SK288147B6 - Isolated antibody or antibody fragment, which specifically bind to RG1 polypeptide, and immunoconjugate - Google Patents
Isolated antibody or antibody fragment, which specifically bind to RG1 polypeptide, and immunoconjugate Download PDFInfo
- Publication number
- SK288147B6 SK288147B6 SK5055-2008A SK50552008A SK288147B6 SK 288147 B6 SK288147 B6 SK 288147B6 SK 50552008 A SK50552008 A SK 50552008A SK 288147 B6 SK288147 B6 SK 288147B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- cells
- sequence
- antibody
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 337
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 319
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 303
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 title claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 91
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 10
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 claims abstract description 8
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims abstract description 7
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims abstract description 4
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims abstract description 4
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims abstract description 4
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims abstract description 4
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 61
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 49
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Chemical compound CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 abstract description 5
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 abstract description 4
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 abstract description 3
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 abstract description 3
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 101710163345 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A Proteins 0.000 description 240
- 102100034503 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A Human genes 0.000 description 240
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 171
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 171
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 170
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 description 86
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 74
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 74
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 56
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 54
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 49
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 41
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 37
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 31
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 28
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 25
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 19
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- -1 mRNA and cDNA Chemical compound 0.000 description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 12
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 102100036427 Spondin-2 Human genes 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 239000002585 base Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 101710092167 Spondin-1 Proteins 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 108010074865 mindin Proteins 0.000 description 10
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 101150031187 fba gene Proteins 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 101150066142 tsr gene Proteins 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 102100036428 Spondin-1 Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 101000642256 Rattus norvegicus Spondin-2 Proteins 0.000 description 7
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 7
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 5
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241001326189 Gyrodactylus prostae Species 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 108010071850 M-spondin Proteins 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 101000642260 Rattus norvegicus Spondin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011472 radical prostatectomy Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 3
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- LBYMZCVBOKYZNS-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LBYMZCVBOKYZNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N Ala-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 2
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- GCXGCIYIHXSKAY-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GCXGCIYIHXSKAY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 208000004965 Prostatic Intraepithelial Neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 206010071019 Prostatic dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- OHAJHDJOCKKJLV-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OHAJHDJOCKKJLV-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N Thr-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 2
- MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N Thr-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 2
- FWTFAZKJORVTIR-VZFHVOOUSA-N Thr-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FWTFAZKJORVTIR-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GAYLGYUVTDMLKC-UWJYBYFXSA-N Tyr-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GAYLGYUVTDMLKC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 101100043251 Xenopus laevis spon1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010078114 alanyl-tryptophyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 2
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000021046 prostate intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- LBJYAILUMSUTAM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O LBJYAILUMSUTAM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CBCCCLMNOBLBSC-XVYDVKMFSA-N Ala-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CBCCCLMNOBLBSC-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- SBVJJNJLFWSJOV-UBHSHLNASA-N Arg-Ala-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SBVJJNJLFWSJOV-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N Arg-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N Asn-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- HPNDBHLITCHRSO-WHFBIAKZSA-N Asp-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O HPNDBHLITCHRSO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MUWDILPCTSMUHI-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O MUWDILPCTSMUHI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AITKTFCQOBRJTG-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N AITKTFCQOBRJTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BRRPVTUFESPTCP-ACZMJKKPSA-N Asp-Ser-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BRRPVTUFESPTCP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000251522 Cephalochordata Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- VZKXOWRNJDEGLZ-WHFBIAKZSA-N Cys-Asp-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VZKXOWRNJDEGLZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N Cys-Gly-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QQAYIVHVRFJICE-AEJSXWLSSA-N Cys-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N QQAYIVHVRFJICE-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Cys Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N Gly-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N Gly-Thr-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- OHOXVDFVRDGFND-YUMQZZPRSA-N His-Cys-Gly Chemical compound N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O OHOXVDFVRDGFND-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N His-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101001067946 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IIKJNQWOQIWWMR-CIUDSAMLSA-N Leu-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N IIKJNQWOQIWWMR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- IBSGMIPRBMPMHE-IHRRRGAJSA-N Leu-Met-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O IBSGMIPRBMPMHE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JCMMNFZUKMMECJ-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JCMMNFZUKMMECJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WPTHAGXMYDRPFD-SRVKXCTJSA-N Met-Lys-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WPTHAGXMYDRPFD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N N'-hexadecylthiophene-2-carbohydrazide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCNNC(=O)c1cccs1 HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- CYZBFPYMSJGBRL-DRZSPHRISA-N Phe-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CYZBFPYMSJGBRL-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N Phe-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N Phe-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Tyr Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UEHYFUCOGHWASA-HJGDQZAQSA-N Pro-Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UEHYFUCOGHWASA-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000550081 Renata Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N Ser-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GVIGVIOEYBOTCB-XIRDDKMYSA-N Ser-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 GVIGVIOEYBOTCB-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- JJUNLJTUIKFPRF-BPUTZDHNSA-N Ser-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N JJUNLJTUIKFPRF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N Ser-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- BCAVNDNYOGTQMQ-AAEUAGOBSA-N Ser-Trp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(O)=O BCAVNDNYOGTQMQ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N Thr-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- UNURFMVMXLENAZ-KJEVXHAQSA-N Thr-Arg-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O UNURFMVMXLENAZ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- XSEPSRUDSPHMPX-KATARQTJSA-N Thr-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XSEPSRUDSPHMPX-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- DEGCBBCMYWNJNA-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O DEGCBBCMYWNJNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- NMCBVGFGWSIGSB-NUTKFTJISA-N Trp-Ala-Leu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N NMCBVGFGWSIGSB-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)=CNC2=C1 LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N Trp-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- XYBNMHRFAUKPAW-IHRRRGAJSA-N Tyr-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N XYBNMHRFAUKPAW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- RVGVIWNHABGIFH-IHRRRGAJSA-N Tyr-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RVGVIWNHABGIFH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010317 ablation therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000010516 arginylation Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical group NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 108010084264 glycyl-glycyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010249 in-situ analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000025712 muscle attachment Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000008137 solubility enhancer Substances 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
The invention relates to an isolated antibody or antibody fragment, which specifically bind to a RG1 polypeptide, for use as a medicament. The antibody is a polyclonal or monoclonal antibody. The antibody fragment is selected from the group consisting of Fv, F(ab') and F(ab')2 fragments. The invention further relates to an immunoconjugate comprising an isolated antibody or antibody fragment, which specifically bind to a RG1 polypeptide, conjugated to a therapeutic agent for use as a medicament. The therapeutic agent is a cytotoxic agent, such as ricin, doxorubicin, daunorubicin, taxol, ethidium bromide, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, dihydroxy anthracin dione, aktinomycin D, diphtheria toxin, Pseudomonas exotoxin (PE) A, PE40, abrin, glucocorticoid and radioisotopes.
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka použitia protilátok zacielených na nedávno identifikované polypetidy ľudského extracelulámeho matrixu (označované RG1), ich varianty a deriváty.
Doterajší stav techniky
Rakovina prostaty je často sa vyskytujúce ochorenie u mužov, ktorým je postihnutá asi tretina mužov do 45 rokov. Dokázalo sa, že jej vznik súvisí tak s genetickými vplyvmi, ako aj s vplyvmi prostredia, pričom väčšina prípadov je výsledkom kombinácie oboch týchto faktorov. Štúdie rodinného výskytu tejto choroby naznačili, že genetická predispozícia má úlohu asi pri 5 - 10 % všetkých prípadov rakoviny prostaty a pri okolo 45 % prípadov u mužov mladších ako 55 rokov.
Dokázalo sa, že k vzniku rakoviny prostaty dochádza vo viacerých krokoch, pričom jednou z prekurzorových lézií je prostatická intraepitelová neoplázia (PIN). Skoré štádiá choroby sú závislé od androgénu, zatiaľ čo neskoršie fázy sú od tohto hormónu nezávislé. Často je klinicky zistená proliferačná porucha prostaty známa ako benígna prostatická hyperplázia, ale zrejme nie je jedným z vývojových štádií rakoviny. S výskytom rakoviny prostaty je však často spojená. Pri rakovine prostaty je častý výskyt viacerých ložísk, obvyklý je pomalý rast a heterogenita nádorov. V neskorších štádiách dochádza k častému výskytu metastáz v lymfatických uzlinách a v kostiach.
Rakovina prostaty sa obvykle diagnostikuje pri bežnom fyzikálnom vyšetrení a ďalej na základe zvýšenej hladiny prostatického špecifického antigénu (PSA) v sére. Pri lokalizovanej chorobe je optimálnou liečbou radikálna prostatektómia. Pokročilá metastatická choroba sa obvykle lieči potlačením výskytu androgénu orchektómiou alebo liečbou pomocou GnRH (hormón uvoľňujúci gonadotropín), alebo antiandrogénnou liečbou. V pokročilých štádiách sa však choroba stáva rezistentnou na tento hormón a rozvinutá choroba nie je liečiteľná. Navyše tak radikálna prostatektómia, tako liečba potlačením výskytu androgénu má závažné vedľajšie účinky. Medzi ne patrí vysoké riziko inkontinencie a impotencie spojené s radikálnou prostatektómiou a lámavosť kostí a osteoporóza spojená s androgénovou ablačnou liečbou.
Je preto potrebné nájsť nové terapeutické spôsoby na liečbu včasných aj neskorých štádií rakoviny prostaty.
Pri rakovine prostaty boli zaznamenané zmeny v expresii špecifických proteínov, vrátane expresie p53 v neskorších štádiách tejto choroby, znížené hladiny receptorov pre TGF-β, znížené hladiny E-cadherinu, C-Cam (bunková adhezívna molekula) a niekoľkých rôznych integrínov. Expresia onkogénu bcl-2 je pri neskorých nádoroch závislých od androgénu výrazne zvýšená a prognóza pacientov so zvýšenou expresiou bcl-2 je pomerne nepriaznivá. Zatiaľ čo uvedené zmeny génovej expresie boli dobre doložené, dokázalo sa žiadne príčinné spojenie týchto zmien s danou chorobou. Bolo by teda užitočné identifikovať nové proteíny, ktorých expresia je spojená s výskytom či vývojom prostatických nádorov, a ktoré by mohli slúžiť ako molekulárne ciele na diagnostiku a liečbu rakoviny prostaty.
Predkladaný vynález opisuje nový homológ vyššej rodiny proteínov extracelulámeho matrixu. Tento homológ, nazývaný RG1, je exprimovaný v prostatickom tkanive ajeho expresia môže byť v prostatických nádoroch zvýšená.
Extracelulámy matrix je komplexný sieťovitý útvar, tvorený kolagénom a elastínom, uložený vo viskózne-elastickej základnej hmote z proteoglykánov a glykoproteínov. Matrix tvorí trojrozmernú podpornú konštrukciu, ktorá oddeľuje jednotlivé bunkové kompartmenty, sprostredkováva bunkové väzby a určuje štruktúru tkaniva (Bissel et al., J. Theor. Biol. 99: 31 - 68, 1982; Carlson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2403 - 2406, 1981) . Matrix funguje ako makromolekulámy filter (Hay, E.D., Celí Biology of Extracellular Matrix, New York, Plénum Press, 1982) a má tiež vplyv na bunkovú diferenciáciu, mitogenézu a morfogenézu (Gospodarowiczs, D., Cancer Res. 38: 4155 - 171, 1978). Biochemické interakcie medzi normálnymi bunkami a matrixom môžu byť pri neoplázii pozmenené a môžu tak ovplyvňovať nádorový rast. Nádorové bunky môžu s matrixom interagovať rôznym spôsobom. Buď sa môžu prichytiť na matrix prostredníctvom špecifických plazmatických membránových receptorov (Terranova et al. , Cancer Res. 42: 22 65 - 2269, 1982). Alebo môže byť matrix degradovaný kaskádou enzýmov dodávaných nádorovými aj hostiteľskými bunkami (Eisen et al., Biochem. Biophys. Acta 151: 637 - 645, 1968). A nakoniec môžu nádorové bunky v diferencovaných častiach nádoru syntetizovať a hromadiť matrix alebo vyvolávať hromadenie nadbytočného matrixu v hostiteľských bunkách (Brownstein et al., Cancer 40: 2979 - 2986, 1977).
RG1 má homológiu s vyššou rodinou proteínov extracelulámeho matrixu, ktoré sú kódované génmi Mindin/F-spondín. Táto génová rodina má spoločné dve konzervatívne spodínové domény FS1 a FS2 blízko Nkonca a najmenej jeden opakujúci sa úsek trombospondínu typu 1 (TSR1) na C-konci (Shimeld, S.M., Mol. Biol. Evol. 15(9): 1218 - 1223, 1998). Motív TSR sa pôvodne našiel v proteínoch extracelulámeho matrixu stavovcov (Bomstein, P., J. Celí. Biol. 130: 503 - 506, 1995) a potom sa našiel aj v niekoľkých ďalších prote2
SK 288147 Β6 ínoch extracelulámeho matrixu. Existuje rad dôkazov, že oblasti TSR sprostredkujú bunkovú adhéziu a majú kľúčovú úlohu pri vzniku nádorov. Bolo napr. dokázané, že proteolytické fragmenty trombospondínu obsahujúce oblasť TSR a syntetické peptidy so sekvenciami, ktoré zodpovedajú TSR oblasti trombospondínu podporujú adhéziu nádorových buniek a vytváranie metastáz (Prater et al. , J. Celí Biol. 112: 1031 - 1040, 1991; Tuszynski and Nicosia, BioEssays 18: 71 - 76, 1996), vykazujú antiangiogénnu aktivitu (Tolsma et al., J. Celí Biol. 122: 497 - 511, 1993) a inhibujú zhlukovanie krvných doštičiek a metastázovanie melanómov (Tuszynski et al., J. Celí Biol. 116: 209 - 217, 1992).
V súčasnej dobe patrí do tejto vyššej rodiny génov jeden gén Caenorhabditis elegans, jeden gén Drozofily a niekoľko génov stavovcov. V C. elegans gén F10E7.4 kóduje okrem FS1 a FS2 päť oblastí TSR (Higashijima et al. , Dev. Biol. 192: 211 - 227, 1997). Člen tejto rodiny u Drozofily nazývaný M-spondin (mspo) obsahuje domény FS1 a FS2 a jedinú oblasť TSR (Umemiya et al., Dev. Biol. 186: 165 - 176, 1997). Gén pre M-sponodin kóduje sekretovaný proteín, ktorý sa nachádza v miestach svalových úponov a slúži ako proteín extracelulámeho matrixu, ktorý podporuje pripojenie svalov k apodému. Členovia tejto rodiny génov u stavovcov zahŕňajú gény izolované z Danio rerio (zebrafish) (Mindinl a Mindin2, F-spondinl a F-spondin2), potkaní F-spondín, F-spondín žiab Xenopus a potkaní Mindin. Mindinl a Mindin2 sú navzájom blízko príbuzné a ich génová štruktúra je podobná M-spondínu Drozofily. Oba tieto gény kódujú okrem domén FS1 a FS2 jedinú oblasť TSR (Higashijima et al., Dev. Biol. 192: 211 - 227, 1997). Gény pre F-spondínl a F-spondín2 Danio rerio (zebrafish), potkaní F-spondín (Klár et al., Celí 69: 95 - 110, 1992) a F-spondín žiab Xenopus (Altaba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8268 - 8272) majú všetky podobnú štruktúru a kódujú okrem domén FS1 a FS2 šesť kópií oblasti TSR. U stavovcov je možné vyššiu rodinu génov Mindin/F-spondín rozdeliť do dvoch skupín: gény blízko príbuzné pôvodným potkaním génom pre F-spondín a Mindin a gény blízko príbuzné génu pre M-spondín Drozofily. Tak pre Mindin, ako aj gén pre F-spondín u stavovcov kódujú proteíny, ktoré sú primáme exprimované bunkami dna neutrálnej trubice počas embryonálneho vývoja.
Nedávno bol z kopytníka Amphioxus izolovaný jediný gén príbuzný F-spondínu, AmphiF-spondín (Shimeld, S.M., Mol. Biol. Evol. 15 (9): 1218 - 1223, 1998).
Na základe molekulárnej fylogenetiky je AmphiF-spondín blízko príbuzný určitej skupine génov stavovcov pre F-spondín, ktoré kódujú šesť oblastí TSR. AmphiF-spondín kóduje tri oblasti TSR a dva opakujúce sa úseky fibronektínu typu III, z ktorých jeden vykazuje silnú podobnosť s opakujúcim sa úsekom fibronektínu typu III produktu génu DCC („Deleted in Colorectal Cancer“). Expresiu tohto proteínu je možné nájsť vo väčšine oblastí centrálneho nervového systému a nielen v stredovej línii, ako bolo opísané pri proteínoch Mindin a F-spondín stavovcov.
Tieto fakty naznačujú, že proteíny extracelulámeho matrixu, ako napr. nový proteín RG1, ktorý je homológom vyššej rodiny Mindin/F-spondín, by mohli byť dobrými kandidátmi na využitie na diagnostiku rakoviny a na použitie na liečenie.
WO98/45442 sa týka sekretovaného zsig25 polypeptidu exprimovaného vo veľkej miere v tkanive prostaty a protilátok k zsig25 polypeptidu. Aminokyselinová sekvencia zsig25 polypeptidu zodpovedá v podstate sekvencií RG1 polypeptidu. Ale nebol identifikovaný žiadny epitop zo zsig25 polypeptidu.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je izolovaná protilátka alebo fragment protilátky, ktoré sa špecificky viažu na RG1 polypeptid, ako je uvedený v SEQ ID NO: 2, pričom protilátka sa špecificky viaže na člen zvolený zo skupiny pozostávajúcej z:
a) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 77 až aminokyselinu 91 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2);
b) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 263 až aminokyselinu 274 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2); na použitie ako liečivo.
Protilátka na uvedené použitie je polyklonálna alebo monoklonálna protilátka. Fragment protilátky je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z Fv, F(ab’) a F(ab’)2 fragmentov.
Ďalej je predmetom vynálezu imunokonjugát obsahujúci izolovanú protilátku alebo fragment protilátky, ktoré sa špecificky viažu na RG1 polypetid, ako je uvedený v SEQ ID NO: 2, pričom izolovaná protilátka alebo jej fragment sa špecificky viažu na člen zvolený zo skupiny pozostávajúcej z:
a) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 77 až aminokyselinu 91 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2);
b) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 263 až aminokyselinu 274 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2); spojené s terapeutickým činidlom, na použitie ako liečivo.
Terapeutickým činidlom je cytotoxické činidlo.
Cytotoxické činidlo je zvolené zo skupiny pozostávajúcej z ricínu, doxorubicínu, daunorubicínu, taxolu, etidiumbromidu, mitomycínu, etoposidu, tenoposidu, vinkristínu, vinblastínu, kolchicínu, dihydroxyantracín3
SK 288147 Β6 diónu, aktinomycínu D, difterického toxínu, Pseudomonas exotoxínu (PE) A, PE40, abrinu, glukokortikoidu a rádioizotopov.
Predkladaný vynález opisuje polynukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje výhradne nový proteín, ktorý je označovaný ako RG1. Polypeptid RG1 vykazuje homológiu s potkaním Mindinom, proteínom extracelulárneho matrixu. Obsahuje hydrofóbnu signálnu sekvenciu na N-konci, dve spondínové domény (FS1 a FS2) a opakujúci sa úsek („repeat“) trombospondínu typu I na C-konci. RG1 má 89,7 % podobnosť s potkaním Mindinom. Polynukleotidová sekvencia označovaná ako rgl a uvedená na obr. 1 (a v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1) kóduje aminokyselinovú sekvenciu RG1, ktorá je uvedená na obr. 2 (v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2).
Tento vynález poskytuje polypeptidy, ktoré boli identifikované, ako nové proteíny homologické s rodinou proteínov extracelulámeho matrixu, ktorá sa nazýva Mindin, ako ukazuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) so známymi aminokyselinovými sekvenciami iných proteínov extracelulámeho matrixu.
Vynález ďalej poskytuje polynukleotidy kódujúce tieto polypeptidy, najmä polynukleotidy kódujúce polypeptidy označované ako RG1.
Poskytujú sa izolované polynukleotidy kódujúce RG1, vrátane mRNA a cDNA a ich biologicky, diagnosticky, klinicky alebo terapeuticky využiteľné varianty, analógy a deriváty, vrátane fragmentov ich variantov analógov a derivátov.
Medzi zvlášť výhodnými uskutočneniami sú prirodzene sa vyskytujúce alelické varianty polynukleotidov, ktoré kódujú varianty polypeptidov označované ako RG1.
Poskytujú sa nové polypeptidy ľudského pôvodu označované ako RG1 ako aj ich biologicky, diagnosticky či terapeuticky využiteľné fragmenty, varianty a deriváty, varianty a deriváty ich fragmentov, vrátane ich analógov.
Medzi zvlášť výhodnými uskutočneniami sú varianty RG1 kódované prirodzene sa vyskytujúcimi alelickými variantmi polynukleotidu rgl.
Taktiež sa poskytuje spôsob prípravy už zmienených polypeptidov, ich fragmentov, variantov a derivátov, fragmentov variantov a derivátov a ich analógov. Vo výhodnom uskutočnení sa poskytujú spôsoby prípravy zmienených polypeptidov RG1, zahŕňajúce kultiváciu hostiteľských buniek, do ktorých bol vložený exogénne odvodený polynukleotid kódujúci RG1 exprimovateľný za podmienok na expresiu ľudského RG1 v hostiteľovi, s následnou izoláciou exprimovaného polypeptidu.
Poskytujú sa prípravky, zlúčeniny a spôsoby využívajúce už zmienené polypeptidy a polynukleotidy okrem iného na výskumné, biologické, klinické a terapeutické účely.
Poskytujú sa prípravky, zlúčeniny a spôsoby, ktoré slúžia na vyhodnotenie expresie RG1 v bunkách stanovením polypeptidov RG1 a mRNA kódujúce RG1; a ďalej stanovením genetických variácii a aberácií, napr. defektov, v génoch rgl.
N súlade s určitými výhodnými uskutočneniami sa poskytujú sondy, ktoré hybridizujú so sekvenciami rglPredmetom tohto vynálezu sú protilátky na použitie ako liečivo, ktoré sú vysoko selektívne pre polypeptidy RG1 alebo fragmenty týchto protilátok, ktoré je možné využiť na diagnostiku a/alebo detekciu expresie RG1, ktorá by mohla byť spojená s rakovinou prostaty. V súlade s určitými výhodnými uskutočneniami tohto zámeru vynálezu sú tieto protilátky značené tak, aby poskytli detegovateľný signál. Zvlášť výhodné sú protilátky značené rádioaktívne, enzymaticky, pomocou chromofóru alebo fluorescenčné.
V ďalšom aspekte tohto vynálezu sú opísané protilátky na použitie ako liečivo, konjugované s terapeutickou látkou určené na podanie do buniek in vitro, ex vivo alebo in vivo, alebo na podanie do mnohobunkového organizmu. V tomto ohľade sú zvlášť výhodné terapeutické látky (terapeutické agens, terapeutické činidlá), ktoré sú cytotoxické. V určitých uskutočneniach výhodných z tohto hľadiska ide o podanie takých konjugovaných protilátok ľudským pacientom na liečbu chorobného stavu, ktorý je charakterizovaný aktivitou alebo expresiou RG1, ako napr. rakovina prostaty.
V ďalšom aspekte tohto vynálezu sú opísané peptidy a antiidiotypové protilátky, ktoré je možné využiť na stimuláciu imunitnej odpovede.
Poskytujú sa ribozýmy a polynukleotidy komplementárne k polynukleotidom rgl (t.j. „antisense polynukleotidy) určené na podanie do buniek in vitro, ex vivo alebo in vivo, alebo do mnohobunkového organizmu. Zvlášť výhodné z tohto hľadiska je podanie „antisense“ molekúl ľudským pacientom na liečenie chorobného stavu, ako napr. rakoviny prostaty či benígnej prostatickej hyperplázie, ktorý sa zmierni znížením úrovne aktivity RG1.
Ďalšie predmety, vlastnosti, výhody a aspekty predkladaného vynálezu vyplynú pre odborníkov z nasledujúceho opisu. Malo by však byť zrejmé, že nasledujúci opis a špecifické príklady, ktoré ukazujú výhodné uskutočnenia tohto vynálezu, slúžia iba na ilustráciu.
SK 288147 Β6
Definície
Tak ako sa používajú v opise vynálezu, príkladoch a pripojených nárokoch, majú nasledujúce termíny stanovený význam, pokiaľ nie je výslovne určené inak.
„RG1“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2); jeho varianty, analógy, deriváty a fragmenty a fragmenty týchto variantov, analógov a derivátov. Termíny „fragment“, „derivát“ a „analóg“, pokiaľ sa vzťahujú na polypeptid na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), označujú polypeptid, ktorý má v podstate tú istú biologickú a/alebo imunologickú aktivitu ako polypeptid na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).
„Rgl“ označuje polynukleotid, ktorého sekvencia je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1) a polynukleotidy, ktoré kódujú polypeptidy, ktorých aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2); a ďalej polynukleotidy, ktoré kódujú varianty, analógy, deriváty a fragmenty RG1 a fragmenty týchto variatov, analógov a derivátov. Rgl tiež označuje tieto polynukleotidy vo forme RNA a polynukleotidy, ktoré sú komplementárne k polynukleotidom, ktoré kódujú polypeptidovú sekvenciu, ktorá je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).
Termín „polynukleotid“ obvykle označuje akýkoľvek polyribonukleotid či polydeoxyribonukleotid, ktorým môže byť nemodifikovaná RNA či DNA alebo modifikovaná RNA či DNA. Tak napr. polynukleotidy, ako sú uvedené, označujú okrem iného jednovláknovú a dvojvláknovú DNA, DNA, ktorá je zmesou jedno- a dvojvláknových oblastí, jedno- a dvojvláknovú RNA a RNA, ktorá je zmesou jedno- a dvojvláknových oblastí, hybridné molekuly obsahujúce DNA a RNA, ktoré môžu byť jednovláknové alebo, čo je typickejšie, dvojvláknové alebo zmes jedno- a dvojvláknových oblastí. Navyše, termín polynukleotid, ako je použitý označuje aj oblasti trojvláknovej RNA či DNA alebo trojvláknovej oblasti obsahujúcej tak RNA, ako aj DNA. Vlákna týchto oblastí môžu pochádzať tak z tej istej molekuly, ako z rôznych molekúl. Tieto oblasti môžu zahŕňať úseky pochádzajúce zo všetkých týchto molekúl, ale v typickejšom prípade sú mienené úseky iba niektorých týchto molekúl. Jednou z molekúl takejto trojvláknovej oblasti často býva oligonukleotid.
Termín „polynukleotid“, ako sa tu používa, označuje tiež molekuly DNA alebo RNA, ako sú tu opísané, a ktoré obsahujú jednu alebo viac modifikovaných báz. To znamená, že molekuly DNA či RNA, ktorých cukor-fosfátová kostra bola pozmenená na zvýšenie stability alebo z iných dôvodov, sú tu tiež označované termínom „polynukleotidy“. Navyše, molekuly DNA či RNA, ktoré obsahujú neobvyklé bázy ako napr. inozín či modifikované bázy ako bázy značené tríciom, aby sa uviedli aspoň dva príklady, sa tiež označujú používaným termínom polynukleotidy.
Je zrejmé, že na molekulách DNA a RNA sa uskutočnilo množstvo rôznych modifikácií, ktoré slúžia na rôzne užitočné účely známe odborníkom v odbore. Termín „polynukleotid“, ako je používaný, zahŕňa okrem iného takéto chemicky, enzymaticky či metabolický modifikované formy polynukleotidov, ako aj chemické formy DNA či RNA charakteristické pre vírusy či bunky, a to pre bunky jednoduché aj zložité, inter alia.
Termín „polypeptidy“, ako je tu používaný, zahŕňa všetky polypeptidy, ktoré sú opísané. Základná štruktúra polypeptidov je dobre známa a je opísaná v nespočetnom množstve učebníc a iných odborných publikácií. V kontexte predkladaného vynálezu označuje tento termín akýkoľvek peptid alebo protein obsahujúci dve alebo viac aminokyselín, ktoré sú vzájomne spojené do lineárneho reťazca peptidovou väzbou. Tento termín, ako sa tu používa, označuje tak krátke reťazce, ktoré sú tiež bežne v stave techniky označované napr. ako peptidy, oligopeptidy a oligoméry, ako aj dlhé reťazce, ktoré sa v stave techniky bežne označujú ako proteíny, ktorých je mnoho typov.
Je zrejmé, že polypeptidy často obsahujú aminokyseliny iné ako 20 aminokyselín obvykle označovaných ako 20 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín a že mnoho aminokyselín, vrátane koncových, môže byť v danom polypeptide modifikovaných a to buď prirodzenou cestou ako glykozyláciou, alebo inými posttranslačnými modifikáciami alebo chemickými modifikačnými spôsobmi odborníkom dobre známym. Dokonca aj bežné modifikácie, ktoré sa v polypeptidoch prirodzene vyskytujú, sú príliš početné, aby ich bolo možné vyčerpávajúcim spôsobom vymenovať, ale sú dobre opísané v základných príručkách a detailnejších monografiách, ako aj v rozsiahlej odbornej literatúre a sú dobre známe odborníkom. Medzi známe modifikácie, ktoré sa môžu vyskytovať v polypeptidoch zmienených v predkladanom vynáleze, patria, aby sa vymenovalo aspoň niekoľko ilustratívnych príkladov, acetylácia, acylácia, ADP-ribozylácia, amidácia, kovalentné naviazanie flavínu, kovalentné naviazanie hému, kovalentné naviazanie polynukleotidu alebo derivátu polynukleotidu, kovalentné naviazanie lipidu alebo derivátu lipidu, kovalentné naviazanie fosfatidylinozitolu, tvorba priečnych väzieb, cyklizácia, tvorba disulfidových mostíkov, demetylácia, tvorba priečnych kovalentných väzieb, tvorba cystínu, tvorba pyroglutamátu, formylácia, gama-karboxylácia, glykácia, glykozylácia, tvorba kotvy GPI, hydroxylácia, jodácia, metylácia, myristylácia, oxidácia, proteolitické úpravy, fosforylácia, prenylácia, racemizácia, naviazanie selénu, naviazanie síry, adícia aminokyseliny prostredníctvom transferovej RNA ako napr. arginylácia a naviazanie ubikvitínu.
Tieto modifikácie sú odborníkom dobre známe a boli detailne opísané v odbornej literatúre. Rad zvlášť známych modifikácií, ako napr. glykozylácia, naviazanie lipidov, naviazanie síry, gama-dekarboxylácia, naviazanie zvyškov glutámovej kyseliny, hydroxylácia a ADP-ribozylácia, boli opísané v celkom základných
SK 288147 Β6 príručkách, ako napr. I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York, 1993. Na túto tému existuje mnoho prehľadných článkov, ako napr. texty, ktoré publikovali Wold, F., in Posttranslational Covalent Modifícation of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1 - 12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626 - 646, 1990, a Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48 - 62, 1992.
Je zrejmé, ako je všeobecne známe a tu už poukázané, že polypeptidy nie sú vždy lineárne. Napr. polypeptidy môžu byť rozvetvené dôsledkom naviazania ubikvitínu, môžu byť cirkuláme, s rozvetvením alebo bez neho, obvykle ako dôsledok posttranslačných úprav, vrátane prirodzených úprav alebo procesov spôsobených ľudskou manipuláciou, ku ktorým normálne nedochádza. Cirkuláme, vetvené a cirkuláme vetvené polypeptidy môžu byť syntetizované netranslačnými prirodzenými procesmi aj čisto syntetickými spôsobmi.
Modifikácie sa môžu vyskytovať kdekoľvek v polypeptide, vrátane peptidovej kostry, bočných reťazcov aminokyselín alebo N- a C-konca. V skutočnosti je blokovanie aminoskupiny alebo karboxyskupiny, alebo oboch týchto skupín prostredníctvom kovalentnej modifikácie bežne sa vyskytujúcim javom v prirodzene sa vyskytujúcich aj syntetických polypeptidoch a tieto modifikácie sa môžu v polypeptidoch uvedených v predkladanom vynáleze vyskytovať tiež. Napr. N-koncovým aminokyselinovým zvyškom polypeptidov produkovaných E. coli pred proteolytickou úpravou bude vždy N-formylmetionín.
Modifikácie vyskytujúce sa v polypeptide sú často výsledkom spôsobu, akým tento polypeptid vznikol. Pri polypeptidoch, ktoré vznikli napr. expresiou génu klonovaného v hostiteľovi, bude podstata a rozsah modifikácii z veľkej časti určený posttranslačnou modifikačnou kapacitou hostiteľskej bunky a modifikačnými signálmi, ktoré sa nachádzajú v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu. Napr. ako je dobre známe, glykozylácia sa často nevyskytuje pri bakteriálnych hostiteľoch ako E. coli. Pokiaľ sa teda glykozylácia požaduje, polypeptid by mal byť exprimovaný v glykozylujúcom hostiteľovi, obvykle v eukaryotickej bunke. Bunky hmyzu často uskutočňujú tie isté posttranslačné glykozylácie ako cicavčie bunky a preto boli napr. vyvinuté hmyzie expresné systémy na účinnú expresiu cicavčích proteínov, ktoré majú natívnu formu glykozylácie. Podobné úvahy sa vzťahujú aj na iné modifikácie.
Je zrejmé, že ten istý typ modifikácie sa môže vyskytovať v tej istej alebo rôznej miere na rôznych miestach daného polypeptidu. Daný polypeptid tiež môže obsahovať mnoho typov modifikácií.
Termín polypeptid, ako sa používa, obvykle zahŕňa všetky takéto modifikácie, najmä tie, ktoré sa nachádzajú v polypeptidoch syntetizovaných expresiou polynukleotidu v hostiteľskej bunke.
Termín „polynukleotid kódujúci polypeptid“, ako sa tu používa, zahŕňa polynukleotidy obsahujúce sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid uvedený v predkladanom vynáleze, v konkrétnom prípade polypeptid RG1, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2). Tento termín zahŕňa polynukleotidy, ktoré obsahujú jednu súvislú oblasť alebo nesúvislé oblasti, ktoré kódujú polypeptid (prerušené napr. intrónmi) spolu s ďalšími oblasťami.
„Biologická aktivita“ označuje štrukturálne, regulačné alebo biochemické funkcie prirodzene sa vyskytujúceho polypeptidu RG1.
„Imunologická aktivita“ označuje schopnosť prirodzeného, rekombinantného alebo syntetického RG1, alebo akéhokoľvek jeho fragmentu vyvolať špecifickú imunitnú odpoveď v zodpovedajúcom živočíchovi či bunke, a viazať špecifické protilátky.
Termín „oligonukleotid“ označuje pomerne krátke polynukleotidy. Tento termín sa často vzťahuje na jednovláknové deoxyribonukleotidy, ale môže tiež označovať okrem iného jedno- či dvojvláknové ribonukleotidy, hybridy RNA a DNA a dvojvláknovej DNA. Oligonukleotidy, ako napr. jednovláknové oligonukleotidy sond DNA, sa často syntetizujú chemickými spôsobmi, napr. pomocou automatických syntetizátorov oligonukleotidov. Oligonukleotidy sa však môžu pripraviť aj množstvom iných metód, vrátane metód in vitro využívajúcich rekombinantnú DNA a expresiu DNA v bunkách a organizmoch. „Oligonukleotidy“ alebo „oligoméry“ alebo polynukleotidový „fragment“, „úsek“ alebo „segment“ označuje polynukleotidovú sekvenciu s najmenej 10 nukleotidmi a najviac približne 60 nukleotidmi, výhodne asi 15 až 30 nukleotidmi a najvýhodnejšie približne 20 až 25 nukleotidmi.
„Prirodzene sa vyskytujúci RG1“ označuje RG1 produkovaný ľudskými bunkami, ktoré neboli geneticky modifikované a špecificky označuje rôzne formy RG1, ktoré vznikli posttranslačnými úpravami polypeptidu zahŕňajúcimi, ale bez obmedzenia, acetyláciu, karboxyláciu, glykozyláciu, fosforyláciu, lipidáciu, acyláciu a štiepenie.
Termín „variant (y)“ polynukleotidov alebo polypeptidov, ako sa používa v tomto texte, označuje polynukleotidy alebo polypeptidy, ktoré sa líšia od referenčného polynukleotidu či polypeptidu. Varianty v tomto zmysle sú opísané neskôr a na iných miestach v predkladanom vynáleze detailnejšie.
(1) Polynukleotid, ktorý sa líši svojou sekvenciou od iného, referenčného polynukleotidu. Tieto rozdiely sú obvykle obmedzené, takže sekvencie referenčného polynukleotidu a jeho variantov sú veľmi podobné a v mnohých oblastiach sú zhodné.
Ako je poukázané ďalej, zmeny v sekvencií variantu polynukleotidu môžu byť bez vonkajšieho prejavu. To znamená, že nemusia ovplyvniť aminokyselinovú sekvenciu polypeptidu kódovaného polynukleotidom.
SK 288147 Β6
Tam, kde sú zmeny obmedzené na tento typ bez vonkajšieho prejavu, variant kóduje polypeptid s veľkosťou tej istej aminokyselinovej sekvencie ako referenčný polypeptid. Ako sa uvádza ďalej, zmeny v sekvencií variantu polynukleotidu môžu spôsobiť zmeny v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu kódovaného referenčným polynukleotidom. Takéto zmeny polynukleotidu môžu viesť k substitúcii, adícii, delécii alebo fúzii aminokyselín alebo skracovaniu aminokyselinovej sekvencie kódovanej referenčnou sekvenciou, ako bude opísané ďalej.
(2) Polypeptid, ktorý sa aminokyselinovou sekvenciou líši od iného, referenčného polypeptidu. Tieto zmeny sú obvykle obmedzené, takže sekvencie referenčného polypeptidu a jeho variantu sú veľmi podobné a v mnohých oblastiach sú zhodné. Referenčný polypeptid a jeho variant sa môžu odlišovať v aminokyselinovej sekvencií jednou lebo viacerými substitúciami, adíciami, deléciami, fúziami alebo skrátením sekvencie, pričom tieto zmeny môžu byť prítomné v rôznych kombináciách. Rekombinantné varianty kódujúce tieto alebo podobné polypeptidy môžu byť syntetizované alebo selektované na základe tzv. „redundancie“ genetického kódu. Rôzne substitúcie kodónov, ako napr. tie, ktoré sa navonok neprejavia, ale vedú k vzniku rôznych reštrikčných miest, sa môžu využiť na optimalizáciu klonovania do plazmidu alebo vírusového vektora, alebo expresie v určitom prokaryotickom alebo eukaryotickom systéme. Mutácie sa môžu tiež zavádzať s cieľom modifikovať vlastnosti polypeptidu, meniť jeho väzbovú afinitu na ligandy, afinitu medzi reťazcami, degradáciu alebo rýchlosť obratu polypeptidu (polypeptid tumover rate).
Termín „alelický variant“ označuje alternatívnu formu polynukleotidu rgl. Alely sú výsledky mutácie, t. j. zmeny v sekvencií polynukleotidu a obvykle vedú k vzniku pozmenených mRNA alebo polypeptidov, ktorých štruktúra alebo funkcia môže alebo nemusí byť pozmenená. Akýkoľvek gén môže mať žiadnu, jednu alebo viac alelických foriem. Bežné mutačné zmeny vedúce k vzniku alel sú pripisované prirodzeným deléciám, adíciám alebo substitúciám nukleotidov. Každý typ týchto zmien sa môže v danej sekvencií uskutočniť buď samostatne, alebo v kombinácii s ostatnými, jeden alebo viackrát.
„Derivát“ označuje polynukleotid alebo polypeptid odvodený z prirodzene sa vyskytujúceho rgl alebo RG1 chemickými modifikáciami, ako je naviazanie ubikvitínu, značenie (napr. rádionuklidmi, rôznymi enzymatickými modifikáciami), „pegylácia“ (tvorbou derivátov pomocou polyetylénglykolu, PEG) alebo inzercia alebo substitúcia aminokyselín, ako je omitín (alebo substitúcia nukleotidov, ktoré kódujú túto aminokyselinu), ktoré sa normálne v ľudských proteínoch nevyskytujú.
„Delécia“ je definovaná ako zmena sekvencie polynukleotidu alebo aminokyselinovej sekvencie, kde chýba jeden alebo viac nukleotidov alebo aminokyselinových zvyškov.
„Inzercia“ alebo „adícia“ je taká zmena sekvencie polynukleotidu alebo aminokyselinovej sekvencie, keď dochádza k pridaniu jedného alebo viac nukleotidov či aminokyselinových zvyškov v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcou sekvenciou polynukleotidu alebo polypeptidu.
„Substitúcia“ je výsledkom nahradenia jedného alebo viac nukleotidov či aminokyselín odlišnými nukleotidmi či aminokyselinami, tak ako je uvedené.
Substitúcie aminokyselín sú výhodne výsledkom nahradenia jednej aminokyseliny inou aminokyselinou vykazujúcou podobné štruktúrne a/alebo chemické vlastnosti, napr. nahradenie leucínu izoleucínom či valínom a asparátu glutamátom alebo treonínu serínom, t. j. konzervatívne nahradenie aminokyseliny. Inzercie alebo delécie prebiehajú v rozmedzí od 1 do 5 aminokyselín. Povolená variácia môže byť experimentálne určená uskutočňovaním systematických inzercií, delécii alebo substitúcií aminokyselín v polypeptide pomocou metód rekombinantnej DNA a testovanie aktivity vzniknutých rekombinantých variantov.
„Fragment“ je polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou totožnou s časťou, ale nie s celkom aminokyselinovej sekvencie už spomenutých polypeptidov RG 1 a ich variantov alebo derivátov.
Polypeptidový „fragment“, „úsek“ alebo „segment“ predstavuje spojené aminokyselinové zvyšky v minimálnom počte 5, často aspoň 7, typicky aspoň 9 až 13 aminokyselín a v rôznych uskutočneniach predkladaného vynálezu aspoň 17 alebo viac aminokyselín.
„Rekombinant“ alebo „rekombinantná molekula DNA“ označuje sekvenciu polynukleotidu, ktorá sa prirodzene nevyskytuje alebo je pripravená umelou kombináciou dvoch inak oddelených segmentov alebo sekvencií. „Rekombinantné pripravený“ znamená pripravený umelou kombináciou oddelených segmentov polynukleotidov, často využitím buď chemických prostriedkov, alebo umelých manipulácií, napr. technikami génového inžinierstva. Tieto manipulácie sa obvykle uskutočňujú preto, aby bol jeden kodón nahradený iným, redundantným kodónom kódujúcim tú istú či konzervatívnu aminokyselinu, pričom je typicky vnesené či odstránené rozpoznávacie miesto sekvencie. Inak sa uskutočňuje spájanie segmentov polynukleotidov s požadovanými funkciami s cieľom vytvoriť jedinú genetickú entitu, ktorá obsahuje požadovanú kombináciu funkcií, a ktorá sa inak v prirodzenej bežnej forme nevyskytuje. Takto môžu byť cielene vložené rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy, regulačné sekvencie či iné využiteľné oblasti. „Rekombinantné molekuly DNA“ zahŕňajú klonovacie a expresné vektory. „Rekombinant“ môže tiež označovať polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid a je pripravený pomocou techník rekombinantnej DNA.
„Izolovaný“ znamená pozmenený „ľudským zásahom“ zo svojho prirodzeného stavu, t. j. pokiaľ sa vyskytuje v prírode, bol pozmenený či odstránený zo svojho prirodzeného prostredia alebo oboch. Napr. priro7
SK 288147 Β6 dzene sa vyskytujúci polynukleotid alebo polypeptid prirodzene sa vyskytujúci v živom zvierati vo svojom prirodzenom stave nie je „izolovaný“, ale ten istý polynukleotid alebo polypeptid oddelený z materiálu, s ktorým koexistuje v prirodzenom stave, je „izolovaný“ tak, ako sa tento termín používa v predkladanom vynáleze. Napr. pokiaľ ide o polynukleotidy, termín izolovaný znamená, že je oddelený od chromozómu a bunky, v ktorej sa prirodzene vyskytuje.
Polynukleotidy a polypeptidy sa môžu vyskytovať v kompozícii, ako sú formulácie médií, roztoky na vnášanie polynukleotidov alebo polypeptidov napr. do buniek, kompozície alebo roztoky na chemické alebo enzymatické reakcie, napr. ktoré nie sú prirodzene sa vyskytujúcimi kompozíciami, a tu sú izolované polynukleotidy alebo polypeptidy v zmysle tohto termínu, ako sa používa v predkladanom vynáleze.
„V podstate čistý“ a „v podstate homogénny“ sú vzájomne nahraditeľné termíny a označujú polypeptid RG1 alebo jeho fragmenty, alebo segment polynukleotidu, ktorý ich kóduje, pričom tento polypeptid či polynukleotid je oddelený od látok, s ktorými sa vyskytuje prirodzene. Polypeptid RG1 alebo jeho fragmenty, alebo segment polynukleotidu, ktorý ich kóduje, je v podstate jednoduchý vo všetkých komponentoch, s ktorými sa prirodzene vyskytuje, pokiaľ je oddelený od natívnych kontaminantov, s ktorými sa vyskytuje v prirodzenom stave. To znamená, že polypeptid, ktorý sa syntetizuje chemicky alebo bunkovým systémom odlišným od bunky, z ktorej prirodzene pochádza, je v podstate zbavený komponentov, s ktorými sa prirodzene vyskytuje.
„Homológny“, pokiaľ sa tento termín týka polynukleotidu, znamená, že dva polynukleotidy alebo ich vyznačené sekvencie sú optimálnym lineárnym porovnaním („alignement“) totožné so zodpovedajúcimi inzerciami či deléciami nukleotidov aspoň v 70 % nukleotidov, obvykle v 75 až 99 % a výhodnejšie v minimálne 98 až 99 % nukleotidov.
„Podobnosť“, pokiaľ sa týka polypeptidu, sa určí porovnaním aminokyselinovej sekvencie a konzervatívnych aminokyselinových náhrad jedného polypeptidu so sekvenciou druhého polypeptidu.
„Polymerázová reťazová reakcia“ teda „PCR“ označuje spôsob, pri ktorom sú špecifické úseky DNA amplifíkované, ako je opísané v patente USA č. 4 683 195 udelenom 28. 7. 1987. Obvykle je potrebné poznať koncové alebo dlhšie sekvencie fragmentov požadovaného polypeptidu, aby sa mohli navrhnúť oligonukleotidové priméry; tieto priméry budú antiparalelné a budú mať totožnú či podobnú sekvenciu ako opačné vlákna templátu, ktorý má byť amplifikovaný. Nukleotidy 5' konca oboch primérov sa budú kryť s koncami amplifikovaného materiálu. PCR je možné využiť na amplifíkáciu špecifických sekvencii DNA z celkovej genómovej DNA, cDNA transkribovanej z celkovej bunkovej RNA, z plazmidových sekvencii atď. (pozri všeobecne Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).
„Stringencia“ (hybridizačných podmienok) sa obvykle vyskytuje v rozmedzí Tm (teplota topenia) -5 °C (5 °C pod Tm sondy) do približne 20 °C až 25 °C pod Tm. Odborníkom bude zrejmé, že stringentnú hybridizáciu je možné použiť na identifikáciu alebo detekciu zhodných sekvencii polynukleotidov alebo na identifikáciu alebo detekciu podobných alebo príbuzných sekvencii polynukleotidov. Termín „stringentné podmienky“, tak ako je používaný, znamená, že hybridizácia bude prebiehať, iba pokiaľ bude medzi sekvenciami najmenej 95 % a výhodne menej 97 % identita.
„Hybridizácia“, ako sa používa, zahŕňa „akýkoľvek proces, ktorým je polynukleotidové vlákno spojené s komplementárnym vláknom na princípe párovania báz“ (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N. Y., 1994).
„Terapeuticky účinná dávka“ označuje také množstvo polypeptidu alebo jeho protilátok, jeho antagonistov či inhibítorov, vrátane „antisense“ molekúl a ribozýmov, ktorá zlepší príznaky alebo podmienky chorobného stavu. Terapeutická účinnosť a toxicita týchto látok sa môže určiť štandardnými farmaceutickými spôsobmi v bunkových kultúrach či na experimentálnych zvieratách, napr. ako ED50 (dávka terapeuticky účinná v 50 % populácie) alebo LD50 (dávka letálna pre 50 % populácie). Pomer dávok s terapeutickým a toxickým účinkom sa nazýva terapeutický index a dá sa vyjadriť ako pomer ED5o/LD5o.
„Liečenie“ či „liečba“, ako sa tento termín používa, znamená liečbu chorobného stavu (ochorenia) u ľudského pacienta, pričom tento chorobný stav je spojený s rastom nádoru prostaty a zahŕňa chorobné stavy, pri ktorých je potrebné u pacienta znížiť hladinu RG1.
Podrobný opis vynálezu
Predkladaný vynález sa týka okrem iného nových polypeptidov RG1, polynukleotidov rgl a protilátok zameraných proti polypeptidom RG1, ako bude podrobnejšie opísané. Konkrétne sa tento vynález týka nových polypeptidov RG1 a polynukleotidov kódujúcich tieto polypeptidy RG1, najmä sa týka RG1 s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je uvedená na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a rgl s polynukleotidovou sekvenciou, ktorá je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1) . Tento vynález tiež zahŕňa varianty RG1. Výhodný variant RG1 je variant majúci najmenej 70 % podobnosť (výhodne najmenej 70 % identitu) s polypeptidovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a výhodnejšie najmenej 90 % podobnosť (výhodnejšie najmenej 90 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a
SK 288147 Β6 ešte výhodnejšie najmenej 95 % podobnosť (ešte výhodnejšie najmenej 95 % identitu) s polypeptidovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a tiež zahŕňa úseky týchto polypeptidov, pričom tieto úseky polypeptidu obvykle obsahujú najmenej 30 aminokyselín a výhodnejšie najmenej 50 aminokyselín.
Sekvencia kódujúca predikovaný polypeptid RG1 začína 296 bázových párov od 5' konca nukleotidovej sekvencie uvedenej na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1). RG1 obsahuje tri štrukturálne domény charakteristické pre vyššiu rodinu proteínov extracelulámeho matrixu Mindin/F-spondín: dve spondínové domény (FS1 a FS2), ktoré zahŕňajú aminokyseliny 31 až 103 a 138 až 221 a trombospondínovú doménu zahŕňajúcu aminokyseliny 278 až 330.
Predkladaný vynález je čiastočne založený na štrukturálnej homológii medzi RG1 a potkaním Mindinom, ďalším členom rodiny proteínov extracelulámeho matrixu, uvedeného na obr. 3. Aminokyselinová sekvencia RG1 má približne 89,7 % podobnosť s potkaním Mindinom.
Predkladaný vynález je tiež založený na expresnom profile RG1, ktorého expresia bola dokázaná v knižniciach prostatických tkanív a zvýšená expresia v knižniciach prostatických nádorov. Tento expresný profil v tkanivách sa pozoroval pri analýze expresie mRNA vo vzorkách normálnych a nádorových tkanív zistených analýzou PCR pomocou Taqman. Tento analytický spôsob dokázal, že expresia mRNA kódujúca RG1 je v prostatických tkanivách oproti iným tkanivám zvýšená.
Polynukleotidy
V súlade s jedným aspektom predkladaného vynálezu sú opísané izolované polynukleotidy kódujúce polypeptid RG1 s dedukovanou aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).
Pomocou uvedených informácií, ako napr. polynukleotidová sekvencia uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1), možno získať polynukleotid kódujúci polypeptid RG1 uvedený v predkladanom vynáleze pomocou štandardných klonovacích a testovacích spôsobov, ako napr. klonovanie cDNA pomocou mRNA z buniek ľudských tkanív ako východiskového materiálu. Ako príklad možno uviesť fakt, že polynukleotidová sekvencia uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1) sa identifikovala v klonoch cDNA získaných z ľudských prostatických tkanív. Rgl bol identifikovaný ako gén exprimovaný v prostate prehľadávaním databázy Incyte LifeSeq. Táto nukleotidová sekvencia bola identifikovaná prehľadávaním anotácií v databáze pomocou nástroja „Funkcia proteínu“ poskytnutého spoločnosťou Incyte. Táto nukleotidová sekvencia sa našla v anotovanej databáze v kategórii bunkových adhéznych molekúl a bola opísaná ako homológ F-spondínu. Elektronická Northern analýza distribúcie polynukleotidových sekvencii rgl v súbore knižníc v databáze dokázala, že vysoké hladiny expresie rgl boli zistené v knižniciach prostatických tkanív a nižšie hladiny v knižniciach mnohých iných tkanív, vrátane normálnych a nádorových.
Po zostavení súboru klonov rgl z databázy do sústavy kontigov polynukleotidových sekvencii a po ich úprave na súvislú sekvenciu sa identifikovala úplná kódujúca sekvencia predikovaného zostaveného polynukleotidu. Táto sekvencia kóduje proteín homológny s potkaním mindinom.
Klony databázy Incyte 1640796, 1712252 a 1880265 sa získali z Incyte na experimentálne účely a kloň 3360733 bol identifikovaný ako obsahujúci najväčšiu časť nukleotidovej sekvencie 5' konca. Získala sa úplná sekvencia tohto klonu, ktorá obsahuje úplnú kódujúcu sekvenciu pre umelo odvodený proteín RG1. Táto sekvencia je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1).
Polynukleotidy v predkladanom vynáleze môžu byť vo forme RNA, napr. mRNA alebo vo forme DNA, vrátane napr. cDNA a genómovej DNA získanej klonovaním alebo pripravené spôsobmi chemickej syntézy či kombinácie týchto spôsobov alebo spôsobmi opísanými v tomto vynáleze. DNA môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová. Jednovláknová DNA môže byť kódujúcim vláknom, tiež nazývaným „sense“ vlákno alebo to môže byť nekódujúce vlákno, tiež nazývané „antisense“ vlákno.
Sekvencia kódujúca polypeptid môže byť zhodná s kódujúcou sekvenciou polynukleotidu uvedeného na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1). Môže to tiež byť polynukleotid s odlišnou sekvenciou, ktorý vďaka redundancii (degeneratívnosti) genetického kódu kóduje polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).
Polynukleotidy predkladaného vynálezu kódujúce polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) môžu obsahovať okrem iného sekvencie kódujúce tento samotný polypeptid; sekvencie kódujúce tento polypeptid s ďalšími nekódujúcimi sekvenciami, vrátane okrem iného napr. intrónov a nekódujúcich 5' a 3' sekvencií, ako napr. transkribované, ale netranslatované sekvencie zúčastňujúce sa transkripcie a úpravy mRNA (napr. signály na zostrih a polyadenyláciu) či ďalšie kódujúce sekvencie, ktoré kódujú ďalšie aminokyseliny, ako napr. aminokyseliny zaisťujúce ďalšie funkcie. Tak môže byť polypeptid napr. fúzovaný s markerovou sekvenciou, ako napr. s peptidom uľahčujúcim purifikáciu fúzneho polypeptidu. V určitých výhodných uskutočneniach tohto zámeru predkladaného vynálezu je markerovou sekvenciou hexahistidínový peptid, ktorý slúži ako značka pridaná pomocou vektora pTrcHisB (Invitrogen, Carlsbad, CA) a ďalšie, z ktorých mnoho je komerčne dostupných. Ako bolo opísané napr. v publikácii Gentz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821 - 824, 1989), hexahistidín umožňuje ľahkú purifikáciu fúzovaného proteínu.
Polynukleotidy môžu kódovať polypeptid, ktorý okrem daného polypeptidu obsahuje ďalšie aminokyselinové zvyšky na C- a N-konci alebo vnútri tohto polypeptidu (napr. keď jeho aktívna forma obsahuje viac ako
SK 288147 Β6 jeden polypeptidový reťazec). Tieto sekvencie môžu mať úlohu v úprave polypeptidu z prekurzorovej na konečnú formu, môžu uľahčovať pohyb polypeptidu, môžu predlžovať či skracovať jeho polčas alebo môžu uľahčovať manipuláciu s polypeptidom pri testovaní či produkcii atď. Ako je obvyklé v situácii in situ, tieto ďalšie aminokyseliny môžu byť z polypeptidu odstránené proteolytickými enzýmami.
Predkladaný vynález sa ďalej týka variantov opísaných polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty, analógy a deriváty polypeptidu s dedukovanou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2). Variantom polynukleotidu môže byť prirodzene sa vyskytujúci variant ako napr. prirodzene sa vyskytujúci alelický variant alebo to môže byť variant, o ktorom nie je známe, že by sa vyskytoval prirodzene. Tieto varianty polynukleotidu nevyskytujúce sa prirodzene sa môžu získať technikami mutagenézy, vrátane tých, ktoré sa využívajú pre polynukleotidy, bunky či organizmy.
Medzi varianty v tejto súvislosti patria varianty, ktoré sa od opísaných polynukleotidov líšia substitúciami, deléciami či adíciami nukleotidov. Tieto substitúcie, delécie či adície sa môžu týkať jedného alebo viac nukleotidov. Varianty môžu byť pozmenené tak v kódujúcich, ako aj v nekódujúcich oblastiach. Zmeny v kódujúcich oblastiach môžu viesť k substitúciám, deléciam či adíciam konzervatívnych aj nekonzervatívnych aminokyselín.
Medzi zvlášť výhodné uskutočnenia predkladaného vynálezu patria z tohto hľadiska polynukleotidy kódujúce polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou RG1, ako je uvedené na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2); ich varianty, analógy, deriváty či fragmenty a fragmenty týchto variantov, analógov a derivátov.
Ďalším zvlášť výhodným uskutočnením z tohto hľadiska sú polynukleotidy, ktoré kódujú varianty, analógy, deriváty a fragmenty RG1 a varianty, analógy a deriváty týchto fragmentov, ktorých aminokyselinová sekvencia zodpovedá sekvencii polypeptidu RG1 uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), a kde pri väčšom počte, niekoľkých, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 alebo žiadnej aminokyseline došlo k substitúcii, delécii, adícii či akejkoľvek kombinácii týchto javov. Zvlášť výhodnými sú substitúcie, adície a delécie bez vonkajšieho prejavu, ktoré nemenia vlastnosti a aktivity polypeptidu RG1. Zvlášť výhodnými z tohto hľadiska sú tiež konzervatívne substitúcie. Najvýhodnejšími sú polynukleotidy kódujúce polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) bez substitúcií.
Ďalšími výhodnými uskutočneniami predkladaného vynálezu sú polynukleotidy majúce aspoň 70 % identitu s polynukleotidom kódujúcim polypeptid RG1 s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a polynukleotidy komplementárne k týmto polynukleotidom. Okrem nich sú vysoko výhodné polynukleotidy obsahujúce oblasť vykazujúcu aspoň 80 % identitu s polynukleotidom kódujúcim polypeptid RG1 a polynukleotidy k nim komplementárne. Z tohto hľadiska sú zvlášť výhodné polynukleotidy aspoň s 90 % identitou s týmto polynukleotidom a medzi nimi sú zvlášť výhodné tie, ktoré s nim vykazujú aspoň 95 % identitu. Navyše, polynukleotidy vykazujúce aspoň 97 % identitu sú zvlášť výhodné medzi tými, ktoré vykazujú aspoň 95 % identitu a z nich sú zvlášť výhodné tie, ktoré vykazujú aspoň 98 % a 99 % identitu, pričom tie s 99 % identitou sú najvýhodnejšie.
Z tohto hľadiska sú navyše výhodnými uskutočneniami polynukleotidy kódujúce polypeptidy, ktoré vykazujú v podstate tú istú biologickú aktivitu ako polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvenciou uvedenou na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1).
Predkladaný vynález sa ďalej týka polynukleotidov, ktoré hybridizujú s opísanými sekvenciami. Z tohto hľadiska sa tento vynález týka zvlášť polynukleotidov, ktoré hybridizujú za stringentných podmienok s opísanými polynukleotidmi.
Ako bude uvedené v súvislosti s testovaním polynukleotidov, ktoré sú opísané v predkladanom vynáleze, polynukleotidy z tohto vynálezu, ako sú opísané, môžu slúžiť napr. ako hybridizačné sondy pre cDNA a genómovú DNA na izoláciu klonov cDNA a genómovej DNA s úplnou dĺžkou, kódujúcich RG 1 a na izoláciu klonov cDNA a genómovej DNA iných génov vykazujúcich vysokú podobnosť sekvencie s génom rgl. Tieto sondy obvykle obsahujú najmenej 15 báz. Výhodne tieto sondy obsahujú najmenej 30 báz a môžu mať aj najmenej 50 báz.
Tak napr. kódujúcu oblasť génu rgl je možné izolovať skríningom knižníc pomocou syntetických oligonukleotidových sond, ktoré boli navrhnuté podľa známej sekvencie DNA. Napr. značený oligonukleotid so sekvenciou komplementárnou k sekvencii polynukleotidu uvedeného v predkladanom vynáleze sa môže využiť na skríning knižnice cDNA či genómovej DNA s cieľom identifikovať klony hybridizujúce s danou sondou.
Môže sa teda zhrnúť, že polynukleotid opísaný v predkladanom vynáleze môže kódovať polypeptid a polypeptid s vedúcou „leader“ sekvenciou (ktorý môže byť označený ako „prepolypeptid“).
Je zrejmé, že predkladaný vynález sa okrem iného týka polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty polypeptidov, polynukleotidov hybridizujúcich s polynukleotidmi, ktoré kódujú fragmenty polypeptidov, najmä tých, ktoré hybridizujú za stringentných podmienok a polynukleotidov slúžiacich na amplifikáciu polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty polypeptidov ako napr. PCR priméry. Z tohto hľadiska sú výhodné polynukleotidy, ktoré zodpovedajú výhodným fragmentom polypeptidov ako budú opísané.
SK 288147 Β6
Polypeptidy
Predkladaný vynález sa ďalej týka polypeptidu RG1, ktorého dedukovaná aminokyselinová sekvencia je uvedená na obr. 2 (a v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2).
Tento vynález sa tiež týka fragmentov, analógov a derivátov týchto polypeptidov. Termíny fragment, derivát analógov, pokiaľ označujú polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), znamenajú polypeptid majúci v podstate tú istú biologickú aktivitu ako uvedený polypeptid.
Polypeptidom uvedeným v predkladanom vynáleze môže byť rekombinantný polypeptid, prirodzený polypeptid alebo syntetický polypeptid. V niektorých výhodných uskutočneniach je ním rekombinantný polypeptid.
Fragmentom, derivátom alebo analógom polypeptidu uvedeného na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) môže byť (i) polypeptid, v ktorom jeden či viac aminokyselinových zvyškov bolo nahradených konzervovaným alebo nekonzervovaným aminokyselinovým zvyškom (výhodne konzervovaným aminokyselinovým zvyškom) a tento substituovaný aminokyselinový zvyšok môže alebo nemusí byť kódovaný genetickým kódom, alebo (ii) polypeptid, v ktorom jeden či viac aminokyselinových zvyškov má substituovanú skupinu alebo (iii) polypeptid, ktorý je fúzovaný s inou látkou, napr. s látkou zvyšujúcou polčas polypeptidu (ako napr. polyetylénglykol), alebo (iv) polypeptid, ku ktorému sú fúziou pripojené ďalšie aminokyseliny ako vedúce „leader“ sekvencie, sekrečné sekvencie alebo sekvencie uľahčujúce purifikáciu polypeptidu. Podľa údajov uvedených v predkladanom vynáleze by odborníci mali byť schopní pracovať s týmito fragmentmi, derivátmi a analógmi.
Medzi zvlášť výhodné uskutočnenia predkladaného vynálezu patria z tohto hľadiska polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou RG1 uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), ich varianty, analógy, deriváty či fragmenty a varianty, analógy či deriváty týchto fragmentov.
Výhodnými variantmi sú tie, ktoré sa od referenčného polypeptidu líšia substitúciou konzervatívnych aminokyselín. Ide o také substitúcie, ktoré nahradia danú aminokyselinu v polypeptide inou aminokyselinou s podobnými charakteristikami. Typickými konzervatívnymi substitúciami sú vzájomné nahradenia alifatických aminokyselín Ala, Val, Leu a íle, výmena hydroxylových zvyškov Ser a Thr, výmena kyslých zvyškov Asp a Glu, substitúcia amidových zvyškov Asn a Gin, výmena bázických zvyškov Lys a Arg a výmeny medzi aromatickými zvyškami Phe a Tyr.
Ďalšími výhodnými variantmi, analógmi, derivátmi či fragmentmi týchto variantov, analógov či derivátov sú z tohto hľadiska tie, ktorých aminokyselinová sekvencia zodpovedá sekvencii RG1 uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), v ktorej pri väčšom počte, niekoľkých, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 alebo žiadneho aminokyselinového zvyšku došlo k substitúcii, delécii či adícii alebo akejkoľvek ich kombinácii. Zvlášť výhodnými sú substitúcie, adície či delécie bez vonkajších prejavov, ktoré nemenia vlastnosti a aktivity polypeptidu RG1. Z tohto hľadiska sú tiež zvlášť výhodné konzervatívne substitúcie. Najvýhodnejšie sú polypeptidy s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) bez substitúcií.
Polypeptidy a polynukleotidy uvedené v predkladanom vynáleze sú výhodné v izolovanej forme a purifikované do homogenity.
Polypeptidy v predkladanom vynáleze tiež zahŕňajú polypeptid uvedený na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), ako aj polypeptidy majúce aspoň 70 % podobnosť (výhodne aspoň 70 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a výhodnejšie aspoň 90 % podobnosť (výhodnejšie aspoň 90 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a ešte výhodnejšie aspoň 95 % podobnosť (ešte výhodnejšie aspoň 95 % identitu) s polypeptidom uvedeným na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a tiež zahŕňajú úseky polypeptidu obsahujúce obvykle najmenej 30 aminokyselín a výhodnejšie najmenej 50 aminokyselín.
Ako je známe v stave techniky, „podobnosť“ medzi dvoma polypeptidmi je určená porovnaním aminokyselinovej sekvencie a ich konzervatívnych aminokyselinových substituentov jedného polypeptidu so sekvenciou druhého polypeptidu.
Fragmenty alebo úseky polypeptidov opísaných v predkladanom vynáleze je možné využiť na prípravu zodpovedajúcich kompletných polypeptidov peptidovou syntézou; tieto fragmenty je preto možné využiť ako medziprodukty prípravy kompletných polypeptidov.
Fragmenty
Výhodným uskutočnením tohto zámeru predkladaného vynálezu sú tiež polypeptidy obsahujúce fragmenty RG1 a to najmä fragmenty RG1 uvedeného na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a fragmenty variantov a derivátov RG1 uvedeného na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).
Z tohto hľadiska je fragmentom polypeptid, ktorého celková aminokyselinová sekvencia je zhodná s časťou, ale nie s celkom aminokyselinovej sekvencie uvedených polypeptidov RG 1 a ich variantov a derivátov.
Tieto fragmenty môžu byť „samostatné“ alebo „voľné“, t. j. nie sú súčasťou iných polypeptidov alebo fúzované s ďalšími aminokyselinami alebo môžu byť súčasťou väčšieho polypeptidu, ktorého sú úsekom alebo oblasťou. Pokiaľ sú súčasťou väčšieho polypeptidu, tieto uvedené fragmenty najvýhodnejšie tvoria jedinú súvislú oblasť. Jediný väčší polypeptid však môže obsahovať viac fragmentov. Napr. niektoré určité uskutočnenia sa týkajú fragmentu RG1 uvedeného v predkladanom vynáleze, ktorý je obsiahnutý v prekurzore polypeptidu určeného na expresiu v hostiteľovi, a ktorého pre- a propolypeptidové oblasti sú fúzované s N-koncom fragmentu RG1 a ďalšia oblasť je fuzovaná s C-koncom tohto fragmentu. Fragment v jednom určitom význame, ktorý je mienený v tomto aspekte vynálezu, teda označuje úsek alebo úseky fuzneho polypeptidu či fuzneho proteínu odôvodeného z RG1.
Reprezentatívnymi príkladmi polypeptidových fragmentov uvedených v tomto vynáleze môžu byť tie, ktoré obsahujú približne 25 až približne 331 aminokyselín.
V tomto kontexte „približne“ zahŕňa konkrétne uvedené rozmedzie a rozmedzie väčšie alebo menšie o niekoľko, pár, 5, 4, 3, 2 alebo 1 aminokyselinu na jednej hranici rozmedzia alebo na oboch hraniciach rozmedzia. Napr. približne 331 aminokyselín v tomto kontexte znamená polypeptidový fragment od 25 plus alebo mínus niekoľko, pár, 5, 4, 3, 2 alebo 1 aminokyselinu do 331 plus alebo mínus niekoľko, pár, 5, 4, 3, 2 alebo 1 aminokyselinový zvyšok, t. j. rozmedzie široké od 25 mínus niekoľko aminokyselín do 331 plus niekoľko aminokyselín a úzke od 25 plus niekoľko aminokyselín do 331 mínus niekoľko aminokyselín.
Vysoko výhodné z tohto hľadiska sú už uvedené rozmedzia plus alebo mínus až 5 aminokyselín na ktorejkoľvek z oboch hraníc rozmedzia alebo na oboch hraniciach rozmedzia. Zvlášť vysoko výhodné sú uvedené rozmedzia plus alebo mínus až 3 aminokyseliny na ktorejkoľvek z oboch hraníc rozmedzia alebo na oboch hraniciach rozmedzia. Veľmi vysoko výhodné sú rozmedzia plus alebo mínus jedna aminokyselina na jednej či oboch hraniciach uvedených rozmedzí bez adícií či delécií. Najvýhodnejšími z tohto hľadiska sú fragmenty od približne 25 do približne 331 aminokyselín.
Zvlášť výhodnými fragmentmi v predkladanom vynáleze sú skrátené mutanty RG1. Medzi skrátené mutanty RG1 patria varianty alebo deriváty sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) okrem delécie súvislej série zvyškov (t. j. súvislej oblasti, časti alebo úseku) pokrývajúcej N-koniec sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2), alebo súvislej série zvyškov pokrývajúcej C-koniec, alebo ako je to pri dvojnásobných skrátených mutantoch, delécie dvoch súvislých sérií zvyškov, z ktorých jedna zahŕňa N-koniec a jedna C-koniec. Fragmenty s veľkosťou v uvedenom rozmedzí sú tiež výhodnými uskutočneniami skrátených fragmentov, ktoré sú medzi fragmentmi všeobecne považované za zvlášť výhodné.
Zvlášť výhodnými pre tento aspekt predkladaného vynálezu sú fragmenty vyznačujúce sa biologickými a/alebo imunologickými charakteristikami RG1. Tieto fragmenty zhŕňajú fragmenty obsahujúce vopred stanovené štrukturálne domény RG1, ktoré pokrývajú aspoň aminokyseliny 31 až 103, 138 až 221, resp. 278 až 330 alebo fragmenty využité na prípravu protilátok, napr. tie, ktoré sú opísané v príklade 4.
Niektoré oblasti výhodné z tohto hľadiska sú uvedené na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2) a zahŕňajú, ale bez obmedzenia, oblasti uvedených typov identifikované analýzou aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 2).
Medzi vysoko výhodné fragmenty z tohto hľadiska patria tie, ktoré obsahujú oblasti RG1, v ktorých sú kombinované určité štrukturálne charakteristiky, ako napr. tie, ktoré sú opísané. Z tohto hľadiska sú zvlášť výhodnými oblasťami dve spondínové a jedna trombospondínová oblasť, ktorá pokrýva približne aminokyseliny 31 až 103, 138 až 221, resp. 278 až 330, ktoré sú charakteristické pre vyššiu rodinu Mindin/spondín proteínov extracelulámeho matrixu. Tieto oblasti môžu byť súčasťou väčšieho polypeptidu, alebo môžu samy osebe predstavovať výhodný fragment predkladaného vynálezu, ako už bolo opísané. Je zrejmé, že termín „približne“, ako je použitý v tomto odseku má uvedený význam, ktorý sa týka fragmentov všeobecne.
Ďalšími výhodnými oblasťami sú oblasti zaisťujúce aktivity RG1. Najvýhodnejšími z tohto hľadiska sú fragmenty majúce chemickú, biologickú či inú aktivitu RG1, vrátane tých, ktoré majú podobnú alebo vyššiu aktivitu tohto typu, alebo majú zníženú nežiaducu aktivitu. Vysoko výhodné z tohto hľadiska sú fragmenty obsahujúce oblasti so sekvenciou či pozíciou, alebo sekvenciou aj pozíciou homológnou s aktívnymi oblasťami príbuzných polypeptidov, ako napr. iné proteíny rodiny Mindinov, vrátane RG1.
Vektory, hostiteľské bunky a expresné systémy
Predkladaný vynález sa tiež týka vektorov, medzi ktoré patria polynukleotidy uvedené v tomto vynáleze, hostiteľské bunky, ktoré sú obvykle geneticky modifikované pomocou vektorov uvedených v tomto vynáleze a prípravy polypeptidov uvedených v tomto vynáleze rekombinantnými metódami. Tieto metódy sú opísané v publikáciách Sambrook et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989, a Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1989.
Hostiteľské bunky môžu byť geneticky modifikované na vnášanie polynukleotidov uvedených v tomto vynáleze a ich expresiu. Polynukleotidy môžu byť vnesené do hostiteľských buniek napr. pomocou dobre známych spôsobov infekcie, transdukcie, transfekcie, transvekcie (transvection) a transformácie. Polynukleotidy môžu byť vnesené samostatne alebo s inými polynukleotidmi. Tieto ďalšie polynukleotidy môžu byť vnesené nezávisle, spoločne alebo v spojení s polynukleotidmi tohto vynálezu.
SK 288147 Β6
Tak môžu napr. byť pomocou štandardných spôsobov kotransfekcie a selekcie, napr. v bunkách cicavcov, vnesené polynukleotidy uvedené v tomto vynáleze do hostiteľských buniek s inými oddelenými polynukleotidmi, ktoré kódujú selektovateľný marker.V tomto prípade budú obvykle polynukleotidy stabilne zabudované do genómu hostiteľskej bunky.
V inom prípade môžu byť polynukleotidy určené na propagáciu v hostiteľovi spojené s vektorom obsahujúcim selektovateľný marker. Vektorový konštrukt môže byť vnesený do hostiteľskej bunky zmienenými spôsobmi. Plazmidový vektor sa obvykle vnáša ako DNA v precipitáte, napr. ako precipitát fosforečnanu draselného alebo v komplexe s lipidickým iónom. Na vnesenie polynukleotidu do hostiteľa sa môže tiež využiť elektroporácia. Pokiaľ je vektorom vírus, môže byť zabalený in vitro alebo vnesený do zbaľujúcej bunkovej línie a zabalený vírus môže byť transdukciou vnesený do buniek. Odborníkom je dobre známy celý rad rutinne využívaných spôsobov prípravy polynukleotidov a vnášania polynukleotidov do buniek podľa potrieb tohto aspektu predkladaného vynálezu. Tieto spôsoby sú podrobne opísané v uvedenej publikácii Sambrook et al., ktorá je príkladom z mnohých laboratórnych príručiek detailne opisujúcich tieto spôsoby. V súlade s týmto aspektom predkladaného vynálezu môže byť vektorom napr. plazmidový vektor, jednovláknový alebo dvojvláknový fágový vektor, jednovláknový či dvojvláknový RNA či DNA vírusový vektor. Tieto vektory môžu byť vnášané do buniek ako polynukleotidy, výhodne ako DNA, dobre známymi spôsobmi na vnášanie DNA a RNA do buniek. V prípade fágových a vírusových vektorov môžu byť a výhodne aj sú tieto vektory vnášané do buniek ako prirodzene či umelo zbalený vírus dobre známymi spôsobmi infekcie a transdukcie. Vírusové vektory môžu byť schopné či neschopné samostatnej replikácie. Pokiaľ sú replikačne defektné, propagácia vírusu obvykle prebieha iba v komplementujúcich hostiteľských bunkách.
Výhodnými vektormi sú v určitých ohľadoch vektory na expresiu polynukleotidov a polypeptidov uvedených v predkladanom vynáleze. Tieto vektory obvykle obsahujú intramolekuláme pôsobiace kontrolné oblasti na expresiu v hostiteľovi podľa potreby spojené s polynukleotidom, ktorý má byť exprimovaný. Zodpovedajúce intermolekuláme pôsobiace faktory sú poskytnuté buď hostiteľom, alebo komplementujúcim vektorom, či samotným vektorom pri vnášaní do hostiteľa.
V určitých z tohto hľadiska výhodných uskutočneniach vektory umožňujú špecifickú expresiu. Takouto špecifickou expresiou môže byť indukovateľná expresia či expresia iba v určitých typoch buniek alebo oboje, expresia indukovateľná iba v určitých typoch buniek. Medzi zvlášť výhodné indukovateľné vektory patria vektory, ktorých expresiu je možné indukovať faktormi prostredia, ktoré je možné ľahko ovplyvňovať, ako napr. teplota a nutričné prídavky. Rad vektorov vhodných na tento zámer predkladaného vynálezu, vrátane vektorov na konštitutívnu alebo indukovateľnú expresiu v prokaryotických či eukaryotických bunkách, je dobre známy a rutinne využívaný odborníkmi.
Geneticky modifikované hostiteľské bunky sa môže kultivovať v konvenčnom živnom médiu, ktoré môže byť podľa potreby upravené napr. na aktiváciu promótorov, selekciu transformantov alebo amplifikáciu génov. Kultivačné podmienky, ako napr. teplota, pH a pod., predtým použité na kultiváciu hostiteľskej bunky vybranej na expresiu všeobecne, budú vhodné na expresiu polypeptidov podľa predkladaného vynálezu a odborníci ich ľahko odvodia.
Na expresiu polypeptidu predkladaného vynálezu je možné využiť množstvo rôznych expresných vektorov. Medzi tieto vektory patria chromozomálne, epizomálne alebo od vírusové odvodené vektory, napr. vektory odvodené z bakteriálnych plazmidov, bakteriofágov, kvasinkových epizómov, kvasinkových chromozomálnych elementov, z vírusov, ako sú bakulovírusy, papovavírusy ako SV40, vírusy kravských kiahní, adenovírusy, vírus kiahní hydiny, vírusy pseudobesnoty, retrovírusy a alfavírusy, ako je vírus Sindbis a vektory odvodené z ich kombinácií, ako napr. vektory odvodené z plazmidových a bakteriofágových genetických elementov, ako sú kozmidy a „phagemidy“, všetky tieto vektory sa môžu využiť na expresiu v súlade s týmto aspektom predkladaného vynálezu. Z tohto hľadiska je možné využiť na expresiu polypeptidu v hostiteľovi akýkoľvek vektor, ktorý je schopný niesť, množiť či exprimovať nejaký polynukleotid.
Zodpovedajúca sekvencia DNA môže byť vložená do vektora akýmkoľvek z celého radu dobre známych a rutinne využívaných spôsobov. Sekvencia DNA, ktorá má byť exprimovaná, je obvykle spojená s expresným vektorom pomocou štiepenia sekvencie DNA a expresného vektora jednou či viac reštrikčnými endonukleázami a potom spojením reštrikčných fragmentov pomocou DNA ligázy T4. Spôsoby štiepenia a ligácie, ktoré sa môžu na tento účel využiť, sú dobre známe a rutinne využívané odborníkmi. Spôsoby vhodné na tieto účely a na konštrukciu expresných vektorov pomocou alternatívnych techník, ktoré sú tiež dobre známe a rutinne využívané odborníkmi, sú objasnené v publikácii Sambrook et al., ktorá je tu uvedená na inom mieste.
Sekvencia DNA v expresnom vektore je podľa potreby spojená s vhodnou sekvenciou (vhodnými sekvenciami) na kontrolu expresie, ako napr. promótorom riadiacim transkripciu mRNA. Príklady takýchto promótorov sú PL promótor λ fága, promótory E. coli, lac, trp, tac a trc, skorý a neskorý promótor SV40 a promótory retrovírusových LTR, aby sa uviedlo aspoň niekoľko dobre známych promótorov. Je zrejmé, že mnoho promótorov, ktoré tu nie sú uvedené, je vhodných na použitie v tomto aspekte predkladaného vynále13 zu, a sú dobre známe a môžu byť ľahko využité odborníkmi podľa opisu a príkladov uvedených v tomto vynáleze.
Expresné vektory obvykle obsahujú miesta na iniciáciu transkripcie a terminácie a v transkribovanej oblasti majú ribozómové väzbové miesto na transláciu. Kódujúci úsek transkriptov exprimovaný konštruktmi obsahuje na začiatku kodón AUG na iniciáciu transkripcie a na konci vhodne umiestnený terminačný kodón pre polypeptid, ktorý má byť translatovaný.
Okrem toho môžu konštrukty obsahovať kontrolné oblasti, ktoré regulujú aj vyvolávajú expresiu. V súlade s mnohými bežne používanými spôsobmi tieto oblasti obvykle fungujú tak, že zaisťujú kontrolu transkripcie ako napr. väzbové miesta pre represory a enhancery.
Vektory na propagáciu (množenie) a expresiu obvykle obsahujú selektovateľné markery. Tieto markery môžu byť tiež využité na ich amplifikáciu alebo môžu s týmto cieľom obsahovať iné markery. Z tohto hľadiska expresné vektory obsahujú výhodne jeden či viac selektovateľných markerových génov, poskytujúcich fenotypovú charakteristiku na selekciu transformovaných hostiteľských buniek. Výhodnými markermi sú pre eukaryotické bunky napr. rezistencia na dihydrofolátreduktázu, neomycín, puromycín či hydromycín a na kultiváciu E. coli a iných baktérií gény pre rezistenciu na tetracyklín, teomycín, kanamycín či ampicilín.
Vektor, ktorý obsahuje vhodnú sekvenciu DNA, ako je opísaná inde v predkladanom vynáleze, ako aj vhodný promótor a ďalšie vhodné kontrolné sekvencie, sa môže vniesť do vhodného hostiteľa pomocou množstva dobre známych vhodných spôsobov na zaistenie expresie požadovaného polypeptidu v tomto hostiteľovi. Medzi reprezentatívne príklady vhodných hostiteľov patria bakteriálne bunky, ako napr. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium·, bunky húb ako kvasinkové bunky; bunky hmyzu ako Drozofila S2 a Spodoptera Sf9, živočíšne bunky ako CHO, COS a bunky Bowesovho melanómu; a rastlinné bunky; výhodne hmyzie bunky BTI-TN-5B1-4. Je známy celý rad hostiteľov na expresné konštrukty a odborníci by mali byť schopní pomocou uvedených informácií vybrať hostiteľa na expresiu polypeptidov pre účely tohto aspektu predkladaného vynálezu.
Na expresiu je možné využiť celý rad cicavčích systémov tkanivových kultúr. Medzi príklady cicavčích expresných systémov patria bunkové línie opičích obličkových fibroblastov COS-7 (Gluzman et al., Celí 23: 175, 1991). Ďalšie bunkové línie schopné exprimovať kompatibilný vektor, sú napr. bunkové línie 027, 3T3, CHO, HeLa, ľudské obličkové bunky 293 a BHK. V cicavčích hostiteľských bunkách môže byť využitý rad vírusových expresných systémov. Pokiaľ sa ako expresný vektor použije adenovírus, polynukleotidová sekvencia kódujúca RG1 sa môže ligovať do adenovírusového komplexu na transkripciu/transláciu, zloženého z neskorého promótora a trojdielnej vedúcej „leader“ sekvencie. Vnesením do postrádateľných oblastí vírusového genómu EI či E3 sa získa životaschopný vírus schopný exprimovať RG1 v infikovaných hostiteľských bunkách (Logan a Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655 - 59, 1984). Navyše môžu byť na zosilnenie expresie v cicavčích hostiteľských bunkách využité enhancery transkripcie ako napr. enhancer vírusu Rousovho sarkómu (RVS).
Predkladaný vynález tiež konkrétnejšie uvádza rekombinantné konštrukty, ako napr. expresné konštrukty, ktoré obsahujú jednu alebo viac opísaných sekvencií. Tieto konštrukty obsahujú vektor, napr. plazmidový alebo vírusový, do ktorého sa vložila sekvencia uvedená v tomto vynáleze. Sekvencia môže byť vložená v priamom či opačnom smere. V niektorých, z tohto hľadiska výhodných, uskutočneniach konštrukt ďalej obsahuje regulačné sekvencie ako napr. promótor, podľa potreby spojený s danou sekvenciou. Odborníkom je známy celý rad vhodných vektorov a existuje mnoho komerčne dostupných vektorov využiteľných na účely predkladaného vynálezu.
Ako príklad sú tu uvedené nasledujúce komerčne dostupné vektory. Medzi vektory výhodne využiteľné v baktériách patria pQE70, pQE60 a pQE-9 od firmy Qiagen USA (Valencia, CA); vektory pBS, Phagescript®, Bluescript®, pNH8A, pNHI6a, pNHI8A, pNH46A od firmy Stratagene (LaJolla, CA) ; a ptrc99a, pK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 od firmy Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) . Najvýhodnejší je vektor pTrcHisB od firmy Invitrogen. Medzi výhodné eukaryotické vektory patrí pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTI a pSG od firmy Stratagene; a PSVK3, pBPV, pMSG a pSVL od firmy Pharmacia Biotech. Najvýhodnejší je vektor pCIneo od firmy Promega. Tieto vektory sú uvedené iba ako ilustratívne príklady mnohých komerčne dostupných a dobre známych vektorov, ktoré majú odborníci k dispozícii a môžu ich využiť na účely predkladaného vynálezu. Je zrejmé, že akýkoľvek iný plazmid alebo vektor, vhodný napr. na vnesenie, uchovanie, propagáciu alebo expresiu polynukleotidu či polypeptidu uvedeného v tomto vynáleze v hostiteľovi, sa môže využiť na účely predkladaného vynálezu.
Promótorovú oblasť je možné selektovať z akéhokoľvek požadovaného génu pomocou vektorov, ktoré obsahujú reportérovú transkripčnú jednotku a chýbajúcu promótorovú oblasť, ako napr. chloramfenikolacetyltransferázová („cat“) transkripčná jednotka, ktorá je umiestená za reštrikčným miestom alebo miestami na vloženie kandidátneho promótorového fragmentu, t. j. fragmentu, ktorý by mohol obsahovať promótor. Ako je dobre známe, vloženie fragmentu obsahujúceho promótor do reštrikčného miesta vektora pred gén cat spôsobí, že sa prejaví aktivita CAT, ktorá môže byť stanovená štandardnými testami na CAT. Vektory vhodné na tento účel sú dobre známe a dostupné. Dvoma takýmito vektormi sú pKK232-B a pCM7. Promótory na
SK 288147 Β6 expresiu polynukleotidov predkladaného vynálezu sú teda nielen dobre známe a dostupné promótory, ale tiež promótory, ktoré je možné pripraviť existujúcimi spôsobmi pomocou reportérových génov.
Medzi známe bakteriálne promótory vhodné na expresiu polynukleotidov a polypeptidov na účely predkladaného vynálezu patria promótory E. coli lacl a lacZ, promótory T3 a T7, promótor T5 tac, lambda PR, PL promótory, promótor trp a hybridný promótor trc, ktorý je odvodený z promótorov trp a lac. Známymi eukaryotickými promótormi vhodnými na tieto účely sú veľmi skorý promótor CMV, tymidínkinázový promótor HSV, skorý a neskorý promótor SV40, promótory retrovírusových LTR, ako napr. z vírusu Rousovho sarkómu (RVS) a metalotioneínové promótory, ako napr. promótor myšieho metalotioneínu-I.
Selekcia vhodných vektorov a promótorov na expresiu v hostiteľskej bunke je dobre známa a potrebné spôsoby na konštrukciu vektorov, vnesenie vektora do hostiteľa a expresiu v hostiteľovi sú odborníkmi rutinne využívané.
Rekombinantné expresné vektory obvykle obsahujú počiatok replikácie, promótor odvodený z vysoko exprimovaného génu na riadenie transkripcie štruktúrnej sekvencie, ktorá sa nachádza za ním a selektovateľný marker umožňujúci izoláciu buniek, ktoré obsahujú vektor po ich vystavení pôsobenia vektorov.
Predkladaný vynález sa tiež týka už opísaných hostiteľských buniek, ktoré obsahujú už zmienené konštrukty. Hostiteľskou bunkou môže byť vyššia eukaryotická bunka, napr. cicavčia, alebo nižšia eukaryotická bunka, napr. kvasinka, alebo hostiteľskou bunkou môže byť prokaryotická bunka, napr. bakteriálna. Konštrukty vnesené do hostiteľských buniek sa môžu využiť konvenčným spôsobom na produkciu génového produktu, ktorý je kódovaný rekombinantnou sekvenciou.
Polypeptidy sa môžu exprimovať v cicavčích bunkách, kvasinkách, baktériách alebo iných bunkách pod kontrolou vhodných promótorov. Na produkciu týchto proteínov pomocou RNA odvodených z konštruktov DNA uvedených v predkladanom vynáleze sa tiež môžu využiť bezbunkové translačné systémy. Vhodné klonovacie a expresné vektory na využitie v prokaryotických a eukaryotických hostiteľoch sú opísané v publikácii Sambrook et al., ktorá je tu uvedená na inom mieste.
Transkripcia DNA, ktorá kóduje polypeptid uvedený v predkladanom vynáleze, vyššími eukaryotickými bunkami môže byť zosilnená vložením enhancerovej sekvencie do vektora. Enhancery sú intramolekuláme pôsobiace elementy DNA, obvykle o 10 - 300 bp, ktorých funkciou je zosilňovať transkripčnú aktivitu promótora v danom hostiteľskom bunkovom type. Príkladom enhancerov je enhancer SV40, ktorý je umiestnený v neskoršej časti od počiatku replikácie medzi bp 100 a 270, ďalej skorý cytomegalovírusový enhancer, enhancer polyómového vírusu umiestnený v neskorej časti od počiatku replikácie a ďalej adenovírusové enhancery.
Polynukleotidy uvedené v tomto vynáleze, ktoré kódujú heterológnu štruktúrnu sekvenciu polypeptidu podľa vynálezu, sa obvykle vkladajú do vektora pomocou štandardných techník, pričom sú operabilne spojené s expresným promótorom. Polynukleotid je umiestený tak, aby bol počiatok transkripcie umiestený v správnej pozícii 5' od ribozóm viažuceho miesta. Ribozóm viažuce miesto je umiestnené v pozícii 5' od kodónu AUG, ktorý iniciuje transláciu polypeptidu, ktorý má byť exprimovaný. Medzi ribozóm viažucim miestom a iniciačným kodónom AUG obvykle nie je žiadny ďalší otvorený čítací rámec, ktorý začína iniciačným kodónom AUG. Na konci polypeptidu je tiež obvykle umiestený kodón na termináciu translácie a na 3' konci transkribovanej oblasti sa tiež nachádza zodpovedajúcim spôsobom umiestený polyadenylačný signál a signál na termináciu transkripcie.
Na sekréciu translatovaného proteínu do lumenu endoplazmatického retikula, do periplazmatického priestoru alebo do extracelulámeho prostredia môžu byť do exprimovaného polypeptidu zabudované zodpovedajúce sekrečné signály. Týmito signálmi môžu byť endogénne signály daného polypeptidu alebo to môžu byť heterológne signály. Polypeptid môže byť exprimovaný v pozmenenej forme, napr. ako fuzny protein a môže obsahovať nielen sekrečné signály, ale tiež ďalšie heterológne funkčné oblasti. Tak môže byť napr. na N-koniec polypeptidu pripojená oblasť ďalších aminokyselín, najmä tých, ktoré nesú náboj, aby tak bola zvýšená stabilita a schopnosť pretrvávania v hostiteľskej bunke pri purifikácii alebo pri ďalšej manipulácii a skladovaní. Môžu byť tiež pripojené ďalšie špeciálne oblasti na uľahčenie purifikácie polypeptidu. Tieto oblasti môžu byť pred konečnou prípravou polypeptidu odstránené. Pripojenie peptidových oblastí na polypeptidy, napr. s cieľom vyvolať sekréciu či exkréciu, na zlepšenie stability a na uľahčenie purifikácie, sú bežné známe a rutinné spôsoby. Napr. v prípade potreby väčšieho množstva RG1 na indukciu protilátok, môžu byť potrebné vektory, ktoré zaisťujú vysokú hladinu expresie ľahko purifikovatelných fuznych proteínov. Medzi týmito vektormi je možné uviesť okrem iného multifúnkčné klonovacie a expresné vektory E. coli, ako napr. Bluescript® (Stratagene), kde kódujúca sekvencia rgl môže byť do vektora ligovaná v čítacom rámci so sekvenciou N-koncového Met a ďalších 7 zvyškov (β-galaktozidázy, takže vzniká hybridný protein; vektory pIN (Van Heede a Shuster, J. Biol. Chem. 264: 5503 - 5509, 1989) a pod. Vektory PtrcHis (Invitrogen, Carísbad, CA) je možné využiť na expresiu cudzorodých polypeptidov a fuznych proteínov, ktoré obsahujú polyhistidínovú (6x His) značku pre ľahkú purifikáciu. Proteíny produkované v týchto systémoch sú navrhnuté tak, aby obsahovali štiepne miesta, napr. štiepne miesto pre enterokinázu, takže klonovaný polypeptid sa môže vyštiepiť z fúznej peptidovej časti podľa potreby.
SK 288147 Β6
Po transformácii vhodného hostiteľského kmeňa a namnožení hostiteľského kmeňa do potrebnej bunkovej hustoty je možné zodpovedajúcim spôsobom indukovať indukovateľné promótory, ak sú prítomné (napr. zmenou teploty či pridaním chemického induktora) a potom bunky ďalej kultivovať.
Potom sa bunky obvykle odoberú centrifugáciou, rozrušia fyzickou alebo chemickou cestou a výsledný hrubý extrakt sa uchováva na ďalšiu purifikáciu.
Mikrobiálne bunky využité na expresiu proteínov sa môžu rozrušiť akýmkoľvek vhodným spôsobom, vrátane cyklického zmrazovania a rozmrazovania, ultrazvukom, mechanickým rozrušením, alebo využitím látok, ktoré vyvolávajú lýzu buniek; tieto spôsoby sú odborníkom známe.
Polypeptid RG1 sa môže získať a purifikovať z kultúr rekombinantných buniek dobre známymi spôsobmi, napr. precipitáciou síranom amónnym či etanolom, kyslou extrakciou, chromatografiou na ionomeničoch a fosfocelulóze, chromatografiou, ktorá využíva hydrofóbne interakcie, afinitnú chromatografiu, chromatografiu na hydroxyapatite a lektínovú chromatografiu. Najvýhodnejšou purifikáciou je chromatografia HPLC (high performance liquid chromatography). Pokiaľ je polypeptid počas izolácie a purifikácie denaturovaný, je možné na obnovu jeho aktívnej konformácie využiť dobre známe spôsoby obnovy molekulárneho usporiadania proteínov. Medzi mnohé dobre známe spôsoby purifikácie proteínov je možné uviesť tie, ktoré sú opísané v publikáciách Deutscher, M., Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press, San Diego, 1982; a Scopes, R., Proteín Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982.
Polypeptidy uvedené v predkladanom vynáleze je tiež možné pripraviť priamou syntézou peptidov spôsobmi, ktoré využívajú látky v pevnej fáze (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Čo., San Francisco, 1969; Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 - 2154, 1963). Syntéza proteínov in vitro sa môže uskutočňovať ručne alebo automatizovane. Automatizovaná syntéza sa môže uskutočňovať napr. pomocou syntetizátora Applied Biosystems 413A Peptide Synthetizer (Perkin Elmer, Foster City, Calif) podľa návodu výrobcu. Rôzne fragmenty RG1 sa môžu chemicky syntetizovať každý zvlášť a potom kombinovať chemickými spôsobmi na kompletné molekuly.
Medzi polypeptidy uvedené v predkladanom vynáleze patria prirodzene purifikované produkty, produkty chemických syntetických spôsobov a produkty získané rekombinantnými spôsobmi z buniek prokaryotických či eukaryotických hostiteľov, napr. z baktérií, kvasiniek, buniek vyšších rastlín, hmyzích buniek či cicavčích buniek. V závislosti od hostiteľa, ktorý sa použil pri spôsobe rekombinantnej prípravy, môžu byť polypeptidy uvedené v tomto vynáleze glykozylované či neglykozylované. Navyše môžu tieto polypeptidy tiež obsahovať modifikovaný počiatočný metionínový zvyšok, niekedy ako dôsledok procesov, za ktoré je zodpovedný hostiteľ.
Použitie polypeptidov RG1 a polynukleotidov, ktoré ich kódujú
Polynukleotidy rgl a polypeptidy RG1 sa môžu využiť na účely predkladaného vynálezu v množstve aplikácií, najmä tých, ktoré využívajú chemické a biologické vlastnosti RG1. Ďalšie aplikácie sa týkajú diagnostiky a liečby chorôb zhubného bujnenia, napr. rakoviny prostaty. Tieto aspekty predkladaného vynálezu sú diskutované v nasledujúcom texte a sú tiež opísané ďalej v opise.
Dôvod na použitie polynukleotidových a polypeptidových sekvencií v predkladanom vynáleze je založený čiastočne na chemickej a štruktúrnej homológii medzi opísaným RG1 a inými molekulami extracelulámeho matrixu, a ďalej na prevládajúcej expresii RG1 v prostatických tkanivách v porovnaní s inými tkanivami. RG1 je možné využiť na diagnostiku a liečbu stavov, porúch či chorôb spojených s abnormálnym rastom prostatického tkaniva. Tými sú napr. rakovina a metastatické nádorové bujnenie, ale aj iné choroby.
Polynukleotidové sekvencie rgl je možné využiť ako sondy DNA a ako ciele na „antisense“ či ribozýmovú liečbu, alebo ako templáty na prípravu „antisense “ polynukleotidov.
Polypeptidy RG1 je možné využiť na prípravu protilátok proti RG1, ktoré môžu slúžiť na detekciu hladiny polypeptidu RG1 v bunkách a tkanivách a na zacielenie liečiv do primárnych a metastatických nádorov.
Polypeptidy RG1 sa môžu využiť na stimuláciu imunitnej odpovede buniek obsahujúcich RG1.
Polynukleotidy kódujúce RG 1 sa môžu využiť na diagnostické testy na detekciu hladiny polynukleotidov kódujúcich RG1 v bunkách a tkanivách.
Pri stavoch spojených s expresiou RG1, napr. pri rakovine prostaty, môže byť výhodné potlačiť expresiu či aktivitu RG1. Expresia RG1 môže byť potlačená podaním „antisense“ oligonukleotidov alebo ribozýmov. Je možné tiež podávať protilátky špecificky rozpoznávajúce oblasti polypeptidu RG1 zodpovedné za jeho aktivitu, a tak liečiť choroby či stavy spojené s aktivitou RG1.
Polynukleotidové testy
Predkladaný vynález sa tiež týka použitia polynukleotidov, ktoré sú príbuzné rgl na detekciu komplementárnych polynukleotidov, napr. ako diagnostických činidiel. Detekcia polynukleotidov rgl spojených s chorobným stavom môže slúžiť ako nástroj na vývoj diagnostických spôsobov in vivo a in vitro, ktoré môžu zlepšiť alebo určiť diagnózu choroby alebo náchylnosť na chorobu, ktorá je výsledkom tkanivovo špecifickej expresie RG 1.
SK 288147 Β6
Jedinci s mutáciami génu, ktorý kóduje RG1, môžu byť identifikovaní na úrovni DNA množstvom spôsobov. Vzorky polynukleotidov na diagnostiku sa môžu získať z pacientových buniek, napr. z krvi, moču, slín, biopsie tkaniva či pitevných materiálov. Genómová DNA sa môže využiť na priamu detekciu alebo sa môže pred analýzou enzymaticky amplifikovať pomocou PCR (Saiki et al., Náture 324: 163 - 166, 1986). Takto je možné tiež využiť RNA alebo cDNA. Ako príklad je možné uviesť využitie PCR primérov komplementárnych k polynukleotidovej sekvencii kódujúcej RG1 na identifikáciu a analýzu expresie a mutácií rgl. Delécie a inzercie je možné napr. zaistiť zmenami veľkosti amplifikovaného produktu oproti normálnemu genotypu. Bodové mutácie je možné určiť hybridizáciou amplifikovanej DNA rádioaktívne značenou RNA rgl alebo pomocou rádioaktívne značených „antisense“ sekvencii DNA rgl. Dokonale môžu byť odlíšené zodpovedajúce sekvencie od nezodpovedajúcich duplexov štiepením Rnázou A alebo rozdielmi v teplote topenia.
Rozdiely v sekvencii medzi referenčným génom a mutovanými génmi sa môžu tiež zistiť priamym sekvenovaním DNA. Klonované segmenty DNA sa môžu tiež využiť ako sondy na detekciu špecifických segmentov DNA. Citlivosť týchto spôsobov môže byť značne zvýšená vhodným využitím PCR alebo inými amplifikačnými spôsobmi. Napr. sekvenovací primér sa používa s dvojvláknovým produktom PCR alebo jednovláknovou molekulou templátu pripravenou modifikovanou reakciou PCR. Sekvencia je určená konvenčnými spôsobmi pomocou rádioaktívne značených polynukleotidov či automatickými sekvenčnými spôsobmi pomocou fluorescenčných značiek.
Genetické testy založené na rozdieloch sekvencii DNA sa môžu uskutočňovať na základe detekcie zmien elektroforetickej pohyblivosti fragmentov DNA v géloch, za prítomnosti denaturačných činidiel alebo bez nich. Malé sekvenčné delécie a inzercie sa môžu zviditeľniť gélovou elektroforézou s vysokou odlíšiteľnosťou. Fragmenty DNA rôznych sekvencii môžu byť odlíšené na denaturačných formamidových gradientových géloch, kde pohyblivosť rôznych fragmentov DNA je v géli spomalená v rôznych miestach, ktoré zodpovedajú ich špecifickej teplote topenia alebo čiastočného topenia (pozri napr. Myers et al., Science 230: 1242, 1985).
Zmeny sekvencie na rôznych miestach sa môžu tiež identifikovať pomocou nukleázových ochranných testov (nuclease protection assays), ako je ochrana pred RNázou a SI alebo spôsobom chemického štiepenia (pozri napr. Catton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397 - 4401, 1985).
Detekcia špecifickej sekvencie DNA sa teda môže uskutočňovať spôsobmi, ako je hybridizácia, ochrana pred Rnázou, chemické štiepenie, priame sekvenovanie DNA alebo využitím reštrikčných enzýmov (napr. testovanie polymorfizmu dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP) a Southern blotting genómovej DNA).
Okrem konvenčnejších spôsobov, ako je géíová elektroforéza alebo sekvenovanie DNA, je možné uskutočňovať detekciu mutácií tiež analýzou in situ.
Polypeptidové testy
Predkladaný vynález sa tiež týka diagnostických spôsobov, ako sú kvantitatívne a diagnostické testy na detekciu hladiny polypeptidu RG1 v bunkách, tkanivách a telesných tekutinách, ktoré zahŕňajú určenie normálnej a abnormálnej hladiny. Tak napr. diagnostický test podľa predkladaného vynálezu, ktorý slúži na detekciu zvýšenej expresie polypeptidu RG1 oproti normálnym vzorkám tkaniva, sa môže využiť na detekciu výskytu neoplázie, napr. rakoviny prostaty. Tieto diagnostické testy sa môžu tiež využiť na detekciu metastatického nádorového rastu. Testovacie spôsoby, ktoré je možné využiť na určenie hladiny nejakého polypeptidu, napr. polypeptidu RG1 uvedeného v tomto vynáleze, vo vzorke odvodenej od hostiteľa, sú odborníkom dobre známe. Tieto testovacie spôsoby zahŕňajú rádioimunologické testy (RIA), kompetitívne väzbové testy, analýzu Western blot a testy ELISA („enzyme-linked immunoabsorbant assay“), ďalej fluorescenčné bunkové triedenie (FACS), z ktorých sa najčastejšie používa test ELISA. Pri teste ELISA sa najskôr pripraví protilátka špecifická pre RG1, výhodne monoklonálna protilátka. Okrem toho sa obvykle pripraví reportérová protilátka, ktorá sa viaže na monoklonálnu protilátku. Reportérová protilátka sa pripojí na identifikovanú látku, ako napr. na rádioaktívnu, fluorescenčnú či enzymatickú látku, v tomto prípade na enzým chrenová peroxidáza.
Pri uskutočňovaní testu ELISA sa z hostiteľa odoberie vzorka a inkubuje sa na pevnom nosiči, napr. na polystyrénovej doštičke, kde sa ukotvia polypeptidy zo vzorky. Všetky voľné väzbové miesta na doštičke sa potom blokujú inkubáciou s nešpecifickým proteínom, ako je bovinný sérový albumín. Potom sa monoklonálna protilátka inkubuje na doštičke, pričom sa na polypeptidy RG1 ukotvené na polystyrénovej doštičke naviažu monoklonálne protilátky. Naviazaná monoklonálna protilátka sa vymyje pufrom. Reportérová protilátka viazaná na chrenovú peroxidázu sa nanesie na doštičku, takže reportérová protilátka sa naviaže na ktorúkoľvek monoklonálnu protilátku viazanú na RG1. Nenaviazaná reportérová protilátka sa potom vymyje. Potom sa na doštičku pridajú látky na zistenie peroxidázovej aktivity, vrátane substrátu pre farebnú reakciu. Imobilizovaná peroxidáza viazaná na RG1 cez primáme a sekundárne protilátky vyvolá farebnú reakciu. Sila farebnej reakcie v určitých časových intervaloch označuje množstvo polypeptidu RG1, ktorý je prítomný vo vzorke. Kvantitatívne výsledky sa obvykle vyhodnocujú referenčným porovnaním so štandardnou krivkou.
SK 288147 Β6
Kompetitívny test je možné uskutočňovať kedykoľvek, keď je protilátka špecifická pre RG1 ukotvená na pevnom nosiči, a keď značený RG1 a vzorka odvodená z hostiteľa sa nanesie na pevný nosič, pričom množstvo značiacej látky ukotvenej na pevnom nosiči je potom možné korelovať s množstvom RG1 vo vzorke.
Tento test a ďalšie sú opísané okrem iného v publikáciách Hamptom et. al. (Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn, 1990) a Maddos et al. (J. Exp. Med. 158: 12111, 1983).
Protilátky
Predkladaný vynález sa ďalej týka protilátok, ktoré špecificky viažu RG1 a sú označené ako protilátky proti RG1. Zvýšená expresia RG1 v tkanivách prostaty a jeho výskyt na povrchu bunky sú výbornými markerovými charakteristikami (značkami) na skríning, diagnostiku, určenie prognózy, testovanie pri dlhodobom sledovaní a na zobrazovacie spôsoby. Navyše tieto charakteristiky naznačujú, že by RG1 mohol byť výborným cieľom pre terapeutické spôsoby, ako je cielená liečba protilátkami, imunoterapia a génová terapia. Termín „špecificky viaže“, ako je používaný, znamená interakciu protilátky s polypeptidom, kde táto interakcia závisí od prítomnosti konkrétnej štruktúry (t. j. antigénneho determinantu či epitopu) na polypeptide; inými slovami protilátka rozpoznáva a viaže skôr špecifickú polypeptidovú štruktúru než proteíny všeobecne.
Polypeptidy RG1, ich fragmenty či iné deriváty, ich analógy alebo bunky, ktoré ich exprimujú, sa môžu využiť ako imunogény na produkciu protilátok proti nim (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989). Týmito protilátkami môžu byť napr. polyklonálne či monoklonálne protilátky. Predkladaný vynález tiež zahŕňa chimérické a jednoreťazcové protilátky, humanizované a ľudské protilátky a ďalej fragmenty Fab alebo produkty expresných knižníc Fab. Na prípravu týchto fragmentov a protilátok je možné využiť množstvo spôsobov známych odborníkom.
Protilátky pripravené proti polypeptidom, ktoré zodpovedajú sekvencií uvedenej v predkladanom vynáleze, sa môžu získať priamou injekciou polypeptidov do živočíšneho jedinca alebo podaním polypeptidov živočíšnemu jedincovi, najlepšie iného druhu než človek. Takto získaná protilátka potom bude sama viazať tieto polypeptidy. Tak sa aj pomocou sekvencie, ktorá kóduje iba fragment týchto polypeptidov, dajú získať protilátky viažuce celý natívny polypeptid. Tieto protilátky je potom možné využiť na izoláciu polypeptidov z tkanív, ktoré exprimujú požadovaný polypeptid.
Pri príprave monoklonálnych protilátok sa môže využiť akýkoľvek spôsob, ktorý zaistí tvorbu protilátok kultúrami permanentných bunkových línií. Ako príklad je možné uviesť prípravu hybridómov (Kohler a Milstein, Náture 256: 495 - 497, 1975), prípravu hybridómov ľudských B buniek (Rozbor et al., Imunology Today č: 72, 1983) a prípravu EBV-hybridómov na produkciu ľudských monoklonálnych protilátok (Cóle et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77 - 96, 1985).
Je možné tiež využiť spôsoby vyvinuté na prípravu „chimérických protilátok“, založených na spojení myších génov pre protilátky s ľudskými génmi pre protilátky a získať tak molekulu so zodpovedajúcou špecifickou antigénnou špecificitou a biologickou aktivitou (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 - 6855, 1984; Neuberger at al., Náture 312: 604 - 608, 1984; Takeda et al., Náture 314: 452 - 454, 1985). Okrem toho je možné využiť aj spôsoby na prípravu jednoreťazcových protilátok (U.S. Pat. č. 4 946 778) a prispôsobiť ich na prípravu jednoreťazcových protilátok, ktoré sú špecifické pre RG1.
Ďalej je možné pripraviť „ľudské“ („humánne“) protilátky spôsobmi opísanými v patentoch USA č. 5 877 397 a 5 569 825, ktoré sú uvedené v plnom znení formou odkazu.
Protilátky je tiež možné pripraviť indukovaním produkcie in vivo v populácii lymfocytov alebo plošným testovaním rekombinantných imunoglobulínových knižníc či súborov vysoko špecifických väzbových látok, ako je opísané v publikáciách Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 - 3837, 1989) a Winter a Milstein (Náture 349: 293 - 299, 1991).
Je možné tiež pripraviť fragmenty protilátok, ktoré obsahujú špecifické väzbové miesta pre RG1. Tieto fragmenty zahŕňajú okrem iného napr. fragmenty F(ab')2, ktoré sa môžu pripraviť pepsínovým štiepením molekuly protilátky a fragmenty Fab, ktoré je možné pripraviť redukciou disulfidických mostíkov fragmentov F(ab')2. Je možné tiež pripraviť expresné knižnice Fab na rýchlu a ľahkú identifikáciu fragmentov monoklonálnych Fab s požadovanou špecificitou (Huse et al., Science 256: 1270 - 1281, 1989).
Aminokyselinová sekvencia RG1 uvedená v tomto vynáleze môže slúžiť na selekciu špecifických oblastí polypeptidov RG1 na prípravu protilátok. Odborníkom je známe, že výber oblastí alebo epitopov polypeptidov RG1, proti ktorým je protilátka zameraná, sa môže líšiť podľa zamýšľaného využitia. Napr. protilátky určené na imunologické testovanie RG1 viazaného na membránu buniek prostaty by mali byť zamerané proti prístupným epitopom na polypeptide RG1. Oblasti polypeptidu RG1 majú imunogénnu štruktúru a ďalšie oblasti a domény je možné ľahko identifikovať pomocou množstva ďalších spôsobov známych odborníkom, ako napr. analýza podľa Chou-Fasmana, Garnier-Robsona či Jameson-Wolfa. Fragmenty obsahujúce tieto aminokyselinové zvyšky sú zvlášť výhodné na prípravu protilátok proti RG1. Medzi zvlášť výhodné fragmenty patrí okrem iného sekvencia PLGGESICSAGAPAKYSIT (sekvencia SEQ ID NO: 8); HSSDYSMWRKNQYVS (sekvencia SEQ ID NO: 10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (sekvencia SEQ ID NO: 11); a NEIVSASVPET (sekvencia SEQ ID NO: 12).
SK 288147 Β6
Príprava protilátok proti týmto oblastiam je opísaná v príklade 4.
Protilátky proti RG1 opísané v predkladanom vynáleze môžu byť zvlášť výhodné na diagnostické testovanie, zobrazovacie spôsoby a terapeutické spôsoby pri liečbe rakoviny prostaty. Tento vynález navrhuje rad imunologických testov na detekciu polypeptidov RG1 a na diagnostiku rakoviny prostaty. Tieto testy obvykle zahŕňajú jednu alebo viac protilátok proti RG1 schopnú rozpoznávať a viazať polypeptíd RG1. Najvýhodnejšími protilátkami sú tie protilátky, ktoré viažu RG1 a neviažu (alebo viažu len slabo) iné polypeptídy než RG1. Tieto testy zahŕňajú rôzne formy imunologických testov dobre známe odborníkom, vrátane okrem iného rôznych typov rádioimunologických testov, testov ELISA a pod. Okrem toho predkladaný vynález tiež uvádza imunologické zobrazovacie spôsoby na detekciu rakoviny prostaty, vrátane okrem iného radioscintigrafických zobrazovacích spôsobov pomocou značených protilátok proti RG1. Tieto testy sa môžu využiť klinicky na detekciu, sledovanie a určenie prognózy rakoviny prostaty.
Opísané protilátky môžu slúžiť na izoláciu a identifikáciu klonov exprimujúcich polypeptíd uvedený v predkladanom vynáleze alebo na purifikáciu tohto polypeptidu ukotvením protilátky na pevný nosič na izoláciu a/alebo purifikáciu afmitnou chromatografiou.
Protilátky proti RG1 sa môžu ďalej použiť na izoláciu buniek pozitívnych na RG1 použitím techník založených na triedení buniek a purifikačnými technikami. Protilátky proti RG1 sa môžu využiť zvlášť na izoláciu nádorových buniek prostaty z nádorového tkaniva xenograftov alebo z buniek tkanivových kultúr a pod. triedením buniek protilátkami alebo technikami afinitnej purifikácie. Ďalej je možné protilátky proti RG1 uvedené v tomto vynáleze využiť na prípravu antiidiotypových protilátok napodobňujúcich polypeptíd RG1.
Protilátky proti RG1 môžu slúžiť na detekciu výskytu rakoviny prostaty či nádorových metastáz. Prítomnosť týchto buniek obsahujúcich RG1 v rôznych biologických vzorkách, ako je sérum, vzorky biopsií prostaty a iného tkaniva, je možné stanoviť pomocou protilátok proti RG1. Protilátky proti RG1 je tiež možné využiť na rôzne zobrazovacie spôsoby ako imunoscintigrafia pomocou 99mTc (či iného izotopu) konjugovaného s protilátkou. Napr. zobrazovací protokol podobný protokolu nedávno opísanému v literatúre, ktorý využíva lnI konjugovaný s protilátkou proti PSMA, je možné využiť na detekciu opakovaných a metastatických nádorov prostaty (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759 - 766,1997).
Protilátky proti RG1 uvedené v predkladanom vynáleze sa môžu značiť markerom schopným detekcie alebo konjugovať s ďalšou molekulou, ako napr. s cytotoxickou látkou a využiť na zacielenie tejto ďalšej molekuly proti bunke pozitívnej na RG1 (Vitetta, E. S. et al., Immunotoxin Therapy, in DeVita, Jr., V. T. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4,h ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624 - 2636, 1993). Príklady cytotoxických látok zahŕňajú okrem iného ricín, doxorubicín, daunorubicín, taxol, etídiumbromid, mitomycín, etoposide, tenoposide, vinkristín, vinblastín, kolchicín, dihydroxyantracíndión, aktinomycín D, difterický toxín, Pseudomonas exotoxín (PE) A, PE40, abrin a glukokortikoidné a iné chemoterapeutické činidlá, ako aj rádioizotopy. Markery vhodné na detekciu sú okrem iného rádioizotopy, fluorescenčné zlúčeniny, bioluminiscenčné zlúčeniny, chemiluminiscenčné zlúčeniny, kovové chelátory či enzýmy. Medzi vhodné rádioizotypy patria nasledujúce izotopy: 124Sb, 125Sb, 74As, 103Ba, 140Ba, 7Be, j206Bi, 207Bi, 109Cd, 115mCd, 45Ca, 139Ce, 141Ce, 144Ce, 137Cs, 51Cr, 56Co, 57Co, 58Co, 60Co, 64Co, 169Er, 152Eu, 153Gd, 195Au, 199Au, 175Hf, l81Hf, llln, 1231, 1311, 192Ir, 55Fe, 59Fe, 85Kr, 210Pb, 54Mn, 197Hg, 203Hg, 99Mo, 147Nd, 237Np, 63Ni, 95Nb, 185 + 1910s, 103Pd, 195mPt, 143Pr, 147Pm, 233Pa, 2226Ra, 186Re, 86Rb, 103Ru, 106Ru, 44Sc, 46Sc, 75Se, llOmAg, llAg, 22Na, 85Sr, 89Sr, 90Sr, 35S, 182Ta, 99mTc, 125Te, 132Te, 170T1,204T1, 228Th, 232Th, 113Sn, 44Ti, 185W, 48V, 49V, 169Yb, 88Y, 90Y, 91Y, 65Zn, 95Zr. Imunoterapia rakoviny prostaty
Predkladaný vynález uvádza rôzne imunoterapeutické spôsoby liečby rakoviny prostaty, ako napr. terapia protilátkami, vakcínami in vivo, či imunoterapeutickými spôsobmi ex vivo. V jednom spôsobe uvádza tento vynález na liečbu rakoviny prostaty systémové využitie protilátok proti RG1. Napr. nekonjugované protilátky proti RG1 je možné do pacienta vnášať tak, že sa protilátka naviaže na RG1, ktorý sa nachádza na prostatických nádorových bunkách alebo v nich, prípadne, je na ne pripojený a sprostredkuje deštrukciu týchto buniek a tumoru mechanizmami, ako sú napr. cytolýza sprostredkovaná komplementom, bunková cytotoxicita závislá od protilátky, zmena fyziologickej funkcie RG1 a/alebo inhibícia väzby na ligand alebo dráh prenosu signálu. Protilátky proti RG1 konjugované s toxickými látkami, ako ricín či rádioizotopy, je možné tiež využiť terapeuticky na priame doručenie toxickej látky do prostatických nádorových buniek, ktoré nesú RG1, čím dôjde k deštrukcii nádorových buniek.
Na imunoterapiu rakoviny prostaty pomocou protilátok proti RG1 je možné využiť rad prevzatých spôsobov, ktoré sa využívajú v súvislosti s inými typmi rakoviny, okrem iného napr. s rakovinou hrubého čreva (Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18: 133 - 138, 1998), mnohonásobným myelómom (Ozaki et al., Blood 90: 317 9 - 3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90: 2437 - 2444, 1997), rakovinou žalúdka (Kasprzyk et al., Cancer Res. 52: 2771 - 277 6, 1992), B-bunkovým lymfómom (Funakoshi et al., Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93 - 101, 1996), leukémiou (Zhong et al., Leuk. Res. 20: 581 - 589, 1996), kolorektálnou rako19 vinou (Moun et al., Cancer Res. 54: 6160 - 6166, 1994; Velders et al., Cancer Res. 55: 4398 - 4403, 1995) a rakovinou prsníka (Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11: 117 - 127, 1991).
Predkladaný vynález ďalej poskytuje vakcíny navrhnuté tak, aby obsahovali polypeptid RG1 alebo jeho fragmenty. Využitie nádorovo špecifického antigénu na prípravu vakcín na vyvolanie humorálnej a bunkovej imunity pri liečbe rakoviny je veľmi dobre známy spôsob v stave techniky a využíva sa na liečbu rakoviny prostaty pomocou ľudských imunogénov PSMA a imunogénov PAP hlodavcov (Hodge et al., Int. J. Cancer 63:231 - 237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159:3113 - 3117, 1997). Tieto spôsoby je ľahké uskutočňovať využitím polypeptidu RG1 alebo jeho fragmentu, alebo molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej RG1 a rekombinantných vektorov schopných exprimovať a správne prezentovať imunogén RG1.
Na doručenie molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej RG1 sa môžu využiť napr. doručovacie systémy založené na vírusových génoch. Rôzne doručovacie systémy založené na vírusových génoch, ktoré sa môžu využiť v tomto aspekte vynálezu, zahŕňajú, ale bez obmedzenia, vírus kravských kiahní, vírus kiahní hydiny, kiahní kanárikov, adenovírusy, vírus chrípky, vírus obmy, vírus asociovaný s adenovírusom, letivírusy alebo vírus sindbus (Restifo, in Curr. Opin. Immunol. 8: 658 - 663, 1996). Je tiež možné využiť nevírusové systémy využívajúce vnesenie holej molekuly DNA, ktorá kóduje polypeptid RG1 alebo jeho fragment do pacientovho organizmu (napr. intramuskuláme) s cieľom vyvolať protinádorovú odpoveď. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je možné využiť úplnú cDNA ľudského rgl. V inom uskutočnení je možné využiť fragmenty cDNA rgl. V ďalšom uskutočnení je možné využiť molekulu nukleovej kyseliny rgl, ktorá kóduje špecifické epitopy T lymfocytov (CTL). Epitopy CTL je možné určiť pomocou špecifických algoritmov (napr. Epimer, Brown University) na identifikáciu peptidov vnútri polypeptidu RG1, ktoré sú schopné optimálnej väzby na špecifické alely HLA.
Je možné tiež využiť rôzne stratégie ex vivo. Jeden spôsob zahŕňa využitie dendritických buniek, ktoré prezentujú polypeptid RG1 pacientovmu imunitnému systému ako antigén. Dendritické bunky exprimujú molekuly MHC I a II, kostimulačnú molekulu B7 a IL-12 a sú teda vysoko špecializované na prezentáciu antigénu. Pri rakovine prostaty sa využívajú v klinických skúškach 1. stupňa autológne dendritické bunky pulzované (pulsed) s peptidmi membránového antigénu špecifického pre prostatické bunky (PSMA) na stimuláciu imunitného systému pacientov s rakovinou prostaty (Tjoa et al., Prostate 28: 65 - 69, 1996; Murphy et al., Prostate 29: 371 - 380, 1996). Dendritické bunky môžu slúžiť na prezentáciu polypeptidov RG1 T bunkám v kontexte molekúl MHC I a II. V jednom uskutočnení tohto vynálezu sú dendritické bunky pulzované s polypeptidmi RG1 schopnými viazať molekuly MHC. V inom uskutočnení sú dendritické bunky pulzované s úplným polypeptidom RG1. Ďalšie uskutočnenie zahŕňa navodenie zvýšenej expresie génu rgl v dendritických bunkách pomocou rôznych vektorov známych v stave techniky, ako sú adenovírus (Arthur et al. , Cancer Gene Ther. 4:, 17 - 25, 1997), retrovírus (Henderson et al., Cancer Res. 56: 3763 - 3770, 1996), lentivírus, adenoasociovaný vírus, transfekcie DNA (Ribas et al, Cancer Res. 57: 2865 - 2869, 1997) a transfekcie nádorovo odvodenej RNA (Ashley et al., J. Exp. Med. 186: 1177 - 1182, 1997).
Antiidiotypové protilátky proti RG1 je možné tiež využiť pri protinádorovej terapii ako vakcínu na vyvolanie imunitnej odpovede proti bunkám exprimujúcim polypeptid RG1. Zvlášť príprava antiidiotypových protilátok je odborníkom dobre známa a tento spôsob je ľahké prispôsobiť na prípravu antiidiotypových protilátok anti-RGl, ktoré napodobňujú epitop na polypeptide RG1 (pozri napr. Wagner et al., Hybridoma 16: 33 - 40, 1997; Foon et al., J. Clin. Invest. 96: 334 - 342, 1995; Herlyn et al., Cancer Immunol. Immunother. 43: 65 - 76, 1996). Takúto antiidiotypovú protilátku je potom možné využiť pri antiidiotypovej liečbe, podobne ako iné protilátky zamerané proti nádorovým antigénom.
Na vyvolanie profylaktickej a terapeutickej humorálnej a bunkovej imunitnej odpovede proti nádorovým bunkám exprimujúcim RG1 je možné využiť spôsoby génovej imunizácie. Využitím opísaných molekúl DNA, ktoré kódujú RG1, je možné konštrukty obsahujúce DNA, ktorá kóduje polypeptid/imunogén RG1 so zodpovedajúcimi regulačnými sekvenciami, priamo injikovať do svalu alebo kože jedinca, takže svalové alebo kožné bunky konštrukt prijmú a exprimujú kódovaný polypeptid/imunogén RG1. Polypeptid/imunogén RG1 sa môže exprimovať ako povrchový polypeptid alebo môže byť sekretovaný. Expresia polypeptidu/imunogénu RG1 vedie k vyvolaniu profylaktickej alebo liečebnej humorálnej a bunkovej imunity proti rakovine prostaty. Je možné využiť množstvo profylaktických a liečebných spôsobov génovej imunizácie známych v stave techniky (pozri prehľad informácií a prác publikovaných na intemetovej adrese www.genweb.com).
„Antisense“ oligonukleotidy, „antisense“ vektory a ribozýmy „Antisense“ polynukleotidy komplementárne k rgl je možné pripraviť synteticky. Tieto oligonukleotidy je možné doručiť do buniek samotné alebo s lipidmi, ktoré napomáhajú prijatiu „antisense“ oligonukleotidov bunkami.
Alebo expresné vektory, vektory odvodené od retrovírusov, adenovírusu, herpesvírusov herpes alebo kravských kiahní alebo z rôznych bakteriálnych plazmidov môžu tiež slúžiť na konštrukciu a doručenie rekombinantných vektorov, ktoré budú exprimovať „antisense“ rgl (pozri napr. spôsoby opísané v publikáciách Sambrook et al. alebo Ausubel et al.).
SK 288147 Β6
Polynukleotidy obsahujúce úplnú sekvenciu cDNA a/alebo jej regulačné elementy umožňujú pracovníkom vo výskume, aby využívali polynukleotidy rgl ako nástroj na prehľadávanie „sense“ vlákien (Youssoufian and Lodish, Mol. Celí. Biol. 13: 98 - 104, 1993) alebo „antisense“ vlákien (Eguchi et al., Annu Rev. Biochem. 60: 631 - 652, 1991) na zistenie regulácie fúnkcii tohto génu. Tieto spôsoby sú už v stave techniky dobre známe, a „sense“ alebo „antisense“ oligoméry alebo väčšie fragmenty je možné odvodiť z rôznych miest z kódujúcich alebo nekódujúcich oblastí.
Gény kódujúce RG1 môžu byť vypnuté transfekciou buniek alebo tkaniva expresnými vektormi, ktoré exprimujú vysokú hladinu požadovaného fragmentu polynukleotidu rgl. Tieto konštrukty môžu zaplaviť bunku netranslatovateľnými „sense“ či „antisense“ sekvenciami. Aj keď nedôjde k integrácii do DNA, tieto vektory môžu ďalej transkribovať molekuly RNA, pokiaľ nie sú všetky kópie vyradené endogénnymi nukleázami. Pri nereplikatívnych vektoroch môže prechodná expresia trvať mesiac alebo viac a pokiaľ sú súčasťou vektorového systému zodpovedajúce replikačné elementy, môže trvať aj dlhšie.
Ako bolo uvedené, zmeny génovej expresie je možné dosiahnuť pomocou „antisense“ molekúl DNA či RNA, ktoré kontrolujú oblasti vrgl, napr. promótory, enhancery a intróny. Výhodné sú oligonukleotidy odvodené z miesta iniciácie transkripcie, t. j. z oblasti medzi -10 a +10 vedúcej „leader“ sekvencie. Je tiež možné pripraviť „antisense“ molekuly na blokovanie translácie mRNA zabránením väzby transkriptu na ribozóm. Inhibíciu je tiež možné uskutočniť pomocou spôsobu využívajúceho párovanie báz do „trojitej závitnice“. Tvorbou trojitej závitnice dochádza k zamedzeniu schopnosti molekuly dostatočne sa otvoriť pre väzbu s polymerázami, transkripčnými faktormi alebo regulačnými molekulami, ktorú by inak ako dvojitá závitnica mala. Najnovšie liečebné zlepšenia, ktoré využívajú tvorbu trojitých závitnic DNA (triplex DNA), sú zhrnuté v publikácii Gee J. E. et al. (In Huber a Car, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994).
Ribozýmy sú enzymatické molekuly RNA, ktoré sú schopné katalyzovať špecifické štiepenie RNA (patent USA č. 4 987 071; WO93/23057). Mechanizmus pôsobenia ribozýmu spočíva v sekvenčne špecifickej hybridizácii molekuly ribozýmu s komplementárnou cieľovou RNA, nasledovanej endonukleolytickým štiepením. V predkladanom vynáleze sú pripravené ribozýmové molekuly s tzv. „hammerhead“ motívom, ktoré môžu špecificky a účinne katalyzovať endonukleolytické štiepenie RNA, ktorá kóduje RG1. Špecifické štiepne miesta pre ribozýmy je možné na každej potenciálnej cieľovej RNA predbežne identifikovať vyhľadávaním štiepnych miest pre ribozýmy, ktoré obsahujú sekvencie GUA, GUU a GUC na cieľovej molekule. Hneď ako sa tieto miesta identifikujú, je možné určiť tie charakteristiky sekundárnej štruktúry krátkych sekvencii RNA s 15 - 20 ribonukleotidmi, ktoré zodpovedajú oblasti cieľového génu obsahujúcej štiepne miesto, a na základe ktorých by bolo možné daný oligonukleotid vyradiť z fúnkcie. Vhodnosť potenciálnych cieľov je tiež možné zhodnotiť testovaním prístupnosti pre hybridizáciu s komplementárnymi oligonukleotidmi pomocou ribonukleázových ochranných testov (ribonuclease protection assays) (Irie et al., Advances Pharmacol. 40: 207-257, 1997).
„Antisense molekuly a ribozýmy uvedené v tomto vynáleze je možné pripraviť akýmkoľvek spôsobom na syntézu molekúl RNA známym v stave techniky. Sú to napr. spôsoby chemickej syntézy oligonukleotidov, ako syntéza použitím fosforamiditu v pevnej fáze. Molekuly RNA je možné pripraviť transkripciou in vitro a in vivo alebo pomocou sekvencii DNA, ktoré kódujú RG1. Tieto sekvencie DNA sa môžu vniesť do celého radu vektorov so zodpovedajúcimi promótormi RNA polymerázy ako T7 alebo SP6. Je možné tiež vniesť konštrukty „antisense“ cDNA, ktoré syntetizujú „antisense“ RNA, do bunkových línií, buniek alebo tkanív.
Molekuly RNA môžu byť modifikované s cieľom zvýšiť ich stabilitu vnútri bunky alebo ich polčas. Možnými zmenami sú okrem iného napr. pripojenie priľahlých sekvencii na 5' koniec a/alebo 3' koniec molekúl, alebo využitie fosforotioátových alebo 2'O-metylových väzieb namiesto fosfodiesterových pri tvorbe základnej kostry molekuly. Stabilitu molekúl je možné tiež zvýšiť vložením neobvyklých báz, ako sú inozín alebo queozín (queosine), ako aj acetyl-, metyl-, tio- a podobne modifikovaných foriem adenínu, guanínu, tymínu a uridínu, ktoré nie sú tak ľahko rozpoznané endogénnymi endonukleázami.
Medzi spôsoby vnesenia „antisense“ vektorov do buniek alebo tkanív patria opísané spôsoby, ktoré sú vhodné tak na liečenie in vivo, ako aj in vitro a ex vivo. Na liečenie ex vivo sú vektory vnášané do buniek odobratých z pacientovho organizmu a klonálne pomnožené na autológnu transplantáciu do toho istého pacienta, ako je uvedené v patentoch USA č. 5 399 493 a 5 437 994, ktoré sú uvedené v literatúre. Prenos transfekciou alebo lipozómami či inými lipidickými a nelipidickými činidlami je odborníkom tiež dobre známy. Testy na identifikáciu látok viažucich RG1
Predkladaný vynález sa tiež týka testov a spôsobov, ktoré môžu slúžiť na identifikáciu látok (agensov, činidiel) viažucich RG1. Tieto látky viažuce RG1 môžu byť identifikované najmä na základe schopnosti ligandu RG1 alebo inej látky a zložky viazať RG1 a/alebo schopnosti inhibovať/stimulovať aktivitu RG1.
Látky viažuce polypeptid RG1 môžu byť tiež identifikované pomocou kvasinkového dvojhybridného systému a testu väzbovej schopnosti. Pri kvasinkovom dvojhybridnom systéme sa expresná jednotka, ktorá kó21 duje fúzny proteín skladajúci sa z transkripčného faktora s jednou podjednotkou, transkripčného faktora s dvomi podjednotkami a polypeptidu RG1 vnesie do bunky kvasinky a je v nej exprimovaná. Táto bunka je ďalej pozmenená tak, aby obsahovala (1) expresnú jednotku kódujúcu detegovateľný marker, na ktorého expresiu je potrebný transkripčný faktor s dvomi podjednotkami a (2) expresnú jednotku kódujúcu fúzny proteín skladajúci sa z druhej podjednotky transkripčného faktora a klonovaného segmentu DNA. Pokiaľ klonovaný segment DNA kóduje proteín viažuci polypeptid RG1, výsledkom expresie je interakcia RG1 a kódovaného proteínu. Tým sa obe podjednotky a transkripčný faktor dostanú do väzbovej blízkosti a transkripčný faktor sa môže obnoviť. Tak je exprimovaný detegovateľný marker. Kvasinkový dvojhybridný systém je zvlášť výhodný pri plošnom testovaní knižnice cDNA, ktorá kóduje segmenty bunkových väzbových partnerov RG1.
Medzi polypeptidy RG1, ktoré je možné využiť v opísaných testoch, patrí okrem iného napr. izolovaný polypeptid RG1, fragment polypeptidu RG1, či bunka, ktorá bola pozmenená tak, aby exprimovala polypeptid RG1. Polypeptidom RG1 môže byť ďalej celý tento polypeptid či jeho definovaný fragment. Bežnému odborníkovi bude zrejmé, že pokiaľ je polypeptid RG1 testovateľný na väzbu k nejakej látke, napr. pomocou posunu molekulovej váhy alebo aktivity, je možné tento spôsob testovania využiť.
Spôsob, ktorým bude určené, či látka/bunková zložka viaže polypeptid RG1, bude primáme závisieť od charakteru použitého polypeptidu RG1. Na určenie, či látka viaže RG1 alebo jeho fragment, môže slúžiť napr. gélový retardačný test. Na testovanie polypeptidu RG 1 je tiež možné využiť imunodetekciu alebo spôsoby založené na biočipoch. Na zistenie, či určitá látka viaže RG1, môže skúsený odborník využiť rad spôsobov známych zo stavu techniky.
Látky a bunkové zložky je možné ďalej testovať, či sú schopné ovplyvňovať aktivitu polypeptidu RG1, pomocou bezbunkového testovacieho systému alebo bunkového testovacieho systému. Definované aktivity polypeptidu RG1 môžu byť ďalej testované funkčnými testami.
V kontexte predkladaného vynálezu platí, že látka antagonizuje aktivitu RG1, pokiaľ jeho aktivitu znižuje. Výhodný antagonista selektívne antagonizuje RG1 a neovplyvňuje ďalšie bunkové proteíny. Výhodný antagonista ďalej znižuje aktivitu RG1 o viac než 50 %, výhodnejšie o viac než 90 % a najvýhodnejšie vyradí celkovú aktivitu RG 1.
Látky testované uvedeným spôsobom sa môžu vybrať náhodne alebo racionálne. V kontexte predkladaného vynálezu platí, že látka sa vyberá náhodne, pokiaľ sa neprihliada na špecifické sekvencie polypeptidu RG1. Príkladom náhodne vybraných látok je využitie chemickej knižnice alebo kombinatorickej knižnice peptidov, živnej pôdy pre určitý organizmus alebo rastlinného extraktu.
V kontexte predkladaného vynálezu platí, že látka je vybratá racionálne, pokiaľ je vybratá nenáhodne v závislosti od sekvencie cieľového miesta a/alebo jeho konformácie a v súvislosti s pôsobením danej látky. Látky sa môžu vyberať alebo navrhovať racionálne na základe peptidových sekvencii polypeptidu RG1.
Racionálne vybratou peptidovou látkou môže byť napr. peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zhodná s fragmentom polypeptidu RG1.
Látky testované spôsobmi podľa predkladaného vynálezu môžu byť napr. peptidy, protilátky, oligonukleotidy, malé molekuly a deriváty vitamínov a tiež uhľovodíky. Skúsenému odborníkovi je zrejmé, že výber látok pre uvedený testovací spôsob nie je nijako obmedzený ich štrukturálnou povahou. Jedna trieda látok podľa predkladaného vynálezu sú peptidové látky, ktorých aminokyselinové sekvencie sú vybraté na základe aminokyselinovej sekvencie polypeptidu RG1.
Peptidové látky je možné pripraviť pomocou štandardných syntetických spôsobov, ktoré využívajú látky v pevnej (alebo kvapalnej) fáze, ktoré sú v stave techniky známe. Navyše je možné syntetizovať DNA, ktorá kóduje tieto peptidy pomocou komerčne dostupných prístrojov na syntézu oligonukleotidov a pripraviť ich rekombinantne pomocou štandardných rekombinantných produkčných systémov. Prípravu pomocou syntézy v pevnej fáze je nutné využiť tam, kde sa vyskytujú aminokyseliny nekódované žiadnym génom.
Inými látkami uvedenými v predkladanom vynáleze sú protilátky imunoreaktívne s kritickými miestami polypeptidu RG1. Ako je tu už opísané, protilátky sa získavajú imunizáciou vhodných cicavčích organizmov peptidmi, ktoré obsahujú ako antigénnu oblasť tie časti polypeptidu RG1, proti ktorým majú byť protilátky zamerané. Tieto látky je možné využiť pri štúdiách väzbových kompetícií na identifikáciu inhibičných látok druhej generácie a na blokovanie aktivity RG 1.
Bunkové extrakty testované spôsobmi uvedenými v predkladanom vynáleze môžu byť napr. vodné extrakty buniek či tkanív, organické extrakty buniek alebo tkanív alebo čiastočne purifikované frakcie buniek. Skúsenému odborníkovi je zrejmé, že výber zdroja bunkového extraktu pre uvedený testovací spôsob nie je nijako obmedzený jeho štruktúrnou povahou.
Látky viažuce polypeptid RG1, ako napr. protilátka proti RG1, sa môžu využiť na modulovanie aktivity RG1, na zacielenie protirakovinových látok do zodpovedajúcich cicavčích buniek alebo na identifikáciu látok blokujúcich interakciu s RG1. Bunky exprimujúce RG1 je možné zacieliť alebo identifikovať použitím látky, ktorá viaže RG 1.
SK 288147 Β6
To, ako bude látka viažuca RG1 využitá, závisí od jej povahy. Látka viažuca RG1 môže byť napr. využitá na: doručenie konjugovaných toxínov, ako sú difterický toxín, toxín cholery, ricín alebo exotoxín Pseudomonas, do bunky exprimujúcej RG1; moduláciu aktivity RG1; priame zabitie bunky exprimujúcej RG1; alebo pri skríningoch na identifikáciu látok s kompetitívnou väzbou. Tak napr. látka inhibujúca RG1 sa môže využiť na priamu inhibíciu rastu buniek, ktoré exprimujú RG1, zatiaľ čo látka viažuca RG1 sa môže využiť ako diagnostické činidlo.
Farmaceutické prípravky a spôsoby podávania
Predkladaný vynález sa tiež týka využitia farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú polynukleotidy rgl, polypeptidy RG1, protilátky proti nim, ich agonisty, antagonisty alebo inhibítory a to samotné alebo v kombinácii aspoň s jednou látkou, ako napr. stabilizačnou látkou a ktoré môžu byť podané v akomkoľvek sterilnom, biokompatibilnom farmaceutickom nosiči, ako okrem iného napr. vo fyziologickom roztoku, dextróze alebo vode. Ktorúkoľvek z týchto molekúl je možné pacientovi podať samotnú alebo v kombinácii s inými látkami, liečivami či hormónmi vo farmaceutických kompozíciách, kde sú zmiešané s vehikulom (vehikulmi) alebo s farmaceutický prijateľnými nosičmi. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je farmaceutický prijateľný nosič farmaceutický inertný.
Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobu podania farmaceutických kompozícií. Toto podanie sa môže uskutočňovať perorálne alebo parenterálne. Medzi spôsoby parenterálneho podania patrí podanie topické, intraarteriálne (priamo do tumoru), intramuskuláme, subkutánne, intrameduláme, intratekálne, intraventrikuláme, intravenózne, intraperitoneálne alebo intranazálne. Okrem aktívnych zložiek môžu tieto farmaceutické kompozície obsahovať vhodné farmaceutický prijateľné nosiče, ako sú vehikulá a pomocné látky, ktoré umožňujú spracovanie aktívnych zložiek na preparáty, ktoré je možné farmaceutický využiť. Ďalšie podrobnosti o spôsoboch prípravy a podania týchto látok je možné nájsť v poslednom vydaní Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa).
Farmaceutické kompozície na perorálne podávanie je možné formulovať pomocou farmaceutický prijateľných nosičov dobre známych zo stavu techniky v dávkach vhodných na orálne podanie. Tieto nosiče umožňujú formuláciu farmaceutických kompozícií ako tablety, pilulky, dražé, tobolky, roztoky, gély, sirupy, husté suspenzie, normálne suspenzie a pod., určené na podanie pacientom.
Farmaceutické prípravky na perorálne podávanie je možné získať kombináciou aktívnych zložiek s pevným vehikulom, podľa potreby rozomletím vzniknutej zmesi a po prípadnom pridaní vhodných aditív (pomocných látok) spracovaním tejto zmesi granúl na tablety alebo dražé. Vhodnými vehikulmi sú sacharidové alebo proteínové plnidlá ako cukry, napr. laktóza, sacharóza, manitol alebo sorbitol; kukuričný, pšeničný, ryžový alebo zemiakový škrob, alebo škrob z iných rastlín; celulóza vo forme metylcelulózy, hydroxypropylmetylcelulózy alebo karboxymetylcelulózy sodnej; gumy ako arabská guma alebo tragakantová guma; a ďalej proteíny ako želatína a kolagén. Podľa potreby je možné pridať dekompozičné alebo solubilizačné činidlá ako napr. zosieťovaný polyvinylpyrolidón, agar, kyselinu algínovú alebo jej soľ, ako napr. alginát sodný.
Jadrá dražé sa obaľujú do vhodných poťahov, ako sú napr. koncentrované cukrové roztoky, ktoré môžu tiež obsahovať arabskú gumu, mastenec, polyvinylpyrolidón, karbopolový gél, polyetylénglykol a/alebo oxid titaničitý, roztoky lakov a vhodné organické rozpúšťadlá alebo ich zmesi. Do poťahov tabliet alebo dražé sa môžu pridať farbivá alebo pigmenty na identifikáciu výrobku či označenia množstva aktívnej látky, t. j. dávkovania.
Medzi farmaceutické prípravky, ktoré sa môžu používať perorálne, patria napr. „push-fit“ želatínové tobolky ako aj mäkké zatavené želatínové tobolky a povrchý film z glycerolu alebo sorbitolu. „Push-fit“ tobolky môžu obsahovať aktívne zložky zmiešané s plnidlom alebo spojivom, ako je laktóza alebo škroby, lubrikanty, ako je mastenec alebo stearát horčíka, prípadne stabilizátory. V mäkkých tobolkách môžu byť aktívne zložky rozpúšťané alebo suspendované vo vhodných tekutinách/kvapalinách, ako sú mastné oleje, kvapalný parafín, alebo kvapalný polyetylénglykol s alebo bez stabilizátorov.
Medzi farmaceutické formulácie na parenterálne podávanie patria vodné roztoky aktívnych zložiek. Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu určené na injekciu môžu byť formulované vo vodných roztokoch, výhodne vo fyziologických kompatibilných pufroch, ako je Hankov roztok, Ringerov roztok alebo pufrovaný fyziologický roztok. Vodné injekčné suspenzie môžu obsahovať látky, ktoré zvyšujú viskozitu suspenzie, ako je karboxymetylcelulóza sodná, sorbitol alebo dextrán. Suspenzie aktívnych zložiek môžu byť tiež pripravené ako vhodné olejové suspenzie na injekciu. Vhodnými lipofilnými rozpúšťadlami alebo vehikulami sú mastné oleje, ako je sezamový olej, alebo syntetické estery mastných kyselín, ako je etyloleát alebo triglyceridy, alebo lipozómy. Suspenzie môžu tiež prípadne obsahovať vhodné stabilizátory alebo látky zvyšujúce rozpustnosť zlúčenín, takže je možné pripraviť vysoko koncentrované roztoky.
Na topické alebo nazálne podanie sa do formulácie pridávajú penetranty pre zodpovedajúcu bariéru, ktorou majú preniknúť. Tieto penetranty sú v stave techniky bežne známe.
SK 288147 Β6
Súpravy (Kity)
Predkladaný vynález sa ďalej týka farmaceutických balení a súprav (kitov) zahŕňajúcich jednu alebo viac nádob naplnených jednou alebo viacerými zložkami opísaných kompozícií uvedených v tomto vynáleze. K tejto nádobke (nádobkám) môže byť priložený leták vo forme predpísanej príslušným vládnym úradom, v ktorého kompetencii je výroba, použitie alebo predaj farmaceutických či biologických výrobkov, kde je vyjadrený súhlas tohto úradu s výrobou, použitím alebo predajom daného výrobku na ľudské účely.
Výroba a skladovanie
Farmaceutické kompozície uvedené v predkladanom vynáleze je možné pripraviť spôsobmi známymi v stave techniky, t. j. konvenčným miešaním, rozpúšťaním, granulovaním, prípravou dražé, drvením, tvorbou emulzií, uzatváraním do kapsúl alebo iných produktov alebo lyofilizáciou. Tieto farmaceutické kompozície sa môžu získať vo forme solí mnohých kyselín ako okrem iného napr. kyseliny chlorovodíkovej, sírovej, octovej, mliečnej, šťaveľovej, jablčnej, jantárovej a pod. Soli sú často rozpustnejšie vo vodných alebo iných protonických rozpúšťadlách, ktoré sú ich zodpovedajúcou voľnou bázickou formou. Inokedy môže byť výhodným prípravkom lyofilizovaný prášok v 1 mM - 50 mM histidíne, 0,1 % - 2 % sacharóze, 2 % - 7 % manitole v rozmedzí pH 4,5 až 5,5, ktorý sa pred použitím zmieša s pufrom.
Potom, ako sú farmaceutické kompozície obsahujúce zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu, formulovanú v prijateľnom nosiči, pripravené, môžu byť uložené do vhodnej nádoby a označené na liečenie indikovaných stavov. Pre podávanie RG1 toto označenie zahŕňa množstvo, frekvenciu a spôsob podávania. Terapeuticky účinná dávka
Farmaceutické kompozície vhodné na použitie v predkladanom vynáleze zahŕňajú kompozície, v ktorých sú aktívne zložky obsiahnuté v účinnom množstve na docielenie zamýšľaného účelu, t. j. liečby konkrétneho chorobného stavu charakterizovaného expresiou RG1. Určenie účinnej dávky je celkom v kompetencii odborníkov.
Pre každú zložku môže byť terapeuticky účinná dávka najprv stanovená testovaním v bunkovej kultúre, napr. v neoplastických bunkách alebo na zvieracom modeli, obvykle na myšiach, králikoch, psoch alebo prasatách. Zvieracie modely sa tiež využívajú na určenie požadovaného koncentračného rozpätia a spôsobu podania. Na základe tejto informácie je potom možné stanoviť užitočné dávky a cesty podania ľudským jedincom.
Terapeuticky účinná dávka znamená také množstvo proteínu alebo jeho protilátok, jeho antagonistov alebo inhibítorov, ktoré zlepší symptómy alebo stav pacienta. Terapeutická účinnosť alebo toxicita týchto látok sa môže určiť štandardnými farmaceutickými spôsobmi v bunkovej kultúre alebo na zvieracom modeli, napr. ako ED5o (terapeuticky účinná dávka v 50 % populácie) a LD50 (dávka letálna pre 50 % populácie). Pomer dávok s terapeutickým a toxickým účinkom sa nazýva terapeutický index a dá sa vyjadriť ako pomer ED50/LD50. Výhodné sú farmaceutické kompozície majúce vysoké terapeutické indexy. Údaje získané testovaním bunkových kultúr a zvieracích modelov je možné využiť na určenie rozpätia pre dávkovanie ľudským jedincom. Dávkovanie týchto látok sa výhodne pohybuje v rozmedzí obehových koncentrácií, pri ktorých má ED5o nízku alebo žiadnu toxicitu. Dávkovanie sa pohybuje v tomto rozmedzí v závislosti od formy podania, citlivosti pacienta a cesty podania.
Presné dávkovanie určí lekár podľa toho, ktorému pacientovi má byť liek podaný. Dávkovanie a spôsob podania sa upravia tak, aby sa dosiahla dostatočne vysoká hladina aktívnej zložky na docielenie požadovaného účinku. Ďalšími faktormi, ktoré sa môžu brať do úvahy, sú napr. závažnosť chorobného stavu, ako napr. veľkosť nádoru a jeho umiestnenie; vek, hmotnosť a pohlavie pacienta; diéta, čas a početnosť podaní, kombinácia liečiv, citlivosť reakcie a ďalej tolerancia/odpoveď na liečbu. Farmaceutické kompozície s dlhodobou účinnosťou sa môžu podávať každé 3-4 dni, každý týždeň, raz každých 14 dní v závislosti od polčasu a rýchlosti klírens konkrétnej formulácie z organizmu.
Množstvá normálnej dávky sa môžu pohybovať od 0,1 do 100 000 mikrogramov, až do celkovej dávky 1 g, v závislosti od cesty podania. Návod na určité dávky a spôsoby podania je opísaný v literatúre, (pozri patenty USA 4 657 760; 5 206 344; alebo 5 225 212). Odborníci využijú odlišné formulácie pre polynukleotidy ako pre proteíny alebo ich inhibítory. Podobne bude podanie polynukleotidov či polypeptidov špecificky zodpovedať určitým bunkám, stavom, umiestneniam a pod.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Polynukleotidová sekvencia rgl (sekvencia SEQ ID NO: 1), kódujúca biologicky alebo imunologický aktívnu formu RG1.
Obr. 2: Odvodená aminokyselinová sekvencia RG1 (sekvencia SEQ ID. NO: 2), kde domény F-spondínu sú podčiarknuté jednoducho a doména trombospondínu dvojito.
SK 288147 Β6
Obr. 3: Lineárne porovnanie sekvencie RG1 so sekvenciou potkanieho Mindinu. Sekvencia RG1 sa nachádza hore.
Obr. 4: Polynukleotidová a dedukovaná aminokyselinová sekvencia RG 1.
Obr. 5: Expresia rgl v ľudských tkanivách zistená PCR analýzou založenou na Taqman. RNA z ľudských tkanív, tak nádorových ako normálnych, sa izolovala štandardnými spôsobmi. Priméry a sondy na detekciu expresie rgl mRNA boli navrhnuté pomocou Software Perkin Elmer's Primér Express a syntetizované pomocou Synthetic Genetics. Rgl mRNA sa stanovila v ľudskom prostatickom tkanive. Omnoho nižšiu expresiu rgl mRNA bolo možné zachytiť v ďalších tkanivách, napr. v pečeni.
Obr. 6: Purifikácia natívneho proteínu RG1 sekretovaného bunkami LNCaP. Analýza spôsobom Westem blot pomocou antiséra pripraveného proti syntetickej peptidovej sekvencií RG1 (3C, sekvencia SEQ ID NO: 10, pozri príklad 4) na detekciu natívneho proteínu RG1 sekretovaného bunkami LNCaP. Frakcia eluovanej chromatografie na Q-Sepharóze z koncentrovaného média upraveného pre bunky LNCaP: (L) náplň kolóny, (F) prietok kolóny, (1-12) frakcie eluované cez soľný gradient. Predpokladaná molekulová hmotnosť RG1 je približne 36 kD, ale zistilo sa, že proteíny RG1 exprimované baktériami, bunkami BHK a LNCaP, všetky putujú na géli PAGE v pozícii približne 45 kD (L, frakcia 6-9).
Obr. 7: Imunohistochemické farbenie expresie RG1 v ľudskom prostatickom tkanive. Vzorky prostatického tkaniva sa získali na Urologickom oddelení lekárskej fakulty Standfordovej univerzity. Farbenie sa uskutočnilo pomocou súpravy Vector ABC-AP (AK5002). Farbenie sa zviditeľnilo pomocou súpravy Vector Red substráte a následným farbením hematoxylínom. Výsledky ukazujú silné zafarbenie perilumenálnej membrány vo formáciách žľazy.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predkladaný vynález je ďalej opísaný nasledujúcimi príkladmi. Tieto príklady sú uvedené iba na ilustráciu tohto vynálezu ako príklady špecifických uskutočnení. Tieto príklady síce ilustrujú určité špecifické aspekty predkladaného vynálezu, ale vynález inak neobmedzujú a nevymedzujú rozsah tohto vynálezu.
Všetky príklady sa uskutočnili štandardnými spôsobmi, ktoré sú odborníkom dobre známe a sú inými rutinne využívané, s výnimkou inak podrobne opísaných prípadov. Rutinné spôsoby molekulárnej biológie použité v uvedených príkladoch je možné uskutočňovať podľa štandardných laboratórnych príručiek, ako napr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.
Príklad 1
Identifikácia polynukleotidu ľudského rgl
Rgl bol identifikovaný ako gén exprimovaný v prostate prehľadávaním databázy Incyte LifeSeq. Táto nukleotidová sekvencia sa identifikovala prehľadávaním anotácií v databáze pomocou nástroja „Funkcia proteínu“ poskytnutého spoločnosťou Incyte na účely prehľadávania databázy. Táto nukleotidová sekvencia sa našla v anotovanej databáze v kategórii bunkových adhéznych molekúl a bola opísaná ako homológ F-spondínu. Elektronická Northern analýza distribúcie polynukleotidových sekvencií rgl v súbore knižníc v databáze odhalila, že v knižniciach prostatických tkanív bol rgl exprimovaný vo vysokých hladinách a v nižších hladinách v knižniciach mnohých iných tkanív, vrátane normálnych a nádorových.
Po zostavení súboru klonov rgl z databázy do sústavy kontingov polynukleotidových sekvencií a po ich úprave na súvislú sekvenciu bola identifikovaná úplná kódujúca sekvencia umelo odvodeného zostaveného polynukleotidu. Táto sekvencia kóduje proteín homológny so spondínom-F a Mindinom-2.
Klony databázy Incyte 1640796, 1712252 a 1880265 sa získali z Incyte na experimentálne účely a kloň 3360733 sa identifikoval ako obsahujúci najväčšiu časť nukleotidovej sekvencie 5' konca. Získala sa úplná sekvencia tohto klonu, ktorá obsahuje úplnú kódujúcu sekvenciu pre umelo odvodený proteín RG1. Táto sekvencia je uvedená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 1).
Príklad 2
Expresia rgl mRNA
Expresia rgl mRNA v rôznych vzorkách normálneho a nádorového tkaniva a v bunkových líniách sa určila semikvantitatívnou PCR pomocou testu Taqman (Perkin-Elmer). Vzorky normálnych, benígnych a malígnych prostatických tkanív, ktorých štádium (granding) sa určilo podľa Gleasonovho systému, sa získali z Urologickej katedry lekárskej fakulty Stanfordovej Univerzity. Štandardnými spôsobmi sa z nich izolovala RNA. RNA iných nádorových a normálnych tkanív sa získala z komerčných zdrojov, vrátane firiem Biotech a Biochain. Prostatické nádorové bunkové línie (PC-3, LNCaP a DU145) sa získali z American Type Culture Collection a kultivovali sa štandardnými spôsobmi v médiu, ktoré obsahovalo sérum. V nahých myšiach sa pomocou týchto línií vyvolal vznik nádorových xenograftov, ktoré sa odobrali z týchto myší približne 4-6 týždňov po implantácií. Z nádorov sa štandardnými spôsobmi izolovala RNA.
Analýza PCR založená na Taqman sa uskutočnila využitím primérov:
CGC GCA TAG CTC CGA CTA C (sekvencia SEQ ID NO: 3) a GCC GCG TCC GCA AAG (sekvencia SEQ ID NO: 4) a sonda Taqman
- FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (sekvencia SEQ ID NO: 5).
Tieto priméry a sonda boli navrhnuté pomocou Software Perkin Elmer Primér Express a syntetizované pomocou Synthetic Genetics. Reakcie PCR sa uskutočnili v 30 - 40 cykloch a kvantifikované pomocou prostatickej RNA na vytvorenie štandardnej krivky na relatívne porovnávanie. Touto analýzou sa dokázalo, že najvyššie množstvo rgl mRNA sa našlo v prostate a významne nižšie hladiny v iných tkanivách (pozri obr. 5).
Príklad 3
Klonovanie a expresia RG1 v bunkách BHK
Kódujúca oblasť pre RG1 sa získala z plazmidu Incyte 3360733. Táto kódujúca sekvencia sa amplifikovala pomocou PCR s primérmi:
SST115 (5' - TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC- 3') (sekvencia SEQ ID NO: 6) a SST113 (5' - AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG- 3') (sekvencia SEQ ID NO: 7) v štandardnej PCR reakcii (100 μΐ) s použitím 1 x Pfu pufra Turbo polymerázy (Stratagene, La Jolla, CA)/200 (μΜ každého dNTP/0,2 (μΜ oligonukleotidových primérov/2,5 U Pfu Turbo polymerázy (Stratagene). Podmienky na amplifikáciu PCR boli nasledujúce: 3 min. pri 95 °C (15 s pri 95 °C, 30 s pri 60 °C, 2 min. pri 72 °C) x 35, 72 °C po 7 min. Výsledný amplifikovaný produkt sa prečistil na kolóne QIAquick PCR (Qiagen, Valencia, CA) a štiepil reštrikčnými enzýmami Xbal a Pmll na fragment s 1010 bp, ktorý sa vyčistil na 1 % agarózovom géli pomocou súpravy BIO 101 GeneClean Kit (Vista, CA). Purifikovaný fragment sa ligoval (pomocou Epicientre Fast Link Kit (Epicenter, Madison, WI) do necytopatického expresného vektora Sindbis pSINrep21 (Agapov et al., 1998, PNAS 95: 12989 - 12994) štiepeného Xbal a Pmľl, použil sa na transformáciu kompetentných buniek DH5 alfa (Life Technologies, Gaithersburg, CA) a selektoval na platniach s LB agarom obsahujúcim ampicilín (100 (pg/ml). Jedna z týchto kolónií rezistentných na ampicilín sa pomnožila v médiu LB obsahujúcom ampicilín a sekvenčnou analýzou sa v nej dokázala prítomnosť kódujúcej sekvencie pre RG1. Tento plazmid sa nazval pPEG6.
Dva mikrogramy pPEG6 sa použili na transfekciu 1-3 x 105 buniek BHK (bovine hamster kidney cells) pomocou látky Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) podľa návodu výrobcu. Po transfekcii sa bunky inkubovali v médiu DMEM obsahujúcom fetálne sérum počas 24 - 48 hod. potom sa 10-krát zriedili a selekcia buniek obsahujúcich plazmid sa iniciovala pridaním puromycínu (konečná koncentrácia 2,5 pg/ml) a média DMEM obsahujúceho sérum. Keď boli bunky konfluentné (4 - 5 dní po pridaní puromycínu), premyli sa PBS, 10- krát zriedili a pridalo sa médium DMEM obsahujúce sérum a 5 pg/ml puromycínu. Po ďalších 2-3 dňoch sa médium vymenilo za DMEM bez séra obsahujúceho 5 jag/ml puromycínu, bunky ďalej rástli 2 - 3 dni a potom sa prítomnosť proteínu RG1 v médiu stanovila Westem analýzou pomocou protilátok proti RG1. Stanovené množstvo proteínu RG1 bolo 1 pg/ml.
Príklad 4
Príprava protilátok
Pripravili sa králičie polyklonálne antiséra proti piatim syntetickým polypeptidovým sekvenciám odvodeným zo sekvencie proteínu RGL Tieto sekvencie sa vybrali podľa ich vopred odhadnutej polohy na povrchu proteínu, aby vytvorili antiséra, ktoré by ľahko rozpoznali povrchové epitopy. Na uľahčenie syntézy sa cysteínové zvyšky nahradili kyselinou aminobutánovou (Abu). Špecifické aminokyselinové sekvencie, ich poloha v proteíne RG1 a označenie všetkých piatich peptidov, sú uvedené ďalej.
Označen. | Poloha | Aminokyselinová sekvencia |
C | 28-46 | PLGGESICSAGAPAKYSIT (sekvencia SEQ ID NO: 8) |
2C | 46-64 | TFTGKWSQTAFPKQYPLFR (sekvencia SEQ ID NO: 9) |
3C | 77-91 | HSSDYSMWRKNQYVS (sekvencia SEQ ID NO: 10) |
4C | 188-210 | DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (sekvencia SEQ ID NO: 11) |
5C | 263-274 | NEIVDSASVPET (sekvencia SEQ ID NO: 12) |
Peptidy sa kovalentne viazali cez ďalší C-koncový cysteín na farbivo KLH (keyhole limpet hemocyanín), aby ich bolo možné využiť ako imunogény. Podobne sa pripravili konjugáty s bovinným sérovým albumínom (BSA) na analýzu titra antisér testom ELISA.
SK 288147 Β6
Každým peptidom sa imunizovali dve zvieratá. Počiatočné imunizácie sa uskutočnili vo Freundovom kompletnom adjuvans (0,5 mg/zviera) a následné podporné imunizácie sa uskutočňovali v trojtýždňových intervaloch pomocou dávky 0,25 mg/zviera vo Freundovom nekompletnom adjuvans intramuskuláme. Uskutočnili sa pravidelné odbery a titer protilátok proti špecifickým konjugátom BSA-peptid sa meral testom ELISA a porovnával sa s preimúnnym sérom. Dokázalo sa, že antiséra proti peptidom 1C a 3C sú aktívne. Antiséra proti peptidom 2C nerozpoznávali polypeptid RG1. Antiséra proti peptidom 4C a 5C sa testovali.
Ľudské monoklonálne protilátky proti RG1 sa pripravili imunizáciou transgénnych myší proti peptidom RG1 a fúznemu proteínu značenému 6-histidínovou značkou exprimovanému v E. coli. Splenocyty týchto zvierat sa fúzovali s myelómovými bunkami, čím vznikli hybridómové bunky. Výsledné hybridómy sa testovali testom ELISA, aby sa získali hybridómy produkujúce protilátky proti peptidom a proteínu RG1.
Príklad 5
Analýza protilátok metódou Western blot
Špecificita antisér pre RG1 sa testovala spôsobom Western blot. Antiséra špecifické pre RG1 (získané proti sekvenciám 1C a 3 C už uvedeným) sa testovali pomocou RG1 prechodne exprimovaného v bunkách COS, natívneho RG1 sekretovaného bunkami LNCaP a RG1 produkovaného bunkami BHK (baby hamster kidney cells). Antiséra špecifické pre RG1 sa ďalej testovali lyzátmi pripravenými z: nádorov LNCaP, buniek LNCaP, nádorov PC3, buniek PC3 a ďalších klinických vzoriek ľudských nádorov prostaty. Bunky a tkanivá sa lyžovali v detergentovom pufri. Po 5 min. povarenia sa 10 μΐ každého lyzátu nanieslo na 12 % SDS-polyakrylamidový gél na rozdelenie proteínov. Rozdelené proteíny potom sa preniesli na nitrocelulózovú membránu. Väzbová špecificita protilátok proti RG1 sa overila väzbou v prítomnosti homológnych a heterológnych proteínov. Pomocou antisér špecifických pre RG1 sa prítomnosť proteínov dokázala vo všetkých vzorkách okrem buniek PC-3 a nádorov PC-3.
Príklad 6
Purifikácia natívneho proteínu RG1 sekretovaného bunkami LNCaP
Analýza spôsobom Western blot dokázala, že bunky LNCaP sekretujú natívny protein RG1. Na purifikáciu natívneho proteínu sa bunky ponechali rásť počas 48 hodín v médiu bez séra. Toto médium bez séra sa potom odobralo a centrifúgovalo tak, aby sa odstránili všetky bunky, a približne 50x sa koncentrovalo ultrafiltráciou. Koncentrované médium sa potom lOx zriedilo 20 mM pufrom octanu sodného, pH 6,5 a nanieslo na kolónu na výmenu aniónov Q-Sepharose. Elúcia z kolóny sa uskutočnila gradientom chloridu sodného (0,5 % za min.), pričom sa odoberali 2,0 ml frakcie. Ako sa potvrdilo spôsobmi Western blot a SDS PAGE, frakcie obsahujúce protein RG1 sa vymyli pri koncentrácii približne 5 mM NaCI. Natívny protein RG1 sa pohybuje pri mierne nižších molekulových hmotnostiach než fúzny protein 6-histidín-RGl exprimovaný v baktériách, zrejme pretože neobsahuje fúzny peptid.
Príklad 7
Imunohistochemické farbenie expresie RG1
Expresia proteínu RG1 sa stanovila firmou LifeSpan Biosciences, Inc., v rôznych typoch ľudských tkanív ako sú obličky, pľúca, pankreas, svaly, mozog a prostata. Ďalšie tkanivá prostaty sa získali z Urologickej katedry lekárskej fakulty Stanfordovej univerzity a testovali sa v Berlex. Tkanivové rezy sa zbavili parafínu pomocou štandardných spôsobov. Polyklonálna protilátka RG1-3C sa použila ako primárna protilátka a ako detekčný systém sa použila súprava Vector ABC-AP (AK5002) so súpravou Vector red substráte (Sk5002). Ako negatívna kontrola sa uskutočnilo farbenie za neprítomnosti primárnej protilátky.
Všetky publikácie a patenty uvedené v opise sú v plnom rozsahu zahrnuté do opisu formou odkazu. Zatiaľ čo predkladaný vynález je opísaný s odkazom na špecifické uskutočnenia, odborníkovi je zrejmé, že je v ňom možné uskutočňovať rôzne zmeny a ekvivalentné nahradenia, bez toho, aby došlo k odchýleniu od vynálezeckej myšlienky a rozsahu tohto vynálezu. Navyše môže byť uskutočnené mnoho modifikácií na prispôsobenie sa určitej situácii, materiálu, zlúčeniny alebo látky, spôsobu, kroku či krokov určitého spôsobu na účely, zámer a rozsah tohto vynálezu. Všetky tieto modifikácie spadajú do rozsahu vynálezu vymedzeného pripojenými patentovými nárokmi.
Zoznam sekvencii <110> Harkins, Richard Parkes, Deborah Parry, Gordon Schneider, Douglas Steinbrecher, Renáte < 12 □ > DNA kódujúca polypeptid RG-1 <130> 51791ADSM1 <140>
<141>
<150> 60/172,370 <151> 1999-12-16 <160> 12 <17Q> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1785 <212> ONA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (2961..(1291) <400> 1 agaaaggggt gcggcagcac tgccagggga agagggtgat ccgacccggg gaaggtcgct 60 gggcagggcg agttgggaaa.gcggcagccc ccgccgcccc cgcagcccct tctcctcctt 120 tctcccacgt cctatctgcc tctegctgga ggccaggccg tgcagcatcg aagacaggag 180 gaactggagc ctcattggcc ggcccggggc gccggcctcg ggcttaaata ggagctccgg 240 gctctggctg ggacccgacc gctgccggcc gcgctcccgc tgctcctgcc gggtg atg 298
Met
gaa aac ccc | age ccg gcc gcc | gcc Ala | ctg ggc aag | gcc Ala | ctc tgc get Leu Cys Ala 15 | ctc Leu | 34 6 | |||||||||
Glu | Asn | Pro | Ser Pro 5 | Ala | Ala | Leu Gly 10 | Lys | |||||||||
ctc | ctg | gcc | act | ctc | ggc | gcc | gcc | ggc | cag | cct | ctt | ggg | gga | garg | tcc | 394 |
Leu | Leu | Ala | Thr | Leu | Gly | Ala | Ala | Gly | Gin | Pro | Leu | Gly | Gly | Glu. | Ser | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
atc | tgt | tcc | gcc | gga | gcc | ccg | gcc | aaa | tac | age | atc | acc | ttc | acg | ggc | 442 |
íle | Cys | Ser | Ala | Gly | Ala | Pro | Ala | Lys | Tyr | Ser | íle | Thr | Phe | Thr | Gly |
40 45
aag Lys 50 | tgg Trp | agc Ser | cag Gin | acg Thr | gcc ttc | ccc Pro | aag Lys | cag Gin | tac Tyr 60 | ccc Pro | ctg Leu | ttc Phe | cgc Arg | ccc Pro 65 | 4 90 | |
Ala 55 | Phe | |||||||||||||||
cct | gcg | cag | tgg | tct | tcg | ccg | ctg | ggg | gcc | gcg | cat | agc | tcc | gac | tac | 538 |
Pro | Ala | Gin | Trp | Ser 70 | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala 75 | Ala | His | Ser | Ser | Asp 80 | Tyr | |
agc | atg | tgg | agg | aag | aac | cag | tac | gtc | agt | aac | ggg | ctg | cgc | gac' | ttt | 586 |
Ser | Met | Trp | Arg 85 | Lys | Asn | Gin | Tyr | Val 90 | Ser | Asn | Gly | Leu | Arg 95 | Asp | Phe | |
gcg | gag | cgc | ggc | gag | gcc | tgg | gcg | ctg | atg | aag | gag | atc | gag | gcg | gcg | 634 |
Ala | Glu | Arg 100 | Gly | Glu | Ala | Trp | Ala 105 | Leu | Met | Lys | Glu | íle 110 | Glu | Ala | Ala | |
ggg | gag | gcg | ctg | cag | agc | gtg | cac | gcg | gtg | ttt | tcg | gcg | ccc | gcc | gtc | 682 |
Gly | Glu 115 | Ala | Leu | Gin | Ser | val 120 | His | Ala | val | Phe | Ser 125 | Ala | Pro | Ala | Val | |
ccc | agc | ggc | acc | ggg | cag | acg | tcg | gcg | gag | ctg | gag | gtg | cag | cgc | agg | 730 |
Pro 130 | Ser | Gly | Thr | Gly | Gin 135 | Thr | Ser | Ala | Glu | Leu 140 | Glu | Val | Gin | Arg | Arg 145 | |
cac | tcg | ctg | gtc | tcg | ttt | gtg | gtg | cgc | atc | gtg | ccc | agc | ccc | gac | tgg | 778 |
His | Ser | Leu | .Val | Ser 150 | Phe | Val | Val | Arg | íle 155 | Val | Pro | Ser | Pro | Asp 160 | Trp | |
ttc | gtg | ggc | gtg | gac | agc | ctg | gac | ctg | tgc | gac | ggg | gac | cgt | tgg | cgg | 826 |
Phe | val | Gly | Val 165 | Asp | Ser | Leu | Asp | Leu Π0 | Cys | Asp | Gly | Asp | Arg 175 | Trp | Arg | |
gaa | cag | gcg | gcg | ctg | gac | ctg | tac | ccc | tac | gac | gcc | ggg | acg | gac | agc | 874 |
Glu | Gin | Ala 180 | Ala | Leu | Asp | Leu | Tyr 185 | Pro | Tyr | Asp | Ala | Gly 190 | Thr | Asp | Ser | |
ggc | ttc | acc | ttc | tcc | tcc | ccc | aac | ttc | gcc | acc | atc | ccg | cag | gac | acg | 922 |
Gly | Phe 19S | Thr | Phe | Sex | Ser | Pro 200 | Asn | Phe | Ala | Thr | íle 205 | Pro | Gin | Asp | Thr | |
gtg | acc | gag | ata | acg | tcc | tcc | tct | ccc | agc | cac | ccg | gcc | aac | tcc | ttc | 970 |
Val 210 | Thr | Glu | Íle | Thr | Ser 215 | Ser | Ser | Pro | Ser | His 220 | Pro | Ala | Asn | Ser | Phe 225 | |
tac | tac | cca | cgg | ctg | aag | gcc | ctg | cct. | ccc | atc | gcc | agg | gtg | aca | ctg | 101E |
Tyr | Tyr | Pro | Arg | Leu 230 | Lys | Ala | Leu | Pro | Pro 235 | íle | Ala | Arg | Val | Thr 240 | Leu | |
gtg | cgg | ctg | ega | cag | agc | ccc | agg | gcc | ttc | atc | cct | ccc | gcc | cca | gtc | 1066 |
Val | Arg | Leu | Arg 245 | Gin | Ser | Pro | Arg | Ala 250 | Phe | íle | Pro | Pro | Ala 255 | Pro | Val | |
ctg | ccc | agc | agg | gac | aat | gag | att | gta | gac | agc | gcc | tca | gtt | cca | gaa | 1114 |
Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Asn | Glu | íle | Val | Asp | Ser | Ala | Ser | Val | Pro | Glu |
260 265 270 acg ccg ctg gac tgc gag gtc tcc ctg tgg tcg tcc tgg gga ctg tgc 1162
Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys
27S 280 285 gga ggc cac tgt ggg agg ctc ggg acc aag age agg act cgc tac gtc 1210
Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val
290 295 300 305 cgg gtc cag ccc gcc aac aac ggg age ccc tgc ccc gag ctc gaa gaa 1258
Arg Val Gin Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu
310 315 320 gag get gag tgc gtc cct gat aac tgc gtc taa gaccagagcc ccgcagcccc 1311 Glu Ala Glu Cýs Val Pro Asp Asn Cys Val
325 330 tggggccccc cggagecatg gggtgtcggg ggctcctgtg caggctcatg ctgcaggcgg 1371 ccgagggcac agggggtttc gcgctgctcc tgaccgcggt gaggccgcgc cgaccatctc 1431 tgcactgaag ggccctctgg tggccggcac gggcattggg aaacagcctc ctcctttccc 1491 aaccttgctt cttaggggcc cccgtgtccc gtctgctctc agcctcctcc tcctgcagga 1551 taaagtcatc cccaaggctc cagctactct aaattatgtc tccttataag ttattgctgc 1611 tecaggagat tgtcetteat cgtccagggg cctggctccc acgtggttgc agatacctca 1671 gacctggtgc tCCaggctgt gctgagccca ctctcccgag ggcgcatcca agcgggggcc 1731 acttgagaag tgaataaatg gggcggtttc ggaagcgtca aaaaaaaaaa aaaa 1785 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met 1 | Glu | Asn | Pro | Ser 5 | Pro | Ala | Ala | Ala | Leu 10 | Gly | Lys | Ala | Leu | Cys 15 | Ala |
Leu | Leu | Leu | Ala 20 | Thr | Leu | Gly | Ala | Ala 25 | Gly | Gin | Pro | Leu | Gly 30 | Gly | Glu |
Ser | íle | Cys 35 | Ser | Ala | Gly | Ala | Pro 40 | Ala | Lys | Tyr | Ser | íle 45 | Thr | Phe | Thr |
Gly | Lys 50 | Trp | Ser | Gin | Thr | Ala 55 | Phe | Pro | Lys | Gin | Tyr 60 | Pro | Leu | Phe | Arg |
Pro 65 | Pro | Ala | Gin | Trp | Ser 70 | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala 75 | Ala | Kis | Ser | Ser | Asp 80 |
Tyr | Ser | Met | Trp | Arg 85 | Lys | Asn | Gin | Tyr | Val 90 | Ser | Asn | Gly | Leu | Arg 95 | Asp |
SK 288147 Β6
Phe | Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys | Glu | íle 110 | Glu | Ala | ||||||||||
100 | 105 | ||||||||||||||
Ala | Gly | Glu | Ala | Leu | Gin | Ser | Val | His | Ala | Val | Phe | Ser | Ala | Pro | Ala |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Val | Pro | Ser | Gly | Thr | Gly | Gin | Thr | Ser | Ala | Glu | Leu | Glu | Val | Gin | Arg |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Arg | Kla | Ser | Leu | Val | Ser | Phe | Val | Val | Arg | íle | Val | Pro | Ser | Pro | Asp |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Trp | Phe | val | Gly | Val | Asp | Ser | Leu | Asp | Leu | Cys | Asp | Gly | Asp | Arg | Trp |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Arg | Glu | Gin | Ala | Ala | Leu | Asp | Leu | Tyr | Pro | Tyr | Asp | Ala | Gly | Thr | Asp |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Pro | Asn | Phe | Ala | Thr | íle | Pro | Gin | ASp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Thr | val | Thr | Glu | íle | Thr | Ser | Ser | Ser | Pro | Ser | His | Pro | Ala | Asn | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Tyr | Tyr | Pro | Arg | Leu | Lys | Ala | Leu | Pro | Pro | íle | Ala | Arg | Val | Thr |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Val | Arg | Leu | Arg | Gin | Ser | Pro | Arg | Ala | Phe | íle | Pro | Pro | Ala | Pro |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Leu | Pro | Ser | Arg | Asp | Asn | Glu | íle | Val | Asp | Ser | Ala | Ser | Val | Pro |
2 60 | 265 | 270 | |||||||||||||
Glu | Thr | Pro | Leu | Asp | Cys | Glu | Val | Ser | Leu | Trp | Ser | Ser | Trp | Gly | Leu |
27S | 280 | 285 | |||||||||||||
Cys | Gly | Gly | His | Cys | Gly | Arg | Leu | Gly | Thr | Lys | Ser | Arg | Thr | Arg | Tyr |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
val | Arg | Val | Gin | Pro | Ala | Asn | Asn | Gly | Ser | Pro | Cys | Pro | Glu | Leu | Glu |
305 | 310 | 315 | 3-20 | ||||||||||||
Glu | Glu | Ala | Glu | Cys | Val | Pro | Asp | Asn | Cys | Val | |||||
325 | 330 |
<210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: primér <400> 3 egegeatage tccgactac <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <220 Opis umelej sekvencie: primér <400> 4 gccgcgtccg caaag 15 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: sonda <400> 5 aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg 30 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213 > Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: primér <400 6 tccctctaga gccaccacgg aaaaccccag cccggc 36 <210? 7 <211> 35 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér <400> 7 aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg 35 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Umelá sekvencia
SK 288147 Β6 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <4oo> a
Pro Leu Gly Gly Glu Ser íle Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr 15 10 15
Ser íle Thr <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid2 <400> 9
Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro 15 10 15
Leu Phe Arg <210> 10 <21i> 15 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 10
His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser 15 10 15 <21O> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 11
Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala 15 10 15
Thr íle Pro Gly Asp Thr Val 20 <210> 12 <21I> 12 <212> P8T <213> Umelá sekvencia <22O>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 12
Asn Glu íle Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY5 1. Izolovaná protilátka alebo fragment protilátky, ktoré sa špecificky viažu na RG 1 polypetid, ako je uvedený v SEQ ID NO:
- 2, pričom protilátka sa špecificky viaže na člen zvolený zo skupiny pozostávajúcej z:a) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 77 až aminokyselinu 91 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2);b) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 263 až aminokyselinu 274 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2); na použitie ako liečivo.10 2. Protilátka na použitie ako v nároku 1, kde protilátkou je polyklonálna alebo monoklonálna protilátka.
- 3. Protilátka na použitie ako v niektorom z nárokov 1 alebo 2, kde fragment protilátky je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z Fv, F(ab') a F(ab')2 fragmentov.
- 4. Imunokonjugát obsahujúci izolovanú protilátku alebo fragment protilátky podľa nároku 1, 2 alebo 3, ktoré sa špecificky viažu na RG1 polypetid, ako je uvedený v SEQ ID NO: 2, pričom izolovaná protilátka15 alebo jej fragment sa špecificky viažu na člen zvolený zo skupiny pozostávajúcej z:a) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 77 až aminokyselinu 91 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2);b) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinu 263 až aminokyselinu 274 uvedené na obr. 2 (SEQ IN NO: 2); konjugované s terapeutickým činidlom, na použitie ako liečivo.
- 5. Imunokonjugát podľa nároku 4, kde terapeutickým činidlom je cytotoxické činidlo.20 6. Imunokonjugát podľa nároku 5, kde cytotoxické činidlo je zvolené zo skupiny pozostávajúcej z ricínu, doxorubicínu, daunorubicínu, taxolu, etídiumbromidu, mitomycínu, etoposidu, tenoposidu, vinkristínu, vinblastínu, kolchicínu, dihydroxyantracíndiónu, aktinomycínu D, difterického toxínu, Pseudomonas exotoxínu (PE) A, PE40, abrinu, glukokortikoidu a rádioizotopov.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US17237099P | 1999-12-16 | 1999-12-16 | |
US09/732,357 US6682902B2 (en) | 1999-12-16 | 2000-12-07 | DNA encoding a novel RG1 polypeptide |
PCT/US2000/033901 WO2001044291A2 (en) | 1999-12-16 | 2000-12-15 | Polynucleotid encoding the rg1 polypeptide |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK288147B6 true SK288147B6 (sk) | 2013-12-02 |
Family
ID=26868022
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK848-2002A SK286384B6 (sk) | 1999-12-16 | 2000-12-15 | Izolované protilátky alebo fragmenty protilátok špecificky viažucich polypeptidy RG1, ich imunokonjugát a ich použitie |
SK5055-2008A SK288147B6 (sk) | 1999-12-16 | 2000-12-15 | Isolated antibody or antibody fragment, which specifically bind to RG1 polypeptide, and immunoconjugate |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK848-2002A SK286384B6 (sk) | 1999-12-16 | 2000-12-15 | Izolované protilátky alebo fragmenty protilátok špecificky viažucich polypeptidy RG1, ich imunokonjugát a ich použitie |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6682902B2 (sk) |
EP (2) | EP2048157B1 (sk) |
JP (1) | JP4979867B2 (sk) |
KR (1) | KR100752434B1 (sk) |
CN (1) | CN1297566C (sk) |
AT (1) | ATE440862T1 (sk) |
AU (1) | AU784674B2 (sk) |
BG (1) | BG65898B1 (sk) |
BR (1) | BR0017022A (sk) |
CA (1) | CA2394574A1 (sk) |
CZ (1) | CZ299232B6 (sk) |
DE (1) | DE60042836D1 (sk) |
DK (1) | DK1237915T3 (sk) |
EE (1) | EE05293B1 (sk) |
ES (1) | ES2331106T3 (sk) |
HR (1) | HRP20020549B1 (sk) |
HU (1) | HU229001B1 (sk) |
IL (2) | IL150115A0 (sk) |
LT (1) | LT5046B (sk) |
ME (1) | MEP37808A (sk) |
MX (1) | MXPA02005914A (sk) |
NO (1) | NO330924B1 (sk) |
NZ (1) | NZ519598A (sk) |
PL (1) | PL207634B1 (sk) |
PT (1) | PT1237915E (sk) |
RO (1) | RO122543B1 (sk) |
RS (1) | RS50831B (sk) |
RU (1) | RU2283130C2 (sk) |
SI (2) | SI21140A (sk) |
SK (2) | SK286384B6 (sk) |
WO (1) | WO2001044291A2 (sk) |
ZA (1) | ZA200205638B (sk) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020161199A1 (en) * | 1998-04-08 | 2002-10-31 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
NZ528700A (en) * | 1998-04-08 | 2005-02-25 | Genentech Inc | Novel PRO866 polypeptides and nucleic acids with homology to mindin and spondin proteins |
US6960433B1 (en) | 1998-10-19 | 2005-11-01 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer |
US20070031901A1 (en) * | 1999-03-08 | 2007-02-08 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
US6682902B2 (en) * | 1999-12-16 | 2004-01-27 | Schering Aktiengesellschaft | DNA encoding a novel RG1 polypeptide |
TWI353992B (en) | 2003-07-22 | 2011-12-11 | Schering Ag | Rg1 antibodies and uses thereof |
US7294704B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-11-13 | Diadexus, Inc. | Pro108 antibody compositions and methods of use and use of Pro108 to assess cancer risk |
US7785591B2 (en) | 2004-10-14 | 2010-08-31 | Morphosys Ag | Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies |
TWI610939B (zh) * | 2007-02-21 | 2018-01-11 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗 |
AR069746A1 (es) * | 2007-11-30 | 2010-02-17 | Medarex Inc | Conjugados de anticuerpos anti- rg-1 |
TW201008574A (en) | 2008-08-19 | 2010-03-01 | Oncotherapy Science Inc | INHBB epitope peptides and vaccines containing the same |
CN102346184B (zh) * | 2010-08-03 | 2014-03-26 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | Spon2的新用途 |
DE102012016127A1 (de) | 2011-08-31 | 2013-02-28 | Daniel Elias | Bioaktive, regenerative Mischung zur Herstellung eines Ergänzungsnahrungsmittels |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4657760A (en) | 1979-03-20 | 1987-04-14 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US5206344A (en) | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US4831175A (en) * | 1986-09-05 | 1989-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate |
US5246692A (en) * | 1986-09-05 | 1993-09-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate |
US4987071A (en) | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
US5399493A (en) | 1989-06-15 | 1995-03-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures |
US5437994A (en) | 1989-06-15 | 1995-08-01 | Regents Of The University Of Michigan | Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells |
US5225212A (en) | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
US6150584A (en) * | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
DK0814159T3 (da) | 1990-08-29 | 2005-10-24 | Genpharm Int | Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
CA2135499A1 (en) | 1992-05-14 | 1993-11-25 | James D. Thompson | Method and reagent for inhibiting cancer development |
US5871969A (en) | 1996-02-12 | 1999-02-16 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids encoding human neuronal attachment factor-1 |
US5804382A (en) | 1996-05-10 | 1998-09-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for identifying differentially expressed genes and differences between genomic nucleic acid sequences |
US6287777B1 (en) | 1996-05-10 | 2001-09-11 | Beth Israel Deaconess Medical Center | NPG-1 gene that is differentially expressed in prostate tumors |
US6177244B1 (en) | 1996-05-10 | 2001-01-23 | Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. | NPG-1 gene that is differentially expressed in prostate tumors |
JP3494529B2 (ja) * | 1996-06-06 | 2004-02-09 | Ykk株式会社 | 一体成形面ファスナー |
US6432636B1 (en) * | 1996-08-26 | 2002-08-13 | University Of Washington | Diagnostic applications of perlecan domain I splice variants |
AU6961398A (en) | 1997-04-10 | 1998-10-30 | Zymogenetics Inc. | Secreted f-spondin homologs |
JP2002529046A (ja) * | 1997-05-06 | 2002-09-03 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ,インコーポレイテッド | Enterococcus faecalisのポリヌクレオチドおよびポリペプチド |
WO1998050073A1 (en) | 1997-05-09 | 1998-11-12 | Smithkline Beecham Corporation | Integrin ligand, human mindin |
PT1490386E (pt) | 1998-03-10 | 2008-11-24 | Genentech Inc | Novos polipéptidos e ácidos nucleicos que os codificam |
US6166176A (en) * | 1998-03-17 | 2000-12-26 | Immvarx, Inc. | Cancer marker protein and peptides thereof |
JP2002527757A (ja) * | 1998-10-19 | 2002-08-27 | ダイアデクスアス・インコーポレーテッド | 前立腺癌を診断、監視、病期分類、イメージング及び治療する方法 |
US6960433B1 (en) * | 1998-10-19 | 2005-11-01 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer |
US6682736B1 (en) * | 1998-12-23 | 2004-01-27 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
US6824780B1 (en) * | 1999-10-29 | 2004-11-30 | Genentech, Inc. | Anti-tumor antibody compositions and methods of use |
US6682902B2 (en) | 1999-12-16 | 2004-01-27 | Schering Aktiengesellschaft | DNA encoding a novel RG1 polypeptide |
-
2000
- 2000-12-07 US US09/732,357 patent/US6682902B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 EP EP08163898A patent/EP2048157B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-15 EP EP00990937A patent/EP1237915B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-15 PT PT00990937T patent/PT1237915E/pt unknown
- 2000-12-15 IL IL15011500A patent/IL150115A0/xx unknown
- 2000-12-15 DE DE60042836T patent/DE60042836D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-15 RU RU2002119208/15A patent/RU2283130C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 SK SK848-2002A patent/SK286384B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 CN CNB008190518A patent/CN1297566C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 MX MXPA02005914A patent/MXPA02005914A/es active IP Right Grant
- 2000-12-15 JP JP2001544779A patent/JP4979867B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 SI SI200020058A patent/SI21140A/sl not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 SK SK5055-2008A patent/SK288147B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 ME MEP-378/08A patent/MEP37808A/xx unknown
- 2000-12-15 WO PCT/US2000/033901 patent/WO2001044291A2/en active Application Filing
- 2000-12-15 EE EEP200200323A patent/EE05293B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 ES ES00990937T patent/ES2331106T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-15 DK DK00990937T patent/DK1237915T3/da active
- 2000-12-15 RS YUP-446/02A patent/RS50831B/sr unknown
- 2000-12-15 NZ NZ519598A patent/NZ519598A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 KR KR1020027007708A patent/KR100752434B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 SI SI200031038T patent/SI1237915T1/sl unknown
- 2000-12-15 HU HU0204224A patent/HU229001B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 RO ROA200200857A patent/RO122543B1/ro unknown
- 2000-12-15 AT AT00990937T patent/ATE440862T1/de active
- 2000-12-15 BR BR0017022-4A patent/BR0017022A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-12-15 CZ CZ20022037A patent/CZ299232B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 PL PL356220A patent/PL207634B1/pl unknown
- 2000-12-15 CA CA002394574A patent/CA2394574A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-15 AU AU30746/01A patent/AU784674B2/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-06-10 IL IL150115A patent/IL150115A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-13 BG BG106823A patent/BG65898B1/bg unknown
- 2002-06-14 NO NO20022836A patent/NO330924B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-06-24 LT LT2002070A patent/LT5046B/lt not_active IP Right Cessation
- 2002-06-24 HR HRP20020549AA patent/HRP20020549B1/hr not_active IP Right Cessation
- 2002-07-15 ZA ZA200205638A patent/ZA200205638B/xx unknown
-
2003
- 2003-07-08 US US10/616,279 patent/US7307154B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-22 US US10/624,884 patent/US20040152139A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-30 US US11/981,132 patent/US7893217B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-30 US US11/981,240 patent/US7887804B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7893217B2 (en) | Isolated human antibodies that bind epitopes on RG1 | |
JP2002521055A (ja) | 98個のヒト分泌タンパク質 | |
JP2009131263A (ja) | 50個のヒト分泌タンパク質 | |
EP2070949A2 (en) | Gene differentially expressed in breast and bladder cancer and encoded polypeptides | |
JP2002512521A (ja) | 32個のヒト分泌タンパク質 | |
AU2008200628A1 (en) | Nucleic acid and corresponding protein entitled 24P4C12 useful in treatment and detection of cancer | |
US20020009455A1 (en) | DNA encoding a novel PROST 03 polypeptide | |
EP1234037A2 (en) | DNA ENCODING A NOVEL PROST-Ets POLYPEPTIDE | |
EP1220931A1 (en) | Dna encoding prost 07 polypeptide |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20141215 |