CN105349531A - 一种药物成分提取方法 - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract

本发明公开了一种药物成分提取方法，包括体外合成修饰mRNA的方法和纳米颗粒包被mRNA的方法，与现有技术相比，本发明根据肝脏与胰腺均来源于内胚层且肝脏中也表达很多胰腺发育相关的转录因子。体外合成修饰mRNA安全可靠可以改变细胞的命运运用于基因治疗。通过修饰提高mRNA的稳定性，体外制备Pdx1,NeuroD,Mafa三种转录因子的mRNA。利用纳米颗粒将其包被，可成功将肝脏细胞重编程为胰岛素分泌细胞用于治疗I型糖尿病，为后续的临床运用奠定基础，具有推广应用的价值。

Description

一种药物成分提取方法
技术领域
本发明涉及一种药物制作方法，尤其涉及一种药物成分提取方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。但现有技术中的糖尿病治疗药物或治疗方案等，都无法对糖尿病具有更好的疗效，因此，存在改进空间。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种药物成分提取方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括体外合成修饰mRNA的方法和纳米颗粒包被mRNA的方法，所述体外合成修饰mRNA的方法包括以下步骤：
(1)查得Pdx1(852bp)、NeuroD(1070bp)、Mafa(1062bp)三个转录因子的CDS序列，设计引物PCR扩增得到的含BamHI、XhoI酶切位点的Pdx1、Ngn3、Mafa三种转录因子的CDS序列，并将其克隆至mRNA载体，得到Pdx1、Ngn3、Mafa体外合成mRNA的模板；
(2)通过对体外合成mRNA的帽子结构、Ploy(A)尾巴长短及碱基类似物替代等方面的修饰可大大增加mRNA的稳定性；
(3)在体外合成mRNA时以ARCA代替了普通的帽子结构，添加120个A的Ploy(A)尾巴，用假尿苷代替尿苷，5-甲基胞苷代替胞苷；
所述纳米颗粒包被mRNA的方法包括以下步骤：
(A)体外合成的三种胰腺转录因子mRNA与1mg/ml的硫酸鱼精蛋白室温旋转摇床上摇30min；
(B)水相用100mg聚乙烯醇PVA溶于5ml水中室温搅拌2h使之完全溶解，将合成的mRNA和鱼精蛋白的复合物加入完全溶解的水相中，有机相用100mg聚已内酯PCL溶于10ml有机相中湿热30℃、1h；
(C)用0.22μm的过滤器过滤除去未溶解的固体，将过滤的有机相加入上述水相中，边加边搅拌，最终的乳液在磁力搅拌器上以1000rpm速度搅拌1h，然后超声30min，为除去有机溶剂，增加纳米颗粒的硬度，将其放入旋转蒸发仪中，参数设置为50mba、40℃、20min；
最后得到的包被mRNA的纳米颗粒用RNase-freewater洗3遍，12000rpm离心10min,加水重悬保存在4℃。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种药物成分提取方法，与现有技术相比，本发明根据肝脏与胰腺均来源于内胚层且肝脏中也表达很多胰腺发育相关的转录因子。体外合成修饰mRNA安全可靠可以改变细胞的命运运用于基因治疗。通过修饰提高mRNA的稳定性，体外制备Pdx1,NeuroD,Mafa三种转录因子的mRNA。利用纳米颗粒将其包被，可成功将肝脏细胞重编程为胰岛素分泌细胞用于治疗I型糖尿病，为后续的临床运用奠定基础，具有推广应用的价值。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明包括体外合成修饰mRNA的方法和纳米颗粒包被mRNA的方法，所述体外合成修饰mRNA的方法包括以下步骤：
(1)查得Pdx1(852bp)、NeuroD(1070bp)、Mafa(1062bp)三个转录因子的CDS序列，设计引物PCR扩增得到的含BamHI、XhoI酶切位点的Pdx1、Ngn3、Mafa三种转录因子的CDS序列，并将其克隆至mRNA载体，得到Pdx1、Ngn3、Mafa体外合成mRNA的模板；
(2)通过对体外合成mRNA的帽子结构、Ploy(A)尾巴长短及碱基类似物替代等方面的修饰可大大增加mRNA的稳定性；
(3)在体外合成mRNA时以ARCA代替了普通的帽子结构，添加120个A的Ploy(A)尾巴，用假尿苷代替尿苷，5-甲基胞苷代替胞苷；
所述纳米颗粒包被mRNA的方法包括以下步骤：
(A)体外合成的三种胰腺转录因子mRNA与1mg/ml的硫酸鱼精蛋白室温旋转摇床上摇30min；
(B)水相用100mg聚乙烯醇PVA溶于5ml水中室温搅拌2h使之完全溶解，将合成的mRNA和鱼精蛋白的复合物加入完全溶解的水相中，有机相用100mg聚已内酯PCL溶于10ml有机相中湿热30℃、1h；
(C)用0.22μm的过滤器过滤除去未溶解的固体，将过滤的有机相加入上述水相中，边加边搅拌，最终的乳液在磁力搅拌器上以1000rpm速度搅拌1h，然后超声30min，为除去有机溶剂，增加纳米颗粒的硬度，将其放入旋转蒸发仪中，参数设置为50mba、40℃、20min；
(D)最后得到的包被mRNA的纳米颗粒用RNase-freewater洗3遍，12000rpm离心10min,加水重悬保存在4℃。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种药物成分提取方法，其特征在于：包括体外合成修饰mRNA的方法和纳米颗粒包被mRNA的方法，所述体外合成修饰mRNA的方法包括以下步骤：
(1)查得Pdx1(852bp)、NeuroD(1070bp)、Mafa(1062bp)三个转录因子的CDS序列，设计引物PCR扩增得到的含BamHI、XhoI酶切位点的Pdx1、Ngn3、Mafa三种转录因子的CDS序列，并将其克隆至mRNA载体，得到Pdx1、Ngn3、Mafa体外合成mRNA的模板；
(2)通过对体外合成mRNA的帽子结构、Ploy(A)尾巴长短及碱基类似物替代等方面的修饰可大大增加mRNA的稳定性；
(3)在体外合成mRNA时以ARCA代替了普通的帽子结构，添加120个A的Ploy(A)尾巴，用假尿苷代替尿苷，5-甲基胞苷代替胞苷；
所述纳米颗粒包被mRNA的方法包括以下步骤：
(A)体外合成的三种胰腺转录因子mRNA与1mg/ml的硫酸鱼精蛋白室温旋转摇床上摇30min；
(B)水相用100mg聚乙烯醇PVA溶于5ml水中室温搅拌2h使之完全溶解，将合成的mRNA和鱼精蛋白的复合物加入完全溶解的水相中，有机相用100mg聚已内酯PCL溶于10ml有机相中湿热30℃、1h；
(C)用0.22μm的过滤器过滤除去未溶解的固体，将过滤的有机相加入上述水相中，边加边搅拌，最终的乳液在磁力搅拌器上以1000rpm速度搅拌1h，然后超声30min，为除去有机溶剂，增加纳米颗粒的硬度，将其放入旋转蒸发仪中，参数设置为50mba、40℃、20min；
(D)最后得到的包被mRNA的纳米颗粒用RNase-freewater洗3遍，12000rpm离心10min,加水重悬保存在4℃。
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CN103525900A (zh) * 2012-07-06 2014-01-22 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子、其筛选方法和用途

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