KR20050044706A - 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법 - Google Patents

방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균의 호기성 발효에 의한 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것으로서,
상기 발효는 증식기(growth phase)와 생산기(production phase)를 포함하며, 상기 발효에서 글루코스와 L-티로신이 조절되고, 적어도 생산기 중에 발효 배지 중의 글루코스 농도가 1 g/L 내지 20 g/L의 범위 내에서 조절되며, 발효 배지 중의 L-티로신 농도가 36 mg/L 미만으로 조절되는 것을 특징으로 한다.

Description

방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AN AROMATIC AMINO ACID METABOLITE OR DERIVATIVE THEREOF}
재료 및 방법
하기의 재료 및 방법을 모든 실시예에서 사용하였다. 실시예 Ⅰ및 Ⅱ와 비교한 실시예 Ⅲ 및/또는 Ⅳ의 차이는 본문에 나타내었다.
배지 조성
발효 배지: 3.0 g/L MgSO4 ×7H2O, 0.015 g/L CaCl2 ×H2O, 3.0 g/L KH2PO4, 1.0 g/L NaCl, 5.0 g/L (NH4)2SO4, 0.075/0.1 g/L FeSO4 ×7H 2O/Na-시트레이트, 0.075 g/L 티아민, 0.3 g/L L-티로신, 0.1 g/L 암피실린, 15 g/L 글루코스, 및 (2.0 g/L Al2(SO4)3 ×18H2O, 0.75 g/L CoSO4 ×7H 2O, 2.5 g/L CuSO4 ×5H2O, 0.5 g/L H3BO3, 24 g/L MnSO4 ×H2O, 3.0 g/L Na2MoO4 ×2H2O, 2.5 g/L NiSO4 ×6H2O 및 15.0 g/L ZnSO4 ×7H2O를 함유하는) 1.5 ㎖/ℓ의 미량 원소 용액(trace element solution).
예비배양 배지: 하기의 변화를 제외하고 발효용으로 사용한 것과 동일한 배지를 사용하였다: 0.3 g/L MgSO4 ×7H2O, 0.1 g/L NaCl, 0.0075 g/L 티아민 ×HCl, 0.08 g/L L-티로신, 5.0 g/L 글루코스, 및 추가로 12 g/L K2HPO4(최종 pH 7.2). L-페닐알라닌 0.08 g/L의 추가 양과 10 g/L의 글루코스 총 양(실시예 Ⅰ 및 실시예 Ⅱ에서는 5 g/L의 글루코스임)을 제외하고 동일한 예비배양 배지를 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서 사용하였다. L-페닐알라닌 0.6 g/L의 추가 양을 사용한 것을 제외하고 동일한 발효 배지를 실시예 Ⅲ(실시예 Ⅳ에서는 0.5 g/L)에서 사용하였고, 단지 10 g/L의 글루코스만 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서 사용하였다. 실시예 Ⅲ에서 L-페닐알라닌 0.6 g/L의 추가 양(실시예 Ⅳ에서는 0.5 g/L)을 사용한 것을 제외한 동일한 발효 배지와, 단지 10 g/L의 글루코스만 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서 사용하였다.
예비배양
저온배양(cryoculture)은 50 %의 글리세롤을 함유하는 루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지에서 -80 ℃에서 저장하였다. 250 ㎖(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서는 120 ㎖) 예비배양 배지를 1000 ㎖ 교반 플라스크에 넣고, 공급 원료로부터 1.0 ㎖를 접종하고(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서는 0.3 ㎖), 145 rpm(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서는 160 rpm)의 교반 플라스크 배양기에 37 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다.
배양
규정한 배지에서 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용하였다. 25 %의 암모니아수(ammonia water)로 적정하여 pH를 조절하였다. 회분기(batch phase) 중에 세포 증식을 확보하기 위해서 생물 반응기에 (균주의 L-티로신 영양 요구성 때문에) 글루코스와 L-티로신을 첨가하였다. 부가적으로, 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서, (균주의 페닐알라닌 영양 요구성 때문에) L-페닐알라닌도 또한 첨가하였다. L-Tyr(5 % 암모니아수에 용해된 25 g/L의 L-티로신 공급)을 위한, 또는 예를 들어 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서 배합된 L-티로신/L-페닐알라닌 공급(20 % 암모니아수에 용해된 25 g/L의 티로신과 30 g/L의 L-페닐알라닌)과 글루코스에 있어서(700 g/L(실시예 Ⅲ에 있어서는 500 g/L)) 두개로 분리되어 공급되어 증식기를 연장시킨다. 공정 조절 시스템에서 실시되는 조절 전략에 의해서 두개 기질의 공급 속도가 자동적으로 조정된다. 공급기가 개시되는 경우에 IPTG(최종 농도는 100 uM)를 첨가함으로써 생산물(L-페닐알라닌, 2,3-트란스 시클로헥사디엔디올 또는 3,4-시클로헥사디엔디올)의 생산이 유도된다. 발효의 마지막 까지 공급 속도를 150 ㎎/h(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 20 ㎎/h)로 세포 유지를 위해 진행되는 티로신(또한 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 L-페닐알라닌)공급을 확보하는 L-Tyr를 제한함으로써(실시예 Ⅰ과 실시예 Ⅱ 있어서는 대략 OD620≒80, 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 대략 OD620≒50) 세포 증식을 정지시켰다.
20.0 L 생물 반응기(스위스, Infors사의 ISF 200)(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 7.5 L 생물 반응기(스위스, Bioengineering사의 L1532))에 10 % 접종하여 배양을 실행하였다; 초기 부피 7.5 L(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 3.5 L), 배양 온도 37 ℃, 및 pH 6.5. 생물 반응기와 주변 장치를 살균하고, pH-센서, DO-센서 및 배출 가스 분석기를 보정 한 후, 발효 배지 6.75 L(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 3.15 L)를 종말 미세 여과 유닛(dead-end microfiltration unit, 독일의 Satorius, Satorbran, 0.2 ㎛ 컷-오프)을 경유하여 생물 반응기로 직접 여과 하였다.
오프-라인 분석
1.5 시간 내지 2.5 시간의 간격(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 1.0 시간 내지 2.0 시간의 간격)을 두고 시료를 취하여 오프-라인 분석을 실행하였다. 적당하게 희석시킨 후에 620 nm에서 분광 광도계(독일의 Shimadzu UV-160)를 사용하여 세포 농도를 측정하였다. 미리 중량을 잰 마이크로필터(preweighted microfilter, 독일의 Schleicher & Schuell, 0.2 ㎛ 컷-오프)를 통해 2.5 ㎖ 내지 10.0 ㎖의 발효 배지를 여과하여 세포 건조 중량(CDW)를 측정하였다. 80 ℃에서 24 시간 동안 필터를 건조하고, 중량을 측정한 이후, 건조 세포 중량을 계산하였다. 시료를 취한 직후에, 적당하게 희석시킨 후 효소-기본 바이오센서 응용 어큐트렌드(상표명, Accutrend, 스위스의 Hoffmann LaRoche Diagnostics)로 글루코스를 측정하였다. 이온-배출 컬럼(독일의 BioRad사의 Aminex-HPX-87H)과 215 nm에서 분광 광도계 탐지기(독일의 Sycam사의 S3300)를 사용하여 HPLC(독일의 Sycam)에 의해 아세트산 농도를 측정하였다. 아미노-특정 반응물 오르토-프탈산 디알데히드(amino-specific reactant ortho-phthalic dialdehyde(OPA))와 머캅토-에탄올로 예비 유도체화(prederivatisation)하고, 그 이후에 역상 컬럼(reversed phase column)과 형광 탐지기(fluorescence detector)를 사용하여 HPLC에 의해서 아미노산 농도(L-Phe과 L-Tyr)를 측정하였다. Lichrospher(상표명) C8 컬럼(독일의 Langerwehe, CS Chromatographie Service GmbH)과 예비컬럼(precolumn, 독일의 Langerwehe, CS Chromatographie Service GmbH, Lichrospher 100 RP 18-5 EC)을 사용하여 역상 HPLC(미국 Palo Alto, Hewlett Packard Company, HP 1100 System)에 의해 생산물인 2,3 트란스-시클로헥사디엔디올의 농도를 측정하였다. 275 nm에서 포토다이오드 배열 탐지기(Photodiode array detector, DAD)로 2,3 트란스-시클로헥사디엔디올을 확인하였다.
모든 1H NMR 스펙트라를 Bruker AMX300 FT-NMR 분광계(300 MHz)에 기록하였다. 배양 상등액의 1H NMR 0.4 mL에 있어서는 진공 원심분리에서 건조한 상태로 농축시키고, 3-(트리메틸실일)-프로피온-2,2,3,3-d4 산의 나트륨 염, TSP 4 mM을 함유하는 중수소 산화물(D2O)에 재용해시켰다. NMR 시료중 3,4-트란스-시클로헥사디엔디올의 2,3-트란스-시클로헥사디엔디올의 농도는 정수 TSP 표준 신호(‰, 0 ppm)와 대사산물의 정수를 비교하여 계산하였다.
온-라인 글루코스 측정
세개의 퍼리스탈틱 펌프(독일의 Watson & Marlow의 U 504와 U 101, 실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 U 501과 U 101)를 연속적으로 시료를 취하기 위해서 사용하였다. 직류 중공 섬유 한외여과 유닛(cross-flow hollow fibre ultrafiltration unit, 독일의 Schleicher & Schuell의 여과 영역은 23 ㎠(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 20 ㎠)이며, 500 kDa 컷-오프)을 함유하여 800 mL/min 유속으로 발효 배지를 우회로 펌프하였다(총 부피:≒ 20 mL, 평균 잔류 시간:≒ 2s). 1.0 mL/min 내지 2.0 mL/min의 세포가 없는 투과액을 연속적인 온-라인 글루코스 측정 시스템(독일의 IBA GmbH, OLGA)의 다기관에 흘려보내고, 펌프하였으며, 매 120 초 마다 분석을 위해서 10 uL의 시료를 흘려보냈다. 사용하지 않은 투과액은 생물 반응기에 재순환된다. 따라서, 100 mL 미만의 투과액을 발효 중에 온-라인 글루코스 측정을 위해 사용하였다. 전체 시료 채취 시스템은 30 분(실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에 있어서는 120 분) 동안 50 ℃에서 1 M NaOH를 사용하여 살균하였다.
실시예 Ⅰ과 실시예 Ⅱ에서의 공정 조절
Infors(스위스) 장치를 사용하여 표준 공정 파라메터를 조절하였다. 주요한 결과 획득은 LabView(미국의 National Instrument사 제품)로 파악하였으며 상기 LabView는 MEDUSA(IBT 소프트웨어)와 OLGA 조절 시스템과 결합되어 있다. 온-라인 글루코스 측정 신호는 OLGA로부터 LabView를 통해 MEDUSA로 보내지며, 조절 시스템은 미리 규정한 글루코스 설정점에 도달시키기 위해 최적의 글루코스 공급 속도를 평가하는 최소의 변이 조절기(minimal variance controller, Bastin et al., 1984)와 칼만-필터(Kalman-filter)로 구성된다. 글루코스 공급 속도는 공급 시스템(독일의 Satorius)을 사용하여 자동으로 조정된다. 티로신은 배출 가스에서 O2-/CO2(독일의 Leybold사의 Binos 100 2M), 생물 반응기 중량, 및 공기 흐름 속도(air flow rate)를 측정함으로써 비용(volume specific) 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate, OUR)의 온-라인 평가를 사용하여 증식기 중에 간접적으로 조절하였다. 비용 L-Tyr 소비 속도는 MEDUSA에서 평가하였고, 25 g/L을 함유하는 공급은 공급 시스템(독일의 Satorius)을 사용하여 조정하기 위해 사용하였다.
실시예 Ⅲ과 실시예 Ⅳ에서의 공정 조절
Bioengineering(스위스) 장치를 사용하여 표준 공정 파라메터를 조절하였다. 주요한 데이터 획득은 LabView(미국의 National Instrument사 제품)로 파악하였으며 상기 LabView는 OLGA 조절 시스템과 결합되어 있다. 온-라인 글루코스 측정 신호는 OLGA로부터 LabView로 보내지며, 예보성 및 피드백 조절 연산(predictive and feedback control algorithm, Kleman et al., 1991)은 미리 규정한 글루코스의 설정점에 도달시키기 위한 글루코스 공급 속도를 평가한다. 글루코스 공급 속도는 공급 시스템(독일의 Satorius)을 사용하여 자동으로 조정된다. L-티로신은 배출 가스에서 O2-/CO2(독일의 Leybold사의 Oxynos 100과 Binos 100), 생물 반응기 중량, 및 공기 흐름 속도(수학식 1)를 측정함으로써 비용 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate, OUR)의 온-라인 평가를 사용하여 증식기 중에 간접적으로 조절하였다. 비용 L-티로신 소비 속도는 LabView(미국의 National Instruments사 제품)에서 평가하였고, 25 g/L을 함유하는 공급물은 공급 시스템(독일의 Satorius)을 사용하여 조정하기 위해 사용하였다.
실시예 Ⅰ과 실시예 Ⅱ에서 L-페닐알라닌 생산을 위한 생물학적 시스템
대장균 K 12 LJ110(Zeppenfeld et al. 2000)를 기본으로, 유사 대장균 aroF-fbr(유전형 △(pheA tyrA aroF)/pJF119EH aroF fbr pheA fbr aroL wt 를 암호화함)와 대장균 aroF-wt(유전자 △(pheA tyrA aroF)/pJF119EH aroF wt pheA fbr aroL wt 를 암호화함)를 갖는 두개의 생산 균주를 플라스미드 pJF119EH를 사용하여 제조하였다(Fuerste et al., 1986). 두개의 균주에서, 유전자 pheA(초리스메이트 뮤타아제/프리페네이트 탈수효소를 암호화함), tyrA(초리스메이트 뮤타아제/프리페네이트 탈수소효소를 암호화함), 및 aroF(DAHP-합성 효소(3-데속시-D-아라비노-헵투소네이트-7-포스페이트, 3-desoxy-D-arabino-heptusonate-7-phosphate)를 암호화함)는 염색체내에서 삭제하였다. 대장균에서, 세개의 동종 효소 AroF(티로신에 의해 피드백 저해됨), AroG(페닐알라닌에 의해 피드백 저해됨) 및 AroH(트립토판에 의해 피드백 저해됨)는 DAHP-합성 효소 활성이 있다. 대장균 aroF-fbr에서, DAHP-합성 효소의 티로신 내성 유도체(tyrosine resistant derivate, aroF fbr )를 플라스미드에 삽입하였다. 대장균 aroF-wt의 플라즈미드는 aroF fbr 대신에 티로신 민감성 aroF wt 를 포함한다. 부가적으로 페닐알라닌 피드백-내성 pheA fbr 와 천연 aroL wt (시키메이트 키네이즈 II를 암호화함)를 AroL 활성을 증가시키고, 페닐알라닌에 의한 PheA 피드백 저해를 피하기 위해서 pJF119EH에 삽입하였다. △tyrA 때문에 생산 균주는 티로신 영양 요구성이다. 발현 벡터 pJF119EH를 사용하여, 상기 균주는 앰피실린 내성을 가지며, IPTG-유도성(글루코스 내성 tac-프로모터가 사용됨)이다.
실시예 Ⅲ에서 2,3-트란스-시클로헥사디엔디올 생산을 위한 생물학적 시스템
대장균 K 12 LJ110(Zeppenfeld et al. 2000)를 기본으로, 생산 균주 대장균 F82(유전형 △(pheA tyrA aroF)::kan △(entCEBA)::cat/pJF119EH aroF wt aroB wt aroL wt entB entC를 암호화함)를 플라스미드 pJF119EH를 사용하여 제조하였다(Fuerste et al., 1986). 상기 균주에서, 유전자 pheA(초리스메이트 뮤타아제/프리페네이트 탈수효소를 암호화함), tyrA(초리스메이트 뮤타아제/프리페네이트 탈수효소를 암호화함), 및 aroF(DAHP-합성효소(3-데속시-D-아라비노-헵투소네이트-7-포스페이트, 3-desoxy-D-arabino-heptusonate-7-phosphate)를 암호화함)는 염색체내에서 삭제하였다. 부가적으로, 전체 entCEBA 오페론을 불활성화하였다. EntCEBA는 entC, entE, entB 및 entA를 갖는 오페론을 나타낸다. 부가적으로 네이티브 aroF wt (DAHP 합성 효소를 암호화함), aroL wt (시키메이트 키네이즈 II를 암호화함) 및 aroB wt (디히드로퀴네이트 합성 효소를 암호화함)는 AroF, AroL 및 AroB의 활성을 증가시키기 위해서 pJF119EH에 삽입하였다. pheA 삭제 때문에, 생산 균주는 또한 L-페닐알라닌 영양 요구성이다.
실시예 Ⅳ에서 3,4-트란스-시클로헥사디엔디올 생산을 위한 생물학적 시스템
생산 균주로서 대장균 pC22F82(유전자 △(pheA tyrA aroF)::kan △(entCEBA)::cat/pJF119EH aroF wt aroB wt aroL wt entB를 암호화함)를 사용하였으며, 상기 균주는 실시예 Ⅲ에서 2,3-트란스 시클로헥사디엔디올 생산을 위해 사용하는 생산 균주와는 다르며, 상기 경우에는 대장균 균주가 entC 활성을 발현시키지 않는다.
실시예 Ⅰ. L-페닐알라닌 생산
대장균 aro F-fbr 균주로 발효를 실행하였다. 초기 글루코스 농도가 발효 개시 후 대략 10 시간 이후에 선택된 글루코스 조절 값(0.1;5.0, 15.0;30.0)으로 감소되는 경우에 글루코스 조절을 개시하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신 공급 조정에 따른 티로신 조절은 발효 배지중의 L-티로신 농도를 20 mg/L 미만으로 유지시키기 위해서 발효 개시로부터 6 시간 이후에 개시하였다. L-페닐알라닌 생산을 유도하기 위해 620 nm(OD620)에서 광학 밀도가 10 내지 15가 수득된 이후(발효 개시 후 대략 6 시간 이후)에 IPTG 100 uM를 첨가하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신 공급 조절에 따른 L-티로신 조절을 정지시킨 이후에, 5 %의 암모니아수에 용해되어 있으며, 25 g/L L-L-티로신을 함유하는 L-티로신 용액 100 mg/h의 연속 공급을 개시하였다. 발효 배지 중의 글루코스 농도가 0.1 g/L, 5 g/L, 15 g/L 및 30 g/L로 조절되고, 및 L-티로신이 36 mg/L 미만으로 조절된 결과로서 다른 시점에서 발효 배지 중의 L-페닐알라닌(L-Phe) 농도 및 아세테이트(Ac) 농도를 표 1에 나타내었다.
실시예 Ⅱ. 피드백 내성 aro F를 갖는 균주 또는 야생형 aro F를 갖는 균주에 있어서의 L-페닐알라닌 생산
(야생형 aroF를 갖는) 4pF69 균주와 (피드백 내성 aroF를 갖는) 4pF26 균주를 가지고 재료 및 방법에서 기재된 방법에 따라 발효를 실행하였다. 초기 글루코스 농도가 발효 개시 후 대략 10 시간 이후에 발효 배지중 글루코스 농도를 5 g/L로 감소된 경우 글루코스 조절을 개시하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신 공급 조정에 따른 L-티로신 조절은 발효 배지 중의 L-티로신 농도를 20 mg/L 미만으로 유지시키기 위해서 발효 개시로부터 6 시간 이후에 개시하였다. 2개의 다른 m-값(m=1.0, m=1.5)을 선택하고, k-값을 30으로 설정하였다. L-페닐알라닌 생산을 유도하기 위해 620 nm(OD620)에서 광학 밀도가 수득된 이후(대략 발효 개시 6 시간 이후)에 IPTG 100 uM를 첨가하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신 공급 조절에 따른 L-티로신 조절을 정지시킨 이후에, 5 %의 암모니아수에 용해되어 있으며, 25 g/L L-티로신을 함유하는 L-티로신 용액 100 mg/h의 연속 공급을 개시하였다. 다른 m-값 및 다른 균주의 결과로서 동시에 다른 시점에서 발효 배지 중에서의 L-페닐알라닌(L-Phe) 농도를 표 2에 나타내었다.
실시예 Ⅲ. 2,3-트란스 시클로헥사디엔디올 생산
상기에서 기재한 것과 같이 F82pC20 균주를 가지고 재료 및 방법에서 기재된 방법에 따라 발효를 실행하였다. 초기 글루코스 농도가 발효 개시 후 대략 5 시간 이후에 발효 배지 중의 글루코스 농도가 4 g/L로 감소된 경우 글루코스 조절을 개시하였다. 글루코스는 5 g/L의 설정점 주위로 조절하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신 공급 조정에 따른 L-티로신 조절은 발효 배지 중의 L-티로신 농도를 20 mg/L 미만으로 유지시키기 위해서 발효 개시로부터 7.5 시간 이후에 개시하였다. 2,3-트란스-시클로헥사디엔디올 생산을 유도하기 위해 8-9(OD620)의 광학 밀도가 수득된 이후(대략 발효 개시 6 시간 이후)에 IPTG 100 uM를 첨가하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신/L-페닐알라닌 공급 조절에 따른 L-티로신 조절을 정지시킨 이후에(발효 개시 후 16 시간 이후), 10 %의 암모니아수에 용해되어 있으며, 15 g/L L-페닐알라닌과 12.5 g/L의 L-티로신을 함유하는 L-티로신/L-페닐알라닌 용액 20 mg/h의 연속 공급을 개시하여 L-티로신 농도를 36 mg/L 미만으로 조절하고, L-페닐알라닌 농도(100 mg/L 이상으로)를 포화시켰다. 상기 발효 결과를 하기 표 3에 나타내었다:
실시예 Ⅳ. 3,4-트란스 시클로헥사디엔디올 생산
F82pC22 균주를 가지고 발효를 실행하였다. 초기 글루코스 농도가 발효 개시 후 대략 7 시간 이후에 발효 배지 중의 글루코스 농도가 5 g/L로 감소된 경우 글루코스 조절을 개시하였다. 글루코스는 3.5 g/L의 설정점 주위로 조절하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신 공급물의 조정에 따른 L-티로신 조절은 발효 배지중의 L-티로신 농도를 대략 20 mg/L 미만으로 유지시키기 위해서 발효 개시로부터 9 시간 이후에 개시하였다. 3,4-트란스-시클로헥사디엔디올 생산을 유도하기 위해 8-9(OD620nm)의 광학 밀도가 수득된 이후(대략 발효 개시 6.5 시간 이후)에 IPTG 100 uM을 첨가하였다. OUR의 온-라인 측정 및 L-티로신/L-페닐알라닌 공급 조절에 따른 L-티로신 조절을 정지시킨 이후에(발효 개시 후 16 시간 이후), 10 %의 암모니아수에 용해되어 있으며, 15 g/L L-페닐알라닌과 12.5 g/L의 L-티로신을 함유하는 L-티로신/L-페닐알라닌 용액 20 mg/h의 연속 공급을 개시하여, L-티로신 농도를 검출 한계 미만으로 제한하고, L-페닐알라닌 농도를 포화시켰다(100 mg/L 이상). 상기 발효 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
본 발명은 대장균(Escherichia coli)의 호기성 발효(aerobic fermentation)에 의한 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 발효는 증식기(growth phase)와 생산기(production phase)를 포함하고, 발효 중에 글루코스와 L-티로신이 조절된다.
본 출원의 목적에 있어서, "방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체(an aromatic amino acid metabolite or derivative thereof)"라는 용어는 L-티로신과 L-티로신으로부터 유도된 생산물을 제외하고, 방향족 아미노산 경로의 최종 생산물(end product) 또는 방향족 아미노산 경로내의 중간체(intermediate), 또는 상기 대사산물로부터 유도된 생산물인 특정의 대사산물을 의미한다. 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 예로는 예를 들어 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트, 3-디히드로퀴네이트, 퀸산, 히드로퀴논, 3-디히드로시키메이트, 카테콜, 아디프산, 시클리톨(cyclitol), 시키메이트, 시키메이트-3-포스페이트, 5-에놀피루베이트-3-포스페이트, 초리스메이트(chorismate), L-트립토판, 인디고, 프리페네이트, L-p-히드록시페닐글리신, L-페닐글리신, D-p-히드록시페닐글리신, D-페닐글리신, 페닐피루베이트, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, 안트라닐레이트, 포스포리보실 안트라닐레이트, 1-(ο-카르복시페닐아미노)-1-데옥시리불로스-5-포스페이트, 인돌 3-글리세롤 포스페이트, 인돌, 4-히드록시페닐피루베이트이다. 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체는 L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, D-히드록시페닐글리신, D-페닐글리신 또는 시키메이트가 바람직하다. 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체는 L-페닐알라닌 또는 시클리톨 중의 하나: 2,3-트란스-시클로헥사디엔디올 또는 3,4-트란스-시클로헥사디엔디올이 보다 바람직하다.
"호기성 발효(aerobic fermentation)"라는 용어는 산소가 존재하며, 산소를 전체 발효 중에 제한하지 않는 것을 의미한다.
대장균 발효 중의 증식기는 대장균 발효 배지의 생물량(biomass) 농도가 증가하는 단계이다. 620 nm(OD620)에서 발효 배지의 광학 밀도를 측정함으로써 상기 생물량 농도를 측정할 수 있다. 대장균 발효 중의 생산기는 생산물인, 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체를 생산하는 단계이다. 증식기와 생산기는 증식기 이후에 생산기 그리고 생산기 이후에 증식기가 발생할 수 있지만, 실제로는 증식기와 생산기가 겹쳐서 발생한다.
"발효 배지(fermentation medium)"라는 용어는 대장균 세포를 포함하는, 모든 성분을 갖는 액체 발효 배지를 의미한다.
발효는 증식기와 생산기를 포함하고, 발효 중의 글루코스와 L-티로신이 조절되는, 대장균의 호기성 발효에 의한 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법은 Takagi et al.,(1996) Biotechnology and Bioengineering Vol. 52, p 653-660에 공지되어 있다. 상기 문헌은 재조합 대장균 AT2471에 의해서 L-페닐알라닌 생산을 위한 호기성 발효 생산 방법을 기재하고 있으며, 상기 발효에서 발효 배지 중의 글루코스 농도는 발효 개시 10 시간 후(대략 생산기가 개시되는 시간과 동일함)에 초기 양의 글루코스가 소모된 이후 0.1 g/L 미만으로 조절되며, L-티로신 공급은 30 시간 후(대략 증식기가 끝나는 시간과 동일함)에 초기 L-티로신이 소모된 후 13.5 ℓ의 발효 배지의 부피로 1시간 당 2 g/L L-티로신의 용액 100 mg(1 시간 당 약 0.2 g L-티로신의 첨가에 상응함)으로 조절된다.
Takagi et al.(1996)의 실험에서, 글루코스는 발효 배지 중에 0.1 g/L 미만으로 글루코스 농도가 유지됨으로써 조절되며, 높은 생산성에 있어서, 아세트산의 축적을 방지하기 위해 가장 중요한 것으로 사료되기 때문이다. 아세테이트 축적을 방지하기 위해서 글루코스 농도를 낮은 수준으로 조절하는 것이 필요하다는 것이 다른 사람들(그 중에서도 특히 Sakamoto et al.,(1994) J. Ferm. Bioeng. Vol. 78, p 304-309, Shiloach et al.,(1996) Biotechnol. Bioeng. Vol 49, p 421-428, Luli et al.,(1991), Appl. Environ. Microbiol. Vol 56, p 1004-1011)에 의해서도 확인되었다.
방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체를 생산하기 위해 대장균 균주를 발효시키는 경우 대장균에 의해 아세테이트가 분비됨으로써 야기되는 아세트산의 축적은 바람직하지 않으며, 상기는 그 중에서도 특히 증식 속도를 감소시키고, 최종 세포 농도를 감소시키며[Kleman et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57(4) 918-923], 글루코스의 섭취를 감소시키고[Xu B., et al., 1999 Biotechnol. Prog. 15, 81-90], 및 이로 인해 공정의 총 수율(생산물/기질의 몰 %)이 감소된다.
따라서 아세테이트는 발효를 저해시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 발효 배지 중의 발효 공정을 방해하는 세포외 아세테이트 농도를 억제 아세테이트 농도(inhibiting acetate concentration)라고 말한다. 억제 아세테이트 농도는 균주에 따라 달라지며, 본 발명의 목적에 있어서, 생물체의 최대 생산 비율을 반감시키는 농도로서 규정된다. 당 분야에 통상의 지식을 가진 자들은 억제 아세테이트 농도에 있어서의 다른 규정도 존재한다고 알고 있다. 예를 들어 Xu et al., 1999. Biotechn. Prog. Vol. 15, p 81-90은 최대 세포 증식이 반감되는 농도로 억제 아세테이트 농도를 규정하며, 균주 W3110에서 유도된 대장균 K12에 있어서 억제 아세테이트 농도(k i)는 9 g/L로 확인되었다. 바람직한 실시형태에서, 발효는 억제 아세테이트 농도에 도달할 때 까지 실행되며; 그 다음에 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법에 따라서 형성된 생산물을 분리시킬 수 있다.
L-티로신은 방향족 아미노산 경로의 피드백 조절(feed-back regulation)을 초래하는 것으로 통상 공지되어 있다. 상기 피드백은 이중으로 조절된다: (1) 상기는 방향족 아미노산 경로에서 몇몇 효소들을 저해시키며, 상기는 L-티로신(예를 들어 3-데소시-D-아라비노-헵투소네이트-7-포스페이트 합성효소, 또한 DAHP 합성효소라고도 공지됨)에 의해 피드백 조절되며, 그리고 (2) 상기는 tyrR 레귤론(regulon)에 활성 효과를 가지며, 상기 tyrR 레귤론은 L-티로신의 영향하에 단백질을 생산하며, 방향족 아미노산 경로내 필수 효소를 발현시키는 몇몇 유전자의 발현을 억제한다. L-티로신 농도가 36 mg/L이면 DAHP 합성 효소의 86 %가 억제되고, L-티로신 농도가 1.8 mg/L 만큼 낮아지면 효소 합성이 44 %로 감소된다는 것이 Foerberg et al.,(1998) J. Biotechnol. Vol 8, p 291-300에 의해서 밝혀졌다.
따라서 너무 많은 L-티로신이 존재하면 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산에 크게 영향을 준다. 대장균의 호기성 발효에 의한 방향족 아미노산 대사산물 또는 유도체의 생산 중에 존재하는 L-티로신의 양을 제한하기 위해서 통상적으로 대장균 균주가 사용되며, 상기 균주는 L-티로신 영양 요구성(auxotrophic) 균주(예를 들어 상기 균주는 그 자체가 특정의 L-티로신을 생산하지 않음)이다. Takagi et al.(1996)은 세포를 유지하기 위해서 필요하지만, 너무 많을 경우에는 L-페닐알라닌의 생산을 감소시키는 L-티로신의 초기 값이 소모된 이후(대략 발효 후 30 시간 이후) 일정한 값(대략 0.2 g/h)으로 L-티로신의 공급을 유지하였다.
발효 배지 중의 글루코스를 0.1 g/L 미만으로 조절하는 것의 단점은 대규모 발효에서 최대 생산 비율은 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체를 생산하기 위한 미생물에 의해서 사용되는 주요한 탄소 공급원이 글루코스라면 전체 발효 배지에서 달성될 수 없다는 것이다. 상기는 대규모 발효에서 글루코스(및 다른 영양분)의 분포가 전체 발효 배지에서 균질화될 수 없다는 사실 때문에 초래된다. 따라서, 대규모 발효에서 글루코스를 0.1 g/L 미만으로 조절하면 주요 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용하여 미생물에 의해 생산되는 생산물의 최대 생산율을 확보하기 위해 충분하지 않은 글루코스 농도가 있는 발효 배지 중의 국소 부위가 존재하게 된다. 최대 생산율을 확보하기 위해 글루코스 농도가 충분하지 않다면, 상기 글루코스 농도가 제한된 것이라고 한다. 글루코스 농도가 제한되면, 또한 이의 생산물에 대한 미생물의 선별력을 감소시키고, 이는 더 많은 부산물이 형성됨을 의미한다. 부산물(byproduct)은 생산물(방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체) 그 자체를 제외하고 글루코스로부터 형성된 모든 것을 말한다.
본 발명의 목적은 대장균의 호기성 발효에 의해서 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 발효는 증식기와 생산기를 포함하고, 상기 발효에서는 글루코스와 L-티로신이 조절되며, 상기 글루코스 농도는 발효 배지 중에 제한하지 않고, 아세테이트에 의한 억제가 방지되며, L-티로신의 억제 효과가 제한된다.
본 발명의 목적은 적어도 생산기 중에 발효 배지 중의 L-티로신의 농도를 36 mg/L 미만으로 조절하고, 그리고 발효 배지 중의 글루코스 농도를 1 g/L 내지 20 g/L 범위 내에서 조절함으로써 수득된다.
놀랍게도, 발효 배지 중의 글루코스 농도가 1 g/L 이상의 값으로 조절되는 경우에도 아세테이트 농도는 생산기 중 10 시간 이상 동안 억제되지 않는다는 것을 발견하였다.
발효 배지 중의 글루코스 농도는 1 g/L 내지 20 g/L의 범위, 바람직하게는 1 g/L 내지 15 g/L의 범위, 보다 바람직하게는 3 g/L 내지 10 g/L의 범위, 가장 바람직하게는 4 g/L 내지 6 g/L의 범위 내에서 본 발명에 따라 조절된다. 글루코스 농도의 변화는 1 g/L 내지 20 g/L 범위의 글루코스 농도내에 있는 좁은 범위(부분 범위(subrange))내에서 다양한 것이 바람직하다. 바람직하게, 부분 범위의 상한과 하한의 차이는 10 g/L 미만이며, 상기는 예를 들어 글루코스 농도가 3 g/L 내지 13 g/L 또는 7 g/L 내지 17 g/L, 또는 1 g/L 내지 11 g/L로 조절되는 것을 의미한다. 보다 바람직하게, 부분 범위의 상한과 하한의 차이는 5 g/L 미만이며, 상기는 예를 들어 글루코스 농도가 3 g/L 내지 8 g/L, 7 g/L 내지 12 g/L, 1 g/L 내지 6 g/L를 의미한다. 보다 더 바람직하게, 부분 범위의 상한과 하한의 차이는 2 g/L 미만이며, 상기는 예를 들어 글루코스 농도의 변화가 3 g/L 내지 5 g/L, 16 g/L 내지 18 g/L, 4 g/L 내지 6 g/L인 것을 의미한다. 가장 바람직하게, 부분 범위의 상한과 하한의 차이는 1 g/L 미만이며, 상기는 예를 들어 글루코스 농도의 변화가 5 g/L 내지 6 g/L, 17 g/L 내지 18 g/L, 1 g/L 내지 2 g/L인 것을 의미한다. 가장 좋은 결과는 3 g/L 내지 10 g/L, 특히 4 g/L 내지 6 g/L내에 부분 범위가 존재하는 경우에 수득된다.
발효 배지 중의 글루코스 농도는 초기 글루코스가 선택된 조절 범위내의 값에 도달한 후 조절되는 것이 바람직하다. 발효 배지 중의 초기 글루코스 농도는 10 g/L 내지 40 g/L의 범위, 보다 바람직하게는 15 g/L 내지 35 g/L의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 글루코스는 생산기 전체에 걸쳐 조절된다.
L-티로신 조절은 초기 L-티로신 농도가 선택된 상한선 또는 상한 미만의 L-티로신 농도가 된 이후에 개시되는 것이 바람직하며, L-티로신의 초기 양이 모두 소모되기 전에 개시되는 것이 바람직하다. 초기 L-티로신 농도는 100 mg/L 내지 380 mg/L의 범위, 보다 바람직하게는 200 mg/L 내지 300 mg/L의 범위내에서 선택되는 것이 바람직하다. L-티로신 조절의 개시 시간은 중요하지는 않지만, 발효 3 시간 후, 바람직하게는 발효 4 시간 후, 보다 바람직하게는 발효 5 시간 후, 가장 바람직하게는 발효 6 시간 후일 수 있다. 놀랍게도, L-티로신 조절이 Takagi et al.(1996)에 의해서 기재된 것과 같이 발효 중 30 시간 보다 더 이른 시간에 개시된다면, 생산물/기질 수율이 증가된다는 것이 발견되었다. L-티로신은 발효 배지 중의 L-티로신 농도를 36 mg/L 미만, 보다 바람직하게는 20 mg/L 미만, 보다 더 바람직하게는 10 mg/L 미만으로 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 발효가 증식기에 있는 한 L-티로신 조절을 실행시키는 것이 바람직하다. 발효가 더 이상 증식기에 있지 않은 경우(통상적으로 발효 20 시간 후), 일정한 L-티로신 공급을 선택적으로 개시한다. 1 g/L의 세포 건조 중량 농도(CDW)를 갖는 발효 배지를 함유하는 생물 반응기(bioreactor)에 공급되는 일정한 L-티로신 양은 1 시간 당 0.01 g 내지 5 g의 티로신 범위 내에서 선택되는 것이 바람직하다. 따라서, 10 ℓ발효 배지를 함유하는 생물 반응기가 30 g/L의 CDW(총 300 g의 CDW)를 가진다면, 1 시간 당 공급되는 L-티로신의 양은 0.003 kg 내지 1.5 kg의 범위 내에서 선택되는 것이 바람직하다. CDW는 재료와 방법에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 공정에 사용되기에 적당한 대장균 균주는 모든 대장균 균주이며, 상기 균주는 글루코스를 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체로 전환하는 능력을 가지며, L-티로신 영양 요구성 세포이다. 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산에 있어서, 균주는 요구되는 최종 생산물로부터 저해된 하류 경로(impeded downstream pathway)를 가지는 것이 바람직하며, 하류 경로(예를 들어 시키메이트-3-포스페이트 및 추가로 시키메이트를 생산하는 경우에 초래됨)는 목적하는 최종 생산물(예를 들어 시키메이트)의 추가의 전환을 유도할 것이다. 대안적으로, 목적하는 최종 생산물은 생산된 세포로부터 분리된다. 보다 바람직하게, 하류 경로의 저해 뿐만 아니라, 목적하는 최종 생산물과는 다른 생산물을 초래하는 경로(가지치기 경로, branching pathway)가 또한 저해된다(예를 들어 목적하는 최종 생산물로서 L-페닐알라닌의 경우에 L-티로신으로의 경로). 상기 모든 측정은 목적하는 최종 생산물(방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체)로 글루코스 플럭스(flux)의 높은 효율을 획득하는 것을 목적으로 한다. 유사한 결과를 획득하기 위해 상기에서 기재된 방법 이외의 다른 방법이 있을 것임은 당 분야에 통상의 기술을 가진 자에게는 명확하다.
적당한 대장균 균주의 예로는 예를 들어 L-페닐알라닌 생산 균주이며, 상기는 대장균 K12 균주, 바람직하게는 대장균 W3110, 보다 바람직하게는 대장균 LJ110이 기본이다(Zeppenfeld et al.(2000), J. Bacteriol. Vol 182, p 4443-4452). 예를 들어 L-트립토판, 3-디히드로시키민산, 시키민산 및 D-페닐알라닌을 생산할 수 있는 대장균 균주의 다른 예는 Bongaerts et al.(2001) Metabolic Engineering(2001) vol. 3, p 289-300에 기재되어 있다.
방향족 아미노산 경로로부터 생산물, 보다 특히 글루코스로부터 시키메이트 3-포스페이트를 생산할 수 있는 능력을 가지며, 시키메이트 3-포스페이트를 5-에놀피루빌-시키메이트-3-포스페이트로 추가 전환시키는 하류 경로가 저해된 대장균 균주의 예는 대장균 균주 AB2829(CGSC-균주, Pittard et al.(1966) J Bacteriol. Vol 92, p 1494-1508)이다. 상기 균주는 시키메이트 3-포스페이트를 5-에놀피루빌-시키메이트-3-포스페이트로 전환할 수 있는 5-에놀피루빌-시키메이트-3-포스페이트 합성 효소(EPSP-합성 효소)를 암호화하는 유전자(aroA)가 삭제되었다.
글루코스로부터 L-페닐알라닌을 생산할 수 있는 능력을 가지며 다른 생산물을 유도하는 가지치기 경로(branching pathway)가 저해된 대장균 균주의 또 다른 예로는 대장균 K12 균주 4pF26과 4pF69가 있으며, 상기 균주들은 프리페네이트가 4-히드록시페닐피루베이트(L-티로신을 생산하기 위한 전구 물질)로 전환되는 정상적인 환경하에서 초리스메이트 뮤타아제/프리페네이트 탈수소효소(dehydrogenase)를 암호화하는 유전자(tyrA)가 삭제되었다.
L-티로신의 저해 효과를 제한하기 위해서는 주로 야생형(WT) 유전자 aroFWT(L-티로신 피드백 조절된 3-데속시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 합성 효소를 암호화함)가 대장균 게놈에서 삭제하고, 유전자 aroFFBR의 L-티로신 피드백 내성(FBR) 변이체(variant)를 게놈 등에 삽입함으로써, 대장균 균주에서, 예를 들어 벡터상에 보완한다.
놀랍게도, 본 발명에서 야생형 aroF-유전자(aroFWT)를 갖는 대장균 균주를 사용하면 aroFFBR가 보완된 삭제된 aroFWT-유전자를 갖는 대장균 균주를 사용하는 것 보다 L-페닐알라닌의 생산물/글루코스 수율(몰%)이 더 높아진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 예를 들어 벡터 상에 또는 대장균 게놈 중에 aroFWT가 발현되는 대장균 균주가 사용된다.
본 발명에 따른 공정이 실행되는 반응 조건은 통상 대장균의 호기성 발효용으로 선택된 반응 조건이며, 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 10 ℃ 내지 70 ℃의 범위, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃ 범위, 가장 바람직하게는 33 ℃ 내지 37 ℃ 범위에서 선택된 온도와 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 6.6 내지 6.8 범위의 pH이다. 배지 조성은 또한 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며; 가장 적당한 배지는 M9 배지(Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)가 사용된다.
글루코스 농도는 예를 들어 재료 및 방법에 기재된 것과 같은 방법으로 적당하게 직접 기록될 수 있으며, 글루코스 공급은 이에 따라서 조정될 수 있다.
L-티로신 농도는 L-티로신 농도와 직선 또는 직선이 아닌 상관 관계(예를 들어 CO2 방출 속도 또는 산소 섭취 속도와 같은 배기 가스 신호)를 갖는 측정가능한 변수 측정에 의해서 직접 적당하게 기록될 수 있다. 상기 상관 관계는 실험적으로 확립시킬 수 있으며, 그 다음에 L-티로신 농도를 선택된 설정점(set-point) 미만으로 유지하고 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 수득율을 최적화하도록 L-티로신의 공급을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 특별한 실시형태에서, L-티로신 농도는 하기 선형 수학식 1에 따라 조정된다:
L-티로신의 공급()은 선택된 조절 농도 미만으로 L-티로신 농도를 유지시키 위해서 A(A는 측정된 산소 섭취 속도(OUR) 또는 대안적으로 CO2 방출 속도(CER)임)에 따라서 조정될 수 있다. 상기 수학식 1에서, m과 k는 예를 들어 m 또는 k 값을 증가시킴으로써 L-티로신 제한을 증가시키기 위해서 조정될 수 있는 조절 파라메터를 나타낸다. 최적의 조절 파라메터는 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 수율을 최적화할 수 있도록 선택된다. m 값은 통상 0.1 내지 4의 범위내에서 선택되며; k 값은 통상 20 내지 40의 범위 내에서 선택된다. 최적 m과 k 값은 실험적으로 결정될 수 있다. 상기 방법을 사용함으로써 L-티로신 농도의 양호한 조절에 있어서, pH, 온도 또는 용해된 산소 농도(DO)와 같은 다른 상태 변수는 일정하게 유지되어야 한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해서 설명하였다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.

Claims (17)

  1. 대장균(Escherichia coli)의 호기성 발효에 의한 방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체의 생산 방법으로서,
    상기 발효는 증식기(growth phase)와 생산기(production phase)를 포함하며, 상기 발효에서 글루코스와 L-티로신이 조절되고, 적어도 생산기 중에 발효 배지 중의 글루코스 농도가 1 g/L 내지 20 g/L의 범위 내에서 조절되며, 발효 배지 중의 L-티로신 농도가 36 mg/L 미만으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    글루코스 농도는 3 g/L 내지 10 g/L의 범위 내에서 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    글루코스 농도는 1 g/L 내지 20 g/L 또는 3 g/L 내지 10 g/L의 범위 내에서, 그 상한과 하한의 차이가 5 g/L 미만인 부분 범위(subrange) 내에서 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    글루코스 농도는 4 g/L 내지 6 g/L 범위 내에서 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항, 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L-티로신 농도는 20 mg/L 미만으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발효는 발효 부산물로서 생성되는 아세테이트의 농도가 억제 아세테이트 농도에 도달할 때까지 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글루코스 조절은 생산기 전부에 걸쳐 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    발효 배지 중의 티로신 농도는 발효가 증식기에 있는 시간 동안 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    티로신 농도 조절을 정지시킨 이후에 연속 티로신 공급이 개시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    연속 티로신 공급은 공급된 L-티로신 양은 0.01 g 내지 5 g/시간/세포 건조 중량 농도가 되도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지 중의 티로신 농도는 티로신 공급을 조정하기 위한 측정가능한 변수와 그 결과로서의 발효 배지 중의 티로신 농도 사이의 실험적으로 확립된 상관 관계를 사용함으로써 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지 중의 티로신 농도는 하기 수학식 1에 따라서 티로신 공급을 조정함으로서 조절되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (수학식 1)
    (상기 수학식 1에서,
    A는 발효 중 산소 섭취 속도(OUR) 또는 CO2 방출 속도(CER)를 나타내며,
    은 티로신 공급을 나타내고,
    k 및 m은 조절 파라메터를 나타낸다).
  13. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대장균 W3110이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방향족 아미노산 대사산물 또는 이의 유도체는 L-페닐알라닌, 2,3-트란스-시클로헥사디엔디올 또는 3,4-트란스-시클로헥사디엔디올인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    대장균에서 aroFWT가 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 티로신 공급을 조정하기 위한 측정가능한 변수와 그 결과로서의 발효 배지 중의 티로신 농도 사이의 실험적으로 확립된 상관 관계를 사용함으로써 조절되는 것을 특징으로 하는 티로신 농도 조절 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    티로신 공급은 하기 수학식 1에 따라 조정되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (수학식 1)
    (상기 수학식 1에서,
    A는 발효 중 산소 섭취 속도(OUR) 또는 CO2 방출 속도(CER)를 나타내며,
    은 티로신 공급을 나타내고,
    k 및 m은 조절 파라메터를 나타낸다).
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