M-spondínu Drozofily. Oba tieto gény kódujú okrem domén FS1 aFS2 jedinú oblasť TSR (Higashijima et al., Dev. Biol. 192:211-227, 1997). Gény pre F-spondínl aF-spondín2 Danio rerio (zebrafish), potkaní F-spondín (Klár et al., Celí 69:95-110, 1992) a F-spondín žiab Xenopus (Altaba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8268-8272) majú všetky podobnú štruktúru a kódujú okrem domén FS1 a FS2 šesť kópií oblasti TSR. U stavovcov je možné vyššiu rodinu génov Mindin/F-spondín rozdeliť do dvoch skupín: gény blízko príbuzné pôvodným potkaním génom pre F-spondín a Mindin a gény blízko príbuzné génu pre M-spondín Drozofily. Tak gén pre Mindin, ako aj gén pre F-spondín u stavovcov kódujú proteíny, ktoré sú primáme exprimované bunkami dna neutrálnej trubice počas embryonálneho vývoja.

Nedávno bol z kopytníka Amphioxus izolovaný jediný gén príbuzný F-spondínu, AmphiF-spondín (Shimeld, S. M., Mol. Biol. Evol. 15(9):1218-1223, 1998).

Na základe molekulárnej fylogenetiky je AmphiF-spondín blízko príbuzný určitej skupine génov stavovcov pre F-spondín, ktoré kódujú šesť oblastí TSR. AmphiF-spondín kóduje tri oblasti TSR a dva opakujúce sa úseky fibronektinu typu III, z ktorých jeden má silnú podobnosť s opakujúcim sa úsekom fibronektínu typu III produktu génu DCC („Deleted in Colorectal Cancer“). Expresiu tohto proteínu je možné nájsť vo väčšine oblasti centrálneho nervového systému a nie len v stredovej línii, ako bolo opísané pri proteínoch Mindin a F-spondín stavovcov.

Tieto fakty naznačujú, že proteíny extracelulámeho matrixu, ako napr. nový proteín RG1, ktorý je homológom vyššej rodiny Mindin/F-spondín, by mohli byť dobrými kandidátmi na využitie na diagnostiku rakoviny a na použitie na liečenie.

Dokument WO 98/45442 sa týka sekretovaných polypeptidov zsig25, ktoré sú exprimované vo veľmi vysokých hladinách v tkanive prostaty a protilátok k týmto polypeptidom. Aminokyselinová sekvencia polypetidu zsig25 v podstate zodpovedá sekvencii polypeptidu RG1. Ale doteraz nebol identifikovaný žiadny epitop polypeptidu zsig25.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález opisuje polynukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje výhradne nový proteín, ktorý je označovaný ako RG1. Polypeptid RG1 má homológiu s potkaním Mindinom, proteínom extracelulámeho matrixu. Obsahuje hydrofóbnu signálnu sekvenciu na N-konci, dve spondínové domény (FS1 a FS2) a opakujúci sa úsek („repeat“) trombospondínu typu I na C konci. RG1 má 89,7 % podobnosť s potkaním Mindinom. Polynukleotidová sekvencia označovaná ako rgl a uvedená na obr. 1 (a v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1) kóduje aminokyselinovú sekvenciu RG1, ktorá je uvedená na obr. 2 (v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2).

Predkladaný vynález, okrem iného, poskytuje polypeptidy, ktoré boli identifikované ako nové proteíny homologické s rodinou proteínov extracelulárneho matrixu, ktorá sa nazýva Mindin, ako ukazuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) so známymi aminokyselinovými sekvenciami iných proteínov extracelulárneho matrixu.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidy kódujúce tieto polypeptidy, najmä polynukleotidy kódujúce polypeptidy označované ako RG1.

Poskytnuté sú aj izolované polynukleotidy kódujúce RG1, vrátane mRNA a cDNA a aj ich biologicky, diagnosticky, klinicky alebo terapeuticky využiteľné varianty, analógy a deriváty, vrátane fragmentov ich variantov analógov a derivátov.

Medzi zvlášť výhodné uskutočnenia patria prirodzene sa vyskytujúce alelické varianty polynukleotidov, ktoré kódujú varianty polypeptidov označované ako RG1.

Opísané sú nové polypeptidy ľudského pôvodu označované ako RG1 ako aj ich biologicky, diagnosticky či terapeuticky využiteľné fragmenty, varianty a deriváty, varianty a deriváty ich fragmentov, vrátane ich analógov.

Medzi zvlášť výhodné uskutočnenie tohto aspektu vynálezu patria varianty RG1 kódované prirodzene sa vyskytujúcimi alelickými variantmi polynukleotidu rgl.

Taktiež je poskytnutý spôsob prípravy už zmienených polypeptidov, ich fragmentov, variantov a derivátov, fragmentov variantov a derivátov a ich analógov. Vo výhodnom uskutočnení sú opísané spôsoby prípravy zmienených polypeptidov RG1, zahŕňajúce kultiváciu hostiteľských buniek, do ktorých bol vložený exogénne odvodený polynukleotid kódujúci RG1 exprimovateľný za podmienok na expresiu ľudského RG1 v hostiteľovi, s následnou izoláciou exprimovaného polypeptidu.

Poskytnuté sú prípravky, zlúčeniny a spôsoby využívajúce už zmienené polypeptidy a polynukleotidy okrem iného na výskumné, biologické, klinické a terapeutické účely.

Poskytnuté sú aj, okrem iného, prípravky, zlúčeniny a spôsoby, ktoré slúžia na vyhodnotenie expresie RG1 v bunkách stanovením polypeptidov RG1 a mRNA kódujúce RG1; a ďalej stanovením genetických variácií a aberácií, napr. defektov, v génoch rgl.

V súlade s určitými výhodnými uskutočneniami sú opísané sondy, ktoré hybridizujú so sekvenciami rgl.

Predmetom tohto vynálezu sú protilátky vysoko selektívne pre polypeptidy RG1 alebo fragmenty týchto protilátok, ktoré je možné využiť na diagnostiku a/alebo detekciu expresie RG1, ktorá by mohla byť spojená s rakovinou prostaty. V súlade s určitými výhodnými uskutočneniami tohto zámeru vynálezu sú tieto protilátky značené tak, aby poskytli detegovateľný signál. Zvlášť výhodné sú protilátky značené rádioaktívne, enzymaticky, pomocou chromofóru alebo fluorescenčné.

V ďalšom aspekte tohto vynálezu sú opísané protilátky konjugované s terapeutickou látkou určené na podanie do buniek in vitro, ex vivo alebo in vivo, alebo na podanie do mnohobunkového organizmu. V tomto ohľade sú zvlášť výhodné terapeutické látky (terapeutické agens, terapeutické činidlá), ktoré sú cytotoxické. V určitých uskutočneniach výhodných z tohto hľadiska ide o podanie takých konjugovaných protilátok ľudským pacientom na liečbu chorobného stavu, ktorý je charakterizovaný aktivitou alebo expresiou RG1, ako napr. rakovina prostaty.

V ďalšom aspekte tohto vynálezu sú opísané peptidy a antiidiotypové protilátky, ktoré je možné využiť na stimuláciu imunitnej odpovede.

Ďalej sú opísané ribozýmy a polynukleotidy komplementárne k polynukleotidom rgl (t. j.“antisense“ polynukleotidy) určené na podanie do buniek in vitro, ex vivo alebo in vivo, alebo do mnohobunkového organizmu. Zvlášť výhodné z tohto hľadiska je podanie „antisense molekúl ľudským pacientom na liečenie chorobného stavu, ako napr. rakoviny prostaty či benígnej prostatickej hyperplázie, ktorý sa zmierni znížením úrovne aktivity RG1.

Ďalšie predmety, vlastnosti, výhody a aspekty predkladaného vynálezu vyplynú pre odborníkov z nasledujúceho opisu. Malo by však byť zrejmé, že nasledujúci opis a špecifické príklady, ktoré ukazujú výhodné uskutočnenia tohto vynálezu, slúžia iba na ilustráciu.

Definície

Tak ako sa používajú v opise vynálezu, príkladoch a pripojených nárokoch, majú nasledujúce termíny význam stanovený nižšie, pokiaľ nie je výslovne určené inak.

„RG1“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2); jeho varianty, analógy, deriváty a fragmenty a fragmenty týchto variantov, analógov a derivátov. Termíny „fragment“, „derivát“ a „analóg“, pokiaľ sa vzťahujú na polypeptid na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), označujú polypeptid, ktorý má v podstate tú istú biologickú a/alebo imunologickú aktivitu ako polypeptid na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).

„rg/“ označuje polynukleotid, ktorého sekvencia je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1) a polynukleotidy, ktoré kódujú polypeptidy, ktorých aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2); a ďalej polynukleotidy, ktoré kódujú varianty, analógy, deriváty a fragmenty RG1 a fragmenty týchto variatov, analógov a derivátov. Rgl tiež označuje tieto polynukleotidy vo forme RNA a polynukleotidy, ktoré sú komplementárne k polynukleotidom, ktoré kódujú polypeptidovú sekvenciu, ktorá je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).

Termín „polynukleotid“ obvykle označuje akýkoľvek polyribonukleotid či polydeoxyribonukleotid, ktorým môže byť nemodifikovaná RNA či DNA, alebo modifikovaná RNA či DNA. Tak napr. polynukleotidy, ako sú uvedené, označujú okrem iného jednovláknovu a dvojvláknovú DNA, DNA, ktorá je zmesou jedno- a dvoj vláknových oblastí, jedno- a dvojvláknovú RNA a RNA, ktorá je zmesou jedno- a dvojvláknových oblastí, hybridné molekuly obsahujúce DNA a RNA, ktoré môžu byť jednovláknové alebo, čo je typickejšie, dvojvláknové alebo zmes jedno- a dvojvláknových oblastí. Navyše, termín polynukleotid, ako je použitý, označuje aj oblasti trojvláknovej RNA či DNA alebo trojvláknovej oblasti obsahujúcej tak RNA, ako aj DNA. Vlákna týchto oblastí môžu pochádzať tak z tej istej molekuly, ako z rôznych molekúl. Tieto oblasti môžu zahŕňať úseky pochádzajúce zo všetkých týchto molekúl, ale v typickejšom prípade sú mienené úseky iba niektorých týchto molekúl. Jednou z molekúl takejto trojvláknovej oblasti často býva oligonukleotid.

Termín „polynukleotid“, ako sa tu používa, označuje tiež molekuly DNA alebo RNA, ako sú tu opísané, a ktoré obsahujú jednu alebo viac modifikovaných báz. To znamená, že molekuly DNA či RNA, ktorých cukor-fosfátová kostra bola pozmenená na zvýšenie stability alebo z iných dôvodov, sú tu tiež označované termínom „polynukleotidy“. Navyše, molekuly DNA či RNA, ktoré obsahujú neobvyklé bázy ako napr. inozín či modifikované bázy ako bázy značené tríciom, aby sme uviedli aspoň dva príklady, sa tiež označujú používaným termínom polynukleotidy.

Je zrejmé, že na molekulách DNA a RNA sa uskutočnilo množstvo rôznych modifikácií, ktoré slúžia na rôzne užitočné účely známe odborníkom v odbore. Termín „polynukleotid“, ako je používaný, zahŕňa okrem iného takéto chemicky, enzymaticky či metabolický modifikované formy polynukleotidov, ako aj chemické formy DNA či RNA charakteristické pre vírusy či bunky, a to pre bunky jednoduché aj zložité, inter alia.

Termín „polypeptidy“, ako je tu používaný, zahŕňa všetky polypeptidy, ktoré sú opísané. Základná štruktúra polypeptidov je dobre známa a je opísaná v nespočetnom množstve učebníc a iných odborných publikácií. V kontexte predkladaného vynálezu označuje tento termín akýkoľvek peptid alebo proteín obsahujúci dve alebo viac aminokyselín, ktoré sú vzájomne spojené do lineárneho reťazca peptidovou väzbou. Tento termín, ako sa tu používa, označuje ako krátke reťazce, ktoré sú tiež bežne v stave techniky označované napr. tak peptidy, oligopeptidy a oligoméry, ako aj dlhé reťazce, ktoré sa v stave techniky bežne označujú ako proteíny, ktorých je mnoho typov.

Je zrejmé, že polypeptidy často obsahujú aminokyseliny iné ako 20 aminokyselín obvykle označovaných ako 20 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín a že mnoho aminokyselín, vrátane koncových, môže byť v danom polypeptide modifikovaných a to buď prirodzenou cestou ako glykozyláciou, alebo inými posttranslačnými modifikáciami alebo chemickými modifikačnými spôsobmi odborníkom dobre známym. Dokonca aj bežné modifikácie, ktoré sa v polypeptidoch prirodzene vyskytujú, sú príliš počerné, aby ich bolo možné vyčerpávajúcim spôsobom vymenovať, ale sú dobre opísané v základných príručkách a detailnejších monografiách, ako aj v rozsiahlej odbornej literatúre a sú dobre známe odborníkom. Medzi známe modifikácie, ktoré sa môžu vyskytovať v polypeptidoch zmienených v predkladanom vynáleze, patria, aby sme vymenovali aspoň niekoľko ilustratívnych príkladov, acetylácia, acylácia, ADP-ribozylácia, amidácia, kovalentné naviazanie flavínu, kovalentné naviazanie hému, kovalentné naviazanie polynukleotidu alebo derivátu polynukleotidu, kovalentné naviazanie lipidu alebo derivátu lipidu, kovalentné naviazanie fosfatidylinozitolu, tvorba priečnych väzieb, cyklizácia, tvorba disulfidových mostíkov, demetylácia, tvorba priečnych kovalentných väzieb, tvorba cystínu, tvorba pyroglutamátu, formylácia, gama-karboxylácia, glykácia, glykozylácia, tvorba kotvy GPI, hydroxylácia, jodácia, metylácia, myristylácia, oxidácia, proteolitické úpravy, fosforylácia, prenylácia, racemizácia, naviazanie selénu, naviazanie síry, adícia aminokyseliny prostredníctvom transferovej RNA ako napr. arginylácia a naviazanie ubikvitínu.

Tieto modifikácie sú odborníkom dobre známe a boli detailne opísané v odbornej literatúre. Rad zvlášť známych modifikácií, ako napr. glykozylácia, naviazanie lipidov, naviazanie síry, gama-dekarboxylácia, naviazanie zvyškov glutámovej kyseliny, hydroxylácia a ADP-ribozylácia, boli opísané v celkom základných príručkách, ako napr. I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2^nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York, 1993. Na túto tému existuje mnoho prehľadných článkov, ako napr. texty, ktoré publikovali Wold, F., in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646, 1990, aRattan et al., Proteín Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992.

Je zrejmé, ako je všeobecne známe a tu už poukázané, že polypeptidy nie sú vždy lineárne. Napr. polypeptidy môžu byť rozvetvené dôsledkom naviazania ubikvitínu, môžu byť cirkuláme, s rozvetvením alebo bez neho, obvykle ako dôsledok posttranslačných úprav, vrátane prirodzených úprav alebo procesov spôsobených ľudskou manipuláciou, ku ktorým normálne nedochádza. Cirkuláme, vetvené a cirkuláme vetvené polypeptidy môžu byť syntetizované netranslačnými prirodzenými procesmi aj čisto syntetickými spôsobmi.

Modifikácie sa môžu vyskytovať kdekoľvek v polypeptide, vrátane peptidovej kostry, bočných reťazcov aminokyselín alebo N- a C-konca. V skutočnosti je blokovanie aminoskupiny alebo karboxyskupiny, alebo oboch týchto skupín prostredníctvom kovalentnej modifikácie bežne sa vyskytujúcim javom v prirodzene sa vyskytujúcich aj syntetických polypeptidoch a tieto modifikácie sa môžu v polypeptídoch uvedených v predkladanom vynáleze vyskytovať tiež. Napr. N-koncovým aminokyselinovým zvyškom polypeptidov produkovaných E.coli pred proteolytickou úpravou bude vždy N-formylmetionín.

Modifikácie vyskytujúce sa v polypeptide sú často výsledkom spôsobu, akým tento polypeptid vznikol. Pri polypeptidoch, ktoré vznikli napr. expresiou génu klonovaného v hostiteľovi, bude podstata a rozsah modifikácií z veľkej časti určený posttranslačnou modifikačnou kapacitou hostiteľskej bunky a modifikačnými signálmi, ktoré sa nachádzajú v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu. Napr. ako je dobre známe, glykozylácia sa často nevyskytuje pri bakteriálnych hostiteľoch ako E. coli. Pokiaľ sa teda glykozylácia požaduje, polypeptid by mal byť exprimovaný v glykozylujúcom hostiteľovi, obvykle v eukaryotickej bunke. Bunky hmyzu často uskutočňujú tie isté posttranslačné glykozylácie ako cicavčie bunky a preto boli napr. vyvinuté hmyzie expresné systémy na účinnú expresiu cicavčích proteínov, ktoré majú natívnu formu glykozylácie. Podobné úvahy sa vzťahujú aj na iné modifikácie.

Je zrejmé, že ten istý typ modifikácie sa môže vyskytovať v tej istej alebo rôznej miere na rôznych miestach daného polypeptidu. Daný polypeptid tiež môže obsahovať mnoho typov modifikácií.

Termin polypeptid, ako sa používa, obvykle zahŕňa všetky takéto modifikácie, najmä tie, ktoré sa nachádzajú v polypeptidoch syntetizovaných expresiou polynukleotidu v hostiteľskej bunke.

Termín „polynukleotíd kódujúci polypeptid“, ako sa tu používa, zahŕňa polynukleotidy obsahujúce sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid uvedený v predkladanom vynáleze, v konkrétnom prípade polypeptid RG1, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2). Tento termín zahŕňa polynukleotidy, ktoré obsahujú jednu súvislú oblasť alebo nesúvislé oblasti, ktoré kódujú polypeptid (prerušené napr. intrónmi) spolu s ďalšími oblasťami.

„Biologická aktivita“ označuje štrukturálne, regulačné alebo biochemické funkcie prirodzene sa vyskytujúceho polypeptidu RG1.

„Imunologická aktivita“ označuje schopnosť prirodzeného, rekombinantného alebo syntetického RG1, alebo akéhokoľvek jeho fragmentu vyvolať špecifickú imunitnú odpoveď v zodpovedajúcom živočíchovi či bunke, a viazať špecifické protilátky.

Termín „oligonukleotid“ označuje pomerne krátke polynukleotidy. Tento termín sa často vzťahuje na jednovláknové deoxyribonukleotidy, ale môže tiež označovať okrem iného jedno- či dvojvláknové ribonukleotidy, hybridy RNA a DNA a dvojvláknovej DNA. Oligonukleotidy, ako napr. jednovláknové oligonukleotidy sond DNA, sa často syntetizujú chemickými spôsobmi, napr. pomocou automatických syntetizátorov oligonukleotidov. Oligonukleotidy však môžeme pripraviť aj množstvom iných metód, vrátane metód in vitro využívajúcich rekombinantnú DNA a expresiu DNA v bunkách a organizmoch. „Oligonukleotidy“ alebo „oligoméry“, alebo polynukleotidový „fragment“, „úsek“ alebo „segment“ označuje polynukleotidovú sekvenciu s najmenej 10 nukleotidmi a najviac približne 60 nukleotidmi, výhodne asi 15 až 30 nukleotidmi a najvýhodnejšie približne 20 až 25 nukleotidmi.

„Prirodzene sa vyskytujúci RGl“ označuje RG1 produkovaný ľudskými bunkami, ktoré neboli geneticky modifikované a špecificky označuje rôzne formy RGl, ktoré vznikli posttraslačnými úpravami polypeptidu zahŕňajúcimi, ale bez obmedzenia, acetyláciu, karboxyláciu, glykozyláciu, fosforyláciu, lipidáciu, acyláciu a štiepenie.

Termín „variant(y)“ polynukleotidov alebo polypeptidov, ako sa používa v tomto texte, označuje polynukleotidy alebo polypeptidy, ktoré sa líšia od referenčného polynukleotidu či polypeptidu. Varianty v tomto zmysle sú opísané nižšie a na iných miestach v predkladanom vynáleze detailnejšie.

(1) Polynukleotíd, ktorý sa líši svojou sekvenciou od iného, referenčného polynukleotidu. Tieto rozdiely sú obvykle obmedzené, takže sekvencie referenčného polynukleotidu a jeho variantov sú veľmi podobné a v mnohých oblastiach sú zhodné.

Ako je poukázané, zmeny v sekvencií variantu polynukleotidu môžu byť bez vonkajšieho prejavu. To znamená, že nemusia ovplyvniť aminokyselinovú sekvenciu polypeptidu kódovaného polynukleotidom. Tam, kde sú zmeny obmedzené na tento typ bez vonkajšieho prejavu, variant kóduje polypeptid s veľkosťou tej istej aminokyselinovej sekvencie ako referenčný polypeptid. Ako sa uvádza ďalej, zmeny v sekvencií variantu polynukleotidu môžu spôsobiť zmeny v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu kódovaného referenčným polynukleotidom. Takéto zmeny polynukleotidu môžu viesť k substitúcii, adícii, delécii alebo fúzii aminokyselín alebo skracovaniu aminokyselinovej sekvencie kódovanej referenčnou sekvenciou, ako bude opísané.

(2) Polypeptid, ktorý sa aminokyselinovou sekvenciou líši od iného, referenčného polypeptidu. Tieto zmeny sú obvykle obmedzené, takže sekvencie referenčného polypeptidu a jeho variantu sú veľmi podobné a v mnohých oblastiach sú zhodné. Referenčný polypeptid a jeho variant sa môžu odlišovať v aminokyselinovej sekvencií jednou lebo viacerými substitúciami, adíciami, deléciami, fúziami alebo skrátením sekvencie, pričom tieto zmeny môžu byť prítomné v rôznych kombináciách. Rekombinantné varianty kódujúce tieto alebo podobné polypeptidy môžu byť syntetizované alebo selektované na základe tzv. „redundancie“ genetického kódu. Rôzne substitúcie kodónov, ako napr. tie, ktoré sa navonok neprejavia, ale vedú k vzniku rôznych reštrikčných miest, sa môžu využiť na optimalizáciu klonovania do plazmidu alebo vírusového vektora, alebo expresie v určitom prokaryotickom alebo eukaryotickom systéme. Mutácie sa môžu tiež zavádzať s cieľom modifikovať vlastnosti polypeptidu, meniť jeho väzbovú afinitu na ligandy, afinitu medzi reťazcami, degradáciu alebo rýchlosť obratu polypeptidu (polypeptid tumover rate).

Termín „alelický variant“ označuje alternatívnu formu polynukleotidu rgl. Alely sú výsledky mutácie, t. j. zmeny v sekvencií polynukleotidu a obvykle vedú k vzniku pozmenených mRNA alebo polypeptidov, ktorých štruktúra alebo funkcia môže alebo nemusí byť pozmenená. Akýkoľvek gén môže mať žiadnu, jednu alebo viac alelických foriem. Bežné mutačné zmeny vedúce k vzniku alel sú pripisované prirodzeným deléciám, adíciám alebo substitúciám nukleotidov. Každý typ týchto zmien sa môže v danej sekvencií uskutočniť buď samostatne, alebo v kombinácii s ostatnými, jeden alebo viackrát.

„Derivát“ označuje polynukleotid alebo polypeptid odvodený z prirodzene sa vyskytujúceho rgl alebo RG1 chemickými modifikáciami, ako je naviazanie ubikvitínu, značenie (napr. rádionuklidmi, rôznymi enzymatickými modifikáciami), „pegylácia“ (tvorbou derivátov pomocou polyetylénglykolu, PEG) alebo inzercia, alebo substitúcia aminokyselín, ako je omitín (alebo substitúcia nukleotidov, ktoré kódujú túto aminokyselinu), ktoré sa normálne v ľudských proteínoch nevyskytujú.

„Delécia“ je definovaná ako zmena sekvencie polynukleotidu alebo aminokyselinovej sekvencie, kde chýba jeden alebo viac nukleotidov alebo aminokyselinových zvyškov.

„Inzercia“ alebo „adícia“ je taká zmena sekvencie polynukleotidu alebo aminokyselinovej sekvencie, keď dochádza k pridaniu jedného alebo viac nukleotidov či aminokyselinových zvyškov v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcou sekvenciou polynukleotidu alebo polypeptidu.

„Substitúcia“ je výsledkom nahradenia jedného alebo viac nukleotidov či aminokyselín odlišnými nukleotidmi či aminokyselinami, tak ako je uvedené.

Substitúcie aminokyselín sú výhodne výsledkom nahradenia jednej aminokyseliny inou aminokyselinou majúcou podobné štruktúrne a/alebo chemické vlastnosti, napr. nahradenie leucínu izoleucínom či valínom a asparátu glutamátom alebo treonínu serínom, t. j. konzervatívne nahradenie aminokyseliny. Inzercie alebo delécie prebiehajú v rozmedzí od l do 5 aminokyselín. Povolená variácia môže byť experimentálne určená uskutočňovaním systematických inzercií, delécií alebo substitúcií aminokyselín v polypeptide pomocou metód rekombinantnej DNA a testovanie aktivity vzniknutých rekombinantých variantov.

„Fragment“ je polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou totožnou s časťou, ale nie s celkom aminokyselinovej sekvencie už spomenutých polypeptidov RG1 a ich variantov alebo derivátov.

Polypeptidový „fragment“, „úsek“ alebo „segment“ predstavuje spojené aminokyselinové zvyšky v minimálnom počte 5, často aspoň 7, typicky aspoň 9 až 13 aminokyselín a v rôznych uskutočneniach predkladaného vynálezu aspoň 17 alebo viac aminokyselín.

„Rekombinant“ alebo „rekombinantná molekula DNA“ označuje sekvenciu polynukleotidu, ktorá sa prirodzene nevyskytuje alebo je pripravená umelou kombináciou dvoch inak oddelených segmentov alebo sekvencií.

„Rekombinantne pripravený“ znamená pripravený umelou kombináciou oddelených segmentov polynukleotidov, často využitím buď chemických prostriedkov, alebo umelých manipulácií, napi, technikami génového inžinierstva. Tieto manipulácie sa obvykle uskutočňujú preto, aby bol jeden kodón nahradený iným, redundantným kodónom kódujúcim tú istú či konzervatívnu aminokyselinu, pričom je typicky vnesené či odstránené rozpoznávacie miesto sekvencie. Inak sa uskutočňuje spájanie segmentov polynukleotidov s požadovanými funkciami s cieľom vytvoriť jedinú genetickú entitu, ktorá obsahuje požadovanú kombináciu funkcii, a ktorá sa inak v prirodzenej bežnej forme nevyskytuje. Takto môžu byť cielene vložené rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy, regulačné sekvencie či iné využiteľné oblasti. „Rekombinantné molekuly DNA“ zahŕňajú klonovacie a expresné vektory. „Rekombinant“ môže tiež označovať polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid a je pripravený pomocou techník rekombinantnej DNA.

„Izolovaný“ znamená pozmenený „ľudským zásahom“ zo svojho prirodzeného stavu, t. j. pokiaľ sa vyskytuje v prírode, bol pozmenený či odstránený zo svojho prirodzeného prostredia alebo oboch. Napr. prirodzene sa vyskytujúci polynukleotid alebo polypeptid prirodzene sa vyskytujúci v živom zvierati vo svojom prirodzenom stave nie je „izolovaný“, ale ten istý polynukleotid alebo polypeptid oddelený z materiálu, s ktorým koexistuje v prirodzenom stave, je „izolovaný“ tak ako sa tento termín používa v predkladanom vynáleze. Napr. pokiaľ ide o polynukleotidy, termín izolovaný znamená, že je oddelený od chromozómu a bunky, v ktorej sa prirodzene vyskytuje.

Polynukleotidy a polypeptidy sa môžu vyskytovať v kompozícii, ako sú formulácie médií, roztoky na vnášanie polynukleotidov alebo polypeptidov napr. do buniek, kompozície alebo roztoky na chemické alebo enzymatické reakcie, napr. ktoré nie sú prirodzene sa vyskytujúcimi kompozíciami, a tu sú izolované polynukleotidy alebo polypeptidy v zmysle tohto termínu, ako sa používa v predkladanom vynáleze.

„V podstate čistý“ a „ v podstate homogénny“ sú vzájomne nahradíte ľné termíny a označujú polypeptid RG1 alebo jeho fragmenty alebo segment polynukleotidu, ktorý ich kóduje, pričom tento polypeptid či polynukleotidje oddelený od látok, s ktorými sa vyskytuje prirodzene. Polypeptid RG1 alebo jeho fragmenty alebo segment polynukleotidu, ktorý ich kóduje, je v podstate jednoduchý vo všetkých komponentoch, s ktorými sa prirodzene vyskytuje, pokiaľ je oddelený od natívnych kontaminantov, s ktorými sa vyskytuje v prirodzenom stave. To znamená, že polypeptid, ktorý sa syntetizuje chemicky alebo bunkovým systémom odlišným od bunky, z ktorej prirodzene pochádza, je v podstate zbavený komponentov, s ktorými sa prirodzene vyskytuje.

„Homológny“, pokiaľ sa tento termín týka polynukleotidu, znamená, že dva polynukleotidy alebo ich vyznačené sekvencie sú optimálnym lineárnym porovnaním („alignement“) totožné so zodpovedajúcimi inzerciami či deléciami nukleotidov aspoň v 70 % nukleotidov, obvykle v 75 až 99 % a výhodnejšie v minimálne 98 až 99 % nukleotidov.

„Podobnosť“, pokiaľ sa týka polypeptidu, sa určí porovnaním aminokyselinovej sekvencie a konzervatívnych aminokyselinových náhrad jedného polypeptidu so sekvenciou druhého polypeptidu.

„Polymerázová reťazová reakcia“ teda „PCR“ označuje spôsob, pri ktorom sú špecifické úseky DNA amplifikované, ako je opísané v patente USA č. 4 683 195 udelenom 28.7.1987. Obvykle je potrebné poznať koncové alebo dlhšie sekvencie fragmentov požadovaného polypeptidu, aby sa mohli navrhnúť oligonukleotidové priméry; tieto priméry budú antiparalelné a budú mať totožnú či podobnú sekvenciu ako opačné vlákna templátu, ktorý má byť amplifikovaný. Nukleotidy 5' konca oboch primérov sa budú kryť s koncami amplifikovaného materiálu. PCR je možné využiť na amplifikáciu špecifických sekvencií DNA z celkovej genómovej DNA, cDNA transkribovanej z celkovej bunkovej RNA, z plazmidových sekvencií atď. (pozri všeobecne Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

„Stringencia“ (hybridizačných podmienok) sa obvykle vyskytuje v rozmedzí T_m (teplota topenia) -5 °C (5 °C pod T_m sondy) do približne 20 °C až 25 °C pod T_m. Odborníkom bude zrejmé, že stringentnú hybridizáciu je možné použiť na identifikáciu alebo detekciu zhodných sekvencií polynukleotidov alebo na identifikáciu, alebo detekciu podobných alebo príbuzných sekvencií polynukleotidov. Termín „stringentné podmienky“, tak ako je používaný, znamená, že hybridizácia bude prebiehať iba pokiaľ bude medzi sekvenciami najmenej 95 % a výhodne menej 97 % identita.

„Hybridizácia“, ako sa používa, zahŕňa „akýkoľvek proces, ktorým je polynukleotidové vlákno spojené s komplementárnym vláknom na princípe párovania báz“ (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N. Y., 1994).

„Terapeuticky účinná dávka“ označuje také množstvo polypeptidu alebo jeho protilátok, jeho antagonistov či inhibítorov, vrátane „antisense“ molekúl a ribozýmov, ktorá zlepší príznaky alebo podmienky chorobného stavu. Terapeutická účinnosť a toxicita týchto látok sa môže určiť štandardnými farmaceutickými spôsobmi v bunkových kultúrach či na experimentálnych zvieratách, napr. ako ED₅₀ (dávka terapeuticky účinná v 50 % populácie) alebo LD₅o (dávka letálna pre 50 % populácie). Pomer dávok s terapeutickým a toxickým účinkom sa nazýva terapeutický index a dá sa vyjadriť ako pomer ED₅o/LD5₀.

„Liečenie“ či „liečba“ ako sa tento termín používa, znamená liečbu chorobného stavu (ochorenia) u ľudského pacienta, pričom tento chorobný stav je spojený s rastom nádoru prostaty a zahŕňa chorobné stavy, pri ktorých je potrebné u pacienta znížiť hladinu RG1.

Podrobný opis vynálezu

Predkladaný vynález sa týka okrem iného nových polypeptidov RG1, polynukleotidov rgl a protilátok zameraných proti polypeptidom RG1, ako bude podrobnejšie opísané. Konkrétne sa tento vynález týka nových polypeptidov RG1 a polynukleotidov kódujúcich tieto polypeptidy RG1, najmä sa týka RG1 s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a rgl s polynukleotidovou sekvenciou, ktorá je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1). Tento vynález tiež zahŕňa varianty RG1. Výhodný variant RG1 je variant majúci najmenej 70 % podobnosť (výhodne najmenej 70 % identitu) s polypeptidovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a výhodnejšie najmenej 90 % podobnosť (výhodnejšie najmenej 90 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a ešte výhodnejšie najmenej 95 % podobnosť (ešte výhodnejšie najmenej 95 % identitu) s polypeptidovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a tiež zahŕňa úseky týchto polypeptidov, pričom tieto úseky polypeptidu obvykle obsahujú najmenej 30 aminokyselín a výhodnejšie najmenej 50 aminokyselín.

Sekvencia kódujúca predikovaný polypeptid RG1 začína 296 bázových párov od 5' konca nukleotidovej sekvencie uvedenej na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1). RG1 obsahuje tri štrukturálne domény charakteristické pre vyššiu rodinu proteínov extracelulámeho matrixu Mindin/F-spondín: dve spondínové domény (FS1 a FS2), ktoré zahŕňajú aminokyseliny 31 až 103 a 138 až 221 a trombospondínovú doménu zahŕňajúcu aminokyseliny 278 až 330.

Predkladaný vynález je čiastočne založený na štrukturálnej homológii medzi RG1 a potkaním Mindinom, ďalším členom rodiny proteínov extracelulárneho matrixu, uvedeného na obr. 3. Aminokyselinová sekvencia RG1 má približne 89,7 % podobnosť s potkaním Mindinom.

Predkladaný vynález je tiež založený na expresnom profile RG1, ktorého expresia bola dokázaná v knižniciach prostatických tkanív a zvýšená expresia v knižniciach prostatických nádorov. Tento expresný profil v tkanivách sa pozoroval pri analýze expresie mRNA vo vzorkách normálnych a nádorových tkanív zistených analýzou PCR pomocou Taqman. Tento analytický spôsob dokázal, že expresia mRNA kódujúca RG1 je v prostatických tkanivách oproti iným tkanivám zvýšená.

Polynukleotídy

V súlade s jedným aspektom predkladaného vynálezu sú opísané izolované polynukleotídy kódujúce polypeptid RG1 s dedukovanou aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).

Pomocou uvedených informácií, ako napr. polynukleotidová sekvencia uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1), možno získať polynukleotid kódujúci polypeptid RG1 uvedený v predkladanom vynáleze pomocou štandardných klonovacích a testovacích spôsobov, ako napr. klonovanie cDNA pomocou mRNA z buniek ľudských tkanív ako východiskového materiálu. Ako príklad možno uviesť fakt, že polynukleotidová sekvencia uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1) sa identifikovala v klonoch cDNA získaných z ľudských prostatických tkanív. Rgl bol identifikovaný ako gén exprimovaný v prostate prehľadávaním databázy Incyte LifeSeq. Táto nukleotidová sekvencia bola identifikovaná prehľadávaním anotácií v databáze pomocou nástroja .Funkcia proteínu“ poskytnutého spoločnosťou Incyte. Táto nukleotidová sekvencia sa našla v anotovanej databáze v kategórii bunkových adhéznych molekúl a bola opísaná ako homológ F-spondínu. Elektronická Northem analýza distribúcie polynukleotidových sekvencií rgl v súbore knižníc v databáze dokázala, že vysoké hladiny expresie rgl boli zistené v knižniciach prostatických tkanív a nižšie hladiny v knižniciach mnohých iných tkanív, vrátane normálnych a nádorových.

Po zostavení súboru klonov rgl z databázy do sústavy kontigov polynukleotidových sekvencií a po ich úprave na súvislú sekvenciu sa identifikovala úplná kódujúca sekvencia predikovaného zostaveného polynukleotidu. Táto sekvencia kóduje proteín homológny s potkaním mindinom.

Klony databázy Incyte 1640796, 1712252 a 1880265 sa získali z Incyte na experimentálne účely a kloň 3360733 bol identifikovaný ako obsahujúci najväčšiu časť nukleotidovej sekvencie 5' konca. Získala sa úplná sekvencia tohto klonu, ktorá obsahuje úplnú kódujúcu sekvenciu pre umelo odvodený proteín RG1. Táto sekvencia je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1).

Polynukleotídy v predkladanom vynáleze môžu byť vo forme RNA, napr. mRNA alebo vo forme DNA, vrátane napr. cDNA a genómovej DNA získanej klonovaním alebo pripravené spôsobmi chemickej syntézy či kombinácie týchto spôsobov alebo spôsobmi opísanými v tomto vynáleze. DNA môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová. Jednovláknová DNA môže byť kódujúcim vláknom, tiež nazývaným „sense“ vlákno alebo to môže byť nekódujúce vlákno, tiež nazývané „antisense“ vlákno.

Sekvencia kódujúca polypeptid môže byť zhodná s kódujúcou sekvenciou polynukleotidu uvedeného na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1). Môže to tiež byť polynukleotid s odlišnou sekvenciou, ktorý vďaka redundancii (degeneratívnosti) genetického kódu kóduje polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).

Polynukleotídy predkladaného vynálezu kódujúce polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) môžu obsahovať okrem iného sekvencie kódujúce tento samotný polypeptid; sekvencie kódujúce tento polypeptid s ďalšími nekódujúcimi sekvenciami, vrátane okrem iného napr. intrónov a nekódujúcich 5' a 3' sekvencií, ako napr. transkribované, ale netranslatované sekvencie zúčastňujúce sa transkripcie a úpravy mRNA (napr. signály na zostrih a polyadenyláciu) či ďalšie kódujúce sekvencie, ktoré kódujú ďalšie aminokyseliny, ako napr. aminokyseliny zaisťujúce ďalšie funkcie. Tak môže byť polypeptid napr. fuzovaný s markerovou sekvenciou, ako napr. s peptidom uľahčujúcim purifikáciu fúzneho polypeptidu. V určitých výhodných uskutočneniach tohto zámeru predkladaného vynálezu je markerovou sekvenciou hexahistidínový peptid, ktorý slúži ako značka pridaná pomocou vektora pTrcHisB (Invitrogen, Carlsbad, CA) a ďalšie, z ktorých mnoho je komerčne dostupných. Ako bolo opísané napr. v publikácii Gentz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989), hexahistidín umožňuje ľahkú purifikáciu fúzovaného proteínu.

Polynukleotídy môžu kódovať polypeptid, ktorý okrem daného polypeptidu obsahuje ďalšie aminokyselinové zvyšky na C- a N-konci alebo vnútri tohto polypeptidu (napr. keď jeho aktívna forma obsahuje viac ako jeden polypeptidový reťazec). Tieto sekvencie môžu mať úlohu v úprave polypeptidu z prekurzorovej na konečnú formu, môžu uľahčovať pohyb polypeptidu, môžu predlžovať či skracovať jeho polčas alebo môžu uľahčovať manipuláciu s polypeptidom pri testovaní či produkcii atď. Ako je obvyklé v situácii in situ, tieto ďalšie aminokyseliny môžu byť z polypeptidu odstránené proteolytickými enzýmami.

Predkladaný vynález sa ďalej týka variantov opísaných polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty, analógy a deriváty polypeptidu s dedukovanou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2). Variantom polynukleotidu môže byť prirodzene sa vyskytujúci variant ako napr. prirodzene sa vyskytujúci alelický variant alebo to môže byť variant, o ktorom nie je známe, že by sa vyskytoval prirodzene. Tieto varianty poly nukleotidu nevyskytujúce sa prirodzene sa môžu získať technikami mutagenézy, vrátane tých, ktoré sa využívajú pre polynukleotidy, bunky či organizmy.

Medzi varianty v tejto súvislosti patria varianty, ktoré sa od opísaných polynukleotidov líšia substitúciami, deléciami či adíciami nukleotidov. Tieto substitúcie, delécie či adície sa môžu týkať jedného alebo viac nukleotidov. Varianty môžu byť pozmenené tak v kódujúcich, ako aj v nekódujúcich oblastiach. Zmeny v kódujúcich oblastiach môžu viesť k substitúciám, deléciám či adíciám konzervatívnych aj nekonzervatívnych aminokyselín.

Medzi zvlášť výhodné uskutočnenia predkladaného vynálezu patria z tohto hľadiska polynukleotidy kódujúce polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou RG1, ako je uvedené na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2); ich varianty, analógy, deriváty či fragmenty a fragmenty týchto variantov, analógov a derivátov.

Ďalším zvlášť výhodným uskutočnením z tohto hľadiska sú polynukleotidy, ktoré kódujú varianty, analógy, deriváty a fragmenty RG1 a varianty, analógy a deriváty týchto fragmentov, ktorých aminokyselinová sekvencia zodpovedá sekvencií polypeptidu RG1 uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), a kde pri väčšom počte, niekoľkých, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 alebo žiadnej aminokyseline došlo k substitúcii, delécii, adícii či akejkoľvek kombinácii týchto javov. Zvlášť výhodnými sú substitúcie, adície a delécie bez vonkajšieho prejavu, ktoré nemenia vlastnosti a aktivity polypeptidu RG1. Zvlášť výhodnými z tohto hľadiska sú tiež konzervatívne substitúcie. Najvýhodnejšími sú polynukleotidy kódujúce polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) bez substitúcií.

Ďalšími výhodnými uskutočneniami predkladaného vynálezu sú polynukleotidy majúce aspoň 70 % identitu s polynukleotidom kódujúcim polypeptid RG1 s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a polynukleotidy komplementárne k týmto polynukleotidom. Okrem nich sú vysoko výhodné polynukleotidy obsahujúce oblasť majúcu aspoň 80 % identitu s polynukleotidom kódujúcim polypeptid RG1 a polynukleotidy k nim komplementárne. Z tohto hľadiska sú zvlášť výhodné polynukleotidy s aspoň 90 % identitou s týmto polynukleotidom a medzi nimi sú zvlášť výhodné tie, ktoré s ním majú aspoň 95 % identitu. Navyše, polynukleotidy vykazujúce aspoň 97 % identitu sú zvlášť výhodné medzi tými, ktoré majú aspoň 95 % identitu a z nich sú zvlášť výhodné tie, ktoré majú aspoň 98 % a 99 % identitu, pričom tie s 99 % identitou sú najvýhodnejšie.

Z tohto hľadiska sú navyše výhodnými uskutočneniami polynukleotidy kódujúce polypeptidy, ktoré majú v podstate tú istú biologickú aktivitu ako polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvenciou uvedenou na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1).

Predkladaný vynález sa ďalej týka polynukleotidov, ktoré hybridizujú s opísanými sekvenciami. Z tohto hľadiska sa tento vynález týka zvlášť polynukleotidov, ktoré hybridizujú za stringentných podmienok s opísanými polynukleotidmi.

Ako bude uvedené v súvislosti s testovaním polynukleotidov, ktoré sú opísané v predkladanom vynáleze, polynukleotidy z tohto vynálezu, ako sú opísané, môžu slúžiť napr. ako hybridizačné sondy pre cDNA a genómovú DNA na izoláciu klonov cDNA a genómovej DNA s úplnou dĺžkou, kódujúcich RG1 a na izoláciu klonov cDNA a genómovej DNA iných génov majúcich vysokú podobnosť sekvencie s génom rgl. Tieto sondy obvykle obsahujú najmenej 15 báz. Výhodne tieto sondy obsahujú najmenej 30 báz a môžu mať aj najmenej 50 báz.

Tak napr. kódujúcu oblasť génu rgl je možné izolovať skriningom knižníc pomocou syntetických oligonukleotidových sond, ktoré boli navrhnuté podľa známej sekvencie DNA. Napr. značený oligonukleotid so sekvenciou komplementárnou k sekvencií polynukleotidu uvedeného v predkladanom vynáleze sa môže využiť na skríning knižnice cDNA či genómovej DNA s cieľom identifikovať klony hybridizujúce s danou sondou.

Môžeme teda zhrnúť, že polynukleotid opísaný v predkladanom vynáleze môže kódovať polypeptid a polypeptid s vedúcou „leader“ sekvenciou (ktorý môže byť označený ako „prepolypeptid“).

Je zrejmé, že predkladaný vynález sa okrem iného týka polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty polypeptidov, polynukleotidov hybridizujúcich s polynukleotidmi, ktoré kódujú fragmenty polypeptidov, najmä tých, ktoré hybridizujú za stringentných podmienok a polynukleotidov slúžiacich na amplifikáciu polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty polypeptidov ako napr. PCR priméry. Z tohto hľadiska sú výhodné polynukleotidy, ktoré zodpovedajú výhodným fragmentom polypeptidov, ako budú opísané.

Polypeptidy

Predkladaný vynález sa ďalej týka polypeptidu RG1, ktorého dedukovaná aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (a v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2).

Tento vynález sa tiež týka fragmentov, analógov a derivátov týchto polypeptidov. Termíny fragment, derivát analógov, pokiaľ označujú polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) znamenajú polypeptid majúci v podstate tú istú biologickú aktivitu ako uvedený polypeptid.

Polypeptidom uvedeným v predkladanom vynáleze môže byť rekombinantný polypeptid, prirodzený polypeptid alebo syntetický polypeptid. V niektorých výhodných uskutočneniach je ním rekombinantný polypeptid.

Fragmentom, derivátom alebo analógom polypeptidu uvedeného na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) môže byť (i) polypeptid, v ktorom jeden či viac aminokyselinových zvyškov bolo nahradených konzervovaným alebo nekonzervovaným aminokyselinovým zvyškom (výhodne konzervovaným aminokyselinovým zvyškom) a tento substituovaný aminokyselinový zvyšok môže alebo nemusí byť kódovaný genetickým kódom, alebo (ii) polypeptid, v ktorom jeden či viac aminokyselinových zvyškov má substituovanú skupinu alebo (iii) polypeptid, ktorý je íuzovaný s inou látkou, napr. s látkou zvyšujúcou polčas polypeptidu (ako napr. polyetylénglykol), alebo (iv) polypeptid, ku ktorému sú fúziou pripojené ďalšie aminokyseliny ako vedúce „leader“ sekvencie, sekrečné sekvencie alebo sekvencie uľahčujúce purifikáciu polypeptidu. Podľa údajov uvedených v predkladanom vynáleze by odborníci mali byť schopní pracovať s týmito fragmentmi, derivátmi a analógmi.

Medzi zvlášť výhodné uskutočnenia predkladaného vynálezu patria z tohto hľadiska polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou RG1 uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), ich varianty, analógy, deriváty či fragmenty a varianty, analógy či deriváty týchto fragmentov.

Výhodnými variantmi sú tie, ktoré sa od referenčného polypeptidu líšia substitúciou konzervatívnych aminokyselín. Ide o také substitúcie, ktoré nahradia danú aminokyselinu v polypeptide inou aminokyselinou s podobnými charakteristikami. Typickými konzervatívnymi substitúciami sú vzájomné nahradenia alifatických aminokyselín Ala, Val, Leu a íle, výmena hydroxylových zvyškov Ser a Thr, výmena kyslých zvyškov Asp a Glu, substitúcia amidových zvyškov Asn a Gin, výmena bázických zvyškov Lys a Arg a výmeny medzi aromatickými zvyškami Phe a Tyr.

Ďalšími výhodnými variantmi, analógmi, derivátmi či fragmentmi týchto variantov, analógov či derivátov sú z tohto hľadiska tie, ktorých aminokyselinová sekvencia zodpovedá sekvencii RG1 uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), v ktorej pri väčšom počte, niekoľkých, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 alebo žiadneho aminokyselinového zvyšku došlo k substitúcii, delécii či adícii, alebo akejkoľvek ich kombinácii. Zvlášť výhodnými sú substitúcie, adície či delécie bez vonkajších prejavov, ktoré nemenia vlastnosti a aktivity polypeptidu RG1. Z tohto hľadiska sú tiež zvlášť výhodné konzervatívne substitúcie. Najvýhodnejšie sú polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) bez substitúcií.

Polypeptidy a polynukleotidy uvedené v predkladanom vynáleze sú výhodné v izolovanej forme a purifikované do homogenity.

Polypeptidy v predkladanom vynáleze tiež zahŕňajú polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), ako aj polypeptidy majúce aspoň 70 % podobnosť (výhodne aspoň 70 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a výhodnejšie aspoň 90 % podobnosť (výhodnejšie aspoň 90 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a ešte výhodnejšie aspoň 95 % podobnosť (ešte výhodnejšie aspoň 95 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a tiež zahŕňajú úseky polypeptidu obsahujúce obvykle najmenej 30 aminokyselín a výhodnejšie najmenej 50 aminokyselín.

Ako je známe v stave techniky, „podobnosť“ medzi dvoma polypeptidmi je určená porovnaním aminokyselinovej sekvencie a ich konzervatívnych aminokyselinových substituentov jedného polypeptidu so sekvenciou druhého polypeptidu.

Fragmenty alebo úseky polypeptidov opísaných v predkladanom vynáleze je možné využiť na prípravu zodpovedajúcich kompletných polypeptidov peptidovou syntézou; tieto fragmenty je preto možné využiť ako medziprodukty prípravy kompletných polypeptidov.

Fragmenty

Výhodným uskutočnením tohto zámeru predkladaného vynálezu sú tiež polypeptidy obsahujúce fragmenty RG1 a to najmä fragmenty RG1 uvedeného na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a fragmenty variantov a derivátov RG1 uvedeného na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).

Z tohto hľadiska je fragmentom polypeptid, ktorého celková aminokyselinová sekvencia je zhodná s časťou, ale nie s celkom aminokyselinovej sekvencie uvedených polypeptidov RG1 a ich variantov a derivátov.

Tieto fragmenty môžu byť „samostatné“ alebo „voľné“, t. j. nie sú súčasťou iných polypeptidov alebo fuzované s ďalšími aminokyselinami, alebo môžu byť súčasťou väčšieho polypeptidu, ktorého sú úsekom alebo oblasťou. Pokiaľ sú súčasťou väčšieho polypeptidu, tieto uvedené fragmenty najvýhodnejšie tvoria jedinú súvislú oblasť. Jediný väčší polypeptid však môže obsahovať viac fragmentov. Napr. niektoré určité uskutočnenia sa týkajú fragmentu RG1 uvedeného v predkladanom vynáleze, ktorý je obsiahnutý vprekurzore polypeptidu určeného na expresiu v hostiteľovi, a ktorého pre- a propolypeptidové oblasti sú fuzované s N-koncom fragmentu RG1 a ďalšia oblasť je fuzovaná s C-koncom tohto fragmentu. Fragment v jednom určitom význame, ktorý je mienený v tomto aspekte vynálezu, teda označuje úsek alebo úseky fúzneho polypeptidu či fuzneho proteínu odovodeného z RG1.

Reprezentatívnymi príkladmi polypeptidových fragmentov uvedených v tomto vynáleze môžu byť tie, ktoré obsahujú približne 25 až približne 331 aminokyselín.

V tomto kontexte „približne“ zahŕňa konkrétne uvedené rozmedzie a rozmedzie väčšie alebo menšie o niekoľko, pár, 5, 4, 3, 2 alebo 1 aminokyselín na jednej hranici rozmedzia alebo na oboch hraniciach rozmedzia. Napr. približne 331 aminokyselín v tomto kontexte znamená polypeptidový fragment od 25 plus alebo mínus niekoľko, pár, 5, 4, 3,2 alebo 1 aminokyselín do 331 plus alebo mínus niekoľko, pár, 5, 4, 3,2 alebo 1 aminokyselinových zvyškov, t. j. rozmedzie široké od 25 mínus niekoľko aminokyselín do 331 plus niekoľko aminokyselín a úzke od 25 plus niekoľko aminokyselín do 331 mínus niekoľko aminokyselín.

Vysoko výhodné z tohto hľadiska sú už uvedené rozmedzia plus alebo mínus až 5 aminokyselín na ktorejkoľvek z oboch hraníc rozmedzia alebo na oboch hraniciach rozmedzia. Zvlášť vysoko výhodné sú uvedené rozmedzia plus alebo mínus až 3 aminokyseliny na ktorejkoľvek z oboch hraníc rozmedzia alebo na oboch hraniciach rozmedzia. Veľmi vysoko výhodné sú rozmedzia plus alebo mínus jedna aminokyselina na jednej či oboch hraniciach uvedených rozmedzí bez adícii či delécií. Najvýhodnejšími z tohto hľadiska sú fragmenty od približne 25 do približne 331 aminokyselín.

Zvlášť výhodnými fragmentmi v predkladanom vynáleze sú skrátené mutanty RG1. Medzi skrátené mutanty RG1 patria varianty alebo deriváty sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) okrem delécie súvislej série zvyškov (t. j. súvislej oblasti, časti alebo úseku) pokrývajúcej N-koniec sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), alebo súvislej série zvyškov pokrývajúcej C-koniec, alebo ako je to pri dvojnásobných skrátených mutantoch, delécie dvoch súvislých sérií zvyškov, z ktorých jedna zahŕňa N-koniec a jedna C-koniec. Fragmenty s veľkosťou v uvedenom rozmedzí sú tiež výhodnými uskutočneniami skrátených fragmentov, ktoré sú medzi fragmentmi všeobecne považované za zvlášť výhodné.

Zvlášť výhodnými pre tento aspekt predkladaného vynálezu sú fragmenty vyznačujúce sa biologickými a/alebo imunologickými charakteristikami RG1. Tieto fragmenty zhŕňajú fragmenty obsahujúce vopred stanovené štrukturálne domény RG1, ktoré pokrývajú aspoň aminokyseliny 31 až 103, 138 až 221, resp. 278 až 330 alebo fragmenty využité na prípravu protilátok, napr. tie, ktoré sú opísané v príklade 4.

Niektoré oblasti výhodné z tohto hľadiska sú uvedené na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a zahŕňajú, ale bez obmedzenia, oblasti uvedených typov identifikované analýzou aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).

Medzi vysoko výhodné fragmenty z tohto hľadiska patria tie, ktoré obsahujú oblasti RG1, v ktorých sú kombinované určité štrukturálne charakteristiky, ako napr. tie, ktoré sú opísané. Z tohto hľadiska sú zvlášť výhodnými oblasťami dve spondínové a jedna trombospondínová oblasť, ktorá pokrýva približne aminokyseliny 31 až 103, 138 až 221, resp. 278 až 330, ktoré sú charakteristické pre vyššiu rodinu Mindin/spondin proteinov extracelulámeho matrixu. Tieto oblasti môžu byť súčasťou väčšieho polypeptidu, alebo môžu samy osebe predstavovať výhodný fragment predkladaného vynálezu, ako už bolo opísané. Je zrejmé, že termín „približne“, ako je použitý v tomto odseku má uvedený význam, ktorý sa týka fragmentov všeobecne.

Ďalšími výhodnými oblasťami sú oblasti zaisťujúce aktivity RG1. Najvýhodnejšími z tohto hľadiska sú fragmenty majúce chemickú, biologickú či inú aktivitu RG1, vrátane tých, ktoré majú podobnú alebo vyššiu aktivitu tohto typu, alebo majú zníženú nežiaducu aktivitu. Vysoko výhodné z tohto hľadiska sú fragmenty obsahujúce oblasti so sekvenciou či pozíciou, alebo sekvenciou aj pozíciou homológnou s aktívnymi oblasťami príbuzných polypeptidov, ako napr. iné proteíny rodiny Mindinov, vrátane RG1.

Vektory, hostiteľské bunky a expresné systémy

Predkladaný vynález sa tiež týka vektorov, medzi ktoré patria polynukleotidy uvedené v tomto vynáleze, hostiteľské bunky, ktoré sú obvykle geneticky modifikované pomocou vektorov uvedených v tomto vynáleze a prípravy polypeptidov uvedených v tomto vynáleze rekombinantnými metódami. Tieto metódy sú opísané v publikáciách Sambrook et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989, a Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1989.

Hostiteľské bunky môžu byť geneticky modifikované na vnášanie polynukleotidov uvedených v tomto vynáleze a ich expresiu. Polynukleotidy môžu byť vnesené do hostiteľských buniek napr. pomocou dobre známych spôsobov infekcie, transdukcie, transfekcie, transvekcie (transvection) a transformácie. Polynukleotidy môžu byť vnesené samostatne alebo s inými polynukleotidmi. Tieto ďalšie polynukleotidy môžu byť vnesené nezávisle, spoločne alebo v spojení s polynukleotidmi tohto vynálezu.

Tak môžu napr. byť pomocou štandardných spôsobov kotransfekcie a selekcie napr. v bunkách cicavcov, vnesené polynukleotidy uvedené v tomto vynáleze do hostiteľských buniek s inými oddelenými polynukleotidmi, ktoré kódujú selektovateľný markér. V tomto prípade budú obvykle polynukleotidy stabilne zabudované do genómu hostiteľskej bunky.

V inom prípade môžu byť polynukleotidy určené na propagáciu v hostiteľovi spojené s vektorom obsahujúcim selektovateľný markér. Vektorový konštrukt môže byť vnesený do hostiteľskej bunky zmienenými spôsobmi. Plazmidový vektor sa obvykle vnáša ako DNA v precipitáte, napr. ako precipitát fosforečnanu draselného alebo v komplexe s lipidickým iónom. Na vnesenie polynukleotidu do hostiteľa sa môže tiež využiť elektroporácia. Pokiaľ je vektorom vírus, môže byť zabalený in vitro alebo vnesený do zbaľujúcej bunkovej línie a zabalený vírus môže byť transdukciou vnesený do buniek. Odborníkom je dobre známy celý rad rutinne využívaných spôsobov prípravy polynukleotidov a vnášania polynukleotidov do buniek podľa potrieb tohto aspektu predkladaného vynálezu. Tieto spôsoby sú podrobne opísané v uvedenej publikácii Sambrook et al., ktorá je príkladom z mnohých laboratórnych príručiek detailne opisujúcich tieto spôsoby. V súlade s týmto aspektom predkladaného vynálezu môže byť vektorom napr. plazmidový vektor, jednovláknový alebo dvojvláknový fágový vektor, jednovláknový či dvojvláknový RNA či DNA vírusový vektor. Tieto vektory môžu byť vnášané do buniek ako polynukleotidy, výhodne ako DNA, dobre známymi spôsobmi na vnášanie DNA a RNA do buniek. V prípade fágových a vírusových vektorov môžu byť a výhodne aj sú tieto vektory vnášané do buniek ako prirodzene či umelo zbalený vírus dobre známymi spôsobmi infekcie a transdukcie. Vírusové vektory môžu byť schopné či neschopné samostatnej replikácie. Pokiaľ sú replikačne defektné, propagácia vírusu obvykle prebieha iba v komplementujúcich hostiteľských bunkách.

Výhodnými vektormi sú v určitých ohľadoch vektory na expresiu polynukleotidov a polypeptidov uvedených v predkladanom vynáleze. Tieto vektory obvykle obsahujú intramolekuláme pôsobiace kontrolné oblasti na expresiu v hostiteľovi podľa potreby spojené s polynukleotidom, ktorý má byť exprimovaný. Zodpovedajúce intermolekulárne pôsobiace faktory sú poskytnuté buď hostiteľom, alebo komplementujúcim vektorom, či samotným vektorom pri vnášaní do hostiteľa.

V určitých z tohto hľadiska výhodných uskutočneniach vektory umožňujú špecifickú expresiu. Takouto špecifickou expresiou môže byť indukovateľná expresia či expresia iba v určitých typoch buniek alebo oboje, expresia indukovateľná iba v určitých typoch buniek. Medzi zvlášť výhodné indukovateľné vektory patria vektory, ktorých expresiu je možné indukovať faktormi prostredia, ktoré je možné ľahko ovplyvňovať, ako napr. teplota a nutričné prídavky. Rad vektorov vhodných na tento zámer predkladaného vynálezu, vrátane vektorov na konštitutívnu alebo indukovateľnú expresiu v prokaryotických či eukaryotických bunkách, je dobre známy a rutinne využívaný odborníkmi.

Geneticky modifikované hostiteľské bunky sa môže kultivovať v konvenčnom živnom médiu, ktoré môže byť podľa potreby upravené napr. na aktiváciu promótorov, selekciu transformantov alebo amplifikáciu génov. Kultivačné podmienky, ako napr. teplota, pH a pod., predtým použité na kultiváciu hostiteľskej bunky vybranej na expresiu všeobecne, budú vhodné na expresiu polypeptidov podľa predkladaného vynálezu a odborníci ich ľahko odvodia.

Na expresiu polypeptidu predkladaného vynálezu je možné využiť množstvo rôznych expresných vektorov. Medzi tieto vektory patria chromozomálne, epizomálne alebo od vírusov odvodené vektory, napr. vektory odvodené z bakteriálnych plazmidov, bakteriofágov, kvasinkových epizómov, kvasinkových chromozomálnych elementov, z vírusov, ako sú bakulovírusy, papovavírusy ako SV40, vírusy kravských kiahní, adenovírusy, vírus kiahní hydiny, vírusy pseudobesnoty, retrovírusy a alfavírusy, ako je vírus Sindbis a vektory odvodené z ich kombinácií, ako napr. vektory odvodené z plazmidových a bakteriofágových genetických elementov, ako sú kozmidy a „phagemidy“, všetky tieto vektory sa môžu využiť na expresiu v súlade s týmto aspektom predkladaného vynálezu. Z tohto hľadiska je možné využiť na expresiu polypeptidu v hostiteľovi akýkoľvek vektor, ktorý je schopný niesť, množiť či exprimovať nejaký polynukleotid.

Zodpovedajúca sekvencia DNA môže byť vložená do vektora akýmkoľvek z celého radu dobre známych a rutinne využívaných spôsobov. Sekvencia DNA, ktorá má byť exprimovaná, je obvykle spojená s expresným vektorom pomocou štiepenia sekvencie DNA a expresného vektora jednou či viac reštrikčnými endonukleázami a potom spojením reštrikčných fragmentov pomocou DNA ligázy T4. Spôsoby štiepenia a ligácie, ktoré sa môžu na tento účel využiť, sú dobre známe a rutinne využívané odborníkmi. Spôsoby vhodné na tieto účely a na konštrukciu expresných vektorov pomocou alternatívnych techník, ktoré sú tiež dobre známe a rutinne využívané odborníkmi, sú objasnené v publikácii Sambrook et al., ktorá je tu uvedená na inom mieste.

Sekvencia DNA v expresnom vektore je podľa potreby spojená s vhodnou sekvenciou (vhodnými sekvenciami) na kontrolu expresie, ako napr. promótorom riadiacim transkripciu mRNA. Príklady takýchto promótorov sú PL promótor λ fága, promótory E. coli lac, trp, tac a trc, skorý a neskorý promótor SV40 a promótory retrovírusových LTR, aby sme uviedli aspoň niekoľko dobre známych promótorov. Je zrejmé, že mnoho promótorov, ktoré tu nie sú uvedené, je vhodných na použitie v tomto aspekte predkladaného vynálezu, a sú dobre známe a môžu byť ľahko využité odborníkmi podľa opisu a príkladov uvedených v tomto vynáleze.

Expresné vektory obvykle obsahujú miesta na iniciáciu transkripcie a terminácie a v transkribovanej oblasti majú ribozómové väzbové miesto na transláciu. Kódujúci úsek transkriptov exprimovaný konštruktmi obsahuje na začiatku kodón AUG na iniciáciu transkripcie a na konci vhodne umiestnený terminačný kodón pre polypeptid, ktorý má byť translatovaný.

Okrem toho môžu konštrukty obsahovať kontrolné oblasti, ktoré regulujú aj vyvolávajú expresiu. V súlade s mnohými bežne používanými spôsobmi tieto oblasti obvykle fungujú tak, že zaisťujú kontrolu transkripcie ako napr. väzbové miesta pre represory a enhancery.

Vektory na propagáciu (množenie) a expresiu obvykle obsahujú selektovateľné markery. Tieto markery môžu byť tiež využité na ich amplifikáciu alebo môžu s týmto cieľom obsahovať iné markery. Z tohto hľadiska expresné vektory obsahujú výhodne jeden či viac selektovateľných markerových génov, poskytujúcich fenotypovú charakteristiku na selekciu transformovaných hostiteľských buniek. Výhodnými markermi sú pre eukaryotické bunky napr. rezistencia na dihydrofolátreduktázu, neomycín, puromycín či hydromycín a na kultiváciu E. coli a iných baktérií gény pre rezistenciu na tetracyklín, teomycín, kanamycín či ampicilín.

Vektor, ktorý obsahuje vhodnú sekvenciu DNA, ako je opísaná inde v predkladanom vynáleze, ako aj vhodný promótor a ďalšie vhodné kontrolné sekvencie sa môže vniesť do vhodného hostiteľa pomocou množstva dobre známych vhodných spôsobov na zaistenie expresie požadovaného polypeptidu v tomto hostiteľovi. Medzi reprezentatívne príklady vhodných hostiteľov patria bakteriálne bunky ako napr. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; bunky húb ako kvasinkové bunky; bunky hmyzu ako Drozofila S2 a Spodoptera Sf9, živočíšne bunky ako CHO, COS a bunky Bowesovho melanómu; a rastlinné bunky; výhodne hmyzie bunky BTI-TN-5B1-4. Je známy celý rad hostiteľov na expresné konštrukty a odborníci by mali byť schopní pomocou uvedených informácií vybrať hostiteľa na expresiu polypeptidov na účely tohto aspektu predkladaného vynálezu.

Na expresiu je možné využiť celý rad cicavčích systémov tkanivových kultúr. Medzi príklady cicavčích expresných systémov patria bunkové línie opičích obličkových fibroblastov COS-7 (Gluzman et al., Celí 23:175, 1991). Ďalšie bunkové línie schopné exprimovať kompatibilný vektor sú napr. bunkové línie C127, 3T3, CHO, HeLa, ľudské obličkové bunky 293 a BHK. V cicavčích hostiteľských bunkách môže byť využitý rad vírusových expresných systémov. Pokiaľ sa ako expresný vektor použije adenovírus, polynukleotidová sekvencia kódujúca RG1 sa môže ligovať do adenovírusového komplexu na transkripciu/transláciu, zloženého z neskorého promótora a trojdielnej vedúcej „leader“ sekvencie. Vnesením do postrádateľných oblastí vírusového genómu El či E3 sa získa životaschopný vírus schopný exprimovať RG1 v infikovaných hostiteľských bunkách (Logan a Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-59, 1984). Navyše môžu byť na zosilnenie expresie v cicavčích hostiteľských bunkách využite enhancery transkripcie ako napr. enhancer vírusu Rousovho sarkómu (RVS).

Predkladaný vynález tiež konkrétnejšie uvádza rekombinantné konštrukty, ako napr. expresné konštrukty, ktoré obsahujú jednu alebo viac opísaných sekvencii. Tieto konštrukty obsahujú vektor, napr. plazmidový alebo vírusový, do ktorého sa vložila sekvencia uvedená v tomto vynáleze. Sekvencia môže byť vložená v priamom či opačnom smere. V niektorých, z tohto hľadiska výhodných, uskutočneniach konštrukt ďalej obsahuje regulačné sekvencie ako napr. promótor, podľa potreby spojený s danou sekvenciou. Odborníkom je známy celý rad vhodných vektorov a existuje mnoho komerčne dostupných vektorov využiteľných na účely predkladaného vynálezu.

Ako príklad sú tu uvedené nasledujúce komerčne dostupné vektory. Medzi vektory výhodne využiteľné v baktériách patria pQE70, pQE60 a pQE-9 od firmy Qiagen USA (Valencia, CA); vektory pBS, Phagescript®, Bluescript®, pNH8A, pNHI6a, pNHI8A, pNH46A od firmy Stratagene (LaJolla, CA); aptrc99a, pK223-3, pKK233-3, pDR54O, pRIT5 od firmy Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Najvýhodnejší je vektor pTrcHisB od firmy Invitrogen. Medzi výhodné eukaryotické vektory patrí pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTI a pSG od firmy Stratagene; a PSVK3, pBPV, pMSG apSVL od firmy Pharmacia Biotech. Najvýhodnejší je vektor pCIneo od firmy Promega. Tieto vektory sú uvedené iba ako ilustratívne príklady mnohých komerčne dostupných a dobre známych vektorov, ktoré majú odborníci k dispozícii a môžu ich využiť na účely predkladaného vynálezu. Je zrejmé, že akýkoľvek iný plazmid alebo vektor, vhodný napr. na vnesenie, uchovanie, propagáciu alebo expresiu polynukleotidu či polypeptidu uvedeného v tomto vynáleze v hostiteľovi, sa môže využiť na účely predkladaného vynálezu.

Promótorovú oblasť je možné selektovať z akéhokoľvek požadovaného génu pomocou vektorov, ktoré obsahujú reportérovú transkripčnú jednotku a chýbajúcu promótorovú oblasť, ako napr. chloramfenikolacetyltransferázová („cat“) transkripčná jednotka, ktorá je umiestená za reštrikčným miestom alebo miestami na vloženie kandidátneho promótorového fragmentu, t. j. fragmentu, ktorý by mohol obsahovať promótor. Ako je dobre známe, vloženie fragmentu obsahujúceho promótor do reštrikčného miesta vektora pred gén cat spôsobí, že sa prejaví aktivita CAT, ktorá môže byť stanovená štandardnými testami na CAT. Vektory vhodné na tento účel sú dobre známe a dostupné. Dvoma takýmito vektormi sú pKK232-B a pCM7. Promótory na expresiu polynukleotidov predkladaného vynálezu sú teda nielen dobre známe a dostupné promótory, ale tiež promótory, ktoré je možné pripraviť existujúcimi spôsobmi pomocou reportérových génov.

Medzi známe bakteriálne promótory vhodné na expresiu polynukleotidov a polypeptidov na účely predkladaného vynálezu patria promótory E. coli lacl a lacZ, promótory T3 a T7, promótor T5 tac, lambda PR, PL promótory, promótor trp a hybridný promótor tre, ktorý je odvodený z promótorov trp a lac. Známymi eukaryotickými promótormi vhodnými na tieto účely sú veľmi skorý promótor CMV, tymidínkinázový pro motor HSV, skorý a neskorý promótor SV40, promótory retrovírusových LTR, ako napr. z vírusu Rousovho sarkómu (RVS) a metalotioneínové promótory, ako napr., promótor myšieho metalotioneínu-I.

Selekcia vhodných vektorov a promótorov na expresiu v hostiteľskej bunke je dobre známa a potrebné spôsoby na konštrukciu vektorov, vnesenie vektora do hostiteľa a expresiu v hostiteľovi sú odborníkmi rutinne využívané.

Rekombinantné expresné vektory obvykle obsahujú počiatok replikácie, promótor odvodený z vysoko exprimovaného génu na riadenie transkripcie Štruktúrnej sekvencie, ktorá sa nachádza za ním a selektovateľný marker umožňujúci izoláciu buniek, ktoré obsahujú vektor po ich vystavení pôsobenia vektorov.

Predkladaný vynález sa tiež týka už opísaných hostiteľských buniek, ktoré obsahujú už zmienené konštrukty. Hostiteľskou bunkou môže byť vyššia eukaryotická bunka, napr. cicavčia, alebo nižšia eukaryotická bunka, napr. kvasinka, alebo hostiteľskou bunkou môže byť prokaryotická bunka, napr. bakteriálna. Konštrukty vnesené do hostiteľských buniek sa môžu využiť konvenčným spôsobom na produkciu génového produktu, ktorý je kódovaný rekombinantnou sekvenciou.

Polypeptidy sa môžu exprimovať v cicavčích bunkách, kvasinkách, baktériách alebo iných bunkách pod kontrolou vhodných promótorov. Na produkciu týchto proteínov pomocou RNA odvodených z konštruktov DNA uvedených v predkladanom vynáleze sa tiež môžu využiť bezbunkové translačné systémy. Vhodné klonovacie a expresné vektory na využitie v prokaryotických a eukaryotických hostiteľoch sú opísané v publikácii Sambrook et al., ktorá je tu uvedená na inom mieste.

Transkripcia DNA, ktorá kóduje polypeptid uvedený v predkladanom vynáleze, vyššími eukaryotickými bunkami môže byť zosilnená vložením enhancerovej sekvencie do vektora. Enhancery sú intramolekuláme pôsobiace elementy DNA, obvykle o 10-300 bp, ktorých funkciou je zosilňovať transkripčnú aktivitu promótora v danom hostiteľskom bunkovom type. Príkladom enhancerov je enhancer SV40, ktorý je umiestnený v neskoršej časti od počiatku replikácie medzi bp 100 a 270, ďalej skorý cytomegalovírusový enhancer, enhancer polyómového vírusu umiestnený v neskorej časti od počiatku replikácie a ďalej adenovírusové enhancery.

Polynukleotidy uvedené v tomto vynáleze, ktoré kódujú heterológnu štruktúrnu sekvenciu polypeptidu podľa vynálezu, sa obvykle vkladajú do vektora pomocou štandardných techník, pričom sú operabilne spojené s expresným promótorom. Polynukleotid je umiestený tak, aby bol počiatok transkripcie umiestený v správnej pozícii 5' od ribozóm viažuceho miesta. Ribozóm viažuce miesto je umiestnené v pozícii 5' od kodónu AUG, ktorý iniciuje transláciu polypeptidu, ktorý má byť exprimovaný. Medzi ribozóm viažucim miestom a iniciačným kodónom AUG obvykle nie je žiadny ďalší otvorený čítací rámec, ktorý začína iniciačným kodónom AUG. Na konci polypeptidu je tiež obvykle umiestený kodón na termináciu translácie a na 3' konci transkribovanej oblasti sa tiež nachádza zodpovedajúcim spôsobom umiestený polyadenylačný signál a signál na termináciu transkripcie.

Na sekréciu translatovaného proteínu do lumenu endoplazmatického retikula, do periplazmatického priestoru alebo do extracelulámeho prostredia môžu byť do exprimovaného polypeptidu zabudované zodpovedajúce sekrečné signály. Týmito signálmi môžu byť endogénne signály daného polypeptidu alebo to môžu byť heterológne signály. Polypeptid môže byť exprimovaný v pozmenenej forme, napr. ako fúzny proteín a môže obsahovať nielen sekrečné signály, ale tiež ďalšie heterológne funkčné oblasti. Tak môže byť napr. na N-koniec polypeptidu pripojená oblasť ďalších aminokyselín, najmä tých, ktoré nesú náboj, aby tak bola zvýšená stabilita a schopnosť pretrvávania v hostiteľskej bunke pri purifikácii alebo pri ďalšej manipulácii a skladovaní. Môžu byť tiež pripojené ďalšie špeciálne oblasti na uľahčenie purifikácie polypeptidu. Tieto oblasti môžu byť pred konečnou prípravou polypeptidu odstránené. Pripojenie peptidových oblastí na polypeptidy napr. s cieľom vyvolať sekréciu či exkréciu, na zlepšenie stability a na uľahčenie purifikácie sú bežné známe a rutinné spôsoby. Napr. v prípade potreby väčšieho množstva RG1 na indukciu protilátok môžu byť potrebné vektory, ktoré zaisťujú vysokú hladinu expresie ľahko purifikovateľných fuznych proteínov. Medzi týmito vektormi je možné uviesť okrem iného multifunčné klonovacie a expresné vektory E. coli, ako napr. Bluescript® (Stratagene), kde kódujúca sekvencia rgl môže byť do vektora ligovaná v čítacom rámci so sekvenciou N-koncového Met a ďalších 7 zvyškov /3-galaktozidázy, takže vzniká hybridný proteín; vektory pIN (Van Heede a Shuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509, 1989) a pod. Vektory PtrcHis (Invitrogen, Carlsbad, C A) je možné využiť na expresiu cudzorodých polypeptidov a fúznych proteínov, ktoré obsahujú polyhistidínovú (6x His) značku pre ľahkú purifikáciu. Proteíny produkované v týchto systémoch sú navrhnuté tak, aby obsahovali štiepne miesta, napr. štiepne miesto pre enterokinázu, takže klonovaný polypeptid sa môže vyštiepiť z fúznej peptidovej časti podľa potreby.

Po transformácii vhodného hostiteľského kmeňa a namnožení hostiteľského kmeňa do potrebnej bunkovej hustoty je možné zodpovedajúcim spôsobom indukovať indukovateľné promótory, ak sú prítomné (napr. zmenou teploty či pridaním chemického induktora) a potom bunky ďalej kultivovať.

Potom sa bunky obvykle odoberú centrifugáciou, rozrušia fyzickou alebo chemickou cestou a výsledný hrubý extrakt sa uchováva na ďalšiu purifikáciu.

Mikrobiálne bunky využité na expresiu proteínov sa môžu rozrušiť akýmkoľvek vhodným spôsobom, vrátane cyklického zmrazovania a rozmrazovania, ultrazvukom, mechanickým rozrušením alebo využitím látok, ktoré vyvolávajú lýzu buniek; tieto spôsoby sú odborníkom známe.

Polypeptid RG1 sa môže získať a purifikovať z kultúr rekombinantných buniek dobre známymi spôsobmi, napr. precipitáciou síranom amónnym či etanolom, kyslou extrakciou, chromatografiou na ionomeničoch a fosfocelulóze, chromatografiou, ktorá využíva hydrofóbne interakcie, afinitnú chromatografiu, chromatografiu na hydroxyapatite a lektínovú chromatografiu. Najvýhodnejšiou purifikáciou je chromatografia HPLC (high performance liquid chromatography). Pokiaľ je polypeptid počas izolácie a purifikácie denaturovaný, je možné na obnovu jeho aktívnej konformácie využiť dobre známe spôsoby obnovy molekulárneho usporiadania proteínov. Medzi mnohé dobre známe spôsoby purifikácie proteínov je možné uviesť tie, ktoré sú opísané v publikáciách Deutscher, M., Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press, San Diego, 1982; a Scopes, R., Proteín Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982.

Polypeptidy uvedené v predkladanom vynáleze je tiež možné pripraviť priamou syntézou peptidov spôsobmi, ktoré využívajú látky v pevnej fáze (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). Syntéza proteínov in vitro sa môže uskutočňovať ručne alebo automatizovane. Automatizovaná syntéza sa môže uskutočňovať napr. pomocou syntetizátora Applied Biosystems 413A Peptide Synthetizer (Perkin Elmer, Foster City, Calif) podľa návodu výrobcu. Rôzne fragmenty RG1 sa môžu chemicky syntetizovať každý zvlášť a potom kombinovať chemickými spôsobmi na kompletné molekuly.

Medzi polypeptidy uvedené v predkladanom vynáleze patria prirodzene purifikované produkty, produkty chemických syntetických spôsobov a produkty získané rekombinantnými spôsobmi z buniek prokaryotických či eukaryotických hostiteľov, napr. z baktérií, kvasiniek, buniek vyšších rastlín, hmyzích buniek či cicavčích buniek. V závislosti od hostiteľa, ktorý sa použil pri spôsobe rekombinantnej prípravy, môžu byť polypeptidy uvedené v tomto vynáleze glykozylované či neglykozylované. Navyše môžu tieto polypeptidy tiež obsahovať modifikovaný počiatočný metionínový zvyšok, niekedy ako dôsledok procesov, za ktoré je zodpovedný hostiteľ.

Použitie polypeptidov RG1 a polynukleotidov, ktoré ich kódujú

Polynukleotidy rgl a polypeptidy RG1 sa môžu využiť na účely predkladaného vynálezu v množstve aplikácií, najmä tých, ktoré využívajú chemické a biologické vlastnosti RG1. Ďalšie aplikácie sa týkajú diagnostiky a liečby chorôb zhubného bujnenia, napr. rakoviny prostaty. Tieto aspekty predkladaného vynálezu sú diskutované v nasledujúcom texte a sú tiež opísané ďalej v opise.

Dôvod na použitie polynukleotidových a polypeptidových sekvencii v predkladanom vynáleze je založený čiastočne na chemickej a štruktúrnej homológii medzi opísaným RG1 a inými molekulami extracelulárneho matrixu, a ďalej na prevládajúcej expresii RG1 v prostatických tkanivách v porovnaní s inými tkanivami. RG1 je možné využiť na diagnostiku a liečbu stavov, porúch či chorôb spojených s abnormálnym rastom prostatického tkaniva. Tými sú napr. rakovina a metastatické nádorové bujnenie, ale aj iné choroby.

Polynukleotidové sekvencie rgl je možné využiť ako sondy DNA a ako ciele na „antisense“ či ribozýmovú liečbu, alebo ako templáty na prípravu „antisense'' polynukleotidov.

Polypeptidy RG1 je možné využiť na prípravu protilátok proti RG1, ktoré môžu slúžiť na detekciu hladiny polypeptidu RG1 v bunkách a tkanivách a na zacielenie liečiv do primárnych a metastatických nádorov.

Polypeptidy RG1 sa môžu využiť na stimuláciu imunitnej odpovede buniek obsahujúcich RG1.

Polynukleotidy kódujúce RG1 sa môžu využiť na diagnostické testy na detekciu hladiny polynukleotidov kódujúcich RG1 v bunkách a tkanivách.

Pri stavoch spojených s expresiou RG1, napr. pri rakovine prostaty, môže byť výhodné potlačiť expresiu či aktivitu RG1. Expresia RG1 môže byť potlačená podaním „antisense“ oligonukleotidov alebo ribozýmov. Je možné tiež podávať protilátky špecificky rozpoznávajúce oblasti polypeptidu RG1 zodpovedné za jeho aktivitu, a tak liečiť choroby či stavy spojené s aktivitou RG1.

Polynukleotidové testy

Predkladaný vynález sa tiež týka použitia polynukleotidov, ktoré sú príbuzné rgl na detekciu komplementárnych polynukleotidov, napr. ako diagnostických činidiel. Detekcia polynukleotidov rgl spojených s chorobným stavom môže slúžiť ako nástroj na vývoj diagnostických spôsobov in vivo a in vitro, ktoré môžu zlepšiť alebo určiť diagnózu choroby alebo náchylnosť na chorobu, ktorá je výsledkom tkanivovo špecifickej expresie RG1.

Jedinci s mutáciami génu, ktorý kóduje RG1, môžu byť identifikovaní na úrovni DNA množstvom spôsobov. Vzorky polynukleotidov na diagnostiku sa môžu získať z pacientových buniek, napr. z krvi, moču, slín, biopsie tkaniva či pitevných materiálov. Genómová DNA sa môže využiť na priamu detekciu alebo sa môže pred analýzou enzymaticky amplifikovaťpomocou PCR (Saiki et al., Náture 324: 163-166, 1986). Takto je možné tiež využiť RNA alebo cDNA. Ako príklad je možné uviesť využitie PCR primérov komplemen16 támych k polynukleotidovej sekvencii kódujúcej RG1 na identifikáciu a analýzu expresie a mutácií rgl. Delécie a inzercie je možné napr. zaistiť zmenami veľkosti amplifikovaného produktu oproti normálnemu genotypu. Bodové mutácie je možné určiť hybridizáciou amplifikovanej DNA rádioaktívne značenou RNA rgl alebo pomocou rádioaktívne značených „antisense“ sekvencii DNA rgl. Dokonale môžu byť odlíšené zodpovedajúce sekvencie od nezodpovedajúcich duplexov štiepením Rnázou A alebo rozdielmi v teplote topenia.

Rozdiely v sekvencii medzi referenčným génom a mutovanými génmi sa môžu tiež zistiť priamym sekvenovaním DNA. Klonované segmenty DNA sa môžu tiež využiť ako sondy na detekciu špecifických segmentov DNA. Citlivosť týchto spôsobov môže byť značne zvýšená vhodným využitím PCR alebo inými amplifikačnýmí spôsobmi. Napr. sekvenovací primér sa používa s dvoj vláknovým produktom PCR alebo jednovláknovou molekulou templátu pripravenou modifikovanou reakciou PCR. Sekvencia je určená konvenčnými spôsobmi pomocou rádioaktívne značených polynukleotidov či automatickými sekvenačnými spôsobmi pomocou fluorescenčných značiek.

Genetické testy založené na rozdieloch sekvencii DNA sa môžu uskutočňovať na základe detekcie zmien elektroforetickej pohyblivosti fragmentov DNA v géloch, za prítomnosti denaturačných činidiel alebo bez nich. Malé sekvenčné delécie a inzercie sa môžu zviditeľniť gélovou elektroforézou s vysokou odlíšiteľnosťou. Fragmenty DNA rôznych sekvencii môžu byť odlíšené na denaturačných formamidových gradientových géloch, kde pohyblivosť rôznych fragmentov DNA je v géli spomalená v rôznych miestach, ktoré zodpovedajú ich špecifickej teplote topenia alebo čiastočného topenia (pozri napr. Myers et al., Science 230: 1242, 1985).

Zmeny sekvencie na rôznych miestach sa môžu tiež identifikovať pomocou nukleázových ochranných testov (nuclease protection assays), ako je ochrana pred RNázou a SI alebo spôsobom chemického štiepenia (pozri napr. Catton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401, 1985).

Detekcia špecifickej sekvencie DNA sa teda môže uskutočňovať spôsobmi, ako je hybridizácia, ochranná pred Rnázou, chemické štiepenie, priame sekvenovanie DNA alebo využitím reštrikčných enzýmov (napr. testovanie polymorfizmu dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP) a Southem blotting genómovej DNA).

Okrem konvenčnejších spôsobov ako je gélová elektroforéza alebo sekvenovanie DNA je možné uskutočňovať detekciu mutácií tiež analýzou in situ.

Polypeptidové testy

Predkladaný vynález sa tiež týka diagnostických spôsobov, ako sú kvantitatívne a diagnostické testy na detekciu hladiny polypeptidu RG1 v bunkách, tkanivách a telesných tekutinách, ktoré zahŕňajú určenie normálnej a abnormálnej hladiny. Tak napr. diagnostický test podľa predkladaného vynálezu, ktorý slúži na detekciu zvýšenej expresie polypeptidu RG1 oproti normálnym vzorkám tkaniva, sa môže využiť na detekciu výskytu neoplázie, napr. rakoviny prostaty. Tieto diagnostické testy sa môžu tiež využiť na detekciu metastatického nádorového rastu. Testovacie spôsoby, ktoré je možné využiť na určenie hladiny nejakého polypeptidu, napr. polypeptidu RG1 uvedeného v tomto vynáleze, vo vzorke odvodenej od hostiteľa, sú odborníkom dobre známe. Tieto testovacie spôsoby zahŕňajú rádioimunologické testy (RIA), kompetitívne väzbové testy, analýzu Western blot a testy ELISA („enzyme-linked immunoabsorbant assay“) a ďalej fluorescenčné bunkové triedenie (FACS), z ktorých sa najčastejšie používa test ELISA. Pri teste ELISA sa najskôr pripraví protilátka špecifická pre RG1, výhodne monoklonálna protilátka. Okrem toho sa obvykle pripraví reportérova protilátka, ktorá sa viaže na monoklonálnu protilátku. Reportérová protilátka sa pripojí na identifikovanú látku, ako napr. na rádioaktívnu, fluorescenčnú či enzymatickú látku, v tomto prípade na enzým chrenová peroxidáza.

Pri uskutočňovaní testu ELISA sa z hostiteľa odoberie vzorka a inkubuje sa na pevnom nosiči, napr. na polystyrénovej doštičke, kde sa ukotvia polypeptidy zo vzorky. Všetky voľné väzbové miesta na doštičke sa potom blokujú inkubáciou s nešpecifickým proteínom, ako je bovinný sérový albumín. Potom sa monoklonálna protilátka inkubuje na doštičke, pričom sa na polypeptidy RG1 ukotvené na polystyrénovej doštičke naviažu monoklonálne protilátky. Naviazaná monoklonálna protilátka sa vymyje pufrom. Reportérová protilátka viazaná na chrenovú peroxidázu sa nanesie na doštičku, takže reportérová protilátka sa naviaže na ktorúkoľvek monoklonálnu protilátku viazanú na RGL Nenaviazaná reportérová protilátka sa potom vymyje. Potom sa na doštičku pridajú látky na zistenie peroxidázovej aktivity, vrátane substrátu pre farebnú reakciu. Imobilizovaná peroxidáza viazaná na RG1 cez primárne a sekundárne protilátky vyvolá farebnú reakciu. Sila farebnej reakcie v určitých časových intervaloch označuje množstvo polypeptidu RG1, ktorý je prítomný vo vzorke. Kvantitatívne výsledky sa obvykle vyhodnocujú referenčným porovnaním so štandardnou krivkou.

Kompetitívny test je možné uskutočňovať kedykoľvek, keď je protilátka špecifická pre RG1 ukotvená na pevnom nosiči, a keď značený RG1 a vzorka odvodená z hostiteľa sa nanesie na pevný nosič, pričom množstvo značiacej látky ukotvenej na pevnom nosiči je potom možné korelovať s množstvom RG1 vo vzorke.

Tento test a ďalšie sú opísané okrem iného v publikáciách Flamptom et. al. (Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn, 1990) a Maddos et al. (J. Exp. Med. 158: 12111, 1983).

Protilátky

Predkladaný vynález sa ďalej týka protilátok, ktoré špecificky viažu RG1 a sú označnené ako protilátky proti RG1. Zvýšená exprcsia RG1 v tkanivách prostaty a jeho výskyt na povrchu bunky sú výbornými markerovými charakteristikami (značkami) na skrining, diagnostiku, určenie prognózy, testovanie pri dlhodobom sledovaní a na zobrazovacie spôsoby. Navyše tieto charakteristiky naznačujú, že by RG1 mohol byť výborným cieľom pre terapeutické spôsoby, ako je cielená liečba protilátkami, imunoterapia a génová terapia. Termín „špecificky viaže“, ako je používaný, znamená interakciu protilátky s polypeptidom, kde táto interakcia závisí od prítomnosti konkrétnej štruktúry (t. j. antigénneho determinantu či epitopu) na polypeptide; inými slovami protilátka rozpoznáva a viaže skôr špecifickú polypeptidovú štruktúru než proteíny všeobecne.

Polypeptidy RG1, ich fragmenty či iné deriváty, ich analógy alebo bunky, ktoré ich exprimujú, sa môžu využiť ako imunogény na produkciu protilátok proti nim (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Týmito protilátkami môžu byť napr. polyklonálne či monoklonálne protilátky. Predkladaný vynález tiež zahŕňa chimérické a jednoreťazcové protilátky, humanizované a ľudské protilátky a ďalej fragmenty Fab alebo produkty expresných knižníc Fab. Na prípravu týchto fragmentov a protilátok je možné využiť množstvo spôsobov známych odborníkom.

Protilátky pripravené proti polypeptidom, ktoré zodpovedajú sekvencií uvedenej v predkladanom vynáleze, sa môžu získať priamou injekciou polypeptidov do živočíšneho jedinca alebo podaním polypeptidov živočíšnemu jedincovi, najlepšie iného druhu než človek. Takto získaná protilátka potom bude sama viazať tieto polypeptidy. Tak sa aj pomocou sekvencie, ktorá kóduje iba fragment týchto polypeptidov, dajú získať protilátky viažuce celý natívny polypeptid. Tieto protilátky je potom možné využiť na izoláciu polypeptidov z tkanív, ktoré exprimujú požadovaný polypeptid.

Pri príprave monoklonálnych protilátok sa môže využiť akýkoľvek spôsob, ktorý zaistí tvorbu protilátok kultúrami permanentných bunkových línií. Ako príklad je možné uviesť prípravu hybridómov (Kohler a Milstein, Náture 256: 495-497, 1975), prípravu hybridómov ľudských B buniek (Kozbor et al„ Imunology Today č: 72, 1983) a prípravu EBV-hybridómov na produkciu ľudských monoklonálnych protilátok (Cóle et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77-96, 1985).

Je možné tiež využiť spôsoby vyvinuté na prípravu „chimérických protilátok“, založených na spojení myších génov pre protilátky s ľudskými génmi pre protilátky a získať tak molekulu so zodpovedajúcou špecifickou antigénnou špecificitou a biologickou aktivitou (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1984; Neuberger at al„ Náture 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Náture 314: 452-454, 1985). Okrem toho je možné využiť aj spôsoby na prípravu jednoreťazcových protilátok (U. S. Pat. č. 4 946 778) a prispôsobiť ich na prípravu jednoreťazcových protilátok, ktoré sú špecifické pre RG1.

Ďalej je možné pripraviť „ľudské“ („humánne“) protilátky spôsobmi opísanými v patentoch USA č. 5 877 397 a 5 569 825, ktoré sú uvedené v plnom znení formou odkazu.

Protilátky je tiež možné pripraviť indukovaním produkcie in vivo v populácii lymfocytov alebo plošným testovaním rekombinantných imunoglobulínových knižníc či súborov vysoko špecifických väzbových látok, ako je opísané v publikáciách Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989) aWinter a Milstein (Náture 349:293-299, 1991).

Je možné tiež pripraviť fragmenty protilátok, ktoré obsahujú špecifické väzbové miesta pre RG1. Tieto fragmenty zahŕňajú okrem iného napr. fragmenty F(ab')2, ktoré sa môžu pripraviť pepsínovým štiepením molekuly protilátky a fragmenty Fab, ktoré je možné pripraviť redukciou disulfidických mostíkov fragmentov F(ab')2. Je možné tiež pripraviť expresné knižnice Fab na rýchlu a ľahkú identifikáciu fragmentov monoklonálnych Fab s požadovanou špecificitou (Huse et al., Science 256:1270-1281, 1989).

Aminokyselinová sekvencia RG1 uvedená v tomto vynáleze môže slúžiť na selekciu špecifických oblasti polypeptidov RG1 na prípravu protilátok. Odborníkom jc známe, že výber oblastí alebo epitopov polypeptidov RG1, proti ktorým je protilátka zameraná, sa môže líšiť podľa zamýšľaného využitia. Napr. protilátky určené na imunologické testovanie RG1 viazaného na membránu buniek prostaty by mali byť zamerané proti prístupným epitopom na polypeptide RG1. Oblasti polypeptidu RG1 majú imunogénnu štruktúru a ďalšie oblasti a domény je možné ľahko identifikovať pomocou množstva ďalších spôsobov známych odborníkom, ako napr. analýza podľa Chou-Fasmana, Gamier-Robsona či Jameson-Wolfa. Fragmenty obsahujúce tieto aminokyselinové zvyšky sú zvlášť výhodné na prípravu protilátok proti RG1. Medzi zvlášť výhodné fragmenty patrí okrem iného sekvencia PLGGESICSAGAPAKYSIT (sekvencia SEQ ID NO: 8); HSSDYSMWRKNQYVS (sekvencia SEQ ID NO: 10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (sekvencia SEQ ID NO: 11); a NEIVSASVPET (sekvencia SEQ ID NO: 12).

Príprava protilátok proti týmto oblastiam je opísaná v príklade 4.

Protilátky proti RG1 opísané v predkladanom vynáleze môžu byť zvlášť výhodné na diagnostické testovanie, zobrazovacie spôsoby a terapeutické spôsoby pri liečbe rakoviny prostaty. Tento vynález navrhuje rad imunologických testov na detekciu polypeptidov RG1 a na diagnostiku rakoviny prostaty. Tieto testy obvykle zahŕňajú jednu alebo viac protilátok proti RG1 schopnú rozpoznávať a viazať polypeptid RG1. Najvýhodnejšími protilátkami sú tie protilátky, ktoré viažu RG1 a neviažu (alebo viažu len slabo) iné polypeptidy než

RG1. Tieto testy zahŕňajú rôzne formy imunologických testov dobre známe odborníkom, vrátane okrem iného rôznych typov rádioimunologických testov, testov ELISA a pod. Okrem toho predkladaný vynález tiež uvádza imunologické zobrazovacie spôsoby na detekciu rakoviny prostaty, vrátane okrem iného radioscintigrafických zobrazovacích spôsobov pomocou značených protilátok proti RG1. Tieto testy sa môžu využiť klinicky na detekciu, sledovanie a určenie prognózy rakoviny prostaty.

Opísané protilátky môžu slúžiť na izoláciu a identifikáciu klonov exprimujúcich polypeptid uvedený v predkladanom vynáleze alebo na purifikáciu tohto polypeptidu ukotvením protilátky na pevný nosič na izoláciu a/alebo purifikáciu afinitnou chromatografiou.

Protilátky proti RG1 sa môžu ďalej použiť na izoláciu buniek pozitívnych na RG1 použitím techník založených na triedení buniek a purifikačnými technikami. Protilátky proti RG1 sa môžu využiť zvlášť na izoláciu nádorových buniek prostaty z nádorového tkaniva xenograftov alebo z buniek tkanivových kultúr a pod. triedením buniek protilátkami alebo technikami afinitnej purifikácie. Ďalej je možné protilátky proti RG1 uvedené v tomto vynáleze využiť na prípravu antiidiotypových protilátok napodobňujúcich polypeptid RG1.

Protilátky proti RG1 môžu slúžiť na detekciu výskytu rakoviny prostaty či nádorových metastáz. Prítomnosť týchto buniek obsahujúcich RG1 v rôznych biologických vzorkách, ako je sérum, vzorky biopsií prostaty a iného tkaniva, je možné stanoviť pomocou protilátok proti RG1. Protilátky proti RG1 je tiež možné využiť na rôzne zobrazovacie spôsoby ako imunoscintigrafia pomocou ^99raTc (či iného izotopu) konjugovaného s protilátkou. Napr. zobrazovací protokol podobný protokolu nedávno opísanému v literatúre, ktorý využíva ¹¹’l konjugovaný s protilátkou proti PSMA je možné využiť na detekciu opakovaných a metastatických nádorov prostaty (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766,1997).

Protilátky proti RG1 uvedené v predkladanom vynáleze sa môžu značiť markerom schopným detekcie alebo konjugovať s ďalšou molekulou, ako napr. s cytotoxickou látkou a využiť na zacielenie tejto ďalšej molekuly proti bunke pozitívnej na RG1 (Vitetta, E.S. et al., Immunotoxin Therapy, in DeVita, Jr., V.T. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4^th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636, 1993). Príklady cytotoxických látok zahŕňajú okrem iného ricín, doxorubicín, daunorubicín, taxol, etídiumbromid, mitomycín, etoposide, tenoposide, vinkristín, vinblastín, kolchicín, dihydroxyantracíndión, aktinomycín D, difterický toxín, Pseudomonas exotoxín (PE) A, PE40, abrin a glukokortikoidné a iné chemoterapeutické činidlá, ako aj rádioizotopy. Markery vhodné na detekciu sú okrem iného rádioizotopy, fluorescenčné zlúčeniny, bioluminiscenčné zlúčeniny, chemiluminiscenčné zlúčeniny, kovové chelátory či enzýmy. Medzi vhodné rádioizotypy patria nasledujúce izotopy: ^l24Sb, ^l25Sb, ⁷⁴As, ^l03Ba, ¹⁴⁰Ba, ⁷Be, ^j206Bi, ²⁰⁷Bi, ¹⁰⁹Cd, ^5mCd, ⁴⁵Ca, ^l39Ce, ^l41Ce, ¹⁴⁴Ce, ^l37Cs, ⁵¹Cr, ⁵⁶Co, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁶⁰Co, 64Co, 169Er, 152Eu, 153Gd, 195Au, 199Au, 175Hf, 181Hf, llln, 1231, 1311, 192Ir, 55Fe, 59Fe, 85Kr, 210Pb, 54Mn, 197Hg, 203Hg, 99Mo, 147Nd, 237Np, 63Ni, 95Nb, 185+1910s, 103Pd, 195mPt, 143Pr, 147Pm, 233Pa, 186Re, 86Rb, 103Ru, 106Ru, 44Sc, 46Sc, 75Se, llOmAg, 22Na, 85Sr, 89Sr, 90Sr, 35S, 182Ta, 99mTc, 125Te, 132Te, 170T1, 204T1, 228Th, 232Th, 113Sn, 44TÍ, 185W, 48V, 49V, 169Yb, 88Y, 90Y, 91Y, 65Zn, 95Zr.

Imunoterapia rakoviny prostaty

Predkladaný vynález uvádza rôzne imunoterapeutické spôsoby liečby rakoviny prostaty, ako napr. terapia protilátkami, vakcínami in vivo, či imunoterapeutickými spôsobmi ex vivo. V jednom spôsobe uvádza tento vynález na liečbu rakoviny prostaty systémové využitie protilátok proti RG1. Napr. nekonjugované protilátky proti RG1 je možné do pacienta vnášať tak, že sa protilátka naviaže na RG1, ktorý sa nachádza na prostatických nádorových bunkách alebo v nich, prípadne je na ne pripojený a sprostredkuje deštrukciu týchto buniek a tumoru mechanizmami, ako sú napr. cytolýza sprostredkovaná komplementom, bunková cytotoxicita závislá od protilátky, zmena fyziologickej funkcie RG1 a/alebo inhibícia väzby na ligand alebo dráh prenosu signálu. Protilátky proti RG1 konjugované s toxickými látkami ako ricín či rádioizotopy je možné tiež využiť terapeuticky na priame doručenie toxickej látky do prostatických nádorových buniek, ktoré nesú RG1, čím dôjde k deštrukcii nádorových buniek.

Na imunoterapiu rakoviny prostaty pomocou protilátok proti RG1 je možné využiť rad prevzatých spôsobov, ktoré sa využívajú v súvislosti s inými typmi rakoviny, okrem iného napr. s rakovinou hrubého čreva (Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18:133-138, 1998), mnohonásobným myelómom (Ozaki et al., Blood 90:3179-3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90:2437-2444, 1997), rakovinou žalúdka (Kasprzyk et al., Cancer Res. 52:2771-2776, 1992), B-bunkovým lymfómom (Funakoshi et al., Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101, 1996), leukémiou (Zhong et al., Leuk. Res. 20:581-589, 1996), kolorektálnou rakovinou (Moun et al., Cancer Res. 54:6160-6166, 1994; Velders et al., Cancer Res. 55:4398-4403, 1995) a rakovinou prsníka (Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11:117-127, 1991).

Predkladaný vynález ďalej poskytuje vakcíny navrhnuté tak, aby obsahovali polypeptid RG1 alebo jeho fragmenty. Využitie nádorovo špecifického antigénu na prípravu vakcín na vyvolanie humorálnej a bunkovej imunity pri liečbe rakoviny je veľmi dobre známy spôsob v stave techniky a využíva sa na liečbu rakoviny prostaty pomocou ľudských imunogénov PSMA a imunogénov PAP hlodavcov (Hodge et al., Int. J. Cancer 63:231-237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159:3113-3117, 1997). Tieto spôsoby je ľahké uskutočňovať vy užitím polypeptidu RG1 alebo jeho fragmentu, alebo molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej RG1 a rekombinantných vektorov schopných exprimovať a správne prezentovať imunogén RG1.

Na doručenie molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej RG1 sa môžu využiť napr. doručovacie systémy založené na vírusových génoch. Rôzne doručovacie systémy založené na vírusových génoch, ktoré sa môžu využiť v tomto aspekte vynálezu zahŕňajú, ale bez obmedzenia, vírus kravských kiahní, vírus kiahní hydiny, kiahní kanárikov, adenovírusy, vírus chrípky, vírus obmy, vírus asociovaný s adenovíiusom, letivírusy alebo vírus sindbus (Rcstifo, in Curr. Opin. Immunol. 8:658-663, 1996). Je tiež možné využiť nevírusové systémy využívajúce vnesenie holej molekuly DNA, ktorá kóduje polypeptid RG1 alebo jeho fragment do pacientovho organizmu (napr. intramuskulárne) s cieľom vyvolať protinádorovú odpoveď. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je možné využiť úplnú cDNA ľudského rgl. V inom uskutočnení je možné využiť fragmenty cDNA rgl. V ďalšom uskutočnení je možné využiť molekulu nukleovej kyseliny rgl, ktorá kóduje špecifické epitopy T lymfocytov (CTL). Epitopy CTL je možné určiť pomocou špecifických algoritomov (napr. Epimer, Brown University) na identifikáciu peptidov vnútri polypeptidu RG1, ktoré sú schopné optimálnej väzby na špecifické alely HLA.

Je možné tiež využiť rôzne stratégie ex vivo. Jeden spôsob zahŕňa využitie dendritických buniek, ktoré prezentujú polypeptid RG1 pacientovmu imunitnému systému ako antigén. Dendritické bunky exprimujú molekuly MHC I a II, kostimulačnú molekulu B7 a IL-12 a sú teda vysoko špecializované na prezentáciu antigénu. Pri rakovine prostaty sa využívajú v klinických skúškach 1. stupňa autológne dendritické bunky pulzované (pulsed) s peptidmi membránového antigénu špecifického pre prostatické bunky (PSMA) na stimuláciu imunitného systému pacientov s rakovinou prostaty (Tjoa et al., Prostate 28:65-69, 1996; Murphy et al., Prostate 29:371-380, 1996). Dendritické bunky môžu slúžiť na prezentáciu polypeptidov RG1 T bunkám v kontexte molekúl MHC I a II. V jednom uskutočnení tohto vynálezu sú dendritické bunky pulzované s polypeptidmi RG1 schopnými viazať molekuly MHC. V inom uskutočnení sú dendritické bunky pulzované s úplným polypeptidom RG1. Ďalšie uskutočnenie zahŕňa navodenie zvýšenej expresie génu rgl v dendritických bunkách pomocou rôznych vektorov známych v stave techniky, ako sú adenovírus (Arthur et al., Cancer Gene Ther. 4:, 17-25, 1997), retrovirus (Henderson et al., Cancer Res. 56:3763-3770, 1996), lentivírus, adenoasociovaný vírus, transfekcie DNA (Ribas et al, Cancer Res. 57:2865-2869, 1997) a transfekcie nádorovo odvodenej RNA (Ashley et al., J. Exp. Med. 186:1177-1182, 1997).

Antiidiotypové protilátky proti RG1 je možné tiež využiť pri protinádorovej terapii ako vakcínu na vyvolanie imunitnej odpovede proti bunkám exprimujúcim polypeptid RG1. Zvlášť príprava antiidiotypových protilátok je odborníkom dobre známa a tento spôsob je ľahké prispôsobiť na prípravu antiidiotypových protilátok anti-RGl, ktoré napodobňujú epitop na polypeptide RG1 (pozri napr. Wagner et al., Hybridoma 16:33-40, 1997; Foon et al., J. Clin. Invest. 96:334-342, 1995; Herlyn et al., Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76, 1996). Takúto antiidiotypovú protilátku je potom možné využiť pri antiidiotypovej liečbe, podobne ako iné protilátky zamerané proti nádorovým antigénom.

Na vyvolanie profylaktickej a terapeutickej humorálnej a bunkovej imunitnej odpovede proti nádorovým bunkám exprimujúcim RG1 je možné využiť spôsoby génovej imunizácie. Využitím opísaných molekúl DNA, ktoré kódujú RG1, je možné konštrukty obsahujúce DNA, ktorá kóduje polypeptid/imunogén RG1 so zodpovedajúcimi regulačnými sekvenciami priamo injikovať do svalu alebo kože jedinca, takže svalové alebo kožné bunky konštrukt prijmú a exprimujú kódovaný polypeptid/imunogén RGL Polypeptid/imunogén RG1 sa môže exprimovať ako povrchový polypeptid alebo môže byť sekretovaný. Expresia polypeptidu/imunogénu RG1 vedie k vyvolaniu profylaktickej alebo liečebnej humorálnej a bunkovej imunity proti rakovine prostaty. Je možné využiť množstvo profylaktických a liečebných spôsobov génovej imunizácie známych v stave techniky (pozri prehľad informácií a prác publikovaných na intemetovej adrese www.genweb.com).

„Antisense“ oligonukleotidy, „antisense“ vektory a ribozýmy „Antisense“ polynukleotidy komplementárne k rgl je možné pripraviť synteticky. Tieto oligonukleotidy je možné doručiť do buniek samotné alebo s lipidmi, ktoré napomáhajú prijatiu „antisense'' oligonukleotidov bunkami.

Alebo expresné vektory, vektory odvodené od retrovírusov, adenovírusu, herpesvírusov herpes alebo kravských kiahní, alebo z rôznych bakteriálnych plazmidov môžu tiež slúžiť na konštrukciu a doručenie rekombinantaých vektorov, ktoré budú exprimovať „antisense“ rgl. Pozri napr. spôsoby opísané v publikáciách Sambrook et al. alebo Ausubel et al.

Polynukleotidy obsahujúce úplnú sekvenciu cDNA a/alebo jej regulačné elementy umožňujú pracovníkom vo výskume, aby využívali polynukleotidy rgl ako nástroj na prehľadávanie „sense“ vlákien (Youssoufian and Lodish, Mol. Celí. Biol. 13:98-104, 1993) alebo „antisense“ vlákien (Eguchi et al., Annu Rev. Biochem. 60:631-652, 1991) na zistenie regulácie funkcií tohto génu. Tieto spôsoby sú už v stave techniky dobre známe, a „sense“ alebo „antisense“ oligoméry, alebo väčšie fragmetny je možné odvodiť z rôznych miest z kódujúcich alebo nekódujúcich oblastí.

Gény kódujúce RG1 môžu byť vypnuté transfekciou buniek alebo tkaniva expresnými vektormi, ktoré exprimujú vysokú hladinu požadovaného fragmentu polynukleotidu rgl. Tieto konštrukty môžu zaplaviť bunku netranslatovateľnými „sense“ či „antisense“ sekvenciami. Aj keď nedôjde k integrácii do DNA, tieto vektory môžu ďalej transkribovať molekuly RNA, pokiaľ nie sú všetky kópie vyradené endogénnymi nukleázami. Pri nereplikatívnych vektoroch môže prechodná expresia trvať mesiac alebo viac a pokiaľ sú súčasťou vektorového systému zodpovedajúce replikačné elementy, môže trvať aj dlhšie.

Ako bolo uvedené, zmeny génovej expresie je možné dosiahnuť pomocou „antisense“ molekúl DNA či RNA, ktoré kontrolujú oblasti v rgl, napr. promótory, enhancery a intróny. Výhodné sú oligonukleotidy odvodené z miesta iniciácie transkripcie, t. j. z oblasti medzi -10 a +10 vedúcej „leader“ sekvencie. Je tiež možné pripraviť „antisense“ molekuly na blokovanie translácie mRNA zabránením väzby transkriptu na ribozóm. Inhibíciu je tiež možné uskutočniť pomocou spôsobu využívajúceho párovanie báz do „trojitej závitnice“. Tvorbou trojitej závitnice dochádza k zamedzeniu schopnosti molekuly dostatočne sa otvoriť pre väzbu s polymerázami, transkripčnými faktormi alebo regulačnými molekulami, ktorú by inak ako dvojitá závitnica mala. Najnovšie liečebné zlepšenia, ktoré využívajú tvorbu trojitých závitníc DNA (triplex DNA), sú zhrnuté v publikácii Gee J.E. et al. (In Huber a Car, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co„ Mt. Kisco, N.Y., 1994).

Ribozýmy sú enzymatické molekuly RNA, ktoré sú schopné katalyzovať špecifické štiepenie RNA (patent USA č. 4 987 071; WO 93/23057). Mechanizmus pôsobenia ribozýmu spočíva v sekvenčne špecifickej hybridizácii molekuly ribozýmu s komplementárnou cieľovou RNA, nasledovanej endonukleolytickým štiepením. V predkladanom vynáleze sú pripravené ribozýmové molekuly s tzv. „hammerhead“ motívom, ktoré môžu špecificky a účinne katalyzovať endonukleolytické štiepeme RNA, ktorá kóduje RG1. Špecifické štiepne miesta pre ribozýmy je možné na každej potenciálnej cieľovej RNA predbežne identifikovať vyhľadávaním štiepnych miest pre ribozýmy, ktoré obsahujú sekvencie GUA, GUU a GUC na cieľovej molekule. Hneď ako sa tieto miesta identifikujú, je možné určiť tie charakteristiky sekundárnej štruktúry krátkych sekvencií RNA s 15-20 ribonukleotidmi, ktoré zodpovedajú oblasti cieľového génu obsahujúcej štiepne miesto, a na základe ktorých by bolo možné daný oligonukleotid vyradiť z funkcie. Vhodnosť potenciálnych cieľov je tiež možné zhodnotiť testovaním prístupnosti pre hybridizáciu s komplementárnymi oligonukleotidmi pomocou ribonukleázových ochranných testov (ribonuclease protection assays) (Irie et al., Advances Pharmacol. 40:207-257,1997).

.Antisense“ molekuly a ribozýmy uvedené v tomto vynáleze je možné pripraviť akýmkoľvek spôsobom na syntézu molekúl RNA známym v stave techniky. Sú to napr. spôsoby chemickej syntézy oligonukleotidov, ako syntéza použitím fosforamiditu v pevnej fáze. Molekuly RNA je možné pripraviť transkripciou in vitro a in vivo alebo pomocou sekvencii DNA, ktoré kódujú RG1. Tieto sekvencie DNA sa môžu vniesť do celého radu vektorov so zodpovedajúcimi promótormi RNA polymerázy ako T7 alebo SP6. Je možné tiež vniesť konštrukty „antisense“ cDNA, ktoré syntetizujú „antisense“ RNA, do bunkových línií, buniek alebo tkanív.

Molekuly RNA môžu byť modifikované s cieľom zvýšiť ich stabilitu vnútri bunky alebo ich polčas. Možnými zmenami sú okrem iného napr. pripojenie priľahlých sekvencii na 5' koniec a/alebo 3' koniec molekúl, alebo využitie fosforotioátových alebo 2'0-metylových väzieb namiesto fosfodiesterových pri tvorbe základnej kostry molekuly. Stabilitu molekúl je možné tiež zvýšiť vložením neobvyklých báz, ako sú inozín alebo queozín (queosine), ako aj acetyl-, metyl-, tio- a podobne modifikovaných foriem adenínu, guanínu, tymínu a uridínu, ktoré nie sú tak ľahko rozpoznané endogénnymi endonukleázami.

Medzi spôsoby vnesenia „antisense“ vektorov do buniek alebo tkanív patria opísané spôsoby, ktoré sú vhodné tak na liečenie in vivo, ako aj in vitro a ex vivo. Na liečenie ex vivo sú vektory vnášané do buniek odobratých z pacientovho organizmu a klonálne pomnožené na autológnu transplantáciu do toho istého pacienta, ako je uvedené v patentoch USA č. 5 399 493 a 5 437 994, ktoré sú uvedené v literatúre. Prenos transfekciou alebo lipozómami či inými lipidickými a nelipidickými činidlami je odborníkom tiež dobre známy.

Testy na identifikáciu látok viažucich RG1

Predkladaný vynález sa tiež týka testov a spôsobov, ktoré môžu slúžiť na identifikáciu látok (agensov, činidiel) viažucich RG1. Tieto látky viažuce RG1 môžu byť identifikované najmä na základe schopnosti ligandu RG1 alebo inej látky a zložky viazať RG1 a/alebo schopnosti inhibovať/stimulovať aktivitu RG1.

Látky viažuce polypeptidRGl môžu byť tiež identifikované pomocou kvasinkového dvojhybridného systému a testu väzbovej schopnosti. Pri kvasinkovom dvojhybridnom systéme sa expresná jednotka, ktorá kóduje fúzny proteín skladajúci sa z transkripčného faktora s jednou podjednotkou, transkripčného faktora s dvomi podjednotkami apolypeptidu RG1 vnesie do bunky kvasinky a je v nej exprimovaná. Táto bunka je ďalej pozmenená tak, aby obsahovala (1) expresnú jednotku kódujúcu detegovateľný marker, na ktorého expresiu je potrebný transkripčný faktor s dvomi podjednotkami a (2) expresnú jednotku kódujúcu fúzny proteín skladajúci sa z druhej podjednotky transkripčného faktora a klonovaného segmentu DNA. Pokiaľ klonovaný segment DNA kóduje proteín viažuci polypeptid RG1, výsledkom expresie je interakcia RG1 a kódo vaného proteínu. Tým sa obe podjednotky a transkripčný faktor dostanú do väzbovej blízkosti a transkripčný faktor sa môže obnoviť. Tak je exprimovaný detegovateľný marker. Kvasinkový dvojhybridný systém je zvlášť výhodný pri plošnom testovaní knižnice cDNA, ktorá kóduje segmenty bunkových väzbových partnerov RG1.

Medzi polypeptidy RG1, ktoré je možné využiť v opísaných testoch, patrí okrem iného napr. izolovaný polypeptid RG1, fragment polypeptidu RG1, či bunka, ktorá bola pozmenená tak, aby exprimovala polypeptid RG1. Polypeptidom RG1 môže byť ďalej celý tento polypeptid či jeho definovaný fragment. Bežnému odborníkovi bude zrejmé, že pokiaľ je polypeptid RG1 testovateľný na väzbu k nejakej látke, napr. pomocou posunu molekulovej váhy alebo aktivity, je možné tento spôsob testovania využiť.

Spôsob, ktorým bude určené, či látka.bunková zložka viaže polypeptid RG1, bude primáme závisieť od charakteru použitého polypeptidu RG1. Na určenie, či látka viaže RG1 alebo jeho fragment, môže slúžiť napr. gélový retardačný test. Na testovanie polypeptidu RG1 je tiež možné využiť imunodetekciu alebo spôsoby založené na biočipoch. Na zistenie, či určitá látka viaže RG1, môže skúsený odborník využiť rad spôsobov známych zo stavu techniky.

Látky a bunkové zložky je možné ďalej testovať, či sú schopné ovplyvňovať aktivitu polypeptidu RG1, pomocou bezbunkového testovacieho systému alebo bunkového testovacieho systému. Definované aktivity polypeptidu RG1 môžu byť ďalej testované funkčnými testami.

V kontexte predkladaného vynálezu platí, že látka antagonizuje aktivitu RG1, pokiaľ jeho aktivitu znižuje. Výhodný antagonista selektívne antagonizuje RG1 a neovplyvňuje ďalšie bunkové proteíny. Výhodný antagonista ďalej znižuje aktivitu RG1 o viac než 50 %, výhodnejšie o viac než 90 % a najvýhodnejšie vyradí celkovú aktivitu RG1.

Látky testované uvedeným spôsobom sa môžu vybrať náhodne alebo racionálne. V kontexte predkladaného vynálezu platí, že látka sa vyberá náhodne, pokiaľ sa neprihliada na špecifické sekvencie polypeptidu RG1. Príkladom náhodne vybraných látok je využitie chemickej knižnice alebo kombinatorickej knižnice peptidov, živnej pôdy pre určitý organizmus alebo rastlinného extraktu.

V kontexte predkladaného vynálezu platí, že látka je vybratá racionálne, pokiaľ je vybratá nenáhodne v závislosti od sekvencie cieľového miesta a/alebo jeho konľormácie a v súvislosti s pôsobením danej látky. Látky sa môžu vyberať alebo navrhovať racionálne na základe peptidových sekvencií polypeptidu RG1.

Racionálne vybratou peptidovou látkou môže byť napr. peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zhodná s fragmentom polypeptidu RG1.

Látky testované spôsobmi podľa predkladaného vynálezu môžu byť napr. peptidy, protilátky, oligonukleotidy, malé molekuly a deriváty vitamínov a tiež uhľovodíky. Skúsenému odborníkovi je zrejmé, že výber látok pre uvedený testovací spôsob nie je nijako obmedzený ich štrukturálnou povahou. Jedna trieda látok podľa predkladaného vynálezu sú peptidové látky, ktorých aminokyselinové sekvencie sú vybraté na základe aminokyselinovej sekvencie polypeptidu RG1.

Peptidové látky je možné pripraviť pomocou štandardných syntetických spôsobov, ktoré využívajú látky v pevnej (alebo kvapalnej) fáze, ktoré sú v stave techniky známe. Navyše je možné syntetizovať DNA, ktorá kóduje tieto peptidy pomocou komerčne dostupných prístrojov na syntézu oligonukleotidov a pripraviť ich rekombinantne pomocou štandardných rekombinantných produkčných systémov. Prípravu pomocou syntézy v pevnej fáze je nutné využiť tam, kde sa vyskytujú aminokyseliny nekódované žiadnym génom.

Inými látkami uvedenými v predkladanom vynáleze sú protilátky imunoreaktívne s kritickými miestami polypeptidu RG1. Ako je tu už opísané, protilátky sa získavajú imunizáciou vhodných cicavčích organizmov peptidmi, ktoré obsahujú ako antigénmi oblasť tie časti polypeptidu RG1, proti ktorým majú byť protilátky zamerané. Tieto látky je možné využiť pri štúdiách väzbových kompetícií na identifikáciu inhibičných látok druhej generácie a na blokovanie aktivity RG1.

Bunkové extrakty testované spôsobmi uvedenými v predkladanom vynáleze môžu byť napr. vodné extrakty buniek či tkanív, organické extrakty buniek alebo tkanív alebo čiastočne purifikované frakcie buniek. Skúsenemú odborníkovi je zrejmé, že výber zdroja bunkového extraktu pre uvedený testovací spôsob nie je nijako obmedzený jeho štruktúrnou povahou.

Látky viažuce polypeptid RG1, ako napr. protilátka proti RG1, sa môžu využiť na modulovanie aktivity RG1, na zacielenie protirakovinových látok do zodpovedajúcich cicavčích buniek alebo na identifikáciu látok blokujúcich interakciu s RG1. Bunky exprimujúce RG1 je možné zacieliť alebo identifikovať použitím látky, ktorá viaže RG1.

To, ako bude látka viažuca RG1 využitá, závisí od jej povahy. Látka viažuca RG1 môže byť napr. využitá na: doručenie konjugovaných toxínov, ako sú difterický toxín, toxín cholery, ricín alebo exotoxín Pseudomonas, do bunky exprimujúcej RG1; moduláciu aktivity RG1; priame zabitie bunky exprimujúcej RG1; alebo pri skíningoch na identifikáciu látok s kompetitívnou väzbou. Tak napr. látka inhibujúca RG1 sa môže využiť na priamu inhibíciu rastu buniek, ktoré exprimujú RG1, zatiaľ čo látka viažuca RG1 sa môže využiť ako diagnostické činidlo.

Farmaceutické prípravky a spôsoby podávania

Predkladaný vynález sa tiež týka využitia farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú polynukleotidy rgl, polypeptidy RG1, protilátky proti nim, ich agonisty, antagonisty alebo inhibítory a to samotné alebo v kombinácii s aspoň jednou látkou, ako napr. stabilizačnou látkou a ktoré môžu byť podané v akomkoľvek sterilnom, biokompatibilnom farmaceutickom nosiči, ako okrem iného napr. vo fyziologickom roztoku, dextrôze alebo vode. Ktorúkoľvek z týchto molekúl je možné pacientovi podať samotnú alebo v kombinácii s inými látkami, liečivami či hormónmi vo farmaceutických kompozíciách, kde sú zmiešané s vehikulom (vehikulmi) alebo s farmaceutický prijateľnými nosičmi. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je farmaceutický prijateľný nosič farmaceutický inertný.

Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobu podania farmaceutických kompozícií. Toto podanie sa môže uskutočňovať perorálne alebo parenterálne. Medzi spôsoby parenterálneho podania patrí podanie topické, intraarteriálne (priamo do tumoru), intramuskuláme, subkutánne, intrameduláme, intratekálne, intraventrikuláme, intravenózne, intraperitoneálne alebo intranazálne. Okrem aktívnych zložiek môžu tieto farmaceutické kompozície obsahovať vhodné farmaceutický prijateľné nosiče, ako sú vehikulá a pomocné látky, ktoré umožňujú spracovanie aktívnych zložiek na preparáty, ktoré je možné farmaceutický využiť. Ďalšie podrobnosti o spôsoboch prípravy a podania týchto látok je možné nájsť v poslednom vydaní Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa).

Farmaceutické kompozície na perorálne podávanie je možné formulovať pomocou farmaceutický prijateľných nosičov dobre známych zo stavu techniky v dávkach vhodných na orálne podanie. Tieto nosiče umožňujú formuláciu farmaceutických kompozícií ako tablety, pilulky, dražé, tobolky, roztoky, gély, sirupy, husté suspenzie, normálne suspenzie a pod., určené na podanie pacientom.

Farmaceutické prípravky na perorálne podávanie je možné získať kombináciou aktívnych zložiek s pevným vehikulom, podľa potreby rozomletím vzniknutej zmesi a po prípadnom pridaní vhodných aditív (pomocných látok) spracovaním tejto zmesi granúl na tablety alebo dražé. Vhodnými vehikulmi sú sacharidové alebo proteínové plnidlá ako cukry, napr. laktóza, sacharóza, manitol alebo sorbitol; kukuričný, pšeničný, ryžový alebo zemiakový škrob, alebo škrob z iných rastlín; celulóza vo forme metylcelulózy, hydroxypropylmetylcelulózy alebo karboxymetylcelulózy sodnej; gumy ako arabská guma alebo tragakantová guma; a ďalej proteíny ako želatína a kolagén. Podľa potreby je možné pridať dekompozičné alebo solubilizačné činidlá ako napr. zosieťovaný polyvinylpyrolidón, agar, kyselinu algínovú alebo jej soľ, ako napr. alginát sodný.

Jadrá dražé sa obaľujú do vhodných poťahov, ako sú napr. koncentrované cukrové roztoky, ktoré môžu tiež obsahovať arabskú gumu, mastenec, polyvinylpyrolidón, karbopolový gél, polyetylénglykol a/alebo oxid titaničitý, roztoky lakov a vhodné organické rozpúšťadlá alebo ich zmesi. Do poťahov tabliet alebo dražé sa môžu pridať farbivá alebo pigmenty na identifikáciu výrobku či označenia množstva aktívnej látky, t. j. dávkovania.

Medzi farmaceutické prípravky, ktoré sa môžu používať perorálne, patria napr. „push-fit“ želatínové tobolky ako aj mäkké zatavené želatínové tobolky a povrchý film z glycerolu alebo sorbitolu. „Push-fit“ tobolky môžu obsahovať aktívne zložky zmiešané s plnidlom alebo spojivom, ako je laktóza alebo škroby, lubrikanty, ako je mastenec alebo stearát horčíka, prípadne stabilizátory. V mäkkých tobolkách môžu byť aktívne zložky rozpúšťané alebo suspendované vo vhodných tekutinách/kvapalinách, ako sú mastné oleje, kvapalný parafín alebo kvapalný polyetylénglykol s alebo bez stabilizátorov.

Medzi farmaceutické formulácie na parenterálne podávanie patria vodné roztoky aktívnych zložiek. Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu určené na injekciu môžu byť formulované vo vodných roztokoch, výhodne vo fyziologických kompatibilných pufroch, ako je Hankov roztok, Ringerov roztok alebo pufrovaný fyziologický roztok. Vodné injekčné suspenzie môžu obsahovať látky, ktoré zvyšujú viskozitu suspenzie ako je karboxymetylcelulóza sodná, sorbitol alebo dextrán. Suspenzie aktívnych zložiek môžu byť tiež pripravené ako vhodné olejové suspenzie na injekciu. Vhodnými lipofilnými rozpúšťadlami alebo vehikulami sú mastné oleje, ako je sezamový olej, alebo syntetické estery mastných kyselín, ako je etyloleát alebo triglyceridy alebo lipozómy. Suspenzie môžu tiež prípadne obsahovať vhodné stabilizátory alebo látky zvyšujúce rozpustnosť zlúčenín, takže je možné pripraviť vysoko koncentrované roztoky.

Na topické alebo nazálne podanie sa do formulácie pridávajú penetranty pre zodpovedajúcu bariéru, ktorou majú preniknúť. Tieto penetranty sú v stave techniky bežne známe.

Súpravy (Kity)

Predkladaný vynález sa ďalej týka farmaceutických balení a súprav (kitov) zahŕňajúcich jednu alebo viac nádob naplnených jednou alebo viacerými zložkami opísaných kompozícií uvedených v tomto vynáleze. K tejto nádobke (nádobkám) môže byť priložený leták vo forme predpísanej príslušným vládnym úradom, v ktorého kompetencii je výroba, použitie alebo predaj farmaceutických či biologických výrobkov, kde je vyjadrený súhlas tohto úradu s výrobou, použitím alebo predajom daného výrobku na ľudské účely.

Výroba a skladovanie

Farmaceutické kompozície uvedené v predkladanom vynáleze je možné pripraviť spôsobmi známymi v stave techniky, t. j. konvenčným miešaním, rozpúšťaním, granulovaním, prípravou dražé, drvením, tvorbou emulzií, uzatváraním do kapsúl alebo iných produktov alebo lyofilizáciou.

Tieto farmaceutické kompozície sa môžu získať vo forme solí mnohých kyselín ako okrem iného napr. kyseliny chlorovodíkovej, sírovej, octovej, mliečnej, šťaveľovej, jablčnej, jantárovej apod. Soli sú často rozpustnejšie vo vodných alebo iných protonických rozpúšťadlách, ktoré sú ich zodpovedajúcou voľnou bázickou formou. Inokedy môže byť výhodným prípravkom lyofilizovaný prášok v 1 mM - 50 mM histidíne, 0,1 % - 2 % sacharóze, 2 % - 7 % manitole v rozmedzí pH 4,5 až 5,5, ktorý sa pred použitím zmieša s pufrom.

Potom ako sú farmaceutické kompozície obsahujúce zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu, formulovanú v prijateľnom nosiči, pripravené, môžu byť uložené do vhodnej nádoby a označné na liečenie indikovaných stavov. Pre podávanie RG1 toto označenie zahŕňa množstvo, frekvenciu a spôsob podávania.

Terapeuticky účinná dávka

Farmaceutické kompozície vhodné na použitie v predkladanom vynáleze zahŕňajú kompozície, v ktorých sú aktívne zložky obsiahnuté v účinnom množstve na docielenie zamýšľaného účelu, t. j. liečby konkrétneho chorobného stavu charakterizovaného expresiou RG1. Určenie účinnej dávky je celkom v kompetencii odborníkov.

Pre každú zložku môže byť terapeuticky účinná dávka najprv stanovená testovaním v bunkovej kultúre, napr. v neoplastických bunkách alebo na zvieracom modeli, obvykle na myšiach, králikoch, psoch alebo prasatách. Zvieracie modely sa tiež využívajú na určenie požadovaného koncentračného rozpätia a spôsobu podania. Na základe tejto informácie je potom možné stanoviť užitočné dávky a cesty podania ľudským jedincom.

Terapeuticky účinná dávka znamená také množstvo proteínu alebo jeho protilátok, jeho antagonistov alebo inhibítorov, ktoré zlepší symptómy alebo stav pacienta. Terapeutická účinnosť alebo toxicita týchto látok sa môže určiť štandardnými farmaceutickými spôsobmi v bunkovej kultúre alebo na zvieracom modeli, napr. ako ED₅₀ (terapeuticky účinná dávka v 50 % populácie) a LD_S0 (dávka letálna pre 50 % populácie). Pomer dávok s terapeutickým a toxickým účinkom sa nazýva terapeutický index a dá sa vyjadriť ako pomer ED50/LD50. Výhodné sú farmaceutické kompozície majúce vysoké terapeutické indexy. Údaje získané testovaním bunkových kultúr a zvieracích modelov je možné využiť na určenie rozpätia na dávkovanie ľudským jedincom. Dávkovanie týchto látok sa výhodne pohybuje v rozmedzí obehových koncentrácií, pri ktorých má ED₅₀ nízku alebo žiadnu toxicitu. Dávkovanie sa pohybuje v tomto rozmedzí v závislosti od formy podania, citlivosti pacienta a cesty podania.

Presné dávkovanie určí lekár podľa toho, ktorému pacientovi má byť liek podaný. Dávkovanie a spôsob podania sa upravia tak, aby sa dosiahla dostatočne vysoká hladina aktívnej zložky na docielenie požadovaného účinku. Ďalšími faktormi, ktoré sa môžu brať do úvahy, sú napr. závažnosť chorobného stavu, ako napr, veľkosť nádoru a jeho umiestnenie; vek, hmotnosť a pohlavie pacienta; diéta, čas a početnosť podaní, kombinácia liečiv, citlivosť reakcie a ďalej tolerancia/odpoveď na liečbu. Farmaceutické kompozície s dlhodobou účinnosťou sa môžu podávať každé 3-4 dni, každý týždeň, raz každých 14 dní v závislosti od polčasu a rýchlosti klirens konkrétnej formulácie z organizmu.

Množstvá normálnej dávky sa môžu pohybovať od 0,1 do 100 000 mikrogramov, až do celkovej dávky 1 g, v závislosti od cesty podania. Návod na určité dávky a spôsoby podania je opísaný v literatúre. Pozri patenty USA 4 657 760; 5 206 344 alebo 5 225 212. Odborníci využijú odlišné formulácie pre polynukleotidy ako pre proteíny alebo ich inhibítory. Podobne bude podanie polynukleotidov či polypeptidov špecificky zodpovedať určitým bunkám, stavom, umiestneniam a pod.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Polynukleotidová sekvencia rgl (sekvencia SEQ ID NO; 1), kódujúca biologicky alebo imunologický aktívnu formu RG1.

Obr. 2: Odvodená aminokyselinová sekvencia RG1 (sekvencia SEQ ID. NO: 2), kde domény F-spondínu sú podčiarknuté jednoducho a doména trombospondínu dvojito.

Obr. 3: Lineárne porovnanie sekvencie RG1 so sekvenciou potkanieho Mindinu. Sekvencia RG1 sa nachádza hore.

Obr. 4: Polynukleotidová a dedukovaná aminokyselinová sekvencia RG1.

Obr. 5: Expresia rgl v ľudských tkanivách zistená PCR analýzou založenou na Taqman. RNA z ľudských tkanív, tak nádorových ako normálnych, sa izolovala štandardnými spôsobmi. Priméry a sondy na detekciu expresie rgl mRNA boli navrhnuté pomocou softvéru Perkin Elmer's Primer Express a syntetizované pomo cou Synthetic Genetics. Rgl mRNA sa stanovila v ľudskom prostatickom tkanive. Omnoho nižšiu expresiu rgl mRNA bolo možné zachytiť v ďalších tkanivách, napr. v pečeni.

Obr. 6: Purifikácia natívneho proteínu RG1 sekretovaného bunkami LNCaP. Analýza spôsobom Westem blot pomocou antiséra pripraveného proti syntetickej peptidovej sekvencií RG1 (3C, sekvencia SEQ ID NO: 10, pozri príklad 4) na detekciu natívneho proteínu RG1 sekretovaného bunkami LNCaP. Frakcia eluovanej chromatografie na Q-Sepharóze z koncentrovaného média upraveného pre bunky LNCaP: (L) náplň kolóny, (F) prietok kolóny, (1-12) frakcie eluované cez soľný gradient. Predpokladaná molekulová hmotnosť RG1 je približne 36 kD, ale zistilo sa, že proteíny RG1 exprimované baktériami, bunkami BHK a LNCaP všetky putujú na géli PAGE v pozícii približne 45 kD (L, frakcia 6-9).

Obr. 7: Imunohistochemické farbenie expresie RG1 v ľudskom prostatickom tkanive. Vzorky prostatického tkaniva sa získali na Urologickom oddelení lekárskej fakulty Standfordovej univerzity. Farbenie sa uskutočnilo pomocou súpravy Vector ABC-AP (AK5002). Farbenie sa zviditeľnilo pomocou súpravy Vector Red substráte a následným farbením hematoxylínom. Výsledky ukazujú silné zafarbenie perilumenálnej membrány vo formáciách žľazy.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález je ďalej opísaný nasledujúcimi príkladmi. Tieto príklady sú uvedené iba na ilustráciu tohto vynálezu ako príklady špecifických uskutočnení. Tieto príklady síce ilustrujú určité špecifické aspekty predkladaného vynálezu, ale vynález inak neobmedzujú a nevymedzujú rozsah tohto vynálezu.

Všetky príklady sa uskutočnili štandardnými spôsobmi, ktoré sú odborníkom dobre známe a sú inými rutinne využívané, s výnimkou inak podrobne opísaných prípadov. Rutinné spôsoby molekulárnej biológie použité v uvedených príkladoch je možné uskutočňovať podľa štandardných laboratórnych príručiek, ako napr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.

Príklad 1

Identifikácia polynukleotidu ľudského rgl

Rgl bol identifikovaný ako gén exprimovaný v prostate prehľadávaním databázy Incyte LifeSeq. Táto nukleotidová sekvencia sa identifikovala prehľadávaním anotácií v databáze pomocou nástroja „Funkcia proteínu“ poskytnutého spoločnosťou Incyte na účely prehľadávania databázy. Táto nukleotidová sekvencia sa našla v anotovanej databáze v kategórii bunkových adhéznych molekúl a bola opísaná ako homológ F-spondínu. Elektronická Northem analýza distribúcie polynukleotidových sekvencií rgl v súbore knižníc v databáze odhalila, že v knižniciach prostatických tkanív bol rgl exprimovaný vo vysokých hladinách a v nižších hladinách v knižniciach mnohých iných tkanív, vrátane normálnych a nádorových.

Po zostavení súboru klonov rgl z databázy do sústavy kontingov polynukleotidových sekvencií a po ich úprave na súvislú sekvenciu bola identifikovaná úplná kódujúca sekvencia umelo odvodeného zostaveného polynukleotidu. Táto sekvencia kóduje proteín homológny so spondínom-F a Mindinom-2.

Klony databázy Incyte 1640796, 1712252 a 1880265 sa získali z Incyte na experimntálne účely a kloň 3360733 sa identifikoval ako obsahujúci najväčšiu časť nukleotidovej sekvencie 5' konca. Získala sa úplná sekvencia tohto klonu, ktorá obsahuje úplnú kódujúcu sekvenciu pre umelo odvodený proteín RG1. Táto sekvencia je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1).

Príklad 2

Expresia rgl mRNA

Expresia rgl mRNA v rôznych vzorkách normálneho a nádorového tkaniva a v bunkových líniách sa určila semikvantitatívnou PCR pomocou testu Taqman (Perkin-Elmer). Vzorky normálnych, benígnych a malígnych prostatických tkanív, ktorých štádium (granding) sa určilo podľa Gleasonovho systému, sa získali z Urologickej katedry lekárskej fakulty Stanfordovej Univerzity. Štandardnými spôsobmi sa z nich izolovala RNA. RNA iných nádorových a normálnych tkanív sa získala z komerčných zdrojov, vrátane firiem Biotech a Biochain. Prostatické nádorové bunkové línie (PC-3, LNCaP a DU145) sa získali z Američan Type Culture Collection a kultivovali sa štandardnými spôsobmi v médiu, ktoré obsahovalo sérum. V nahých myšiach sa pomocou týchto línií vyvolal vznik nádorových xenograftov, ktoré sa odobrali z týchto myší približne 4-6 týždňov po implantácií. Z nádorov sa štandardnými spôsobmi izolovala RNA.

Analýza PCR založená na Taqman sa uskutočnila využitím primérov:

CGC GCA TAG CTC CGA CTA C (sekvencia SEQ ID NO: 3), GCC GCG TCC GCA AAG (sekvencia SEQ ID NO: 4) a sonda Taqman

- FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (sekvencia SEQ ID NO: 5).

Tieto priméry a sonda boli navrhnuté pomocou softvéru Perkin Elmer Primér Express a syntetizované pomocou Synthetic Genetics. Reakcie PCR sa uskutočnili v 30 - 40 cykloch a kvantifikované pomocou pros5 tatickej RNA na vytvorenie štandardnej krivky na relatívne porovnávanie. Touto analýzou sa dokázalo, že najvyššie množstvo rgl mRNA sa našlo v prostate a významne nižšie hladiny v iných tkanivách (pozri obr. 5).

Príklad 3

Klonovanie a expresia RG1 v bunkách BHK

Kódujúca oblasť pre RG1 sa získala z plazmidu Incyte 3360733. Táto kódujúca sekvencia sa amplifikovala pomocou PCR s primérmi:

SST115 (5'- TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC- 3') (sekvencia SEQ ID NO: 6) a SST113 (5 - AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG- 3') (sekvencia SEQ ID NO: 7).

J 5 V štandardnej PCR reakcii (100 μΐ) s použitím 1 x Pfu pufra Turbo polymerázy (Stratagene, La Jolla, CA)/200 μΜ každého dNTP/0,2 μΜ oligonukleotidových primérov/2,5 U Pfu Turbo polymerázy (Stratagene). Podmienky na amplifikáciu PCR boli nasledujúce: 3 min. pri 95 °C (15 s pri 95 °C, 30 s pri 60 °C, 2 min. pri 72 °C) x 35, 72 °C po 7 min. Výsledný amplifikovaný produkt sa prečistil na kolóne QIAquick PCR (Qiagen, Valencia, C A) a štiepil reštrikčnými enzýmami Xbal aPmll na fragment s 1010 bp, ktorý sa 20 vyčistil na 1 % agarózovom géli pomocou súpravy BIO 101 GeneClean Kit (Vista, CA). Purifikovaný fragement sa ligoval (pomocou Epicientre Fast Link Kit (Epicenter, Madison, WI) do necytopatického expresného vektora Sindbis pSINrep21 (Agapov et al., 1998, PNAS 95: 12989-12994) štiepeného Xbal aPmll, použil sa na transformáciu kompetentných buniek DH5 alfa (Life Technologies, Gaithersburg, CA) a selektoval na platniach s LB agarom obsahujúcim ampicilín (100 pg/ml). Jedna z týchto kolónií rezistentných na ampi25 cilín sa pomnožila v médiu LB obsahujúcom ampicilín a sekvenčnou analýzou sa v nej dokázala prítomnosť kódujúcej sekvencie pre RGL Tento plazmid sa nazval pPEG6.

Dva mikrogramy pPEG6 sa použili na transfekciu 1-3 x 10⁵ buniek BHK (bovine hamster kidney cells) pomocou látky Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) podľa návodu výrobcu. Po transfekcii sa bunky inkubovali v médiu DMEM obsahujúcom fetálne sérum počas 24 - 48 hod., potom sa 10-krát 30 zriedili a selekcia buniek obsahujúcich plazmid sa iniciovala pridaním puromycínu (konečná koncentrácia 2,5 pg/ml) a média DMEM obsahujúceho sénim. Keď boli bunky konfluentné (4 - 5 dní po pridaní puromycínu), premyli sa PBS, 10-krát zriedili a pridalo sa médium DMEM obsahujúce sérum a 5 pg/ml puromycínu. Po ďalších 2-3 dňoch sa médium vymenilo za DMEM bez séra obsahujúceho 5 pg/ml puromycínu, bunky ďalej rástli 2 - 3 dni a potom sa prítomnosť proteínu RG1 v médiu stanovila Western analýzou pomocou pro35 tilátok proti RG1. Stanovené množstvo proteínu RG1 bolo 1 pg/rnl.

Príklad 4

Príprava protilátok

Pripravili sa králičie polyklonálne antiséra proti piatim syntetickým polypeptidovým sekvenciám odvode 40 ným zo sekvencie proteínu RG1. Tieto sekvencie sa vybrali podľa ich vopred odhadnutej polohy na povrchu proteínu, aby vytvorili antiséra, ktoré by ľahko rozpoznali povrchové epitopy. Na uľahčenie syntézy sa cysteínové zvyšky nahradili kyselinou aminobutánovou (Abu). Špecifické aminokyselinové sekvencie, ich poloha v proteíne RG1 a označenie všetkých piatich peptidov, sú uvedené.

Označen.	Poloha	Aminokyselinová sekvencia
C	28-46	PLGGESICSAGAPAKYSIT (sekvencia SEQ ID NO: 8)
2C	46-64	TFTGKWSQTAFPKQYPLFR (sekvencia SEQ ID NO: 9)
3C	77-91	HSSDYSMWRKNQYVS (sekvencia SEQ ID NO: 10)
4C	188-210	DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (sekv. SEQ ID NO: 11)
5C	263-274	NEIVDSASVPET (sekvencia SEQ ID NO: 12)

Peptidy sa kovalentné viazali cez ďalší C-koncový cysteín na farbivo KLH (keyhole limpet hemocyanín), aby ich bolo možné využiť ako imunogcny. Podobne sa pripravili konjugáty s bo vinným sérovým albumínom (BSA) na analýzu titra antisér testom ELISA.

Každým peptidom sa imunizovali dve zvieratá. Počiatočné imunizácie sa uskutočnili vo Freundovom 50 kompletnom adjuvans (0,5 mg/zviera) a následné podporné imunizácie sa uskutočňovali v trojtýždňových intervaloch pomocou dávky 0,25 mg/zviera vo Freundovom nekompletnom adjuvans intramuskuláme. Uskutočnili sa pravidelné odbery a titer protilátok proti špecifickým konjugátom BSA-peptid sa meral testom

ELISA a porovnával sa s preimúnnym sérom. Dokázalo sa, že antiséra proti peptidom 1C a 3C sú aktívne. Antiséra proti peptidom 2C nerozpoznávali polypeptid RG1. Antiséra proti peptidom 4C a 5C sa testovali.

Ľudské monoklonálne protilátky proti RG1 sa pripravili imunizáciou transgénnych myší proti peptidom RG1 a filznemu proteínu značenému 6-histidínovou značkou exprimovanému v E. coli. Splenocyty týchto zvierat sa íuzovali s myelómovými bunkami, čím vznikli hybridómové bunky. Výsledné hybridómy sa testovali testom ELISA, aby sa získali hybridómy produkujúce protilátky proti peptidom a proteínu RG1.

Príklad 5

Analýza protilátok metódou Westem blot

Špecificita antisér pre RG1 sa testovala spôsobom Westem blot. Antiséra špecifické pre RG1 (získané proti sekvenciam 1C a3C už uvedeným) sa testovali pomocou RG1 prechodne exprimovaného v bunkách COS, natívneho RG1 sekretovaného bunkami LNCaP aRGl produkovaného bunkami BHK (baby hamster kidney cells). Antiséra špecifické pre RG1 sa ďalej testovali lyzátmi pripravenými z: nádorov LNCaP, buniek LNCaP, nádorov PC3, buniek PC3 a ďalších klinických vzoriek ľudských nádorov prostaty. Bunky a tkanivá sa lyžovali v detergentovom pufri. Po 5 min. povarenia sa 10 μΐ každého lyzátu nanieslo na 12 % SDS-polyakrylamidový gél na rozdelenie proteínov. Rozdelené proteíny potom sa preniesli na nitrocelulózovú membránu. Väzbová špecificita protilátok proti RG1 sa overila väzbou v prítomnosti homológnych a heterológnych proteínov. Pomocou antisér špecifických pre RG1 sa prítomnosť proteínov dokázala vo všetkých vzorkách okrem buniek PC-3 a nádorov PC-3.

Príklad 6

Purifikácia natívneho proteínu RG1 sekretovaného bunkami LNCaP

Analýza spôsobom Westem blot dokázala, že bunky LNCaP sekretujú natívny protein RG1. Na purifikáciu natívneho proteínu sa bunky ponechali rásť počas 48 hodín v médiu bez séra. Toto médium bez séra sa potom odobralo a centrifugovalo tak, aby sa odstránili všetky bunky, a približne 50x sa koncentrovalo ultrafiltráciou. Koncentrované médium sa potom lOx zriedilo 20 mM pufrom octanu sodného, pH 6,5 a nanieslo na kolónu na výmenu aniónov Q-Sepharose. Elúcia z kolóny sa uskutočnila gradientom chloridu sodného (0,5 % za min.), pričom sa odoberali 2,0 ml frakcie. Ako sa potvrdilo spôsobmi Westem blot a SDS PAGE, frakcie obsahujúce protein RG1 sa vymyli pri koncentrácii približne 75 mM NaCl. Natívny protein RG1 sa pohybuje pri mierne nižších molekulových hmotnostiach než fúzny protein 6-histidín-RGl exprimovaný v baktériách, zrejme pretože neobsahuje fúzny peptid.

Príklad 7

Imunohistochemické farbenie expresie RG1

Expresia proteínu RG1 sa stanovila firmou LifeSpan Biosciences, Inc., v rôznych typoch ľudských tkanív ako sú obličky, pľúca, pankreas, svaly, mozog a prostata. Ďalšie tkanivá prostaty sa získali z Urologickej katedry lekárskej fakulty Stanfordovej univerzity a testovali sa v Berlex. Tkanivové rezy sa zbavili parafínu pomocou štandardných spôsobov. Polyklonálna protilátka RG1-3C sa použila ako primárna protilátka a ako detekčný systém sa použila súprava Vector ABC-AP (AK5002) so súpravou Vector red substráte (Sk5002). Ako negatívna kontrola sa uskutočnilo farbenie za neprítomnosti primárnej protilátky.

Zoznam sekvencií <110> Harkins, Richard

Parkes, Deborah

Parry, Gordon Schneider, Douglas Steinbrecher, Renáte <120> DNA kódujúca polypeptid RG-1 <130> 51791AUSM1 <140>

<141>

<150> 60/172,370 <151> 1999-12-16 <160> 12 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1785 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (296) . . (1291) <400> 1

agaaaggggt	gcggcagcac	tgccagggga	agagggtgat	ccgacccggg	gaaggtcgct	60
gggcagggcg	agttgggaaa.	gcggcagccc	ccgccgcccc	cgcagcccct	tctcctcctt	120
tctcccacgt	cctatctgcc	tctcgctgga	ggccaggccg	tgcagcatcg	aagacaggag	100
gaactggagc	ctcattggcc	ggcccggggc	gccggcctcg	ggcttaaata	ggagctccgg	240
gctctggctg	ggacccgacc	gctgccggcc	gcgctcccgc	tgctcctgcc	gggtg atg	290

Met

gaa Glu

aac ccc agc

ccg Pro

gcc Ala

gcc ctg

ggc Gly

aag gcc

ctc Leu

tgc Cys 15

get Ala

ctc Leu

346

Asn

Pro

Ser 5

Ala

Leu 10

Lys

Ala

ctc

ctg

gcc

act

ctc

ggc

gcc

ggc

cag

cct

ctt

ggg

gga

gag

tcc

394

Leu

Ala

Thr

Leu

Gly

Ala

Gly

Gin

Pro

Leu

Gly

Glu.

Ser

20

25

30

atc

tgt

tcc

gcc

gga

gcc

ccg

gcc

aaa

tac

agc

atc

acc

ttc

acg

ggc

442

íle

Cys

Ser

Ala

Gly

Ala

Pro

Ala

Lys

Tyr

Ser

íle

Thr

Phe

Thr

Gly

35

40

45

aag Lys 50

tgg Trp

age Ser

cag Gin

acg gcc Thr Ala 55

ttc ccc aag

cag Gin

tac Tyr 60

ccc Pro

ctg Leu

ttc Phe

cgc Arg

ccc Pro 65

4 90

Phe

Pro

Lys

cct

gcg

cag

tgg

tet

tcg

ctg

ggg

gcc

gcg

cat

age

tcc

gac

tac

538

Pro

Ala

Gin

Trp

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Ser

Asp

Tyr

70

75

8C

age

atg

tgg

agg

aag

aa'c

cag

tac

gtc

agt

aac

ggg

ctg

cgc

gac

ttt

586

Ser

Met

Trp

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

Phe

85

90

95

gcg

gag

cgc

ggc

gag

gcc

tgg

gcg

ctg

atg

aag

gag

atc

gag

gcg

634

Ala

Glu

Arg

Gly

Glu

Ala

Trp

Ala

Leu

Met

Lys

Glu

íle

Glu

Ala

100

105

110

ggg

gag

gcg

ctg

cag

age

gtg

cac

gcg

gtg

ttt

tcg

gcg

ccc

gcc

gtc

682

Gly

Glu

Ala

Leu

Gin

Ser

Val

His

Ala

Val

Phe

Ser

Ala

Pro

Ala

Val

115

120

125

CCC

age

ggc

acc

ggg

cag

acg

tcg

gcg

gag

ctg

gag

gtg

cag

cgc

agg

7 30

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

Gin

Thr

Ser

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Gin

Arg

130

135

140

145

cac

tcg

ctg

gtc

tcg

ttt

gtg

cgc

atc

gtg

ccc

age

ccc

gac

tgg

778

His

Ser

Leu

val

Ser

Phe

Val

Arg

íle

Val

Pro

Ser

Pro

Asp

Trp

150

155

160

ttc

gtg

ggc

gtg

gac

age

ctg

gac

ctg

tgc

gac

ggg

gac

cgt

tgg

cgg

826

Ptie

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

Arg

165

170

175

gaa

cag

gcg

ctg

gac

ctg

tac

ccc

tac

gac

gcc

ggg

acg

gac

age

874

Glu

Gin

Ala

Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Ala

Gly

Thr

Asp

Ser

180

185

190

ggc

ttc

acc

ttc

tcc

ccc

aac

ttc

gcc

acc

atc

ccg

cag

ga.c

acg

'922

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro

Asn

Phe

Ala

Thr

íle

Pro

Gin

Asp

Thr

195

200

205

gtg

acc

gag

ata

acg

tcc

tet

ccc

age

cac

ccg

gcc

aac

tcc

ttc

970

Val

Thr

Glu

íle

Thr

Ser

Pro

Ser

His

Pro

Ala

Asn

Ser

Phe

210

215

220

225

tac

cca

cgg

ctg

aag

gcc

ctg

cct

ccc

atc

gcc

agg

gtg

aca

ctg

1018

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Pro

íle

Ala

Arg

Val

Thr

Leu

230

235

240

gtg

cgg

ctg

ega

cag

age

ccc

agg

gcc

ttc

atc

cct

ccc

gcc

cca

gtc

1066

Val

Arg

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Ala

Phe

íle

Pro

Ala

Pro

Val

245

250

255

ctg

CCC

age

agg

gac

aat

gag

att

gta

gac

age

gcc

tca

gtt

cca

gaa

1114

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Glu

íle

Val

Asp

Ser

Ala

Ser

Val

Pro

Glu

260

265

270

acg Thr

ccg ctg gac Pro Leu Asp 275

tgc Cys

gag Glu

gtc Val 280

tcc Ser

ctg Leu

tgg tcg

tcc Ser 285

tgg gga ctg

tgc Cys

1162

Trp

Ser

Trp

Gly

Leu

gga

ggc

cac

tgt

ggg

agg

ctc

ggg

acc

aag

agc

agg

act

ege

tac

gtc

1210

Gly

His

Cys

Gly

Arg

Leu

Gly

Thr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

Val

290

295

300

305

cgg

gtc

cag

ccc

gcc

aac

ggg

agc

ccc

tgc

ccc

gag

ctc

gaa

1258

Arg

Val

Gin

Pro

Ala

Asn

Gly

Ser

Pro

Cys

Pro

Glu

Leu

Glu

310

315

320

gag

get

gag

tgc

gtc

cct

gat

aac

tgc

gtc

taa

gaccagagcc i

2cgcagcccc

1311

Glu

Ala

Glu

Cys

Val

Pro

Asp

Asn

Cys

Val

325

330

tggggccccc	cggagccatg	gggtgtcggg	ggctcctgtg	caggctcatg	ctgcaggcgg	1371
ccgagggcac	agggggtttc	gcgctgctcc	tgaccgcggt	gaggccgcgc	cgaccatctc	1431
tgcactgaag	ggccctctgg	tggccggcac	gggcattggg	aaacagcctc	ctcctttccc	1491
aaccttgctt	cttaggggcc	cccgtgtccc	gtctgctctc	agcctcctcc	tcctgcagga	1551
taaagtcatc	cccaaggctc	cagctactct	aaattatgtc	tccttataag	ttattgctgc	1611
tccaggagat	tgtccttcat	cgtccagggg	cctggctccc	acgtggttgc	agatacctca	1671
gacctggtgc	tctaggctgt	gctgagccca	ctctcccgag	ggcgcatcca	agcgggggcc	1731
acttgagaag	tgaataaatg	gggcggtttc	ggaagcgtca	aaaaaaaaaa	aaaa	1785

<210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met 1

Glu

Asn

Pro

Ser Pro 5

Ala

Leu Gly 10

Lys

Ala

Leu

cys 15

Ala

Leu

Ala

Thr

Leu

Gly

Ala

Gly

Gin

Pro

Leu

Gly

Glu

20

25

30

Ser

íle

Cys

Ser

Ala

Gly

Ala

Pro

Ala

Lys

Tyr

Ser

íle

Thr

Phe

Thr

35

40

45

Gly

Lys

Trp

Ser

Gin

Thr

Ala

Phe

Pro

Lys

Gin

Tyr

Pro

Leu

Phe

Arg

50

55

60

Pro

Ala

Gin

Trp

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Ser

Asp

65

70

75

80

Tyr

Ser

Met

Trp

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

85

90

95

Phe

Ala

Glu Arg 100

Gly Glu

Ala Trp

Ala 105

Leu

Met

Lys

Glu

íle 110

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Leu

Gin

Ser

Val

His

Ala

Val

Phe

Ser

Ala

Pro

Ala

115

120

125

Val

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

Gin

Thr

Ser

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Gin

Arg

130

135

140

Arg

His

Ser

Leu

Val

Ser

Phe

Val

Arg

íle

Val

Pro

Ser

Pro

Asp

145

150

155

160

Trp

Phe

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

165

170

175

Arg

Glu

Gin

Ala

Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Ala

Gly

Thr

Asp

180

185

190

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro

Asn

Phe

Ala

Thr

íle

Pro

Gin

Asp

195

200

205

Thr

Val

Thr

Glu

íle

Thr

Ser

Pro

Ser

His

Pro

Ala

Asn

Ser

210

215

220

Phe

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Pro

íle

Ala

Arg

Val

Thr

225

230

235

240

Leu

Val

Arg

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Ala

Phe

íle

Pro

Ala

Pro

245

250

255

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Glu

íle

Val

Asp

Ser

Ala

Ser

Val

Pro

260

265

270

Glu

Thr

Pro

Leu

Asp

Cys

Glu

Val

Ser

Leu

Trp

Ser

Trp

Gly

Leu

275

280

285

Cys

Gly

His

Cys

Gly

Arg

Leu

Gly

Thr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

290

295

300

Val

Arg

Val

Gin

Pro

Ala

Asn

Gly

Ser

Pro

Cys

Pro

Glu

Leu

Glu

305

310

315

320

Glu

Ala

Glu

Cys

Val

Pro

Asp

•Asn

Cys

Val

325

330

<210> 3 <211> 19 <212> DNA < 213 > Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér <400> 3 cgcgcatagc tccgactac <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<2 2 3> Opis umelej sekvencie: primér <400> 4 gccgcgtccg caaag 15 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<2 23> Opis umelej sekvencie: sonda <400> 5 aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér <400> 6 tccctctaga gccaccatgg aaaaccccag cccggc <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér <400> 7 aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg <210> 8 <211> 19 <212> PRT < 213 > Umelá sekvencia <220>

<223 > Opis umelej sekvencie: peptid <400> 8

Pro Leu Gly Gly Glu Ser íle Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr 15 10 15

Ser íle Thr <210> 9 <211> 19 <212> PRT < 213 > Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: peptid2 <400> 9

Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro 1 5 10 15

Leu Phe Arg <210> 10 <21L> 15 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 10

His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser 15 10 15 <210> 11 <21I> 23 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> n

Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala
1	5	10	15
Thr íle Pro	Gly Asp 20	Thr Val

<210> 12 <211? 12 <212> PRT < 213 > Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 12

Asn Glu íle Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná protilátka alebo fragment protilátky, ktoré špecificky viažu polypeptidový fragment majúci aminokyselinovú sekvenciu úplne zhodnú s časťou, ale nie s celou aminokyselinovou sekvenciou polypeptidov RG1 zobrazenou na obrázku 2 (SEQ ID NO: 2), a ich varianty alebo deriváty, pričom uvedená izolovaná protilátka alebo fragment protilátky špecificky viaže člen vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) aminokyseliny 28 až aminokyseliny 46 zo SEQ ID NO: 2;

b) aminokyseliny 188 až aminokyseliny 210 zo SEQ ID NO: 2;

c) polypeptidu, ktorý je aspoň na 70 % identický s polypeptidom a) alebo b).

2. Protilátka podľa nároku 1, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu

PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO: 8).

3. Protilátka podľa nároku 1, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu

DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO: 11).

4. Protilátka podľa niektorého z nárokov 1 až 3, pričom protilátkou je polyklonálna protilátka.

5 -109, kadmia-115m, vápnika-45, céru-139, céru-141, céru-144, cézia-137, chrómu-51, kobaltu-56, kobaltu-57, kobaltu-58, kobaltu-60, kobaltu-64, erbia-169, európia-152, gadolínia-153, zlata-195, zlata-199, hafnia-175, hafnia-181, india-111, jódu-123, jódu-131, irídia-192, železa-55, železa-59, kryptónu-85, olova-210, luténia-177, mangánu-54, ortuti-197, ortuti-203, molydbénu-99, neodýmu-147, neptúnia-237, niklu-63, nióbu-95, osmia-185+191, paládia-103, platiny-195m, prazeodýmu-143, prométia-147, protaktínia-233, rénia-186, 10 rubídia-86, ruténia-103, ruténia-106, skandia-44, skandia-46, selénu-75, striebra-110m, sodíka-22, stroncia-85, stroncia-89, stroncia-90, siry-35, tantalu-182, technécia-99m, telúru-125, telúru-132, tália-170, tália-204, tória-228, tória-232, cínu-113, titánu-44, volfrámu-185, vanádu-48, vanádu-49, yterbia-169, ytria-88, ytria-90, ytria-91, zinku-65 a zirkónu-95.

29. Protilátka podľa nárokov 1, 2, 3,4 alebo 5 na použitie ako liečivo.

5. Protilátka podľa niektorého z nárokov 1 až 3, pričom protilátkou je monoklonálna protilátka.

6. Imunokonjugát zahrnujúci izolovanú protilátku alebo fragment protilátky definované v nároku 1, ktorý je konjugovaný s terapeutickým agens.

7. Imunokonjugát podľa nároku 6, pričom terapeutickým agens je cytotoxický agens.

8. Imunokonjugát podľa nároku 7, pričom cytotoxický agens je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z ricínu, doxorubicínu, daunorubicínu, taxolu, etídiumbromidu, mitomycínu, etoposidu, tenoposidu, vinkristínu, vinblastínu, kolchicínu, dihydroxyantracíndiónu, aktinomycínu D, difterického toxínu, Pseudomonas exotoxínu (PE) A, PE40, ricínu, abrínu, glukokortikoidu a rádioizotopov.

9. Imunokonjugát podľa nároku 6, pričom fragmenty protilátky sú vybrané zo skupiny zahŕňajúcej fragmenty Fv, F(ab') a F(ab')₂.

10. Použitie imunokonjugátu zahrnujúceho terapeutický agens a izolovanú protilátku alebo fragment protilátky, ktoré špecificky viažu polypeptidový fragment majúci aminokyselinovú sekvenciu úplne zhodnú s časťou, ale nie s celou aminokyselinovou sekvenciou polypeptidu RG1 zobrazenou v sekvencii SEQ ID NO: 2, a ich variant alebo derivát, pričom uvedená izolovaná protilátka alebo fragment protilátky špecificky viaže člen vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) aminokyseliny 28 až aminokyselinu 46 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2;

b) aminokyseliny 77 až aminokyseliny 91 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2;

c) aminokyseliny 188 až aminokyseliny 210 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2;

d) aminokyseliny 263 až aminokyseliny 274 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2 a

c) polypeptidu, ktorý je aspoň na 70 % identický s polypeptidom uvedeným v bode (a), (b), (c) alebo (d), na prípravu kompozície na selektívnu deštrukciu bunky exprimujúcej polypeptid RG1 znázornený v sekvencii SEQ ID NO: 2 reakciou imunokonjugátu s touto bunkou, aby terapeutický agens imunokonjugátu mohol zničiť túto bunku.

11. Použitie terapeuticky účinného množstva imunokonjugátu zahrnujúceho terapeutický agens a izolovanú protilátku alebo fragment protilátky, ktoré špecificky viažu polypeptidový fragment majúci aminokyselinovú sekvenciu úplne zhodnú s časťou, ale nie s celou aminokyselinovou sekvenciou polypeptidu RG1 zobrazenou na obrázku 2 (SEQ ID NO: 2), a ich varianty alebo deriváty, pričom uvedená izolovaná protilátka alebo fragment protilátky špecificky viaže člen vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) aminokyseliny 28 až aminokyseliny 46 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2;

e) polypeptidu, ktorý je aspoň na 70 % identický s polypeptidom uvedeným v bode (a), (b), (c) alebo (d), na prípravu kompozície na liečenie chorobného stavu ľudského pacienta, keď je tento chorobný stav spojený s expresiou RG1.

12. Použitie podľa nároku 10 alebo 11, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO: 8).

13. Použitie podľa nároku 10 alebo 11, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO: 10).

14. Použitie podľa nároku 10 alebo 11, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO: 11)

15. Použitie podľa nároku 10 alebo 11, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu NEIVDSASVPET (SEQ ID NO: 12).

16. Spôsob detekcie, ktorý zahŕňa analyzovanie prítomnosti polypeptidu vo vzorke odvodenej z hostiteľa, pričom týmto polypeptidom je člen skupiny pozostávajúcej z:

a) polypeptidu zahrnujúceho aminokyselinu 28 až aminokyselinu 46 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2;

b) polypeptidu zahrnujúceho aminokyselinu 188 až aminokyselinu 210 ako je znázornené v sekvencii SEQ ID NO: 2;

c) polypeptidu, ktorý je aspoň na 70 % identický s polypeptidom uvedeným v bode (a) alebo (b), pričom analyzovanie zahrnuje uvedenie vzorky do kontaktu s protilátkou alebo fragmentom protilátky, ako sú definované v niektorom z nárokov 1 až 9, ktoré špecificky viažu jeden z polypeptidov a detegovanie väzby protilátky na polypeptid vo vzorke.

17. Použitie protilátky alebo fragmentu protilátky, ktoré špecificky viažu polypeptidový fragment majúci aminokyselinovú sekvenciu úplne zhodnú s časťou, ale nie s celou aminokyselinovou sekvenciou polypeptidu RG1 zobrazenou ako SEQ ID NO: 2, a ich varianty alebo deriváty, pričom uvedená izolovaná protilátka alebo fragment protilátky špecificky viaže člen vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

e) polypeptidu, ktorýje aspoň na 70 % identický s polypeptidom uvedeným v bode (a), (b), (c) alebo (d), na prípravu kompozície na diagnostiku metastáz, ktoré súvisia s polypeptidom sekvencie SEQ ID NO: 2 u pacienta.

18. Použitie protilátky alebo fragmentu protilátky, ktoré špecificky viažu polypeptidový fragment majúci aminokyselinovú sekvenciu úplne zhodnú s časťou, ale nie s celou aminokyselinovou sekvenciou polypeptidu RG1 zobrazenou v sekvencii SEQ ID NO: 2, a ich varianty alebo deriváty, pričom uvedená izolovaná protilátka alebo fragment protilátky špecificky viaže člen vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

e) polypeptidu, ktorý je aspoň na 70 % identický s polypeptidom uvedeným v bode (a), (b), (c) alebo (d), na prípravu kompozície na detekciu metastáz rakoviny prostaty u pacienta.

19. Použitie podľa nároku 17 alebo 18, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO: 8).

20. Použitie podľa nároku 17 alebo 18, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO: 10).

21. Použitie podľa nároku 17 alebo 18, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO: 11).

22. Použitie podľa nároku 17 alebo 18, pričom protilátka špecificky viaže aminokyselinovú sekvenciu NEIVDSASVPET (SEQ ID NO: 12).

23. Použitie podľa niektorého z nárokov 17 až 22, pričom kompozícia je na zobrazovanie metodológií.

24. Použitie podľa niektorého z nárokov 17 až 22, pričom kompozícia je na imunoscintigrafíu pomocou Tc-99m konjugovaného s anti-RGl protilátkou alebo In-111 konjugovaného s anti-RGl protilátkou.

25. Použitie podľa niektorého z nárokov 17 až 24, pričom protilátka je značená na priame alebo nepriame produkovanie detegovateľného signálu so zlúčeninou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z rádioaktívnej značky, enzýmu, chromofóru a fluorescenčnej látky.

26. Použitie podľa niektorého z nárokov 17 až 25, pričom protilátka je značená s detegovateľným markerom alebo konjugovaná s druhou molekulou na zacielenie druhej molekuly proti RG1 pozitívnym bunkám.

27. Použitie podľa nároku 26, pričom druhou molekulou je cytotoxický agens vybraný zo skupiny pozostávajúcej z ricínu, doxorubicínu, daunorubicínu, taxolu, etídiumbromidu, mitomycínu, etoposidu, tenoposidu, vinkristínu, vinblastínu, kolchicínu, dihydroxyantracíndiónu, aktinomycínu D, difterického toxínu, Pseudomonas exotoxínu (PE) A, PE40, ricinu, abn'nu a glukokortikoidu.

28. Použitie podľa nároku 26, pričom detegovateľný markér je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z antimónu-124, antimónu-125, arzénu-74, bária-103, bária-140, berýlia-7, bizmutu-j206, bizmutu-207, kadmia-

15 30. Imunokonjugát podľa nárokov 6, 7, 8 alebo 9 na použitie ako liečivo.