JP2012237685A - 新規胆道癌バイオマーカー - Google Patents

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Abstract

【課題】胆道癌を特異的に検出するための方法等の胆道癌マーカーの使用方法を提供すること。
【解決手段】ステージＩ及びIVの胆道癌組織、及び対象となる非癌部胆道組織から、タンパク質を抽出して可溶化し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、それぞれの組織において発現するタンパク質を同定した。次に、スペクトラム・カウンティング解析により、胆道癌組織において発現が増加する１６０種類のタンパク質を同定し、さらに、遺伝子オントロジー解析により、上記１６０種類のタンパク質の中から、７７種類のタンパク質を胆道癌マーカータンパク質候補として選択した。上記７７種類のタンパク質と、これまでの報告から胆道癌マーカー候補と考えられる１７種類のタンパク質とを、ＳＲＭ法により定量し、最終的に、３５種類の胆道癌マーカータンパク質を同定した。これらの胆道癌マーカータンパク質を用いることによって、胆道癌を特異的に検出することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、胆道組織における胆道癌の有無を判定する方法や、該方法に用いるための胆道癌マーカーに関する。
胆道とは肝臓で作られた胆汁の通り道であり、胆道にできる悪性腫瘍を総称して胆道癌という。日本国内における癌の部位別死亡者数では、胆道癌は第６位となっており、さらに、その死亡／罹患比は、この数十年間でほとんど改善されていないことから、消化器系悪性腫瘍の中で最も予後不良な癌のひとつであると考えられている（図１）。また、胆道癌は、早期には自覚症状がないため発見が困難な癌として知られている。
現在のところ、胆道癌の診断用マーカーとして、癌胎児性抗原ＣＥＡや糖鎖抗原ＣＡ１９−９が知られているが、これらはいずれも胆道癌に特異的なマーカーではなく、また、胆道癌の早期診断には有効でないと考えられている。実際、ＣＥＡは胆道癌だけでなく、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌を有する患者の血清中でも増加することが報告されており（非特許文献１）、さらに、ＣＥＡは、初期の癌患者の血清中では増加しないことから（非特許文献２〜４）、癌の早期診断には有効ではないと考えられている（非特許文献５）。ＣＥＡと同様に、ＣＡ１９−９は、消化系の癌、特に膵臓がんに特異性の高い腫瘍マーカーであり、胆道癌を特異的に検出するために適当なマーカーとは言えない。また、初期の癌の場合、ＣＡ１９−９の顕著な発現の変動は認められないことから、癌の早期発見には利用できない。以上のように、胆道癌を特異的に検出するためのマーカーや、胆道癌の早期診断のためのマーカーは未だ存在しておらず、その開発が急がれている。
他方、ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed paraffin embedded）は、手術等で摘出された組織を保存するための最も一般的な方法であり、多くの病院や研究機関では、病理診断等を行った後のホルマリン固定パラフィン包埋組織（以下、「ＦＦＰＥ組織」という場合がある）が大量に保存されている。これらのＦＦＰＥ組織は、患者の治療成績・予後等臨床情報が明らかであることから、バイオマーカー検索や創薬ターゲット探索のために非常に有効であると考えられている。しかし、ＦＦＰＥ組織では、ホルマリン固定よって組織内のタンパク質が架橋されているため、タンパク質を抽出することは困難であり、さらに、ホルマリン固定によって高分子が断片化されていることから、ＦＦＰＥ組織を、プロテオーム解析に用いることは不可能であると考えられていた。しかし、ごく最近になり、ＦＦＰＥ組織からのタンパク抽出法が開発され（特許文献１及び２）、ＦＦＰＥ組織を用いたプロテオーム解析が可能になりつつある。
特許第４５７９２３４号公報 特表２０１０−５３０９８０号公報
J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57: 11-22 (1976) Dis. Colon. Rectum. 42: 921-929 (1999) Ann. Surg. 183: 5-9 (1976) N. Engl. J. Med. 299: 448-451 (1978) Clin. Chem. 48: 1151-1159 (2002)
本発明の課題は、胆道癌を特異的に検出するための方法等の胆道癌マーカーの使用方法を提供することにある。
本発明者らは、ステージＩ及びステージIVのＦＦＰＥ胆道癌組織、及び対象となるＦＦＰＥ非癌部胆道組織から、タンパク質を抽出して可溶化し、それぞれの組織において発現するタンパク質を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。次に、スペクトラルカウント解析により、胆道癌組織において発現が増加している１６０種類のタンパク質を同定し、さらに、遺伝子オントロジー解析により、前記１６０種類のタンパク質の中から、胆道癌マーカータンパク質候補となる７７種類のタンパク質を抽出した。前記７７種類のタンパク質に、これまでの報告から胆道癌マーカー候補と考えられる１７種類のタンパク質と１種類の内部標準タンパク質を加えて、合計９５種類のタンパク質を選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により定量した。ＳＲＭ法の結果から、胆道癌組織において、非癌部胆道組織と比較して、発現量が２倍以上増加、又は、半分以下に減少しているタンパク質を選び出し、最終的に、胆道癌マーカータンパク質として３５種類のタンパク質を選択した。さらに、発明者らは、ステージＩの胆道癌組織、ステージIVの胆道癌組織、及び非癌部胆道組織における、前記３５種類の胆道癌マーカータンパク質の発現を、ＳＲＭ法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により詳細に検討することによって、前記胆道癌マーカータンパク質の発現量と胆道癌の進行度との関連を調べた。その結果、前記胆道癌マーカータンパク質のうち、（１）６種類のタンパク質（ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、及びＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ）は、ステージＩの胆道癌組織においてのみ、非癌部胆道組織と比較して、発現量が変化することから、早期の胆道癌を検出するためのマーカーとなり得ること、（２）１４種類のタンパク質（Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、及びＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ）は、ステージIVの胆道癌組織においてのみ、非癌部胆道組織と比較して、発現量が変化することから、進行期の胆道癌を検出するためのマーカーとなり得ること、（３）１５種類のタンパク質（ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、及びＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ）は、ステージＩ及びIVの両方の胆道癌組織において、非癌部胆道組織と比較して、発現量が変化することから、早期及び進行期の胆道癌を検出するためのマーカーとなり得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）胆道組織における、胆道癌の有無を判定する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を備えたことを特徴とする方法に関する。
（ａ）被験者より採取された判定用試料における、胆道癌マーカーの発現量を定量する定量工程であって、前記胆道癌マーカーが以下の各群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡである定量工程；
［Ａ群マーカータンパク質］
ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１３２７）、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７１４８）、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５４８６８）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１９９７１）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、及びＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９７１５）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５２）
［Ｄ群マーカータンパク質］
ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＣ５）、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０１４２）
［Ｆ群マーカータンパク質］
ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９００）、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０１７４）、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７３４８）、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４８８）、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ００２９９）、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０６３２３）、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３０）、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２８８３８）
［Ｇ群マーカータンパク質］
ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１３９７）、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１２８６４）、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４１８１）
［Ｈ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２６４７）
（ｂ）前記判定用試料における前記胆道癌マーカーの発現量と、対照となる健常試料における前記胆道癌マーカーの発現量とを比較する比較工程；
（ｃ）発現量の比較結果に基づいて、以下の［ｉ］〜［vii］のいずれかの評価をする評価工程；
［ｉ］判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に、早期又は進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［ii］判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質から選択される１以上のタンパク質、又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に、早期又は進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［iii］判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、減少している場合に被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価し、増加している場合に被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［iv］判定用試料におけるＤ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、増加している場合に被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価し、減少している場合に被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［ｖ］判定用試料におけるＦ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［vi］判定用試料におけるＧ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［vii］判定用試料におけるＨ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価する；
また、（２）判定用試料が、組織、血液又は胆汁であることを特徴とする上記（１）記載の方法や、（３）定量工程が、液体クロマトグラフィー質量分析法又は免疫学的測定法により、胆道癌マーカータンパク質の発現量を定量する工程であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法に関する。
また本発明は、（４）以下の各群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡを胆道癌マーカーとして使用する方法に関する。
［Ａ群マーカータンパク質］
ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１３２７）、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７１４８）、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５４８６８）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１９９７１）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、及びＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９７１５）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５２）
［Ｄ群マーカータンパク質］
ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＣ５）、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０１４２）
［Ｆ群マーカータンパク質］
ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９００）、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０１７４）、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７３４８）、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４８８）、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ００２９９）、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０６３２３）、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３０）、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２８８３８）
［Ｇ群マーカータンパク質］
ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１３９７）、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１２８６４）、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４１８１）
［Ｈ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２６４７）
さらに本発明は、（５）胆道癌マーカーとして使用するための、以下の各群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡに関する。
［Ａ群マーカータンパク質］
ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１３２７）、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７１４８）、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５４８６８）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１９９７１）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、及びＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９７１５）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５２）
［Ｄ群マーカータンパク質］
ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＣ５）、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０１４２）
［Ｆ群マーカータンパク質］
ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９００）、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０１７４）、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７３４８）、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４８８）、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ００２９９）、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０６３２３）、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３０）、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２８８３８）
［Ｇ群マーカータンパク質］
ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１３９７）、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１２８６４）、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４１８１）
［Ｈ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２６４７）
本発明によれば、胆道癌の早期診断を行うことや、胆道癌の進行度を判定することが可能となり、胆道癌の治療を行う上で極めて有用な情報を提供することができる。
１９７５〜２００１年までの、日本国内の癌部位別の死亡／罹患比を示す図である。 本発明における、実験の概要（ディスカバリーステージ）を示す図である。 本発明における、実験の概要（バリデーションステージ）を示す図である。 本発明の胆道癌マーカーを検索するために用いたＦＦＰＥ組織の染色像を示す図である。前記ＦＦＰＥ組織としては、７例の非癌部胆管組織、７例のステージＩの胆道癌組織、７例のステージIVの胆道癌組織を使用した。 非癌部胆管組織、ステージＩの胆道癌組織、及びステージIVの胆道癌組織より同定されたタンパク質の数を示す図である。非癌部胆管組織からは１０９５種のタンパク質が、ステージＩの胆道癌組織からは１２６６種のタンパク質が、ステージIVの胆道癌組織からは１１４３種のタンパク質がそれぞれ同定された。 本発明のスペクトラルカウントの結果を示す図である。スペクトラルカウントの結果から、非癌部胆道組織と比較して、癌部胆道組織において１６０種類のタンパク質が有意に高発現していることが明らかとなった。 本発明の胆道癌マーカー候補の選択方法について示す図である。スペクトラルカウントにより胆道癌組織において有意に高発現していることが明らかとなった１６０種のタンパク質の中から、遺伝子オントロジー文献検索によって７７種のタンパク質を選択した。さらに、この７７種のタンパク質について、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法による解析を行った。 ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮの発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により解析した結果を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅ（pankreas krebs bile duct epithelium）は非癌部組織をそれぞれ示す。 ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮの発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により解析した結果を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織をそれぞれ示す。 ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮの発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により解析した結果を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織をそれぞれ示す。 ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮの発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により解析した結果を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織をそれぞれ示す。 ステージIV及びステージＩの胆道癌組織における、胆道癌マーカー（ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５ＡＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ）の発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により解析した結果を示す図である。 本発明の胆道癌マーカーの発現量を、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法によって評価する際の、評価方法について示した図である 本発明の胆道癌マーカーであるＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮの発現量を、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法によって評価した結果を示す図である。図中、ｓｔ１はステージＩの胆道癌組織を、ｓｔ４はステージIVの胆道癌組織を、Ｂｉｌｅ ｄｕｃｔは非癌部胆道組織を示す。また、図中、Ｓｔｒｏｎｇは強陽性を、Ｍｏｄｅｒａｔｅは陽性を、Ｍｉｌｄは弱陽性を、Ｎｅｇａｔｉｖｅは陰性を示す。 選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、胆道癌組織及び非癌部胆道組織における、本発明のＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（図面上部）と、それぞれの方法により得られたデータに基づいて有意差検定を行った結果（図面下部）を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織を、それぞれ示す。 選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、胆道癌組織及び非癌部胆道組織における、本発明のＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（図面上部）と、それぞれの方法により得られたデータに基づいて有意差検定を行った結果（図面下部）を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織を、それぞれ示す。 選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、胆道癌組織及び非癌部胆道組織における、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（図面上部）と、それぞれの方法により得られたデータに基づいて有意差検定を行った結果（図面下部）を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織をそれぞれ示す。 ステージIV及びステージＩの胆道癌組織における、胆道癌マーカー（ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５ＡＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ）の発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により解析し、得られたデータに基づいて有意差検定を行った結果を示す図である。 胆道癌マーカー（ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ）の、発現パターンの違いについて示す図である。 選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、胆道癌組織及び非癌部胆道組織における、ＦＡＭ３Ｃ＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（図面上部）と、それぞれの方法により得られたデータに基づいて有意差検定を行った結果（図面下部）を示す図である。図中、ｓｔａｇｅＩはステージＩの胆道癌組織を、ｓｔａｇｅIVはステージIVの胆道癌組織を、ｐｋｂｅは非癌部胆道組織をそれぞれ示す。
本発明は、前記のＡ群〜Ｄ群及びＦ群〜Ｈ群マーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡ（以下、これらを総称して「本件マーカー物質」ということがある）を胆道癌マーカーとして使用する方法に関し、かかる方法には、後述する胆道癌の有無を判定する方法の他、胆道癌の有無を判定するためのデータを収集する方法や、胆道癌治療の予後を予測するためのデータを収集する方法や、胆道癌治療薬の有効性を判定する方法や、胆道癌治療薬をスクリーニングする方法が含まれる。また本発明は、胆道癌マーカーとして使用するための本件マーカー物質に関する。
本発明の胆道組織における、胆道癌の有無を判定する方法としては、（ａ）被験者より採取された判定用試料における本件マーカー物質の発現量を定量する定量工程；（ｂ）前記判定用試料における本件マーカー物質の発現量と、対照となる健常試料における本件マーカー物質の発現量とを比較する比較工程；（ｃ）発現量の比較結果に基づいて、以下の［ｉ］〜［vii］のいずれかの評価基準により評価する工程；を順次含む方法であれば特に制限されないが、判断基準［ｉ］〜［vii］から選択される２以上の評価を組み合わせて総合評価することが好ましい。また、定量工程（ａ）において、［Ｂ群マーカータンパク質］と同傾向を示す“ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４０８３）、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３５２２２）、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＧＭ３）、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８７２７）”、［Ｄ群マーカータンパク質］と同傾向を示す“Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３５９００）”、［Ｅ群マーカータンパク質］としての“Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２５８１５）、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７３１）、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ９８０８８）”、［Ｆ群マーカータンパク質］と同傾向を示す“ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１１０５）、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１２８１４）”、［Ｈ群マーカータンパク質］と同傾向を示す“ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４０１９９）”からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡを定量し、比較工程（ｂ）で健常試料と比較し、評価工程（ｃ）において評価し（［Ｅ群マーカータンパク質］については以下の評価基準［viii］を適用）、この結果をも加味して総合評価することも好ましい。さらに、判断基準［ｉ］〜［viii］から選択される３以上の評価を組み合わせて総合評価することが好ましい。なお、前記胆道癌の有無を判定するためのデータを収集する方法や胆道癌治療の予後を予測するためのデータを収集する方法は、上記定量工程（ａ）と比較工程（ｂ）を実施した後、発現量の比較結果をデータとして収集する工程が含まれる。
［ｉ］判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に、早期又は進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［ii］判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質から選択される１以上のタンパク質、又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に、早期又は進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［iii］判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、減少している場合に被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価し、増加している場合に被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［iv］判定用試料におけるＤ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、増加している場合に被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価し、減少している場合に被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［ｖ］判定用試料におけるＦ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［vi］判定用試料におけるＧ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［vii］判定用試料におけるＨ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価する；
［viii］判定用試料におけるＥ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に、進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
本発明の胆道組織における、胆道癌治療薬の有効性を判定する方法や胆道癌治療薬をスクリーニングする方法としては、（ａ）胆道癌に罹患したモデル動物に被検薬剤又は被検物質を投与する投与工程：（ｂ）前記モデル動物より採取された判定用試料における、本件マーカー物質のオーソログ（タンパク質やｍＲＮＡ）の発現量を定量する定量工程：（ｃ）前記判定用試料における本件マーカー物質のオーソログの発現量と、対照となる被検薬剤又は被検物質を未投与の場合における本件マーカー物質のオーソログの発現量とを比較する比較工程；（ｄ）発現量の比較結果に基づいて、以下の１）〜８）のいずれかの評価基準により評価する工程；を順次含む方法であれば特に制限されないが、かかる工程１）〜８）から選択される２以上の評価を組み合わせて総合評価することがより好ましく、工程１）〜８）から選択される３以上の評価を組み合わせて総合評価することがさらに好ましい。
１）判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検物質を未投与のときの発現量と比較して減少している場合、被検薬剤又は被検物質が早期又は進行期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
２）判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１以上のタンパク質、又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検物質を未投与のときの発現量と比較して増加している場合、被検薬剤又は被検物質が早期又は進行期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
３）判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質のオーソログ又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して、増加している場合に、被検薬剤又は被検物質が早期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価し、減少している場合に被検薬剤又は被検物質が進行期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
４）判定用試料におけるＤ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して、減少している場合に早期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価し、増加している場合に進行期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
５）判定用試料におけるＥ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して減少している場合、被検薬剤又は被検物質が進行期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
６）判定用試料におけるＦ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して増加している場合、被検薬剤又は被検物質が進行期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
７）判定用試料におけるＧ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して減少している場合、被検薬剤又は被検物質が早期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
８）判定用試料におけるＨ群マーカータンパク質のオーソログから選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して増加している場合、被検薬剤又は被検物質が早期の胆道癌の治療に有効な治療薬と評価する工程；
本件マーカー物質のオーソログ遺伝子の遺伝情報は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索し、適宜入手することができる。例えば、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮのオーソログがマウス、ラット等において知られている。
上記胆道癌に罹患したモデル動物としては、胆道癌を自然に罹患したモデル動物であってもよいし、癌遺伝子の過剰発現や発癌物質で胆道癌を誘導したモデル動物であってもよく、癌遺伝子の過剰発現で胆道癌を誘導したモデル動物としては、例えば受容体チロシンキナーゼの１つであるＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２（Human epidermal growth factor receptor 2）が過剰発現するトランスジェニックマウスが報告されていることから（Kiguchi K., et al. Cancer Res. 61: 6971-6976, 2001）、かかるトランスジェニックマウスを作製し用いることができる。上記モデル動物としてマウスの他、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物モデルを例示することができる。
本発明の胆道癌の有無を判定する方法により、進行期又は早期の胆道癌の有無や、進行期の胆道癌の有無や、早期の胆道癌の有無を判定することができる。ここで、「進行期の胆道癌」とは、日本胆道外科研究会の「胆道癌取扱い規約」において、ステージIII又はIVに分類される胆道癌を意味し、「早期の胆道癌」とは、日本胆道外科研究会の「胆道癌取扱い規約」において、ステージＩ又はIIに分類される胆道癌を意味する。
また、胆道癌としては、肝臓で作られた胆汁の通り道である胆道にできる癌であればどのような癌であってもよく、具体的には、肝外胆管癌、乳頭部癌、胆嚢癌等を例示することができる。
本発明の胆道癌の有無を判定する方法（治療薬のスクリーニング方法）等に用いる判定用試料としては、被験者（モデル動物）より採取された胆道由来の細胞、組織、器官等の非液性試料や、血液、胆汁等の液性試料を例示することができる。例えば上記胆道組織は、胆管の組織であっても、胆嚢の組織であってもよく、また、胆管や胆嚢を形成する上皮、固有筋層、漿膜下層のいずれの組織を含むものであってもよく、さらに胆道組織は、被験者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、前記病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。
また、前記判定用試料における、本件マーカー物質の発現量を定量する定量方法としては、胆道癌マーカータンパク質の一部又は全部、あるいは、胆道癌マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの一部又は全部を、特異的且つ定量的に検出することができる定量方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、胆道癌マーカータンパク質の定量方法として、液体クロマトグラフィー質量分析法や免疫学的測定法を挙げることができ、免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法等を好適に例示することができ、胆道癌マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの定量方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法や、リアルタイムＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等を好適に例示することができるが、液体クロマトグラフィー質量分析法又は免疫学的測定法であることが特に好ましい。
本発明の胆道癌の有無を判定する方法に用いる健常試料としては、健常者や非胆道癌患者由来の上記非液性試料や液性試料、又は、医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかにがん化していないと判断される上記非液性試料や液性試料を例示することができる。また、これら健常試料は、採取された後に、前記判定用試料と同様の処理が施された健常試料であることが好ましい。また、比較工程においては、前記判定用試料及び前記健常試料における同一の本件マーカー物質の発現量を、同一の定量方法により定量し、得られた発現量のデータを比較することが好ましい。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［サンプルの採取］
胆道癌の摘出手術によって採取された１４例（胆道癌取扱い規約におけるステージＩの胆道癌患者７例、ステージIVの胆道癌患者７例）の胆道癌組織を、ホルマリン固定パラフィン包埋処理し、胆道癌マーカー検索用のＦＦＰＥ胆道癌組織として用いた。前記ＦＦＰＥ胆道癌組織は、いずれも臨床情報や予後情報が明らかであり、術前放射線照射・化学療法症例、在院死亡例を除いたものである。また、対照となるＦＦＰＥ非癌部胆道組織としては、膵頭部癌患者（７例）より採取された、癌組織を含まない胆管組織を用いた。前記の摘出手術は、１９９８年〜２００８年の間に東北大学病院肝胆膵外科において行われた。
前記のＦＦＰＥ組織を用いて、胆道癌組織において特異的に増加又は減少するマーカータンパク質の検索を行った。実験の概要は、図２〜４に示す通りである。
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析用サンプルの調製］
１．ＦＦＰＥ組織切片の作製
前記ＦＦＰＥ組織を、ミクロトームを用いて薄切し、１０μｍの切片を作製した。この切片を、エネルギートランスファーコーティングスライドグラス（DIRECTORTMレーザーマイクロセクションスライド；Expression Pathology社製）のコーティング側に直接のせて伸展させた。キシレン及びエタノール浸潰により組織切片の脱パラフィン処理を行った後に、ヘマトキシリン染色を行い、タンパク質抽出用プレパラートを作製した。
２．レーザーマイクロダイセクション
Ｌｅｉｃａ ＬＭＤ ６０００レーザーマイクロダイセクションシステムを用いて、目的とする細胞特異的なダイセクションを行った。Ｌｅｉｃａ ＬＭＤ ６０００レーザーマイクロダイセクションシステムは、重力落下方式により高精度且つ完全なコンタミフリーの条件下で、ＵＶレーザーによるダイセクションが可能なシステムである。かかるレーザーマイクロダイセクションシステムを用いて、前記ＦＦＰＥ組織から胆道癌組織のみを採取した。
３．タンパク質の可溶化及び断片化
レーザーマイクロダイセクションにより採取された胆道癌組織を、Liquid Tissue（登録商標）MS Protein Prep Kit（Expression Pathology社製）を用いて処理し、タンパク質を可溶化した。続いて、トリプシンを用いて可溶化タンパク質を断片化した。これらの処理により、３０，０００個の細胞（厚さ１０μｍのＦＦＰＥ切片においては、約２×４ｍｍの範囲に相当する）から、約２〜４μgのタンパク質が得られた。これは、後述のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析を、１０回行うことができるタンパク質量に相当する。
［胆道癌マーカータンパク質の検索］
１．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
実施例２により調製したサンプルを、０．１％ＴＦＡ／２％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／Ｄ．Ｗ．（ｐＨ２〜３）で再溶解し、ｎａｎｏ ｆｌｏｗ ＥＳＩ−イオントラップ型ＬＣ／ＭＳ（ZAPLOUS Discovery LC/MSシステム）により分析を行った。分析は同一サンプルを３回測定した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの条件の詳細は以下の通りである。
Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ：ＨＴＣ−ＰＡＬ（CTC Analytics社製）
ＨＰＬＣ：Ｐａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４（Michrom BioResources社製）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＭＡＧＩＣ Ｃ１８ＡＱ、３μ、１００オングストローム、０．１ｍｍＩＤ ｘ １５０ｍｍ （Michrom BioResources社製）
Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ： ＡＤＶＡＮＣＥ Ｎａｎｏ Ｓｐｒａｙ Ｓｏｕｒｃｅ（Michrom BioResources社製）
ＭＳ：ＦｉｎｎｉｇａｎＬＸＱ（Thermo Fisher Scientific社製）
Ａ液：２％アセトニトリル／０．１％ギ酸
Ｂ液：９０％アセトニトリル／０．１％ギ酸
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：５００ｎＬ／ｍｉｎ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：５〜４５％Ｂ ｉｎ １００ｍｉｎ
ＥＭＳ ｖｏｌｔａｇｅ：１．４〜１．６ｋＶ
Ｍａｓｓ ｒａｎｇｅ：４５０〜２０００
２．タンパク質の同定
タンパク質の同定のためのソフトウエアとしてＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science社製）を、データベースとしてＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５５．６を用い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析データよりタンパク質を同定した。３回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析により得られたデータから、それぞれタンパク質をリストアップし、最終的に統合した。その結果、図５に示すように、ステージＩの胆道癌組織サンプルからは１２６６種類の、ステージIVの胆道癌組織サンプルからは１１４３種類の、対照となる非癌部胆道組織からは１０９５種類のタンパク質を同定することができた（癌部：１６６４種類、全体：１９９２種類）。
３．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの解析
各群でのタンパク質発現を、ＳＣＡＦＦＯＬＤソフトウエア（Matrix Science社製）を用いて解析し、さらに、タンパク質アイソフォーム、サブセットを識別・グループ化し、遺伝子オントロジー解析を行った。具体的には以下のような解析を行った。
スペクトラルカウント法（図６）：半定量法として下記の計算式を用いた比較定量及び統計検定（Ｇ検定）を実施して、群特異的な発現タンパク質の同定を同時に行った。
（１）相対変化量：Abundance ratio for each protein（Ｒｓｃ）
Ｒｓｃ＝ｌｏｇ２［（ｎ２＋ｆ）／（ｎ１＋ｆ）］＋ｌｏｇ２［（ｔ１−ｎ１＋ｆ）／（ｔ２−ｎ２＋ｆ）］
ｎ１、ｎ２：あるタンパクを同定するのに使用したペプチドの数
ｔ１、ｔ２：タンパク同定に使用したペプチドの総数
ｆ：ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ＝ １．２５
（２）相対発現量：Normalized Spectral Abundance Factor for each protein（ＮＳＡＦ）
ＮＳＡＦｋ＝［ＳｐＣｋ／Ｌｋ］／ＳＵＭ［ＳｐＣｋ／Ｌｋ］
ＳｐＣｋ：あるタンパクを同定するのに使用したペプチド数
Ｌｋ：同定したタンパクのアミノ酸数
（３）スペクトラル・インデックス：Spectral Index for Group Comparison（ＳＩ）
ＳＩ＝［ＳＡ／（ＳＡ＋ＳＢ）＊ＮＤＡ／ＮＴＡ］−［ＳＢ／（ＳＡ＋ＳＢ）＊ＮＤＢ／ＮＴＢ］
ＳＡ、ＳＢ：タンパク同定に使用したペプチドの総数
ＮＤＡ、ＮＤＢ：ある群の中で該当タンパクが同定されたサンプル数
ＮＴＡ、ＮＴＢ：ある群の中のサンプル数
４．胆道癌マーカータンパク質の検索
前記の解析により、スペクトラルインデックス（ＳＩ）、相対発現量（ＮＳＡＦｋ）、相対変化量（Ｒｓｃ）を算出し、さらに、統計検定（Ｇ検定）により、癌部で有意に高発現している１６０種類のタンパク質を胆道癌のバイオマーカー候補として同定した。この１６０種類の胆道癌マーカー候補タンパク質について、遺伝子オントロジー解析を行い、構造タンパク質やハウスキーピングタンパク質などを除外し、さらに、胆道癌に特異的でないと考えられるタンパク質を除外することによって、７７種類の胆道癌に特異的なマーカー候補タンパク質を選定した（図７）。この７７種類のタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＩＤは以下の通りである。
Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ４＿ＨＵＭＡＮ、ＡＤＴ３＿ＨＵＭＡＮ、ＡＬ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＨ６０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＳ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＬＮＢ＿ＨＵＭＡＮ、ＧＥＬＳ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＹＨ１４＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＨＢ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＨＢ２＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＡＴ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＩＦ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｚ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＹＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＦＨＤ２＿ＨＵＭＡＮ、ＦＬＮＡ＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＬＰＰＲＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＮＵＣＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＢＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＭＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＲＤＸ６＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＤ５２＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＤ５４＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＭＥ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＤＴ２＿ＨＵＭＡＮ、ＳＡＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＫ１Ｃ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＮ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮ３２Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＢＸ３＿ＨＵＭＡＮ、ＦＥＲＭ２＿ＨＵＭＡＮ、ＬＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＹＯＦ＿ＨＵＭＡＮ、ＮＤＲＧ１＿ＨＵＭＡＮ、ＮＥＤＤ４＿ＨＵＭＡＮ、ＰＡＲＫ７＿ＨＵＭＡＮ、ＰＯＳＴＮ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＴＭＳ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＡＰ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＥＧ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ。
前記の７７種類のタンパク質と、これまでの報告から胆道癌マーカー候補と考えられるタンパク質を１７種類及び内部標準であるβ−ａｃｔｉｎの合計９５種類のタンパク質を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により定量した。前記の胆道癌マーカー候補と考えられる１７種類タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＩＤは以下の通りである。
ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＭ３Ｃ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＥＴＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ６＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＴＢ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ１＿ＨＵＭＡＮ、ＮＧＡＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＹ１＿ＨＵＭＡＮ、ＳＤＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＥＭＩＬ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＭＧＡ＿ＨＵＭＡＮ。
選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法においては、ＡＣＴＢのＳＲＭ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（４８８．７／６３０．３）のピークエリアを適用し、以下の計算式により標準化した。
Normalized peak area = Each of peak area x (500,000 / peak area of 488.7/630.3)
ＳＲＭ法による解析の結果から、前記のマーカー候補タンパク質の中から、胆道癌組織における発現量が、非癌部胆道組織と比較して２倍以上増加、又は半分以下に減少している３５種類のタンパク質を、胆道癌マーカータンパク質として選択した。この３５種類のタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＩＤは以下の通りである。
ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ。
図８〜１１に、ステージＩの胆道癌組織（７例）、ステージIVの胆道癌組織（７例）、及び非癌部胆道組織（７例）のそれぞれの組織中の、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮの発現量を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により解析した結果を示す。また、図１２に、ステージIV及びステージＩの胆道癌組織における、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５ＡＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮの発現量の変化を示す。
図８〜１２に示されるように、前記の３５種類のタンパク質は、胆道癌の進行度に伴って、それぞれ異なる発現パターンを示すことが明らかとなった。前記の３５種類のタンパク質は、発現パターンの違いから、以下の８群分類することができる（図１９）。
Ａ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、２倍以上に増加しているタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、２倍以上に増加しているタンパク質（ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｅ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、変化しないタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、２倍以上に増加しているタンパク質（Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｃ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、０．５倍以下に減少しているタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、２倍以上に増加しているタンパク質（ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｇ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、２倍以上に増加しているタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、変化しないタンパク質（ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｈ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、０．５倍以下に減少しているタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、変化しないタンパク質（ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｄ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、２倍以上に増加しているタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、０．５倍以下に減少しているタンパク質（ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｆ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、変化しないタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、０．５倍以下に減少しているタンパク質（ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ）。
Ｂ群：ステージＩの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、０．５倍以下に減少しているタンパク質であって、且つ、ステージIVの癌部組織における発現量が、非癌部における発現量と比較して、０．５倍以下に減少しているタンパク質（ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ）。
５．免疫組織化学染色
実施例３において同定された、３５種類の胆道癌マーカータンパク質について、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により発現量の変化を確認した。免疫組織化学染色（ＩＨＣ）による発現量の評価方法を図１３に示す。図１４に示すように、ステージＩの胆道癌組織（７例）、ステージIVの胆道癌組織（７例）、及び非癌部胆道組織（７例）における、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ発現を、ＩＨＣ法により確認した結果、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮは、胆道癌組織において強く発現しており、非癌部胆道組織ではほとんど発現していないことが明らかとなった。また、免疫染色の結果から、ステージＩ又はIVの胆道癌組織におけるＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮの発現が、非癌部胆道組織と比較して、有意に増加しているかどうかを解析した。結果を、図１５〜図１７に示す。
さらに、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）の結果から、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５ＡＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、及びＫ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮは、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法による解析結果と同様に、胆道癌組織において、非癌部胆道組織と比較して、有意に発現が変化することが明らかとなった（図１８）。
以上の解析の結果、図１９に示すように、ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ、ＭＵＣ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ２０＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＬＩ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＭＢＴ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１９＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮのタンパク質発現量は、胆道癌の進行に伴って変動することが明らかとなった。
ＦＡＭ３Ｃ＿ＨＵＭＡＮは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析により胆道癌組織における発現が確認され、遺伝子オントロジー解析によって選択された７７種類のタンパク質のひとつであったが、その後の選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法による解析の結果から、胆道癌組織と非癌部胆道組織とで発現量の顕著な変化が認められなかったことから、最終的には胆道癌マーカータンパク質として選択されなかった。このような、本発明の胆道癌マーカータンパク質の選択の過程で、胆道癌マーカータンパク質として適切でないと判断され、選択から漏れたタンパク質について、より詳細な検討を行い、胆道癌組織及び非癌部胆道組織における発現量を確認した。ＳＲＭ法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、胆道癌組織及び非癌部胆道組織におけるＦＡＭ３Ｃ＿ＨＵＭＡＮの発現量の変化を確認した結果を図２０に示す。実験の結果、ＦＡＭ３Ｃ＿ＨＵＭＡＮは、ＳＲＭ法及びＩＨＣ法のいずれにおいても、胆道癌組織と非癌部胆道組織における発現量の変化は認められないことが明らかとなった。以上の結果は、本実施例における、胆道癌マーカータンパク質の選択方法が適正であることを示している。

Claims (5)

  1. 胆道組織における、胆道癌の有無を判定する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を備えたことを特徴とする方法。
    （ａ）被験者より採取された判定用試料における、胆道癌マーカーの発現量を定量する定量工程であって、前記胆道癌マーカーが以下の各群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡである定量工程；
    ［Ａ群マーカータンパク質］
    ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１３２７）、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７１４８）、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５４８６８）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）
    ［Ｂ群マーカータンパク質］
    ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１９９７１）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、及びＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９７１５）
    ［Ｃ群マーカータンパク質］
    ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５２）
    ［Ｄ群マーカータンパク質］
    ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＣ５）、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０１４２）
    ［Ｆ群マーカータンパク質］
    ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９００）、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０１７４）、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７３４８）、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４８８）、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ００２９９）、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０６３２３）、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３０）、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２８８３８）
    ［Ｇ群マーカータンパク質］
    ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１３９７）、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１２８６４）、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４１８１）
    ［Ｈ群マーカータンパク質］
    ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２６４７）
    （ｂ）前記判定用試料における前記胆道癌マーカーの発現量と、対照となる健常試料における前記胆道癌マーカーの発現量とを比較する比較工程；
    （ｃ）発現量の比較結果に基づいて、以下の［ｉ］〜［vii］のいずれかの評価をする評価工程；
    ［ｉ］判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に、早期又は進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
    ［ii］判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質から選択される１以上のタンパク質、又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に、早期又は進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
    ［iii］判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、減少している場合に被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価し、増加している場合に被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
    ［iv］判定用試料におけるＤ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、増加している場合に被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価し、減少している場合に被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
    ［ｖ］判定用試料におけるＦ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に進行期の胆道癌組織が存在すると評価する；
    ［vi］判定用試料におけるＧ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価する；
    ［vii］判定用試料におけるＨ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して減少している場合、被験者の胆道組織中に早期の胆道癌組織が存在すると評価する；
  2. 判定用試料が、組織、血液又は胆汁であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 定量工程が、液体クロマトグラフィー質量分析法又は免疫学的測定法により、胆道癌マーカータンパク質の発現量を定量する工程であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
  4. 以下の各群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡを胆道癌マーカーとして使用する方法。
    ［Ａ群マーカータンパク質］
    ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１３２７）、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７１４８）、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５４８６８）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）
    ［Ｂ群マーカータンパク質］
    ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１９９７１）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、及びＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９７１５）
    ［Ｃ群マーカータンパク質］
    ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５２）
    ［Ｄ群マーカータンパク質］
    ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＣ５）、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０１４２）
    ［Ｆ群マーカータンパク質］
    ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９００）、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０１７４）、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７３４８）、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４８８）、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ００２９９）、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０６３２３）、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３０）、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２８８３８）
    ［Ｇ群マーカータンパク質］
    ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１３９７）、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１２８６４）、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４１８１）
    ［Ｈ群マーカータンパク質］
    ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２６４７）
  5. 胆道癌マーカーとして使用するための、以下の各群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
    ［Ａ群マーカータンパク質］
    ＣＰＳＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１３２７）、ＦＡＢＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７１４８）、ＨＭＣＳ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５４８６８）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）
    ［Ｂ群マーカータンパク質］
    ＴＹＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１９９７１）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、及びＣＯＣＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９７１５）
    ［Ｃ群マーカータンパク質］
    ＣＯ１Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５２）
    ［Ｄ群マーカータンパク質］
    ＡＣＳＬ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＣ５）、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０１４２）
    ［Ｆ群マーカータンパク質］
    ＨＳ９０Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９００）、ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０１７４）、１４３３Ｔ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７３４８）、ＡＲＫ７２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４８８）、ＣＬＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ００２９９）、ＰＳＭＥ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０６３２３）、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３０）、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２８８３８）
    ［Ｇ群マーカータンパク質］
    ＡＯＦＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１３９７）、ＣＡＤ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１２８６４）、ＯＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４１８１）
    ［Ｈ群マーカータンパク質］
    ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＡＰＯＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２６４７）
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