JP7010520B2 - 胆道細胞でメチオニル-tRNA合成酵素を利用した胆道癌の診断方法 - Google Patents
胆道細胞でメチオニル-tRNA合成酵素を利用した胆道癌の診断方法 Download PDFInfo
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Description
[技術課題]
これに本発明者らは、細胞水準でも正確に胆道癌を診断できる方法を研究する中で、組織検査だけでなく、細胞診(cytodiagnosis)においてMRSをマーカーとして利用する場合に、胆道癌の確定判定において感度及び予測度がほとんど100%の水準に表われるだけでなく、特に異型細胞(atypical cell)についても癌細胞と正確に区別することを確認して、本発明を完成した。
(a)潜在患者から採取した胆道試料から(methionyl-tRNA synthetase)tRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加したら胆道癌患者であると判断する段階。
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、(methionyl-tRNA synthetase)tRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むことを特徴とする補助療法を、追加して実行することを特徴とする、胆道癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供することである。
前記のような目的を達成するために、本発明は、
メチオニルtRNA合成酵素(methoionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胆道癌診断用組成物及びこれを含む胆道癌診断用キットを提供する。
胆道癌の診断に必要な情報を提供するために、潜在的な患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素タンパク質を定性又は定量分析する方法を提供する。
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階。
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むことを特徴とする補助療法を、追加して実行することを特徴とする、胆道癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位1(CDR1)と;配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位2(CDR2)と;配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位3(CDR3)とを含む軽鎖可変領域、及び
配列番号8示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位1(CDR1)と;配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位2(CDR2)と;配列番号12で示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位3(CDR3)とを含む軽鎖可変領域を含むものでもある。
(a)潜在患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むものでもある。
(i)潜在患者から採取した胆道細胞を、細胞核を染色するDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、メチレンブルー(methylene blue)、酢酸カーミン(acetocarmine)、トルイジンブルー(toluidine blue)、ヘマトキシリン(hematoxylin)及びヘキスト(Hoechst)からなる群から選択される1以上の染色溶液と、
細胞質を染色するエオシン(eosin)、クリスタルバイオレット(crystal violet)及びオレンジG(orange G)からなる群から選択される1以上の染色溶液とで細胞を染色する段階;及び
(ii)前記細胞染色により、胆道細胞を、悪性腫瘍細胞、異型細胞(atypical cell)、又は正常細胞に判別する段階をさらに含むことを特徴とする方法。
から、胆道細胞を悪性腫瘍細胞、異型細胞又は正常細胞に判別することは、好ましくも、下記の同じ基準により行われるものでもある:
細胞が3次元で塗抹される;細胞核/細胞質比率(N/c ratio、Nuclear to cytoplasmic ratio)が高い;染色質の凝集現象出現;粗い形状の核膜(核膜の不規則な程度が大きくなる);核小体の出現;及び有糸分裂(mitosis)の出現からなる群から選択される2以上の形態学的異常を示す場合に悪性細胞と判定し、
細胞が一重で塗抹されて、細胞核/細胞質比(N/C ratio)が小さく、核膜が滑らかな形状の場合には、正常細胞に判定して、
細胞の変化が悪性細胞には及ばないが、正常細胞(benign 含む)に判定することができない場合、異型細胞(atypical cell)に判定。
胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、下記段階を含むことを特徴とする、感度及び特異度を向上させる方法を提供する:
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階。
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むことを特徴とする補助療法を、追加して遂行することを特徴とする、胆道癌診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
本願発明の胆道癌検査に対する有用抗体作製(MRSの特異性が高い抗体の収得)
生体内でのMRS(methionyl-tRNA synthetase)は、AIMP3(Aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein3)と結合された状態で存在し、UV照射などによって、これらの結合状態が分離されることが分かった。従って、実質的にMRSの正確な検出のためには、MRSがAIMP3と結合している状態などの状況でも、MRSだけを特異的に検出する必要があるが、現在、AIMP類及びARS類には、タンパク質構造上類似した点が多く、市販の抗体の場合、他のAIMP類及びARS類と交差反応性が表われる問題点がある。これに、本発明の胆道癌検査法の診断正確度のために、本発明者は、他のタンパク質には交差反応性がない高感度のMRS抗体を、以下のような方法で製造した。
大腸菌(E.coli)からMRS-AIMP3共精製(co-purified)タンパク質を発現及び精製し、具体的な実験方法は以下の通りである。BL21DE3株(strain)を利用して、MRS(配列番号1)とAIMP3(配列番号21、NCBI ref. NM_004280.4)とが発現するように形質転換し、LB培地で培養した後、単一コロニーをアンピシリン(ampicilin)を含む5ml LB液体培地でOD600の値が0.6乃至0.8になるように培養した。その後、1mMのIPTGを入れた後、37℃で3時間培養し、その後10分間遠心分離して細胞だけを獲得した。細胞液でSDS-PAGEを実施して、クマシー溶液(coomassie stain)を利用して、前記タンパク質の発現を確認した。その後、IPTGで過発現を誘導した細胞液を集めて遠心分離を実施して、細胞を獲得した。1ml DPBSで細胞を溶解した後、超音波破砕機を利用して細胞を溶解し、その後溶解された細胞で遠心分離を行い、MRS-AIMP3共精製タンパク質を分離した。
ハイブリドーマ細胞の製造に必要な免疫化されたマウスを得るために、前記実施例1-1で得られたMRS-AIMP3共精製タンパク質を、8~10週齢のマウス4匹の腹腔内に1次注射した。体重25乃至30gの10週齢BALB/cマウスをOrient Bio Co. (Sungnam、KyungKiDo、Republic of Korea)から購入し、動物舎の一定した条件(温度:20±2℃、湿度:40~60%、コントラスト:12時間明暗周期)の下で十分に適応させた後で本研究に利用した。動物実験は、ソウル大学の大学動物管理及び使用委員会の指針を遵守した。
まず、細胞融合のために骨髄腫細胞を準備した。骨髄腫細胞を培養して、細胞密度を2.5~5×104 cell/mlにした。細胞融合の24時間前に、骨髄腫細胞を3分の1に希釈して準備した。前記実施例1-2で免疫化されたマウスをエーテルで麻酔させて、脾臓を採取してB細胞を分離した後、SF-DMEM2(DMEM+2×AA)で洗浄して細胞を溶出させた。細胞懸濁液を回収してチューブに詰めて静置させ、重い塊を沈めて、上澄み液を新しいチューブに移した後、1500rpmで5分間遠心分離した。遠心分離された脾臓細胞の上澄み液を除去し、タッピング(tapping)した後、SF-DMEM2を満たした。B細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ遠心分離して洗浄した後、洗浄工程を1回繰り返した。洗浄した骨髄腫細胞の上澄み液を除去してタッピングした後、SF-DMEM2を満たした。また、洗浄したB細胞の上澄み液を除去してタッピングした後、LB(lysis buffer)1 mlに赤血球(RBC、red blood cell)を入れて処理した後、SF-DMEM2を満たした。その後、B細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ遠心分離して、遠心分離されたB細胞と骨髄腫細胞の上澄み液を除去した後、タッピングしてSF-DMEM2 10mlを満たした。B細胞と骨髄腫細胞をそれぞれe-チューブで100倍に希釈して、計数して濃度を決定した。B細胞と骨髄腫細胞は、10:1の比率に決定した[B細胞の濃度(1×108、8×107、5×107)、骨髄腫細胞の濃度(1×107、8×106、5×106)]。決定された濃度のB細胞と骨髄腫細胞とをチューブに一緒に入れて遠心分離した。遠心分離された細胞の上澄み液を除去した後、アルコール綿の上に伏せておいて、30秒~1分間半乾燥させてタッピングした。ここでPEG(2ml)を1分間徐々に入れながらピペッティングして反応させ、SF-DMEM2を入れながらチューブを振った後、遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を除去してタッピングしていない状態で、HT培地[HT50×(HT(sigma) 1 vial+SF-DMEM1 10ml) 1ml、FBS 10ml、SF-DMEM1(DMEM +1×AA)30ml]を滴下して、少しずつ速度を上げながら50mlになるようにした。この懸濁液を再び37℃、5%CO2培養器で3時間培養した。
前記実施例1-3で製造した融合細胞群の中で、MRSをよく認識しながら、AIMP3を認識しない細胞を選別して、抗体を生成するか否かを確認するために、次のように実験を実施した。
MRSに対するモノクローナル抗体は、前記の実施例1-4で選択された最終的な融合細胞(ハイブリドーマ細胞“8A12”)から、それぞれ次の二つの方法を通じて得ることができる。
8A12クローン発現抗体のクローニング及び配列分析は、YBIO inc、及びアブクローン(Abclon Inc. Korea)に依頼して行った。簡単に、まず8A12ハイブリドーマ細胞からRNAを抽出してcDNAを合成した。その後、それぞれVL、CL、VH及びCH1に特異的なプライマーを使用してPCRを行った。予想される大きさのPCR産物(product)をアガロースゲル(agarose gel)で精製してシーケンシング(sequencing)を通じて配列を確認し、Kabatナンバリング(numbering)を通じてCDR領域(region)を確認した。抗原結合部位の配列確認の結果を表1に示す。確認された配列でFabを合成して、MRSに高い結合力を示すことをELISAで確認した。
前記実施例で獲得した8A12抗体のMRS結合能力を確認するために、次のように実験を行った。H460細胞を、10%FBS(Fetal bovine serum、Hyclone、GE lifesciences)、1%ペニシリン(Hyclone、GE lifesciences)を含むDMEM(Hyclone、GE lifesciences)培地で培養した。各細胞は、5%CO2、37℃の条件で培養した。前記培養されたH460細胞にsi-MRSを72時間処理した。その後H460細胞を収得した後、溶解させ、H460細胞溶解度でウエスタンブロットを実施した。実験は2回繰り返えされた。1次抗体として8A12抗体を1:5000(0.2μg/ml)で希釈して使用し、結合能力比較のために市販の流通しているMRS抗体(Abcam、Ab50793)を同じ方法で使用し、対照群にはチューピュリン(Tublin)を使用した。
前記実施例で獲得した8A12抗体が他のARS(aminoacyl-tRNA synthetase)タンパク質に対する交差活性(cross activity)があるか否かを確認するために、次のように実験を実施した。
8A12抗体のMRS特異的親和性を確認するために、MRS-AIMP3共精製タンパク質(以下、MRS+AIMP3タンパク質)及びAIMP3タンパク質を利用して、SPR(Surface plasmon resonance、表面プラズモン共鳴)の実験を実施した。MRS+AIMP3又はAIMP3タンパク質をCM5チップ(chip)にコーティングして、8A12抗体を多様な濃度で流しながら、タンパク質との結合反応の程度を測定した。分析試料やバッファは30μl/minの流速で8分間注入して20分間洗浄した。
前記8A12抗体が結合する部位(エピトープ)を確認するために、次のように実験を実施した。
細胞診検査における胆道癌細胞特異的MRS発現検出法の確立及び効果確認
1)検体を、通常的なブラシ細胞診検査方法(Osnes M, Serck-Hanssen A, Myren J. Scand J Gastroenterol. 1975;10(8): 829-31.)に基づいて収得した。具体的には、GRBH-230-3-3.5ブラシ(Wilson-Cook Medical, Inc., Winston-Salem, NC)を用いて胆管ブラッシング(Bile duct brushing)を行った。ブラシは、病変部位を横切って5-8回程度往復運動(to-and-fro movement)した。その後、前記ブラシをロズウェルパーク記念研究所培地(Roswel Park Memorial Institute (RPMI))1640(GibcoBRL、Rockville、MA、USA)培地で洗浄した後、液状ベース細胞学検査(Thinprep)のために、すぐに細胞学研究室に移動された。前記ブラシ(brush)をThinPrep固定液(PreservvCyt solution)に振って胆道細胞を遊離させ、このように得られた検体(胆道細胞)をThinPrep(Hologic.Inc)を利用して、通常的な方法でThinPrepスライドに塗抹して、細胞試料を準備した。これらの細胞試料は、それぞれ下記の検査法を適用して結果が比較された。
i) D.W洗浄(washing) 2回
ii) 前処理:2%ヤギ正常血清(Normal goat serum)、0.1%Tween-20及び0.09%アジ化ナトリウム(sodium azide)を含むPBSで室温で1時間反応(インキュベーション)
iii) 1次抗体処理:MRS抗体を2μg/mlの濃度で、PBS(0.1% BSA、0.09% sodium azideを含む)に希釈して、室温で1時間反応させて、本実験では、MRS抗体として配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖を有するMRS抗体(8A12抗体)を使用する
iv) 1x洗浄溶液(washing solution)TBST(1XTBS with 0.01% Tween-20)で2回洗浄
v) 発色:2次抗体(Goat-anti-mouse IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(Thermo、cat#A11001))を1:100でPBS(0.1% BSA、0.09% sodium azideを含む)に希釈して、室温で1時間反応
vi) 1x洗浄溶液(washing solution)TBST(1X TBS with 0.01% Tween-20)で2回洗浄
vii) DAPI(Invitrogen P36931)適用後、カバーガラスで覆う
生検組織検査における胆道癌細胞特異的MRS発現検出法の確立及び効果確認
胆道癌組織と正常胆道組織(癌ではない良性(benign)胆道狭窄組織を含む)でのMRSの発現水準を測定するための免疫組織化学法(immunohistochemistry、IHC)を、下記の通り開発した。具体的には、55個の未知の胆道生検組織に対して、一般的にパラフィン包埋して薄切される。その後、次のような順序で処理して最終標本を得た:
i) 薄切組織を24時間キシレンに浸しておく→100%アルコールで2分間2回処理→95%アルコールで2分間1回処理→90%アルコールで2分間1回処理→70%アルコールで2分間1回処理→DWで洗浄(washing)2-3回
ii) 抗原賦活化(Antigen retrieval):市販クエン酸バッファー(citrate buffer)で希釈(DW9: citrate buffer 1)し、2分間予熱(preheating)後、スライドに入れて10分間加熱(電子レンジ)
iii) 加熱後すぐに水道水に2回浸して冷却(cooling)し、1TBSTで5分間3回洗浄
iv) 0.3% H2O2を室温で10分処理→ブロッキング(Blocking)を(2% goat serum+2% BSA、1PBS base)室温で30分
v) 1次抗体(Primary Antibody)(MRS抗体)1:500の割合で希釈処理し、室温で終夜(overnight)→1TBSTで5分間3回洗浄。本実験では、MRS抗体として配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖を有するMRS抗体を使用する。
vi) HRP(2次抗体(secondary antibody))適用後、室温で30分処理→1TBSTで5分間3回洗浄
vii) DABで1分間処理、発色後DWで洗浄2-3回→ヘマトキシリンで3分間処理、発色後DWで洗浄2-3回
viii) 70%アルコールで2分間1回処理→90%アルコールで2分間1回処理→95%アルコールで2分間1回処理→100%アルコールで2分間2回処理→キシレンで5分間3回処理
ix) マウントソリューション適用後、カバーガラスで覆う
Claims (22)
- メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、胆道癌診断用組成物。
- 前記メチオニルtRNA合成酵素タンパク質は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1記載の組成物。
- 前記製剤は、メチオニルtRNA合成酵素タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーであることを特徴とする、請求項1記載の組成物。
- メチオニルtRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、胆道癌診断用キット。
- 胆道癌診断に必要な情報を提供するために、潜在患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素タンパク質を定性又は定量分析する方法。
- 前記方法は、
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階で、正常の対照群と比較して、メチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階
を含む、請求項5記載の方法。 - 前記試料は、胆道細胞であることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 前記方法は、前記(a)段階以前に、前記(a)段階と同時に、又は前記(a)段階以後に、下記段階を追加的に含むことを特徴とする、請求項6記載の方法:
(i)潜在患者から採取した胆道細胞を、
細胞核を染色するDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、メチレンブルー(methylene blue)、酢酸カーミン(acetocarmine)、トルイジンブルー(toluidine blue)、ヘマトキシリン(hematoxylin)及びヘキスト(Hoechst)からなる群から選択される1以上の染色溶液と、
細胞質を染色するエオシン(eosin)、クリスタルバイオレット(crystal violet)及びオレンジG(orange G)からなる群から選択される1以上の染色溶液とで細胞染色する段階;及び
(ii)前記細胞染色により、胆道細胞を、悪性腫瘍細胞、異型細胞(atypical cell)、又は正常細胞に判別する段階。 - 前記胆道細胞は、ブラシ細胞診の方法で得られた胆道細胞であることを特徴とする、請求項7又は8記載の方法。
- 前記タンパク質の発現水準を測定する方法は、ウエスタンブロット、ELISA、放射線免疫分析、放射線免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫染色法、免疫沈降分析法、補体固定分析法、FACS又はタンパク質チップ方法のうちいずれか一つを利用することを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 前記抗体は、MRSの配列番号20で示されるアミノ酸配列を含む領域のエピトープ(epitope)に特異的に結合することを特徴とする抗体又はその機能的断片であることを特徴とする、請求項3記載の組成物。
- 前記抗体は、配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);及び
配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)を含むことを特徴とする、請求項11記載の組成物。 - 前記(ii)段階は、正常な胆道細胞と比較して、前記(i)段階の細胞染色の結果から、細胞が3次元で塗抹される;細胞核/細胞質比率(N/C ratio)が高い;染色質の凝集現象出現;粗い形状の核膜;核小体の出現;及び有糸分裂(mitosis)の出現からなる群から選択される2以上の形態学的異常を示す場合に悪性細胞に判定することを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、下記段階を含むことを特徴とする、従来の細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査と比較して感度及び特異度を向上させる方法:
(a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階で、正常の対照群と比較して、メチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階。 - 前記感度及び特異度が、90%以上であることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 前記細胞診検査は、ブラシ細胞診検査であることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、形態学的検査と併用して、
(a)潜在患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
(b)前記(a)段階で、正常の対照群と比較して、メチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を遂行することを特徴とする、胆道癌診断に必要な情報を提供する方法。 - 前記(a)段階及び前記(b)段階は、形態学的検査と同時に(simultaneous)、別途に(separate)、又は順次的に(sequential)遂行されることを特徴とする、請求項17記載の胆道癌診断に必要な情報を提供する方法。
- 前記形態学的検査は、細胞の群集性;細胞核/細胞質比率(N/C ratio);核膜の形状;染色質の凝集現象;核内核小体の出現;及び有糸分裂(mitosis)の出現からなる群から選択される1以上を検査することを特徴とする、請求項17又は18記載の胆道癌診断に必要な情報を提供する方法。
- 前記製剤は、メチオニルtRNA合成酵素mRNAに特異的に結合するプライマー又はプローブであることを特徴とする、請求項1記載の組成物。
- 胆道癌の診断用製剤を製造するための、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤の使用。
- 被検体(ヒトを除く)試料内のメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定することを特徴とする胆道癌の診断方法。
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