CN1617933A - 芳族氨基酸代谢物或其衍生物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过大肠杆菌需氧发酵生产芳族氨基酸代谢物或其衍生物的方法，其中发酵包括生长期和生产期，并且在此发酵中，对葡萄糖和L－酪氨酸进行控制，其中在至少部分生产期期间，将发酵培养基中的葡萄糖浓度控制在1－20g/L的范围内以及将发酵培养基中的L－酪氨酸浓度控制在小于36mg/L。

Description

芳族氨基酸代谢物或其衍生物的制备方法

本发明涉及一种通过大肠杆菌的需氧发酵制备芳族氨基酸代谢物或其衍生物的方法，其中发酵包括生长期和生产期，以及在发酵期间对葡萄糖和L-酪氨酸进行控制。

在本申请中，术语″芳族氨基酸代谢物或其衍生物″是指除L-酪氨酸和来源于L-酪氨酸的产品外的任何代谢物，其是芳族氨基酸路径中的一种中间体，或者是芳族氨基酸路径中的一种最终产物，或者是来源于这样的一种代谢物的产品。芳族氨基酸代谢物或其衍生物的例子，例如是3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、奎尼酸、氢醌、3-脱氢莽草酸、儿茶酚、己二酸、环多醇、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇丙酮酸-3-磷酸、分支酸、L-色氨酸、靛青、预苯酸、L-p-羟基苯基甘氨酸、L-苯基甘氨酸、D-p-羟基苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸、苯丙酮酸、L-苯基丙氨酸、D-苯基丙氨酸、邻氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸核苷酸、1-(邻羧基苯基氨基)-1-脱氧核酮糖-5-磷酸、吲哚3-甘油磷酸、吲哚、4-羟基苯基丙酮酸。优选地，芳族氨基酸代谢物或其衍生物是L-苯基丙氨酸、D-苯基丙氨酸、D-羟基苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸或莽草酸。更优选地，芳族氨基酸代谢物或其衍生物是L-苯基丙氨酸或环多醇中的一种：2，3-反-环己二烯二醇或3，4-反-环己二烯二醇。

术语″需氧发酵″是指在整个发酵期间存在氧并且对氧没有限制。

大肠杆菌发酵中的生长期是指其中大肠杆菌发酵培养基的生物质浓度增加的阶段。生物质浓度可以通过在620nm(OD₆₂₀)处测定发酵培养基的光密度进行测定。大肠杆菌发酵的生产期是指其中形成产品芳族氨基酸代谢物或其衍生物的阶段。生长期和生产期可以轮流出现，但是在实践中生长期和生产期是重叠在一起的。

术语″发酵培养基″是指含有所有组分包括大肠杆菌细胞的液体发酵培养基。

Takagi等人(1996)在Biotechnology and Bioengineering Vol.52，p 653-660中公开了一种通过大肠杆菌的需氧发酵制备芳族氨基酸代谢物或其衍生物的方法，其中发酵包括生长期和生产期，以及在发酵期间对葡萄糖和L-酪氨酸进行控制。所述文章描述了一种通过重组大肠杆菌AT2471的需氧发酵制备L-苯基丙氨酸的方法，在发酵期间，葡萄糖的初始数量耗尽后，发酵开始10小时后(差不多恰好开始进入生产期)，将发酵培养基中的葡萄糖浓度控制在0.1g/L，以及初始L-酪氨酸耗尽后，其在30小时后(差不多恰好在生长期的末尾)，将L-酪氨酸进料控制在每小时向体积为13.5升的发酵培养基中加入100mg 2g/L的L-酪氨酸溶液(相当于每小时加入约0.2g L-酪氨酸)。

在Takagi(1996)等人的实验中，通过将发酵培养基中的葡萄糖浓度保持在0.1g/L以下，来控制葡萄糖浓度，因为人们相信为了获得较高的生产率，必须防止乙酸的累积。通常认为，为了避免乙酸的累积，需要将葡萄糖浓度控制在一个较低的水平，这一点也被其它人证实(尤其是Sakamoto等人(1994)J.Ferm.Bioeng.Vol.78，p304-309，Shiloachet等人(1996)Biotechnol.Bioeng.Vol 49，p421-428，Luli等人(1990)，Appl.Environ.Microbiol.Vol 56，p 1004-1011)。

在用一种大肠杆菌菌株发酵制备一种芳族氨基酸代谢物或其衍生物中，由大肠杆菌分泌的乙酸盐所引起的乙酸的累积是不需要的，因为它可以引起生长速率降低、最终的细胞浓度降低[Kleman等人，1991，Appl.Environ.Microbiol.57(4)918-923]和葡萄糖吸收降低[XuB.，等人，1999 Biotechnol.Prog.15，81-90]并因此引起方法的总收率减少(产品/底物，以摩尔％表示)。

因此，乙酸盐可以抑制发酵是已知的。在本发明中，发酵培养基中的细胞外乙酸盐浓度妨碍发酵过程时被称为起抑制作用的乙酸盐浓度。起抑制作用的乙酸盐浓度是随菌株而改变的并且在本发明中被定义为有机体的最大生产率减半时的浓度。本领域熟练技术人员知道起抑制作用的乙酸盐浓度还存在其它的定义。例如，Xu等人在Biotechn.Prog.Vol.15，1999，p 81-90中将起抑制作用的乙酸盐浓度定义为最大细胞生长减半时的浓度并且对于来源于大肠杆菌K12菌株W3110，测定出起抑制作用的乙酸盐浓度(k₁)为9g/L。在一个优选实施方案中，进行发酵，直到达到起抑制作用的乙酸盐浓度为止；然后，可以根据本领域熟练技术人员所知的方法分离生成的产物。

已知L-酪氨酸通常可用于芳族氨基酸路径的反馈调节。这种反馈调节是双重的：(1)在芳族氨基酸途径中，它抑制某些酶，其中通过L-酪氨酸(例如3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶，亦称为DAHP合酶)进行反馈调节和(2)它对tyrR调节子具有一种活化效应，其在L-酪氨酸的影响下产生一种蛋白质，其抑制一些表达在芳族氨基酸途径中的酶必需的基因的表达。Frberg等人发现[(1988)J.Biotechnol.Vol 8，p291-300]，36mg/L的L-酪氨酸浓度导致86％的DAHP合酶被抑制并且L-酪氨酸浓度降低到1.8mg/升时，酶的合成被抑制到44％。

因此，存在过多的L-酪氨酸也强烈影响芳族氨基酸代谢物或其衍生物的生产。为了在通过大肠杆菌的需氧发酵生产芳族氨基酸代谢物或其衍生物期间限定L-酪氨酸存在的数量，通常使用一种大肠杆菌菌株，其对于L-酪氨酸是营养缺陷型的(即菌株本身不产生任何L-酪氨酸)。Takagi等人(1996)在初始L-酪氨酸(大约在发酵30小时后)耗尽后，将L-酪氨酸进料保持在一个恒定的数值(约0.2g/h)，因为L-酪氨酸是细胞保养所需要的，但是过多的L-酪氨酸导致L-苯基丙氨酸生产的减少。

在发酵培养基中控制葡萄糖低于0.1g/L的一个缺点是：在大规模的发酵中，在生产芳族氨基酸代谢物或其衍生物中，如果葡萄糖是微生物使用的主要碳源，那么在整个发酵培养基中将永不会获得最大的生产率。这是由下面的事实造成的，即在大规模发酵中，在整个发酵介质中葡萄糖的分布(以及其它营养素)从来是不均匀的。因此，在大规模发酵中把葡萄糖的浓度控制在小于0.1g/L，将引起在发酵介质中存在这样的局部区域，其中该局部区域中葡萄糖浓度远远不足以确保由使用葡萄糖作为主要碳源的微生物产生的产品的最大生产率。如果葡萄糖浓度不足以确保最大生产率，则葡萄糖浓度被称为受限制的。如果葡萄糖浓度是受限制的，则将减少微生物对其产品的选择性，意味着将生成更多的副产物。副产物是指由葡萄糖生成的除产品本身(芳族氨基酸代谢物或其衍生物)外的任何其它东西。

本发明的一个目的是提供一种通过大肠杆菌需氧发酵生产芳族氨基酸代谢物或其衍生物的方法，其中发酵包括生长期和生产期，在此发酵中，葡萄糖和L-酪氨酸是受控制的，其中在发酵介质的任何地方，葡萄糖的浓度是不受限制的，其中防止由乙酸盐引起的抑制以及其中L-酪氨酸的抑制作用是受限制的。

本发明的目的是通过在至少部分生产期期间、在发酵介质中将葡萄糖浓度控制在1-20g/L范围内以及在发酵介质中控制L-酪氨酸浓度低于36mg/L而得以实现。

令人吃惊地是，现已发现，即使当发酵介质中将葡萄糖的浓度控制在1g/L以上，在生产期内至少10小时，乙酸盐浓度没有起抑制作用。

根据本发明，将发酵介质中的葡萄糖浓度控制在1-20g/L的范围内，优选控制在1-15g/L的范围内，更优选控制在3-10g/L的范围内，最优选控制在4-6g/L的范围内。优选地，葡萄糖浓度的变化在一个狭小的范围(子范围)内进行改变，这个狭小的范围落入1-20g/L的葡萄糖浓度范围内。优选地，子范围的上下限相差不超过10g/L，这意味着，例如，葡萄糖浓度被控制在3-13g/L，或者被控制在7-17g/L，或者被控制在1-11g/L。更优选地，子范围的上下限相差不超过5g/L，这意味着，例如，葡萄糖浓度被控制在3-8g/L，或者被控制在7-12g/L，或者被控制在1-6g/L。尤其更优选地，子范围的上下限相差不超过2g/L，这意味着，例如，葡萄糖浓度被控制在3-5g/L，或者被控制在16-18g/L，或者被控制在4-6g/L。最优选地，子范围的上下限相差不超过1g/L，这意味着，例如，葡萄糖浓度被控制在5-6g/L，或者被控制在17-18g/L，或者被控制在1-2g/L。获得最佳结果的子范围是3-10g/L，尤其是4-6g/L。

优选初始葡萄糖达到所选控制范围内的数值后，控制发酵介质中的葡萄糖浓度。发酵介质中的初始葡萄糖浓度优选在10-40g/L的范围内，更优选在15-35g/L的范围内。在本发明的一个优选实施方案中，在整个生产期内控制葡萄糖。

优选初始L-酪氨酸浓度在或低于所选L-酪氨酸极限浓度的上限后，并且优选在初始量的L-酪氨酸被完全消耗完之前，开始控制L-酪氨酸。L-酪氨酸初始浓度优选在100-380mg/L的范围内，更优选在200-300mg/L的范围内。开始控制L-酪氨酸的时间并不重要，但是可以在发酵3小时后，优选在发酵4小时后，更优选在发酵5小时后，最优选在发酵6小时后开始控制L-酪氨酸。令人吃惊地是，现已发现，如果在发酵中，开始控制L-酪氨酸比Takagi等人(1996)描述的30小时早许多，那么产物/底物的收率将增加。优选将发酵介质中的L-酪氨酸浓度控制在低于36mg/L，更优选低于20mg/L，尤其更优选低于10mg/L。

在本发明的一种优选实施方案中，只要发酵在生长期，优选对L-酪氨酸进行控制。当发酵不再处于生长期(通常发酵20小时后)，任选地开始恒定的L-酪氨酸进料。加入到含细胞干重浓度(CDW)为1g/L的发酵介质的生物反应器中的L-酪氨酸的恒定数量优选在0.01-5g_{酪 氨酸}/h的范围内。因此，如果含10升发酵介质的生物反应器具有30g/L的CDW(总CDW为300g)，则L-酪氨酸每小时进料的数量优选在0.003-1.5kg的范围内。CDW可以如在材料和方法中描述的那样进行测定。

适于在本发明的方法中使用的大肠杆菌菌株全部是大肠杆菌菌株，其具有将葡萄糖转化为酪氨酸营养缺陷型的芳族氨基酸代谢物或其衍生物的能力。在芳族氨基酸代谢物或其衍生物的生产中，优选从所需的终产物时起，菌株具有一种阻碍下游路径如从所需的终产物开始的路径的作用，其中下游路径(例如在莽草酸生产中，产生莽草酸-3-磷酸盐以及其它)将使所需的终产物(例如莽草酸)发生进一步转化。或者，将所需终产物从生产细胞中分离出来。更优选地，除了阻碍下游路径外，产生其他产物而不是所需终产物的路径(分枝路径)也被阻碍(例如在L-苯基丙氨酸作为所需终产物的情况中，到L-酪氨酸的路径)。上述所有措施的目的在于使葡萄糖物流高效率地转化为所需的终产物(芳族氨基酸代谢物或其衍生物)。本领域熟练技术人员清楚地知道：可能存在不是上面所述的其它路径获得类似的结果。

合适的大肠杆菌菌株的例子例如是生产L-苯基丙氨酸的菌株，其是基于大肠杆菌K12的菌株，优选大肠杆菌W3110，更优选大肠杆菌LJ110(Zeppenfeld等人(2000)，J.Bacteriol.Vol 182，p4443-4452。能够生产例如L-色氨酸、3-脱氢莽草酸和D-苯基丙氨酸的大肠杆菌菌株的其它例子是描述在Bongaertset等人(2001)Metabolic Engineering(2001)vol.3，p 289-300中。

能够从芳族氨基酸路径生产一种产物，更具体地说，从葡萄糖生产莽草酸3-磷酸盐，以及其中使莽草酸3-磷酸盐进一步转化成5-烯醇丙酮酰基-莽草酸-3-磷酸盐的下游路径被阻断的大肠杆菌菌株的一个例子，是大肠杆菌菌株AB2829(CGSC-strain，Pittard等人(1966)JBacteriol.Vol 92，p 1494-1508)。此菌株在负责使莽草酸3-磷酸盐转化成5-烯醇丙酮酰基-莽草酸-3-磷酸盐的编码5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸盐合酶(EPSP-合酶)的基因(aroA)上具有一个缺失。

具有从葡萄糖生产L-苯基丙氨酸能力并且其中产生不同产物的分枝路径已经被阻断的大肠杆菌菌株的其它例子是大肠杆菌K12菌株4pF26和4pF69，其在编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因(tyrA)上具有一个缺失，其在正常的环境下造成预苯酸转化为4-羟苯基丙酮酸(一种生产L-酪氨酸的前体)。

为了限制L-酪氨酸的抑制作用，将大部分野生型(WT)基因aroF^WT(编码L-酪氨酸反馈调节的3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶)从大肠杆菌的基因组中删去并在大肠杆菌菌株中，例如在载体上修补，或者用抗L-酪氨酸反馈(FBR)的基因aroF^FBR的变体插入基因组中等。

令人吃惊地，现已发现，在本发明中，使用含有野生型aroF-基因(aroF^WT)的大肠杆菌菌株，要比使用删去了aroF^WT-基因并且用aroF^FBR修补的大肠杆菌菌株，产生更高产物产率葡萄糖生产L-苯基丙氨酸的收率(以摩尔％表示)。因此，在本发明的一种优选实施方案中，使用一种大肠杆菌菌株，其中aroF^WT例如在一种载体上或在大肠杆菌基因组中表达。

本发明方法的反应条件是通常在大肠杆菌需氧发酵所选择的反应条件下进行并且是本领域熟练技术人员已知的，温度在10-70℃的范围内，优选在25-40℃的范围内，最优选在33-37℃的范围内，pH值在5-9的范围内，优选在6-8的范围内，最优选在6.6-6.8的范围内。培养基的组成也是本领域熟练技术人员已知的；所使用的一种非常合适的培养基是M9培养基(Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。

可以合适地对葡萄糖浓度进行监控，例如直接用在材料和方法中描述的方法进行监控，因此可以对葡萄糖进行调节。

L-酪氨酸浓度可以合适地通过测量与L-酪氨酸浓度线性或非线性相关的可测量的变量(例如废气信号，例如CO₂排放率或氧吸收率)而间接地进行监控。可以凭经验建立相关性，并因此可以用来调节L-酪氨酸的进料，以便使L-酪氨酸的浓度保持在所选设定值之下以及使芳族氨基酸代谢物或其衍生物的收率最佳化。

在本发明的一种特殊的实施方案中，根据下面的线性方程(1)来调节L-酪氨酸的浓度：

$V_{\mathrm{tyr}}\left[\frac{g}{\mathrm{Lh}}\right]=\frac{A\left[\frac{\mathrm{mmol}}{\mathrm{Lh}}\right]-k\left[\frac{\mathrm{mmol}}{\mathrm{Lh}}\right]}{m\left[\frac{\mathrm{mmol}}{g}\right]}---\left(1\right)$

L-酪氨酸(V_tyr)的进料可以根据A(其是测定的氧吸收率(OUR)，或者CO₂排放率(CER))进行调节，以使L-酪氨酸浓度保持在所选的控制浓度之下。在方程式1中，m和k表示可以调节的控制参数，例如通过增加m或k值，来增加L-酪氨酸的限制范围。应该最好地选择控制参数，以便使芳族氨基酸代谢物或其衍生物的产率最佳化。m值通常在0.1-4的范围内；k值通常在20-40的范围内。最佳的m和k值可以凭经验确定。当使用此方法对L-酪氨酸浓度进行有效控制时，其它状态变量如pH值、温度或(DO)应该保持不变。

本发明通过下列实施例进行说明。但是，这些实施例并不是对本发明进行限制。

实施例

材料和方法

下列材料和方法在所有实施例中使用。实施例III和/或IV与实施例I和II的差别表示在本文中。

培养基组成

发酵培养基：3.0g/L MgSO₄x7H₂O、0.015g/L CaCl₂xH₂O、3.0g/LKH₂PO₄、1.0g/L NaCl、5.0g/L(NH₄)₂SO₄、0.075/0.1g/L FeSO₄x7H₂O/柠檬酸钠、0.075g/L硫胺素、0.3g/L L-酪氨酸、0.1g/L氨苄青霉素、15g/L葡萄糖和1.5mL/L的含2.0g/L Al₂(SO₄)₃x18H₂O、0.75g/L CoSO₄x7H₂O、2.5g/L CuSO₄x5H₂O、0.5g/L H₃BO₃、24g/LMnSO₄xH₂O、3.0g/L Na₂MoO₄x2H₂O、2.5g/L NiSO₄x6H₂O和15.0g/LZnSO₄x7H₂O的微量元素溶液。预培养培养基：除了下面改变外，相同的培养基用于发酵：0.3g/L的MgSO₄x7H₂O、0.1g/L的NaCl、0.0075g/L的硫胺素xHCl、0.08g/L的L-酪氨酸、5.0g/L葡萄糖和额外的12g/L的K₂HPO₄(最终pH值为7.2)。除额外量的0.08g/L的L-苯丙氨酸以及10g/L(而不是实施例I和II中的5g/L)的葡萄糖的总量外，在实施例III和IV中使用相同的预培养培养基。除使用额外量的0.6g/L的L-苯丙氨酸外，在实施例III中使用相同的发酵培养基(在实施例IV中使用0.5g/L的L-苯丙氨酸)以及在实施例III和IV中只使用10g/L的葡萄糖。除使用额外量的0.6g/L的L-苯丙氨酸外，在实施例III中使用相同的发酵培养基(在实施例IV中使用0.5g/L的L-苯丙氨酸)以及在实施例III和IV中只使用10g/L的葡萄糖。

预培养

在-80℃将冷冻培养物储存在含50％甘油的Luria-Bertani(LB)培养基中。将250ml(在实施例III和IV中为120ml)预培养培养基装入到1000ml的摇瓶中，向其中接种1.0ml(在实施例III和IV中为0.3ml)原料，在37℃下在摇瓶培养箱中以145rpm培养16h(在实施例III和IV中为160rpm)。

培养

在合成培养基中葡萄糖被用作唯一的碳源。通过25％的氨水滴定控制pH值。将葡萄糖和L-酪氨酸(由于是L-酪氨酸营养缺陷型菌株)加入到生物反应器以保证在分批阶段期间细胞的生长。另外，对于实施例III和IV，还加入L-苯丙氨酸(由于是苯丙氨酸营养缺陷型菌株)。分两次加料L-Tyr(25g/L的L-酪氨酸进料，溶于5％的氨水中)，或者对于实施例III和IV为混合的L-酪氨酸/L-苯丙氨酸进料(25g/L的酪氨酸和30g/L的L-苯丙氨酸，溶于20％的氨水中)和葡萄糖(700g/L(对于实施例III为500g/L))后，然后开始延长生长期。两种底物的进料速度通过控制策略自动地进行调适，在过程控制系统中完成。当开始进料阶段时，通过加入IPTG(最终浓度为100μM)促使生成产物(L-苯丙氨酸、2，3-反环己二烯二醇或3，4-环己二烯二醇)。通过L-Tyr限制(对于实施例I和II，在约OD620≈80处，对于实施例III和IV，在约OD620≈50处)停止细胞生长，以150mg/h的进料速度(实施例III和IV是20mg/h)确保用于细胞维持的不间断的酪氨酸(以及在实施例III和IV的情况中是L-苯丙氨酸)供应，直到发酵结束为止。

培养在20.0L的生物反应器(ISF 200，infors；Switzerland)(实施例III和IV在7.5L的生物反应器中(L1532，Bioengineering，Switzerland)中进行，接种10％；初始体积为7.5L(对于实施例III和IV为3.5L)，培养温度为37℃，pH值为6.5。生物反应器和外围设备灭菌后，校准pH值传感器、DO传感器和尾气分析仪，将6.75L(实施例III和IV中为3.15L)发酵培养基通过死端微量过滤装置(截止值为2μm，Satorbran，Satorius，Germany)直接过滤到生物反应器中。

脱机分析

以1.5-2.5h间隔(对于实施例III和IV，间隔为1.0-2.0h)采样，进行脱机分析。进行适当稀释后，使用分光光度计(ShimadzuUV-160，Germany)在620nm处测定细胞浓度。通过让2.5-10.0ml的发酵培养基通过一个预称重的微量过滤器(0.2μm cut off，Schleicher & Schuell；Germany)来过滤细胞干重(CDW)。在80℃下干燥过滤器24h后，称重后，计算细胞干重。取样后，进行合适的稀释后，立即通过基于酶的生物传感器装置Accutrend^(HoffmannLaRoche Diagnostics；Switzerland)测定葡萄糖。通过HPLC(Sycam；Germany)使用离子排斥柱(AminexHPX-87H，BioRad；Germany)和分光光度检测器(S3300，Sycam；Germany)在215nm处测定乙酸浓度。氨基酸浓度(L-苯丙氨酸和L-酪氨酸)通过下面方法进行测定：用氨基特异性的反应物邻苯二甲醛(OPA)和巯基-乙醇进行预衍生化，接着使用反相柱(Lichrospher 100 RP 18-5 EC，Merck；Germany)和荧光检测器(RF-535，Shimadzu；Germany)进行HPLC(Sycam；Germany)测定。通过反相HPLC(HP 1100 System，Hewlett Packard Company，Palo Alto，USA)使用LichrospherC8柱(CS ChromatographieService GmbH，Langerwehe，Germany)和预柱(Lichrospher 100 RP18-5EC，CS Chromatographie Service GmbH，Langerwehe，Germany)进行测定产物2，3反-环己二烯二醇浓度。2，3反-环己二烯二醇是通过光电二极管矩阵检测器(DAD)在275nm处进行测定的。

所有¹H NMR光谱记录在Bruker AMX300 FT-NMR光谱仪(300MHz)上。关于¹H NMR，将0.4mL培养物上清液在真空离心机中浓缩至干，将其重新溶解在含4mM的3-(三甲基甲硅烷基)-2，2，3，3-d4-丙酸、TSP的钠盐的重水中(D₂O)。通过比较代谢物的积分与TSP标准信号(‰)0ppm)的积分，计算NMR样品中3，4-反-环己二烯二醇的2，3-反-环己二烯二醇的浓度。

联机葡萄糖测定

使用三个蠕动泵(U501和U101，对于实施例III和IV，U504和U101，Watson & Marlow；Germany)以确保连续取样。流速为800ml/min的发酵培养基经由一个含交叉流空心纤维超滤装置(500kDa截止值，23cm²过滤面积(对于实施例III和IV为20cm²)Schleicher& Schuell，Germany)的旁路(总体积：≈20mL，平均滞留时间：≈2s)泵送。以1.0-2.0ml/min的速度排出无细胞渗透液，并泵送至顺序联机的葡萄糖测定系统(OLGA，IBA GmbH；Germany)的歧管中，其中每120s排出10μL样品用于分析。未使用的渗透液循环回到生物反应器中。因此，在发酵期间，不超过100ml渗透液用于联机葡萄糖测定。整个取样系统用1M的NaOH在50℃下灭菌30分钟(对于实施例III和IV，为120分钟)。

实施例I和II的过程控制

通过Infors(Switzerland)装置控制标准工艺参数。通过与MEDUSA(IBT软件)和OLGA控制系统连接的LabView(NationalInstruments；U.S.A.)获得主数据。联机葡萄糖测定的信号由OLGA通过LabView发送到MEDUSA，其中由卡尔曼滤波器和最小方差控制器(Bastin et al.，1984)组成的控制系统估算最佳的葡萄糖进料速率以满足预定的葡萄糖设定值。在加料系统(Satorius；Germany)的帮助下，自动地调节葡萄糖的进料速率。通过测定尾气中O₂-/CO₂(Binos100 2M，Leybold，Germany)、生物反应器的重量和气流速率，联机估计体积特异性的氧吸收速度(OUR)，从而在生长期期间间接地控制酪氨酸。在MEDUSA中估算体积特异性的L-酪氨酸消耗速率，在加料系统(Satorius；Germany)的帮助下，使用含25g/L的进料进行调节。

实施例III和IV的过程控制

通过生物工程(Switzerland)装置控制标准工艺参数。通过与OLGA控制系统连接的LabView(National Instruments；U.S.A.)获得主数据。联机测定的葡萄糖信号由OLGA发送到LabView，其中由预报和反馈控制算法(Kleman et al.，1991)估算葡萄糖进料速率以满足预定的葡萄糖设定值。在加料系统(Satorius；Germany)的帮助下，自动地调节葡萄糖的进料速率。通过测定尾气(Oxynos100和Binos100，Leybold，Germany)中O₂-/CO₂、生物反应器的重量和气流速率(方程式1)，联机估计体积特异性的氧吸收速度(OUR)，从而在生长期期间间接地控制L-酪氨酸。在LabView(National Instruments；U.S.A.)中估算体积特异性的L-酪氨酸消耗速率，在加料系统(Satorius；Germany)的帮助下，使用含25g/L的进料进行调节。

在实施例I和II中生产L-苯丙氨酸的生物系统

基于大肠杆菌K12LJ110(Zeppenfeld et al.2000)，使用质粒pJF119EH(Furste et al.，1986)，构建两个生产菌株，分别为大肠杆菌aroF-fbr(为基因型Δ(pheA tyrA aroF)/pJF119EH aroF^fbrpheA^fbr aroL^wt编码)和大肠杆菌aroF-wt(为基因型Δ(pheA tyrAaroF)/pJF119EH aroF^wt pheA^fbr aroL^wt编码)。在两种菌株中，在染色体中缺失了基因pheA(编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)、tyrA(编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶)和aroF(编码DAHP-合酶(3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸盐))。在大肠杆菌中，三种同工酶AroF(被酪氨酸反馈抑制)、AroG(被苯丙氨酸反馈抑制)和AroH(被色氨酸反馈抑制)使DAHP-合酶具有活性。在大肠杆菌中，aroF-fbr，一种DAHP-合酶的抗酪氨酸衍生物(aroF^fbr)被插入到质粒上。大肠杆菌的质粒aroF-wt包含对酪氨酸敏感的aroF^wt而不是aroF^fbr。另外，抗苯丙氨酸反馈的pheA^fbr和天然aroL^wt(编码莽草酸激酶II)被插入到pJF119EH上，以避免受到苯丙氨酸的PheA反馈抑制以及增加AroL活性。由于ΔtyrA，生产的菌株是酪氨酸营养缺陷型的。由于使用了表达载体pJF119EH，菌株具有氨苄青霉素抗性并且是可IPTG-诱导的(使用耐葡萄糖的tac-促进剂)。

在实施例III中生产2，3-反-环己二烯二醇的生物系统

基于大肠杆菌K12LJ110(Zeppenfeld et al.2000)，使用质粒pJF119EH(Furste et al.，1986)，构建生产菌株大肠杆菌F82(编码基因型Δ(pheA tyrA aroF)::kanΔ(entCEBA)::cat/pJF119EHaroF^wt aroB^wt aroL^wt entB entC)。在此菌株中，在染色体中缺失了基因pheA(编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)、tyrA(编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶)和aroF(编码DAHP-合酶(3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸))。另外，整个entCEBA操纵子是灭活的。EntCEBA代表含有entC、entE、entB和entA的操纵子。另外，天然aroF^wt(编码DAHP合成酶)、aroL^wt(编码草莽酸激酶II)和aroB^wt(编码脱氢奎尼酸合酶)被插入到pJF119EH上以增加AroF、AroL和AroB的活性。由于pheA的缺失，生产的菌株同样是L-苯丙氨酸营养缺陷型的。

在实施例IV中生产3，4-反环己二烯二醇的生物系统

作为生产菌株，使用大肠杆菌pC22F82(编码基因型Δ(pheA tyrAaroF)::kanΔ(entCEBA)::cat/pJF119EH aroF^wt aroB^wt aroL^wtentB)，其不同于在实施例III中被用于2，3-反环己二烯二醇生产的生产菌株，因为在这种情况下，大肠杆菌菌株没有表达entC的活性。

实施例I.L-苯丙氨酸的生产

用大肠杆菌aro F-fbr菌株进行发酵。在开始发酵约10小时时，当初始葡萄糖浓度降低到选定的葡萄糖控制值(0.1；5.0；15.0；30.0)时，开始控制葡萄糖。在开始发酵6小时的时候开始通过联机检测OUR以及相应地调节L-酪氨酸进料，来控制酪氨酸，以使发酵培养基中的L-酪氨酸的浓度保持在20mg/L以下。在620nm(OD₆₂₀)处的光密度达到10-15后，加入100M的IPTG，以诱导L-苯丙氨酸生产(在开始发酵约6小时后)。在停止通过联机检测OUR以及相应地停止调节L-酪氨酸的进料控制L-酪氨酸，开始以100mg/h的速度连续进料L-酪氨酸溶液，该溶液含有25g/L的L-酪氨酸，溶于5％的氨水中。通过控制发酵培养基中的葡萄糖浓度为0.1、5、15和30g/L以及控制L-酪氨酸小于36mg/L，而获得的不同时间点的发酵培养基中的L-苯丙氨酸(L-Phe)浓度和乙酸盐(Ac)浓度列于表1。

表1在控制葡萄糖(10小时后开始)和酪氨酸(6小时后开始)的情况下，发酵生产L-苯丙氨酸。

时间(小时)	发酵培养基中的葡萄糖浓度(g/L)
									0.1		5		15		30
	L-Phe(g/L)	Ac(g/L)	L-Phe(g/L)	Ac(g/L)	L-Phe(g/L)	Ac(g/L)	L-Phe(g/L)	Ac(g/L)
									0.5	0.0	0.2	0.0	0.1	0.0	0.1	0.0	0.1
10	1.6	0.6	2.8	1.0	2.3	0.0	2.5	1.6
									27	16.0	0.0	25.2	0.8	22.4	1.3	16.7	8.0
35	24.7	0.0	31.9	1.0	30.5	5.5	16.6	24.4
									50	31.6	1.3	34.4	1.9	31.2	24.9	16.1	40.9

实施例II.含有野生型aroF的菌株或含有抗反馈aroF的菌株的L- 苯丙氨酸生产

根据材料和方法中描述的方法，用4pF69菌株(含有野生型aroF)和4pF26菌株(含有抗反馈aroF)进行发酵。在开始发酵约10小时时，当初始葡萄糖浓度降低到发酵培养基中葡萄糖浓度为5g/L时，开始控制葡萄糖。在开始发酵后6小时的时候开始通过联机检测OUR以及相应地调节L-酪氨酸进料，来控制酪氨酸，以使发酵培养基中的L-酪氨酸浓度保持在20/L以下。选择2个不同的m-值(m＝1.0，m＝1.5)，将K值设定为30。达到在620nm处的光密度(OD₆₂₀)后，加入100μM的IPTG以诱导L-苯丙氨酸生产。在停止通过联机检测OUR和相应地停止调节L-酪氨酸进料控制L-酪氨酸后，开始以100mg/h的速度连续进料L-酪氨酸溶液，该溶液含有25g/L的L-酪氨酸，溶于5％的氨水中。对于不同m-值和不同菌株，在不同时间点的发酵培养基中的L-苯丙氨酸(L-Phe)浓度列于表2中。

表2在控制酪氨酸和葡萄糖的情况下，在使用aroF野生型菌株和arof抗反馈菌株进行的发酵中，L-苯丙氨酸的收率，其中葡萄糖的控制值按照方程式1用不同的m-值计算得到。

时间(小时)	菌株类型
					4pF69(aroF野生型)		4pF26(aroF抗反馈)
	m＝1.5	m＝1.0	m＝1.5	m＝1.0
					产物/底物收率(mol/mol％)
	36	20	19	13					18
48					17	16	11	15

实施例III.2，3-反环己二烯二醇的生产

根据材料和方法中描述的，使用上述F82pC20菌株进行发酵。在开始发酵约5小时时，当初始葡萄糖浓度降低到发酵培养基中葡萄糖浓度为4g/L时，开始控制葡萄糖。葡萄糖控制在约5g/L的设定值。在开始发酵7.5小时的时候开始通过联机检测OUR以及相应地调节L-酪氨酸进料，来控制酪氨酸，以使发酵培养基中的L-酪氨酸浓度保持在约20/L以下。当光密度达到8-9(OD_620nm)(在开始发酵约6小时后)后，加入100μM的IPTG，以诱导2，3-反-环己二烯二醇的生产。在停止通过联机检测OUR以及相应地停止调节L-酪氨酸/L-苯丙氨酸进料控制L-酪氨酸后。(开始发酵16小时后)，为了控制L-酪氨酸浓度小于36mg/L以及为了使L-苯丙氨酸的浓度达到饱和(大于100mg/L)，开始以20mg/h的速度连续进料L-酪氨酸/L-苯丙氨酸溶液，该含有12.5g/L的L-酪氨酸和15g/L的L-苯丙氨酸，溶于10％的氨水中。该发酵的结果列于下图3中：

表3在控制葡萄糖(5小时后开始)和酪氨酸(7.5小时后开始)的情况下，发酵生产2，3-反-环己二烯二醇。

菌株类型：大肠杆菌F82(编码基因型Δ(pheA tyrA aroF)::kanΔ(entCEBA)::cat/pJF119EH aroFwt aroBwt aroLwt entB entC)
							开始发酵后的时间(h)	2，3-反-环己二烯二醇(g/L)*	2，3-反-环己二烯二醇(g/L)**	乙酸盐(g/L)	葡萄糖(g/L)	L-Tyr(g/L)	L-Phe(g/L)
1	0.0	0.0	0.01	9.7	0.32	0.53
							5.5	0.0	0.0	0.2	8.1	0.30	0.51
10	0.0	0.5	0.9	2.9	0.01	0.26
							11.5	3.3	1.6	0.9	4.5	0.00	0.23
17.5	16.2	8.8	1.0	2.0	0.00	0.18
							25	29.2	18.3	3.2	6.9	0.00	0.10
33	30.2	17.3	3.4	7.0	0.02	0.13
							39	29.4	17.8	3.0	4.5	0.03	0.14

*用HPLC测定。

**由¹H-NMR计算得到。

实施例IV.3，4-反环己二烯二醇的生产

用F82pC22菌株进行发酵。在开始发酵约7小时时，当初始葡萄糖浓度降低到发酵培养基中葡萄糖浓度为5g/L时，开始控制葡萄糖。葡萄糖控制在约3.5g/L的设定值。在开始发酵9小时的时候开始通过联机检测OUR以及相应地调节L-酪氨酸进料，来控制L-酪氨酸，以使发酵培养基中的L-酪氨酸浓度保持在约20/L以下。当光密度(OD_620nm)达到8-9后(约为开始发酵6.5小时后)，加入100μM的IPTG以诱导3，4-反-环己二烯二醇的生产。在停止通过联机检测OUR以及相应地停止调节L-酪氨酸/L-苯丙氨酸进料控制L-酪氨酸后(开始发酵16小时后)，为了将L-酪氨酸浓度限制在检测极限以下以及为了饱和L-苯丙氨酸的浓度(大于100mg/L)，开始以20mg/h的速度连续进料L-酪氨酸/L-苯丙氨酸溶液，其含有12.5g/L的L-酪氨酸和15g/L的L-苯丙氨酸，溶于10％的氨水中。该发酵的结果列于下图4中：

表4在控制葡萄糖(7小时后开始)和酪氨酸(9小时后开始)的情况下，发酵生产3，4-反-环己二烯二醇。

菌株类型：大肠杆菌F82(编码基因型Δ(pheA tyrA aroF)::kanΔ(entCEBA)::cat/pJF119EH aroFwt aroBwt aroLwt entB)
						开始发酵后的时间(h)	2，3-反-环己二烯二醇(g/L)**	乙酸盐(g/L)	葡萄糖(g/L)	L-Tyr(g/L)	L-Phe(g/L)
1.4	0.0	0.0	9.5	0.27	0.48
						4.3	0.0	0.0	9.2	0.24	0.44
9.6	0.6	0.0	5.5	0.03	0.23
						13.7	3.0	0.0	4.9	0.00	0.22
17.7	8.3	0.5	3.4	0.00	0.17
						24.3	12.8	2.9	3.5	0.00	0.17
28.4	15.8	3.3	3.0	0.00	0.00
						35	19.2	3.2	3.8	0.00	0.00

**由¹H-NMR计算得到。

Claims (17)

1.通过大肠杆菌需氧发酵制备芳族氨基酸代谢物或其衍生物的方法，其中发酵包括生长期和生产期，并且在发酵中，对葡萄糖和L-酪氨酸进行控制，其特征在于：在至少部分生产期期间，将发酵培养基中的葡萄糖浓度控制在1-20g/L的范围内，以及将发酵培养基中的L-酪氨酸浓度控制在小于36mg/L。

2.权利要求1的方法，其特征在于将葡萄糖浓度控制在3-10g/L的范围内。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于葡萄糖浓度在1-20g/L的范围内或葡萄糖浓度在3-10g/L的范围内，将葡萄糖浓度控制在上下限相差不超过5g/L的子范围内。

4.权利要求1-2的任意一项的方法，其特征在于将葡萄糖浓度控制在4-6g/L的范围内。

5.权利要求1-2或4的任意一项的方法，其特征在于将L-酪氨酸浓度控制在小于20mg/L。

6.权利要求1、2、4或5中任意一项的方法，其特征在于进行发酵，直到作为发酵的副产物而生产的乙酸盐的浓度达到起抑制作用的乙酸盐浓度为止。

7.权利要求1、2、4-6中任意一项的方法，其特征在于在整个生产期期间对葡萄糖进行控制。

8.权利要求1、2、4-7中任意一项的方法，其特征在于只要发酵处于生长期，就对发酵培养基中的酪氨酸浓度进行控制。

9.权利要求1、2、4-8中任意一项的方法，其特征在于在停止对酪氨酸浓度的控制后，开始持续地进料酪氨酸。

10.权利要求1、2、4-9中任意一项的方法，其特征在于选择持续的酪氨酸进料，使得每小时每细胞干重浓度的L-酪氨酸进料的数量为0.01-5g。

11.权利要求1、2、4-10中任意一项的方法，其特征在于通过使用一个凭经验建立的一种可测变量之间的相关性来调节酪氨酸进料，并因此调节发酵培养基中的酪氨酸浓度，从而控制培养基中的酪氨酸浓度。

12.权利要求1、2、4-11中任意一项的方法，其特征在于在培养基中的酪氨酸浓度是通过按照下列方程调节酪氨酸进料而进行控制的：

${\stackrel{\·}{V}}_{\mathrm{tyr}}\left[\frac{g}{\mathrm{Lh}}\right]=\frac{A\left[\frac{\mathrm{mmol}}{\mathrm{Lh}}\right]-k\left[\frac{\mathrm{mmol}}{\mathrm{Lh}}\right]}{m\left[\frac{\mathrm{mmol}}{g}\right]}---\left(1\right)$

其中A表示发酵中的氧吸收速率(OUR)或CO₂排放速率(CER)，V_tyr表示酪氨酸进料以及其中k和m表示控制参数。

13.权利要求1、2、4-1 2中任意一项的方法，其特征在于使用大肠杆菌W3110。

14.权利要求1、2、4-13中任意一项的方法，其特征在于芳族氨基酸代谢物或其衍生物是L-苯丙氨酸、2，3-反-环己二烯二醇或3，4-反-环己二烯二醇。

15.根据14的方法，其特征在于在大肠杆菌中，aroF^WT被表达。

16控制酪氨酸浓度的方法，它通过使用一个凭经验建立的一种可测变量之间的相关性以调节酪氨酸进料，并因此调节发酵培养基中的酪氨酸浓度。

17.权利要求16的方法，其特征在于按照下列方程式调节酪氨酸进料：

${\stackrel{\·}{V}}_{\mathrm{tyr}}\left[\frac{g}{\mathrm{Lh}}\right]=\frac{A\left[\frac{\mathrm{mmol}}{\mathrm{Lh}}\right]-k\left[\frac{\mathrm{mmol}}{\mathrm{Lh}}\right]}{m\left[\frac{\mathrm{mmol}}{g}\right]}---\left(1\right)$

其中A表示发酵中的氧吸收速率(OUR)或CO₂排放速率(CER)，V_tyr表示酪氨酸进料以及其中k和m表示控制参数。