FR2922218A1 - Bacterie de la famille des enterobacteriaceae produisant un l-aminoacide et procede de production de l-aminoacides l'utilisant - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne une bactérie produisant un L-aminoacide de la famille des Enterobacteriaceae qui comprend un ADN comprenant un gène codant une enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides, et un fragment d'ADN capable d'être transcrit et codant le peptide de SEQ ID NO : 2, ou un variant de celui-ci, où ledit fragment est fixé audit gène à l'extrémité 3' dudit gène, et un procédé pour produire un L-aminoacide par fermentation au moyen de ladite bactérie.

Description

Arrière-plan de l'invention Domaine technique La présente invention concerne un procédé pour produire un L-aminoacide par fermentation, et plus spécifiquement des gènes qui favorisent cette fermentation. Ces gènes sont utiles pour améliorer la production de L-aminoacides, en particulier de L-phénylalanine et de L-histidine.
Etat de la technique Conventionnellement, des L-aminoacides sont produits industriellement par des procédés de fermentation utilisant des souches de micro-organismes obtenues à partir de sources naturelles, ou de mutants de celles-ci. Typiquement, les micro-organismes sont modifiés pour augmenter les rendements de production de L-aminoacides. De nombreuses techniques pour augmenter les rendements de production de L-aminoacides ont été décrites, incluant la transformation de micro-organismes avec un ADN recombinant (voir par exemple le brevet US 4 278 765). D'autres techniques pour augmenter les rendements de production incluent l'augmentation des activités d'enzymes impliquées dans la biosynthèse des aminoacides et/ou la désensibilisation des enzymes cibles à l'égard de la rétro-inhibition par le L-aminoacide résultant (voir par exemple WO 95/16042 ou les brevets US n° 4 346 170, 5 661 012 et 6 040 160) et la création de souches bactériennes qui sont déficientes en les gènes qui utilisent les précurseurs du composé cible pour d'autres voies, ou la création de souches bactériennes qui sont déficientes en les gènes responsables de la dégradation du composé cible. Ces manipulations conduisent habituellement à des souches qui ne peuvent pas se développer, qui se développent seulement à une vitesse sensiblement réduite, ou qui nécessitent des nutriments supplémentaires, comme des aminoacides. Par exemple, l'augmentation de l'expression de certains gènes peut devenir excessive et pourrait conduire à une inhibition significative de la croissance bactérienne et, par suite, pourrait abaisser l'aptitude de la bactérie à produire le composé cible.
Une approche possible pour éviter les difficultés décrites ci-dessus consiste à optimiser l'expression des gènes qui codent des protéines impliquées dans la distribution des flux de carbone, d'azote ou de phosphore, ou l'excrétion de la substance cible hors de la cellule bactérienne. Ce but a souvent été atteint par introduction d'une mutation dans une séquence promotrice des gènes de biosynthèse d'aminoacides ou d'acides nucléiques (demande de brevet européen EP 1 033 407 Al), par obtention de la banque de promoteurs synthétiques de différentes activités (Jensen P. R. et Hammer K., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, n° 1, 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5) et création d'une banque de promoteurs artificiels (demande PCT WO 03089605). On sait que le marquage d'une protéine avec le marqueur peptidique ssrA, codé par l'ARN SsrA, marque la protéine marquée pour la dégradation protéolytique (Gottesmann S. et al., Genes & Dev., 12:1338-1347 (1998)). L'ARN SsrA (synonymes : SsrA, ARNtm, ARN 10Sa, ARN de transfert-messager, SipB, B2621) fonctionne en libérant un ribosome bloqué depuis l'extrémité d'un ARNm "rompu" qui est dépourvu de codon stop en agissant à la fois comme un ARNt et comme un ARNm, au moyen d'un mécanisme de "trans-traduction". SsrA médie aussi la libération du ribosome bloqué du fait de l'absence d'un ARNt approprié (Hayes C. S. et al., PNAS, 99(6) : 3440-3445 (2002)). D'autres problèmes de traduction peuvent aussi conduire à une activité SsrA. De plus, l'ARN SsrA stimule la dégradation d'ARNm défectueux (Yamamoto Y. et al., RNA, 9 : 408-418 (2003)). L'ARN SsrA contient une région structurale analogue à l'ARNt qui est maturée par la RNase P et chargée par l'alanyl-ARNt synthétase (Komine Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20) : 9223-7 (1994)). L'ARN SsrA a aussi une région qui joue le rôle d'ARN messager et qui code un marqueur traduit qui est ajouté à la protéine naissante et qui cible cette protéine pour la dégradation (Tu G.-F. et al., J. Biol. Chem., 270(16) : 9322-9326 (1995)). La structure de l'ARN SsrA et le mécanisme traductionnel ont été examinés en détail (Corvaisier S. et al., J. Biol. Chem., 278(17) : 14788-97 (2003)). L'ARN SsrA est transcrit sous forme d'un ARN précurseur de plus grande taille qui est ensuite maturé pour former l'ARN mature.
SsrA est similaire à des ARN provenant de Mycoplasma capricolum, Bacillus subtilis (Muto A. et al., Genes Cells, 7(5) : 509-19 (2000)), Dichelobacter nodosus, Synechococcus sp. souches PCC6301 et PCC6803, Thermus thermophilus, Salmonella enterica serovar Typhimurium, et à un ARN en deux parties provenant de Caulobacter crescentus. Des gènes d'ARNtm ont été utilisés comme sondes pour l'identification d'espèces bactériennes (Schonhuber W. et al., BMC Microbiology, 1(1) : 20 (2001)). Cependant, il n'existe aucun document décrivant l'utilisation du marquage ssrA pour la production de L-aminoacides, par exemple pour la production de L-phénylalanine ou de L-histidine. En particulier, il n'existe pas de description antérieure de l'utilisation d'une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae contenant un ADN codant le peptide de SEQ ID NO : 2 ou un variant de celui-ci, fixé immédiatement en aval d'un gène codant une enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 montre le schéma pour l'extension du gène tyrA. La figure 2 montre les positions relatives des amorces P1 et P2 sur le plasmide pMW118-attL-Cm-attR. La figure 3 montre la construction du fragment d'ADN chromosomique avec le gène pheA délété.
La figure 4 montre le schéma pour remplacer le locus du gène cat par le gène pheA. Locus du chromosome de E. col contenant l'allèle tyrA ssrA et le gène cat. Les sites de P4 et P5 utilisés pour vérifier la construction obtenue sont montrés sous forme de flèches noires.
La figure 5 montre l'alignement des séquences primaires du marqueur peptidique induisant la protéolyse codé par l'ARNtm provenant de Baal/us subtilis (BACSU), Bad/lus stearothermophilus (BACST), Serratia marcescens (SERMA), Escherichia col/ (ECOLI), Pseudomonas flurescens (PSECL), Pseudomonas chlororaphis (PSECL), Pseudomonas putida (PSEUPU). L'alignement a été réalisé en utilisant le programme d'alignement multiple PIR (http://pir.georgetown.edu). Les aminoacides identiques sont marqués par un astérisque (*), les aminoacides similaires sont marqués par deux points W.
RESUME DE L'INVENTION Des aspects de la présente invention incluent l'augmentation de la productivité de souches produisant des L-aminoacides et un procédé pour produire des L-aminoacides utilisant ces souches. Les aspects ci-dessus ont été obtenus en trouvant que le marquage SsrA d'une enzyme impliquée dans la synthèse d'un aminoacide cible qui partage des étapes communes dans sa voie de biosynthèse avec d'autres aminoacides peut augmenter la production de l'aminoacide cible aux dépens des aminoacides ayant des étapes de biosynthèse communes et/ou des précurseurs communs. On a constaté aussi que le marquage SsrA d'une enzyme impliquée dans la distribution des flux de carbone entre différentes voies de la glycolyse (par exemple les voies du pentose-phosphate et d'Entner-Duodoroff) peut augmenter la production de ces aminoacides avec des précurseurs produits dans l'une des voies de la glycolyse. Dans l'un et l'autre cas, on a constaté que les propriétés prototrophes des bactéries modifiées sont maintenues. Ce but a été atteint en construisant un nouveau gène tyrA variant et un nouveau gène pgi variant, où les protéines résultantes ont l'une et l'autre une courte séquence peptidique C-terminale codée par une partie du gène ssrA. On a montré que l'utilisation de ce TyrA-ssrA mutant pouvait augmenter la production de L-phénylalanine quand le gène tyrA- ssrA mutant est introduit dans les cellules de la souche produisant de la L-phénylalanine à la place du gène tyrA natif. On a montré aussi que l'utilisation d'un tel Pgi-ssrA mutant pouvait augmenter la production de L-histidine quand le gène pgi-ssrA mutant est introduit dans les cellules de la souche produisant de la L-histidine à la place du gène pgi natif. Ainsi, la présente invention a été réalisée. Un aspect de la présente invention consiste à fournir une bactérie de la famille des Enterobacteriaceae produisant un L-aminoacide comprenant un ADN comprenant un gène codant une enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides, et un fragment d'ADN capable d'être transcrit et codant le peptide de SEQ ID NO : 2, ou un variant de celui-ci, où ledit fragment d'ADN est fixé audit gène à l'extrémité 3' dudit gène. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir la bactérie décrite ci-dessus, où ladite bactérie appartient au genre 5 Escherichia. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir la bactérie décrite ci-dessus, où ladite bactérie est une bactérie produisant de la L-phénylalanine. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir la 10 bactérie décrite ci-dessus, où l'enzyme est la chorismate mutase/préphénate déshydrogénase. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir la bactérie décrite ci-dessus, où ladite bactérie est une bactérie produisant de la L-histidine. 15 Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir la bactérie décrite ci-dessus, où l'enzyme est la phosphoglucose isomérase. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir un procédé de production d'un L-aminoacide comprenant la culture de la 20 bactérie décrite ci-dessus dans un milieu de culture, et l'isolement du L-aminoacide à partir du milieu de culture. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir le procédé décrit ci-dessus, où ledit L-aminoacide est la L-phénylalanine. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir le 25 procédé décrit ci-dessus, où ledit L-aminoacide est la L-histidine. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir un procédé pour produire un alkylester inférieur de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine comprenant la culture de la bactérie décrite ci-dessus dans un milieu de culture pour produire et accumuler la L-phénylalanine 30 dans le milieu, et la synthèse de l'alkylester inférieur de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine à partir de l'acide aspartique ou d'un dérivé de celui-ci et de la L-phénylalanine obtenue. Un autre aspect de la présente invention consiste à fournir le procédé décrit ci-dessus, où le procédé comprend en outre 35 l'estérification de la L-phénylalanine pour produire un alkylester inférieur de L-phénylalanine, la condensation de l'alkylester inférieur de L-phénylalanine avec le dérivé d'acide aspartique, où le dérivé est un anhydride N-acyl-L-aspartique, la séparation de l'alkylester inférieur de N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine d'avec le mélange réactionnel, et l'hydrogénation de l'alkylester inférieur de N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine pour produire l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine.
DESCRIPTION DETAILLEE DES MODES DE REALISATION PREFERES 1. Bactérie de la présente invention On sait que certains L-aminoacides ont des précurseurs communs pendant la biosynthèse par une cellule, comme les aminoacides aromatiques, les aminoacides ramifiés, etc. Lors de la production d'un tel aminoacide dans une souche bactérienne, il est utile de rendre la souche auxotrophe pour les autres aminoacides qui ont un précurseur commun avec l'aminoacide ciblé. Ceci peut empêcher le précurseur commun d'écarter la biosynthèse de la voie de biosynthèse de l'aminoacide ciblé. Un autre procédé pour assurer la production de l'aminoacide ciblé, par opposition à ceux ayant un précurseur commun, consiste à produire une mutation appelée mutation "fuyante" dans une enzyme qui est responsable de la production des autres aminoacides à partir du précurseur commun. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire d'alimenter la bactérie avec le ou les autres L-aminoacides, car la synthèse de ces L- aminoacides dans la bactérie est supprimée. Le marquage SsrA d'une enzyme conduit à une réduction de l'activité enzymatique, car l'enzyme est dégradée par l'ARN marqué avec ssrA transcrit, via la RNase P (Komine Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20) : 9223-7 (1994)) et la protéolyse de l'enzyme marquée avec ssrA par les protéases CIpXP et CIpAP (Wah D. A. et al., Chem. Biol., 9(11) : 1237-45 (2002)). Une telle modification par marquage ssrA permet le maintien des propriétés prototrophes de la bactérie modifiée, tout en présentant un phénotype de type "fuyant". En outre, le marquage ssrA permet la réduction du niveau de sous- produits en diminuant l'activité d'une ou plusieurs enzymes impliquées dans la biosynthèse de tels sous-produits.
Dans la présente invention, "bactérie produisant un L-aminoacide" désigne une bactérie qui est capable de provoquer l'accumulation d'un L-aminoacide dans un milieu quand la bactérie est cultivée dans le milieu. L'aptitude à produire un L-aminoacide peut être conférée ou augmentée par multiplication. La phrase "bactérie produisant un L-aminoacide" telle qu'elle est utilisée ici signifie aussi une bactérie qui est capable de produire et de provoquer l'accumulation d'un L-aminoacide dans un milieu de culture en une quantité plus élevée qu'une souche de type sauvage ou une souche mère de E. coli, comme E. coli K-12, et signifie de préférence que le micro-organisme est capable de provoquer l'accumulation dans un milieu d'une quantité d'au moins 0,5 g/L, de préférence encore d'au moins 1,0 g/L du L-aminoacide cible. Le terme "L-aminoacides" inclut la L-alanine, la L-arginine, la L-asparagine, l'acide L-aspartique, la L-cystéine, l'acide L- glutamique, la L-glutamine, la L-glycine, la L-histidine, la L-isoleucine, la L-leucine, la L-lysine, la L-méthionine, la L-phénylalanine, la L-proline, la L-sérine, la L-thréonine, le L-tryptophane, la L-tyrosine et la L-valine. La L-histidine est particulièrement préférée. Un aminoacide aromatique, comme la L-phénylalanine, le L-tryptophane et la L- tyrosine, est préféré encore et la L-phénylalanine est particulièrement préférée. La famille des Enterobacteriaceae inclut les bactéries appartenant aux genres Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebs/el/a, Pantoea, Pro videncia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, etc.
Spécifiquement, celles qui sont classées parmi les Enterobacteriaceae selon la taxonomie utilisée dans la base de données NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http:/lwww.ncbi.n1m.nih.gov/htbinpost/ Taxonomvlwgetorg?mode=Tree&id=1236&IvI=3&keep=1&srchmode=1 &unlock) peuvent être utilisées. Une bactérie appartenant au genre Escherichia ou Pantoea est préférée. La phrase "une bactérie appartenant au genre Escherichia" signifie que la bactérie est classée dans le genre Escherichia selon la classification connue de l'homme du métier en microbiologie. Les exemples de bactéries appartenant au genre Escherichia telles qu'elles sont utilisées dans la présente invention incluent, mais ne sont pas limitées à, Escherichia coli (E. coh).
La bactérie appartenant au genre Escherichia qui peut être utilisée dans la présente invention n'est pas limitée particulièrement ; cependant, par exemple, les bactéries décrites par Neidhardt, F. C. et al. (Escherichia colt et Salmonella typhimurium, American Society of Microbiology, Washington D. C., 1208, tableau 1) sont incluses dans la présente invention. La bactérie de la présente invention inclut une souche de la famille des Enterobacteriaceae qui est capable de produire un L-aminoacide et qui a été modifiée par fixation d'un fragment d'ADN ayant une partie du gène ssrA à l'extrémité 3' d'un gène codant une enzyme bactérienne. La partie du gène ssrA code le peptide représenté dans SEQ ID NO : 2 ou un variant de celui-ci, et l'enzyme bactérienne est impliquée dans la voie de biosynthèse d'un L-aminoacide qui a un précurseur commun avec le L-aminoacide ciblé. De plus, la bactérie de la présente invention inclut une souche de la famille des Enterobacteriaceae qui est capable de produire un L-aminoacide et qui a été transformée avec un fragment d'ADN codant une partie du gène ssrA de sorte que des composants du peptide codé par le fragment d'ADN sont exprimés.
Le gène ssrA (synonymes : ECK2617, b2621, sipB) code l'ARNtm (synonymes : SsrA, ARN 10Sa, ARN de transfert-messager, SipB, B2621). Le gène ssrA (nucléotides de 2753615 à 2753977 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes smps et int4 sur le chromosome de E col/ K-12.
Le gène ssrA de Escherichia col/ est représenté par SEQ ID NO : 1. La séquence du marqueur peptidique induisant la protéolyse codé par l'ARNtm est représentée par SEQ ID NO : 2. Ce peptide est codé par les nucléotides aux positions de 90 à 119 du gène ssrA représenté dans SEQ ID NO : 1. D'autres gènes ssrA ont également été élucidés comme suit : le marqueur peptidique induisant la protéolyse codé par l'ARNtm provenant de Bacillus subtilis, Bad/lus stearotherrnoph/lus, Serratia marcescens, Escherichia col/, Pseudomonas flurescens, Pseudomonas chlororaphis et Pseudomonas putida. II est possible d'utiliser des bactéries qui sont capables de produire simultanément deux L-aminoacides qui ont un précurseur commun. Le but de la présente invention a été atteint en utilisant une souche qui a été modifiée préalablement pour produire simultanément deux aminoacides, à savoir la L-phénylalanine et la L-tyrosine. Une telle souche peut être obtenue en détruisant le régulateur double de transcription, à savoir le gène tyrR par le procédé de recombinaison commandée par Red standard. La délétion du gène tyrR peut être confirmée par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de la souche transformée comme matrice. Des bactéries qui sont capables de produire des L-aminoacides peuvent être utilisées, et de préférence des bactéries qui sont capables de produire simultanément de la phénylalanine et de la tyrosine. E. col/ MG165S OtyrR est un exemple d'une telle souche. La souche de E. cati MG1655 tyrR a été obtenue par substitution du gène tyrR chromosomique avec une cassette d'ADN contenant le marqueur Cm puis excision du marqueur au moyen de techniques standard décrites dans WO 05/010175. En outre, une souche produisant de la L-histidine dans laquelle le gène pgi est modifié par marquage ssrA pour augmenter le flux de D-glucose-6-phosphate par la voie du pentose-phosphate pour augmenter la productivité de la L-histidine est aussi incluse et décrite. La phrase "un fragment d'ADN capable d'être transcrit et codant le peptide de SEQ ID NO : 2 ou un variant de celui-ci, où ledit fragment est fixé audit gène à l'extrémité 3' dudit gène" signifie que le gène codant l'enzyme bactérienne a été modifié pour avoir des résidus de nucléotides supplémentaires à son extrémité 3' par rapport à un gène non modifié, par exemple un gène de la souche de type sauvage.
La présence de ce fragment d'ADN (codant SEQ ID NO : 2 ou un variant de celui-ci) à l'extrémité Y du gène codant l'enzyme bactérienne conduit à la formation d'une espèce d'ARNm marquée, et la protéine correspondante traduite a un peptide supplémentaire marquant ou fixé à son extrémité C-terminale. L'enzyme bactérienne peut être modifiée par des procédés qui incluent la recombinaison génétique, les extensions C-terminales, les fusions C-terminales, etc. La longueur de la protéine enzyme modifiée peut être mesurée par exemple par Western Blot avec des anticorps spécifiques, séquençage de protéine, et analogues. La phrase "fixer le peptide de SEQ ID NO : 2 ou un variant de celui-ci à l'extrémité carboxy-terminale de la protéine" peut aussi signifier que la protéine modifiée traduite est exprimée dans la bactérie de telle manière que la protéine modifiée est dégradée a un taux contrôlable (McGinness K. E. et al., Molecular Cell, 22: 701-707 (2006)). La phrase "un fragment d'ADN capable d'être transcrit" signifie que le fragment d'ADN est fixé à l'extrémité 3' du gène codant l'enzyme bactérienne de telle manière que le codon-stop du gène codant l'enzyme bactérienne est retiré et que le fragment d'ADN nécessaire est introduit juste après le dernier codon du gène. Une telle construction d'ADN est transcrite sous forme d'une unité transcriptionnelle dans laquelle le fragment d'ADN souhaité marque l'ARNm du gène d'intérêt (l'enzyme bactérienne). Elle conduit aussi à l'expression de protéines marquées avec ssrA. La phrase "un variant de celui-ci", telle qu'elle est utilisée dans la présente invention, signifie un peptide qui a des changements dans la séquence, que ce soit des délétions, des insertions, des additions ou des substitutions d'aminoacides, mais qui maintient l'activité souhaitée à un niveau utile, par exemple utile pour réduire l'activité d'une protéine marquée et par conséquent augmenter la production d'un L-aminoacide. Le nombre de changements dans le peptide variant dépend de la position ou du type de résidus d'aminoacides dans la structure primaire du peptide. Le nombre de changements peut être 1 à 4 et de préférence 1 à 2 pour le peptide indiqué comme étant SEQ ID NO : 2. Ces changements dans les variants peuvent survenir dans des régions du peptide qui ne sont pas critiques pour la fonction du peptide. Ceci est dû au fait que certains aminoacides ont une grande homologie entre eux de sorte que l'activité n'est pas affectée par un tel changement. De ce fait, les variants du peptide peuvent avoir une homologie d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, et de préférence encore d'au moins 90 %, et de manière particulièrement préférable d'au moins 95 °lo avec la séquence d'aminoacides entière montrée dans SEQ ID NO : 2 à condition que la protéine marquée avec ssrA soit reconnue par les protéases, ce qui conduit à une dégradation subséquente. L'homologie entre deux séquences d'aminoacides peut être déterminée au moyen de procédés bien connus, par exemple le programme informatique BLAST 2.0, qui calcule trois paramètres : score, identité et similarité.
La substitution, délétion, insertion ou addition d'un ou plusieurs résidus d'aminoacides devrait être une ou des mutations conservatrices de sorte que l'activité soit maintenue. Une mutation conservatrice représentative est une substitution conservatrice. Des exemples de substitutions conservatrices incluent la substitution de Ser ou Thr pour Ala, la substitution de Gln, His ou Lys pour Arg, la substitution de Glu, Gln, Lys, His ou Asp pour Asn, la substitution de Asn, Glu ou Gln pour Asp, la substitution de Ser ou Ala pour Cys, la substitution de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg pour Gln, la substitution de Asn, Gln, Lys ou Asp pour Glu, la substitution de Pro pour Gly, la substitution de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr pour His, la substitution de Leu, Met, Val ou Phe pour Ile, la substitution de Ile, Met, Val ou Phe pour Leu, la substitution de Asn, Glu, Gin, His ou Arg pour Lys, la substitution de lle, Leu, Val ou Phe pour Met, la substitution de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu pour Phe, la substitution de Thr ou Ala pour Ser, la substitution de Ser ou Ala pour Thr, la substitution de Phe ou Tyr pour Trp, la substitution de His, Phe ou Trp pour Tyr et la substitution de Met, Ile ou Leu pour Val. Les données comparant les séquences primaires d'un marqueur peptidique induisant la protéolyse codé par l'ARNtm provenant de Bad/lus subtils (BACSU), Bacillus stearothermophilus (BACST), Serratia marcescens (SERMA), Escherichia col (ECOLI), Pseudomonas flurescens (PSEFL), Pseudomonas chlororaphis (PSECL), Pseudomonas putida (PSEUPU) montrent un haut niveau d'homologie de la séquence d'aminoacides "YALAA" à l'extrémité C- terminale (voir la figure 5). Il est possible de substituer des résidus d'aminoacides similaires (marqués par deux points) par des résidus d'aminoacides similaires sans détérioration de l'activité du peptide. Toutefois, des modifications d'autres résidus d'aminoacides non conservés peuvent ne pas conduire à une modification de l'activité du marqueur peptidique induisant la protéolyse codé par l'ARNtm. Les séquences d'aminoacides marquées par un peptide citées par McGinness K. E. et al. (Molecular Cell, 22 : 701-707 (2006)) peuvent aussi être considérées comme un variant peptidique de la présente invention.
Les ADN qui codent sensiblement les mêmes peptides comme composants du peptide marqueur peuvent être obtenus par exemple en modifiant les séquences nucléotidiques d'ADN codant des composants du peptide marqueur (SEQ ID NO : 1), par exemple au moyen du procédé de mutagenèse dirigée de sorte qu'un ou plusieurs résidus d'aminoacides à un site spécifié comprennent une délétion, une substitution, une insertion ou une addition. Les ADN modifiés comme décrit ci-dessus peuvent être obtenus par des traitements mutagènes connus conventionnellement. De tels traitements incluent le traitement à l'hydroxylamine de l'ADN codant des protéines de la présente invention, ou le traitement de la bactérie contenant l'ADN par irradiation UV ou avec un réactif comme la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ou l'acide nitreux. Des ADN codant sensiblement les mêmes peptides que le peptide marqueur peuvent être obtenus en exprimant des ADN ayant une mutation comme décrit ci-dessus dans une cellule appropriée, et en étudiant l'activité du produit exprimé. Des ADN codant sensiblement le même peptide que le peptide marqueur peuvent aussi être obtenus en isolant des ADN qui peuvent être hybridés avec des sondes ayant des séquences nucléotidiques qui contiennent, par exemple, les séquences nucléotidiques montrées dans SEQ ID NO : 1 dans des conditions stringentes, et qui codent des peptides ayant les activités du peptide marqueur. Les "conditions stringentes" désignent ici des conditions dans lesquelles des hybrides appelés hybrides spécifiques sont formés, et des hybrides non spécifiques ne sont pas formés. Par exemple, les conditions stringentes peuvent être illustrées à titre d'exemple par des conditions dans lesquelles des ADN ayant une grande homologie, par exemple des ADN ayant une homologie d'au moins 50 %, de préférence d'au moins 60 °/o, de préférence encore d'au moins 70 %, de préférence encore d'au moins 80 %, et de préférence encore d'au moins 90 %, et de manière particulièrement préférable d'au moins 95 % sont capables de s'hybrider entre eux, mais des ADN ayant une homologie inférieure à l'homologie ci-dessus ne sont pas capables de s'hybrider. A titre d'alternative, des conditions stringentes peuvent être illustrées à titre d'exemple par des conditions dans lesquelles un ADN est capable de s'hybrider à une concentration de sel équivalente à des conditions de lavage ordinaires dans l'hybridation de Southern, c'est-à-dire 1 x SSC, 0,1 % SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, à 60°C. La durée de lavage dépend du type de membrane utilisée pour le transfert et, en règle générale, par ce qui est recommandé par le fabricant. Par exemple, une durée de lavage recommandée, par exemple, pour la membrane en nylon HybondTM N'" (Amersham) dans des conditions stringentes est d'approximativement 15 min. De préférence, le lavage peut être accompli deux à trois fois. Des séquences partielles de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 1 peuvent aussi être utilisées comme sondes. Les sondes peuvent être préparées par PCR en utilisant des amorces basées sur la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 1 et des fragments d'ADN contenant la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 1 comme matrices. La substitution, délétion, insertion ou addition de nucléotides comme décrit ci-dessus inclut aussi des mutations qui surviennent naturellement (mutant ou variant), par exemple du fait de la variété dans l'espèce ou le genre de la bactérie, qui contient les composants du peptide marqueur. L'expression d'un gène bactérien qui a un fragment d'ADN codant le peptide représenté dans SEQ ID NO : 2, ou un variant de celui-ci, fixé à l'extrémité 3' du gène, peut être obtenue en transformant une bactérie avec l'ADN codant le peptide, et plus exactement, en introduisant le fragment d'ADN dans le chromosome bactérien en aval du gène codant la protéine sans perturber le cadre de codage, ou de préférence en remplaçant le gène chromosomique natif par un gène mutant codant la protéine marquée par des procédés conventionnels. La transformation d'une bactérie avec l'ADN conduira à la formation d'un nouveau gène mutant chromosomique codant la protéine allongée de la présente invention. Les procédés de transformation incluent tout procédé connu qui a été décrit jusqu'à maintenant. Par exemple, les procédés suivants peuvent être employés pour introduire l'ADN codant le gène mutant par recombinaison génique. Un gène mutant est préparé, et la bactérie est transformée avec un fragment d'ADN contenant le gène mutant. Puis, le gène natif sur le chromosome est remplacé par le gène mutant par recombinaison homologue, et la souche résultante est sélectionnée. Un tel remplacement de gène par recombinaison homologue peut être réalisé en employant un ADN linéaire, ce qui est connu comme étant une "intégration commandée par Red" (Datsenko, K. A. et Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, pages 6640-6645 (2000)), ou par des procédés employant un plasmide contenant une origine de réplication sensible à la température (brevet U.S. 6 303 383 ou 3P 05-007491 A). Pour augmenter la perméabilité des cellules à l'ADN, le traitement des cellules receveuses avec du chlorure de calcium a été décrit pour Escherichia col/ K-12 (Mandel, M. et Higa, A., J. Mol. Biot., 53, 159 (1970)) et peut être utilisé. Les procédés pour la préparation d'ADN plasmidique incluent, mais ne sont pas limités à, la digestion et la ligature d'ADN, la transformation, la sélection d'un oligonucléotide comme amorce et analogue, ou d'autres procédés bien connus de l'homme du métier. Ces procédés sont décrits, par exemple, dans Sambrook, 3., Fritsch, E. F. et Maniatis, T., "Malecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Dans la présente invention, la phrase "enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides" désigne une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse du produit non désiré, par exemple le produit qui partage un précurseur commun avec le L-aminoacide cible. La phrase "enzyme bactérienne impliquée dans la voie de biosynthèse du produit non désiré" désigne une enzyme catalysant la réaction d'un précurseur commun du L-aminoacide cible et du produit non désiré qui est converti en le produit non désiré. Ceci se produit car l'enzyme dirige la réaction en aval de la ramification de la voie de biosynthèse qui conduit à la production du produit non désiré. La phrase "enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides" désigne aussi une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de sous-produits du L-aminoacide cible. La présence de tels sous-produits peut poser des problèmes techniques significatifs pendant la purification, et avoir un effet négatif sur la production de L-aminoacides. Les gènes codant l'enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides sont les gènes d'intérêt de la présente invention. De tels gènes sont représentés par, mais pas limités à, le gène tyrA codant la chorismate mutase/préphénate déshydrogénase, le gène pgi codant la phosphoglucose isomérase, le gène ilvE codant l'aminoacide ramifié aminotransférase, les gènes ilvA et tdcBcodant des thréonine déshydratases, les gènes sdaA et sdaB codant des L- thréonine désaminases, le gène argA codant la N-acétylglutamate synthase, le gène argG codant l'argininosuccinate synthase, le gène proB codant la y-glutamyl kinase, le gène thrB codant l'homosérine kinase, le gène codant l'homosérine déshydrogénase, etc. En général, tout gène codant une enzyme qui entraîne la production d'un métabolite résultant de l'écart d'avec la voie du L-aminoacide cible et/ou impliquée dans la formation d'un sous-produit est le gène d'intérêt de la présente invention. La chorismate mutase/préphénate déshydrogénase (synonymes : B2600, TyrA) catalyse la conversion réversible entre le chorismate et le préphénate, et la conversion réversible entre le préphénate et le p-hydroxyphénylpyruvate, qui est le composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse de la tyrosine. La conversion du chorismate est la première étape dans la biosynthèse de la tyrosine et de la phénylalanine. Une modification de la protéine TyrA par marquage ssrA peut être utile pour diminuer le flux de préphénate dans la voie de biosynthèse de la L-tyrosine, et augmenter la production de L-phénylalanine. L'activité de la chorismate mutase/préphénate déshydrogénase peut être mesurée en utilisant un test à arrêt dans le temps ( stopped-time assay ) en présence de 2,5 mM de chorismate ou par analyse d'immunodiffusion des complexes enzyme-anticorps dans des boîtes préparées avec 0,8 % d'agarose (Rood J. I., Perrot B. et al., Eur. J. Biochem., 124, 513-519 (1982)). Le gène tyrA de type sauvage (synonymes ECK2597, b2600) qui code la chorismate mutase/préphénate déshydrogénase de Escherichia col/ a été élucidé.
Le gène tyrA (nucléotides complémentaires des nucléotides 2736970 à 2738091 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes pheA et aroF sur le chromosome de E. cal/ K-12. Le gène tyrA de Escherichia col/ est représenté par SEQ ID NO : 3, et la séquence d'aminoacides codée par le gène tyrA est représentée par SEQ ID NO : 4.
Dans la voie de biosynthèse de la phénylalanine, la conversion réversible entre le préphénate et le phénylpyruvate est catalysée par la chorismate mutase/préphénate déshydratase (synonymes : B2599, PheA), laquelle sous-unité est codée par le gène pheA (synonymes : ECK2596, b2599) dans E col. Le gène pheA (nucléotides de 2735767 à 2736927 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre le peptide leader du gène pheA et le gène tyrA sur le chromosome de E. col/K-12. Le gène pheA de Escherichia col/ est représenté par SEQ ID NO : 5, et la séquence d'aminoacides codée par le gène pheA est représentée par SEQ ID NO : 6. Une modification simultanée des protéines TyrA et PheA par marquage ssrA peut être utile pour réduire le flux de chorismate dans la voie de biosynthèse de la L-tyrosine et augmenter la production de L-phénylalanine.
La phosphoglucose isomérase (synonymes : B4025, Pgi, glucose-6-phosphate isomérase, D-glucose-6-phosphate-cétolisomérase) catalyse la conversion réversible entre le f3-D-glucose-6-phosphate et le D-fructose-6-phosphate dans les voies de la gluconéogenèse et de la glycolyse. La diminution de l'activité de la phosphoglucose isomérase conduit à la redistribution des flux de carbone en faveur de la voie du pentose phosphate où le métabolite précurseur d'histidine 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate est produit. L'activité de la phosphoglucose isomérase peut être détectée par exemple par le procédé décrit dans Friedberg I. (J. Bacteriol., 112 ,3 : 1201-1205 (1972)) dans un test couplé au moyen de la G6P déshydrogénase (Winkler H. H., J. Bacteriol., 101, 2 : 470-475 (1970)). Le gène pgi de type sauvage (synonymes : ECK4017, b4025) qui code la glucose-6-phosphate isomérase de Escherichia coi/ a été élucidé. Le gène pgi (nucléotides de 4231781 à 4233430 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes lysC et yjbE sur le chromosome de E. col/ K-12. Le gène pgi de Escherichia col/ est représenté par SEQ ID NO : 7, et la séquence d'aminoacides codée par le gène pgi est représentée par SEQ ID NO: 8.
L'aminoacide ramifié aminotransférase (synonymes : B3770, IlvE) catalyse une série de réactions de transamination qui produisent chacune l'a-cétoglutarate et un aminoacide parmi trois aminoacides ramifiés aliphatiques. La modification de la protéine IlvE par marquage ssrA peut être utile pour réduire le flux de 2-cétoisovalérate dans la voie de biosynthèse de la L-valine, ce qui conduit aussi à une réduction de la quantité de L-isoleucine comme sous-produit et à une augmentation de la production de L-leucine. L'activité de l'aminoacide ramifié aminotransférase peut être mesurée par le procédé décrit par exemple dans Lee-Peng F. C. et al. (J. Bacteriol., 139(2) : 339-45 (1979)). Le gène ilvEde type sauvage (synonymes : ECK3762, b3770, thréonine désaminase, L-thréonine hydrolase) qui code l'aminoacide ramifié aminotransférase de Escherichia col/ a été élucidé. Le gène ilvE (nucléotides 3 950 507 à 3 951 436 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes ilvMet /IvD sur le chromosome de E. col/ K-12.
La thréonine déshydratase (synonymes : B3772, Ile, IlvA) catalyse la désamination de la L-thréonine. Une modification de la protéine IlvA par marquage ssrA peut être utile pour empêcher la dégradation de la L-thréonine et réduire le flux de L-thréonine dans la voie de biosynthèse de la L-isoleucine, et peut être utile aussi pour la production de L-arginine. L'activité de la thréonine déshydratase peut être mesurée par le procédé décrit par exemple dans Eisenstein, E. (J. Biol. Chem., 266(9) : 5801-7 (1991)). Le gène '/IA de type sauvage (synonymes : ECK3764, b3772, ile) qui code la thréonine déshydratase de Escherichia col/ a été élucidé. Le gène ilvA (nucléotides 3 953 354 à 3 954 898 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes ilvD et /lvYsur le chromosome de E. col/K-12. La thréonine déshydratase (synonymes : B3117, Tdc, TdcB, thréonine désaminase, L- sérine déshydratase sérine désaminase, L-thréonine hydrolyase) catalyse la désamination de la L-thréonine. Une modification de la protéine TdcB par marquage ssrA peut être utile pour empêcher la dégradation de la L-thréonine et réduire le flux de L-thréonine dans la voie de biosynthèse de la L-isoleucine. Le gène tdcB de type sauvage (synonymes : ECK3106, b3117, tdc) qui code la thréonine déshydratase de Escherichia col/ a été élucidé. Le gène tdcB (nucléotides complémentaires des nucléotides 3 263 061 à 3 264 050 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes tdcCet tdcA sur le chromosome de E col/K-12. Les thréonine désaminases SdaA (synonymes : B1814, SdaA, SDH1, L-SD, L-thréonine désaminase 1, L-sérine déshydratase 1, SDH-1, L-SD1, L-hydroxyaminoacide déshydratase 1, L-sérine désaminase 1, L-sérine hydro-lyase 1) et SdaB (synonymes : B2797, SdaB, L-thréonine désaminase II, L-sérine désaminase 2, L-sérine déshydratase 2, SDH-2, L-SD2, L- sérine hydrolyase 2) catalysent la désamination de la L- thréonine. Une modification de la protéine thréonine désaminase par marquage ssrA peut être utile pour empêcher la dégradation de la L-thréonine et diminuer le flux de L-thréonine dans la voie de biosynthèse de la L-isoleucine. Le gène sdaA de type sauvage (synonymes : ECK1812, b1814) et le gène sdaB (synonymes : ECK2792, b2797) qui codent les thréonines désaminases de Escherichia colt ont été élucidés. Le gène sdaA (nucléotides 1 894 956 à 1 896 320 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes yeaB et yoaD sur le chromosome de E colt K-12. Le gène sdaB (nucléotides 2 927 598 à 2 928 965 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes sdaCet xni sur le chromosome de E col/ K-12. La N-acétylglutamate synthase (synonymes : B2818, ArgA, NAGS, acétyl-CoA:L-glutamate N-acétyltransférase, aminoacide-N-acétyltransférase) catalyse la synthèse de N-acétylglutamate à partir de L-glutamate et d'acétyl-CoA, ce qui constitue la première étape dans la super-voie de biosynthèse de l'arginine et de l'ornithine. Une modification de la protéine ArgA par marquage ssrA peut être utile pour accumuler le glutamate pour la production de L-proline. L'activité de la N-acétylglutamate synthase peut être mesurée par le procédé décrit par exemple dans Marvil, D. K. et Leisinger, T. (J. Biol. Chem., 252(10) : 3295-303 (1977)). Le gène argA de type sauvage (synonymes : ECK2814, Arg2, Argi, b2818) qui code la N-acétylglutamate synthase de Escherichia colla été élucidé. Le gène argA (nucléotides 2 947 264 à 2 948 595 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes amiC et recD sur le chromosome de E. col/ K-12.
L'argininosuccinate synthase (synonymes : B3172, ArgG, argininosuccinate synthétase, citrulline-aspartate ligase, L-citrulline:L-aspartate ligase) catalyse la synthèse d'argininosuccinate à partir de L-aspartate et de citrulline. Une modification de la protéine ArgG par marquage ssrA peut être utile pour la production de citrulline. Le gène argG de type sauvage (synonymes : ECK3161, b3172) qui code l'argininosuccinate synthase de Escherichia cati a été élucidé. Le gène argG (nucléotides 3 316 659 à 3 318 002 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes argR et yhbXsur le chromosome de E. col/ K-12. La y-glutamyl kinase (synonymes : B0242, ProB, glutamate 5-kinase, GK, ATP:L-glutamate 5-phosphotransférase, G5K) catalyse la réaction de phosphorylation du glutamate, qui est la première réaction dans la synthèse de la praline. Une modification de la protéine ProB par marquage ssrA peut être utile pour accumuler le glutamate pour la production de L-arginine. L'activité de la y-glutamyl kinase peut être mesurée par le procédé décrit par exemple dans Smith C. J. et al. (J. Bacteriol., 157(2) : 545-51 (1984)). Le gène proB de type sauvage (synonymes : ECK0243, pro(2), b0242, pro2) qui code la y-glutamyl kinase de Escherichia col/ a été élucidé. Le gène proB (nucléotides 259 612 à 260 715 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes phoEet proA sur le chromosome de E. col/ K-12. L'homosérine kinase (synonymes : B0003, ThrB, ATP:L- homosérine 0-phosphotransférase) catalyse la réaction de phosphorylation de l'homosérine. Une modification de la protéine ThrB par marquage ssrA peut être utile pour la production de L-méthionine. L'activité de l'homosérine kinase peut être mesurée par le procédé décrit par exemple dans Shames, S. L. et Wedler, F. C. (Arch. Biochem.
Biophys., 235(2) : 359-70 (1984)). Le gène thrB de type sauvage (synonymes : ECK0003, b0003) qui code l'homosérine kinase de Escherichia col/ a été élucidé. Le gène thrB (nucléotides 2 801 à 3 733 dans la séquence de GenBank numéro d'ordre NC_000913.2, gi : 49175990) est situé entre les gènes thrA et thrC sur le chromosome de E. colt K-12.
L'homosérine déshydrogénase catalyse la réaction de formation de L-aspartate-semialdéhyde à partir de l'homosérine. Dans Escherichia cati, l'homosérine déshydrogénase est la partie de la protéine aspartate kinase/homosérine déshydrogénase codée par le gène thrA. Toutefois, dans d'autres micro-organismes, comme les Corynebactéries, l'homosérine déshydrogénase est une enzyme séparée. Une modification de l'homosérine déshydrogénase par marquage ssrA peut être utile pour la production de L-lysine. Les gènes ssrA, tyrA, pheA, pgi, ilvE, ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, argA, argG, proB, thrB et d'autres gènes d'intérêt peuvent être obtenus par PCR (réaction en chaîne par polymérase ; voir White, T. 1 et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) au moyen d'amorces préparées sur la base des séquences nucléotidiques connues de ces gènes. Des gènes codant des peptides marqueurs provenant d'autres micro-organismes peuvent être obtenus d'une manière similaire. Les techniques et enseignements décrits ci-dessus pour fixer un fragment d'ADN capable d'être transcrit codant le peptide représenté dans SEQ ID NO : 2 ou un variant de celui-ci, à l'extrémité 3' des gènes codant la chorismate mutase/préphénate dihydrogénase et la phosphoglucose isomérase peuvent être appliquées de manière similaire pour modifier les activités d'autres protéines transcrites à partir d'autres gènes d'intérêt. La bactérie de la présente invention peut être obtenue en introduisant les ADN mentionnés précédemment dans une bactérie qui a de manière inhérente une aptitude à produire des L-aminoacides. A titre d'alternative, la bactérie de la présente invention peut être obtenue en conférant une aptitude à produire des L-aminoacides à une bactérie qui contient déjà les ADN.
Bactéries produisant des L-aminoacides Des bactéries qui sont capables de produire des L-aminoacides aromatiques ou non aromatiques peuvent être utilisées dans la présente invention.
Bactéries produisant de la L-phénylalanine Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-phénylalanine de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les souches appartenant au genre Escherichia, comme E. col/ A312739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197) ; E. col/ HW1089 (ATCC 55371) contenant le gène pheA34 mutant (brevet U.S. n° 5 354 672) ; E col/ MWEC101-b (KR8903681) ; E col/ NRRL 8-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 et NRRL B-12147 (brevet U.S. n° 4 407 952). En outre, comme souche mère, il est possible d'utiliser E. col/K-12 [W311O (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. col/K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. col/ K-12 [W311O (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) et E col/K-12 [W3110 (tyrA)/pPR-aroG4, pACMAB] appelée A] 12604 (FERM BP-3579) (EP 488424 B1). De plus, il est possible aussi d'utiliser des bactéries produisant de la L-phénylalanine appartenant au genre Escherichia ayant une activité de la protéine codée par le gène yedA ou le gène yddG accrue (demandes de brevet U.S. 2003/01484473 Al et 2003/0157667 Al).
Bactéries produisant de la L-histidine Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-histidine de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les souches appartenant au genre Escherichia, comme les souches E. col/ 24 (VKPM B-5945, RU2003677) ; E col/ 80 (VKPM B-7270, RU2119536) ; E. cati NRRL B-12116 û B12121 (brevet U.S. n° 4 388 405) ; E. col/ H-9342 (FERM BP-6675) et H-9343 (FERM BP-6676) (brevet U.S. n° 6 344 347) ; E. col/ H-9341 (FERM BP-6674) (EP 1085087) ; E. col/ AI80/pFM201 (brevet U. S. n° 6 258 554) et analogues. Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-histidine de la présente invention incluent aussi les souches dans lesquelles l'expression d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme de biosynthèse de la L-histidine est augmentée. Les exemples de tels gènes incluent les gènes codant I'ATP phosphoribosyltransférase (hisG), la phosphoribosyl AMP cyclohydrolase (hisl), la phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase (h/SIE), la phosphoribosylformimino-5-amino-imidazole carboxamide ribotide isomérase (h/SA), l'amidotransférase (hisH), l'histidinol phosphate aminotransférase (hisC), l'histidinol phosphatase (hisB), l'histidinol déshydrogénase (hisD), etc. On sait que les enzymes de biosynthèse de la L-histidine codées par his& et h/sBHAFI sont inhibées par la L-histidine, de sorte qu'une aptitude à produire la L-histidine peut aussi être augmentée efficacement en introduisant une mutation conférant une résistance à la rétro-inhibition dans I'ATP phosphoribosyltransférase (brevets russes n° 2003677 et 2119536). Les exemples spécifiques de souches ayant une aptitude à produire de la L-histidine incluent E. col/ FERM-P 5038 et 5048 dans lesquelles a été introduit un vecteur portant un ADN codant une enzyme de biosynthèse de la L-histidine (JP 56-005099 A), les souches de E. col/ dans lesquelles a été introduit rht, un gène pour l'export d'aminoacides (EP 1016710 A), la souche de E. col/ 80 à laquelle a été conférée une résistance à la sulfaguanidine, la DL-1,2,4-triazole-3-alanine et la streptomycine (VKPM B-7270, brevet russe n° 2119356), etc.
Bactéries produisant du L-trvotophane Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant du L-tryptophane de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les souches appartenant au genre Escherichia, comme E. col/ JP4735/pMU3028 (DSM10122) et JP6015/pMU91 (DSM10123) qui est déficiente en la tryptophanyl-ARNt synthétase codée par le gène trpS mutant (brevet U.S. n° 5 756 345), E. col/ SV164 (pGH5) ayant un allèle de serA codant une phosphoglycérate déshydrogénase dépourvue de rétro-inhibition par la sérine et un allèle de trpE codant une anthranilate synthase non soumise à une rétro-inhibition par le tryptophane (brevet U.S. n° 6 180 373) ; E col/ AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) et AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) déficiente en l'enzyme tryptophanase (brevet U.S. n° 4 371 614) ; E col/ AGX17/pGX50,pACKG4-pps dans laquelle l'aptitude à produire du phosphoénolpyruvate est augmentée (WO 9708333, brevet U.S. n° 6 319 696), et analogues peut être utilisée. Il est possible aussi d'utiliser des bactéries produisant du L- tryptophane appartenant au genre Escherichia ayant une activité accrue de la protéine identifiée codée par le gène yedA ou le gène yddG (demandes de brevet U.S. n° 2003/0148473 Al et 2003/0157667 Al). Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant du L-tryptophane de la présente invention incluent aussi les souches dans lesquelles une ou plusieurs activités des enzymes choisies parmi l'anthranilate synthase, la phosphoglycérate déshydrogénase et la tryptophane synthase sont augmentées. L'anthranilate synthase et la phosphoglycérate déshydrogénase sont soumises l'une et l'autre à une rétro-inhibition par le L-tryptophane et la L-sérine, de sorte qu'une mutation désactivant la rétro-inhibition peut être introduite dans ces enzymes. Des exemples spécifiques de souches ayant une telle mutation incluent E colt SV164 qui contient une anthranilate synthase désensibilisée et une souche transformante obtenue par introduction dans E. colt SV164 du plasmide pGH5 (WO 94/08031) qui contient un gène serA mutant codant une phosphoglycérate déshydrogénase désensibilisée pour la rétro-inhibition. Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant du L-tryptophane de la présente invention incluent aussi les souches dans lesquelles l'opéron tryptophane qui contient un gène codant une anthranilate synthase désensibilisée a été introduit (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, brevet U.S. n° 4 371 614). De plus, l'aptitude à produire du L-tryptophane peut être conférée en augmentant l'expression d'un gène qui code la tryptophane synthase, parmi les opérons tryptophane (trpBA). La tryptophane synthase consiste en sous-unités a et 8 qui sont codées par les gènes trpA et trpB, respectivement. De plus, l'aptitude à produire du L-tryptophane peut être améliorée en augmentant l'expression de l'opéron isocitrate lyasemalate synthase (WO 2005/103275).
Bactéries produisant de la L-valine Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-valine de la présente invention, incluent mais ne sont pas limités à, les souches qui ont été modifiées pour surexprimer l'opéron iIvGMEDA (brevet U.S. n° 5 998 178). II est souhaitable de retirer la région de l'opéron iIvGMEDA qui est nécessaire pour l'atténuation pour que l'expression de l'opéron ne soit pas atténuée par la L-valine qui est produite. De plus, de manière souhaitable, le gène ilvA dans l'opéron est interrompu de sorte que l'activité thréonine désaminase est diminuée. Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-valine de la présente invention incluent aussi les mutants ayant une mutation de l'amino-acyl ARNt synthétase (brevet U.S. n° 5 658 766). Par exemple, E. cols VL1970, qui a une mutation dans le gène ileS codant l'isoleucine ARNt synthétase, peut être utilisée. E. co/iVLI970 a été déposée auprès de la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russie, 117545 Moscou, 1 Dorozhny Proezd, 1) le 24 juin 1988 sous le numéro d'ordre VKPM B-4411. De plus, il est possible aussi d'utiliser comme souches mères des mutants nécessitant l'acide lipoïque pour la croissance et/ou dépourvus de H'f-ATPase (WO 96/06926).
Bactéries produisant de la L-isoleucine Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-isoleucine de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les mutants ayant une résistance à la 6- diméthylaminopurine (]P 5-304969 A), les mutants ayant une résistance à un analogue d'isoleucine comme la thiaisoleucine et l'isoleucine hydroxamate, et les mutants ayant en outre une résistance à la DL-méthionine et/ou à l'arginine hydroxamate (]P 5-130882 A). De plus, des souches recombinantes transformées avec des gènes codant des protéines impliquées dans la biosynthèse de la L-isoleucine, comme la thréonine désaminase et l'acétohydroxate synthase, peuvent aussi être utilisées comme souches mères (JP 2-458 A, FR 0356739 et brevet US. n° 5 998 178).
Bactéries produisant de la L-leucine Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-leucine de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les souches appartenant au genre Escherichia, comme les souches de E col/ résistantes à la leucine (par exemple la souche 57 (VKPM B-7386, brevet U. S. n° 6 124 121)) ou à des analogues de la leucine incluant la p-2-thiénylalanine, la 3-hydroxyleucine, la 4-azaleucine, la 5,5,5-trifluoroleucine (JP 62-34397 B et JP 8-70879 A) ; les souches de E. col/ obtenues par le procédé d'ingénierie génique décrit dans WO 96/06926 ; E colt H-9068 (JP 8-70879 A), et analogues.
La bactérie de la présente invention peut être améliorée en augmentant l'expression d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la biosynthèse de la L-leucine. Les exemples incluent les gènes de l'opéron leuABCD, qui sont de préférence représentés par un gène leuA mutant codant I'isopropylmalate synthase qui n'est pas soumise à une rétro-inhibition par la L-leucine (brevet U. S. 6 403 342). De plus, la bactérie de la présente invention peut être améliorée en augmentant l'expression d'un ou plusieurs gènes codant des protéines qui excrètent un L-aminoacide hors de la cellule bactérienne. Les exemples de tels gènes incluent les gènes b2682 et b2683 (gènes ygaZl) (EP 1239041 A2).
Bactéries produisant de la L-arginine Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-arginine de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les souches appartenant au genre Escherichia, comme la souche E. col/ 237 (VKPM IB-7925) (demande de brevet U. S. 2002/058315 Al) et les souche dérivées contenant une N-acétylgultamate synthase mutante (demande de brevet russe n° 2001112869), la souche de E. col! 382 (VKPM B-7926) (EP1170358 Al), une souche produisant de l'arginine dans laquelle le gène argA codant la N-acétylglutamate synthétase est introduit (EP 1170361 Al), et analogues. Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-arginine de la présente invention incluent aussi les souches dans lesquelles l'expressio j d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme de biosynthèse de Iâ L-arginine est augmentée. Les exemples de tels gènes incluent lest gènes codant la N-acétylglutamyl phosphate réductase (argC), l'ornithine acétyl transférase (argJ), la N- acétylgiutamate kinase (arge), l'actylornithine transaminase (argD), l'ornithine carbamoyl transférase (argF), l'acide argininosuccinique synthétase (argG), l'acide argininosuccinique lyase (argH) et la carbamoylphosphate synthétase (carAB).
Bactéries produisant de la L-citrulline Les exemples de souches mères pour obtenir des bactéries produisant de la L-citrulline de la présente invention incluent, mais ne sont pas limités à, les souches appartenant au genre Escherichia contenant une carbamoylphosphate synthétase mutante résistante à la rétro-inhibition (brevet U. S. n° 6 991. 924), et analogues. 2. Procédé de la présente invention Le procédé de la présente invention est un procédé pour produire un L-aminoacide par culture de la bactérie de la présente invention dans un milieu de culture pour produire et excréter le L- aminoacide dans le milieu, et recueillir le L-aminoacide à partir du milieu. Dans la présente invention, la culture, la collecte et la purification d'un L-aminoacide à partir du milieu et analogue peuvent être accomplies d'une manière similaire à des procédés de fermentation conventionnels où un aminoacide est produit au moyen d'une bactérie. Un milieu utilisé pour la culture peut être un milieu synthétique ou un milieu naturel, à condition que le milieu inclut une source de carbone et une source d'azote et des minéraux et, si nécessaire, des quantités appropriées de nutriments nécessaires à la croissance de la bactérie. La source du carbone peut inclure différents glucides comme le glucose et le saccharose, et différents acides organiques. Selon le mode d'assimilation du micro-organisme utilisé, un alcool, incluant l'éthanol et le glycérol, peut être utilisé. Comme source d'azote, différents sels d'ammonium comme l'ammoniac et le sulfate d'ammonium, d'autres composés azotés comme les amines, une source d'azote naturelle comme la peptone, l'hydrolysat de soja, et un micro-organisme de fermentation digéré peuvent être utilisés. Comme minéraux, le monophosphate de potassium ou le diphosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse, le chlorure de calcium et analogues peuvent être utilisés. Comme vitamines, la thiamine, un extrait de levure, et analogues, peuvent être utilisés. La culture est de préférence accomplie dans des conditions aérobies, comme une culture secouée, et une culture agitée avec aération, à une température de 20 à 40°C, de préférence de 30 à 38°C. Le pH de la culture est habituellement entre 5 et 9, de préférence entre 6,5 et 7,2. Le pH de la culture peut être ajusté avec l'ammoniac, le carbonate de calcium, différents acides, différentes bases, et des tampons. Habituellement, une culture de 1 à 5 jours conduit à l'accumulation du L-aminoacide cible dans le milieu de culture. Après la culture, les solides comme les cellules peuvent être retirés du milieu liquide par centrifugation ou filtration sur membrane, après quoi le L-aminoacide peut être recueilli et purifié par des procédés d'échange d'ions, de concentration et/ou de cristallisation.
La phénylalanine produite par le procédé de la présente invention peut être utilisée par exemple pour produire l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (appelée aussi "aspartame"). C'est-à-dire que le procédé de la présente invention inclut la production de l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine en utilisant la L-phénylalanine comme produit de départ. Le procédé inclut la synthèse de l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine à partir de la L-phénylalanine produite par le procédé de la présente invention comme décrit ci-dessus et l'acide aspartique ou son dérivé. Comme alkylester inférieur, on peut mentionner le rnéthylester, l'éthylester et le propylester ou analogues. Dans le procédé de la présente invention, un procédé pour synthétiser l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine à partir de L-phénylalanine et d'acide aspartique ou de son dérivé n'est pas limité particulièrement et tout procédé conventionnel peut être appliqué à condition que la L-phénylalanine, ou son dérivé, puisse être utilisée pour la synthèse de l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. Spécifiquement, par exemple, l'alkylester inférieur d'a-L- aspartyl-L-phénylalanine peut être produit par le procédé suivant (brevet U. S. n° 3 786 039). La L-phénylalanine est estérifiée pour obtenir l'alkylester inférieur de L-phénylalanine. L'alkylester de L- phénylalanine est ensuite mis à réagir avec un dérivé d'acide L- aspartique où le groupe amino et le groupe carboxyle p sont protégés, et le groupe carboxyle a est estérifié pour l'activation. Le dérivé inclut un anhydride N-acyl-L-aspartique comme l'anhydride N-formyl-, N-carbobenzoxy- ou N-p-méthoxycarbobenzoxy-L-aspartique. Par la réaction de condensation, un mélange de N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine et de N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu. Si la réaction de condensation est conduite en présence d'un acide organique ayant une constante de dissociation à 37°C de 10-4 ou moins, le rapport de la forme a à la forme 13 dans le mélange est augmenté (demande de brevet japonais publiée mise à la disposition du public n° 51-113841). Puis, la N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine est séparée du mélange, puis hydrogénée pour obtenir l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine.
Exemples La présente invention va être expliquée d'une manière plus concrète ci-dessous au moyen des exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1. Construction de la souche de E. col/ MG1655 20 AtyrRtyrA-ssrA, qui contient le gène tyrA-ssrA mutant 1. Substitution du gène pheA natif et des 36 nucléotides situés à l'extrémité 3' de la région du gène tyrA dans E. colt avec le gène tyrA-ssrA mutant. Pour substituer le gène pheA natif et les 36 nucléotides situés 25 à l'extrémité 3' de la région du gène tyrA, un fragment d'ADN portant 1) les 36 nucléotides situés à l'extrémité 5' du gène pheA, 2) le gène cat avec les sites attL et attR, 3) un fragment d'ADN codant le marqueur de résistance au chloramphénicol (CmR), 4) le codon stop TAA, 5) les 30 nucléotides situés aux positions de 90 à 119 du gène 30 ssrA, et 6) les 36 nucléotides situés à l'extrémité 3' du gène tyrA a été intégré dans le chromosome de E. col/ MG1655 OtyrR à place du gène pheA natif et de la région du gène tyrA à l'extrémité 3' par le procédé décrit par Datsenko K. A. et Wanner B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) qui est aussi appelé "intégration médiée par Red" 35 et/ou "intégration commandée par Red" (figure 1).
Ce fragment d'ADN a été obtenu dans deux opérations de PCR consécutives où 5 pl de produits d'amplification provenant de la première PCR ont été utilisés comme matrice pour la seconde PCR. Le premier fragment d'ADN contenant le marqueur CmR codé par le gène cat a été obtenu par PCR en utilisant les amorces P1 (SEQ ID NO : 9) et P2 (SEQ ID NO : 10) et le plasmide pMW118-attL-Cm-attR comme matrice (WO 05/010175) (figure 2). L'amorce Pi contient une région identique à la région de 36 nucléotides située à l'extrémité 5' du gène pheA et une région complémentaire de la région attL de 27 nucléotides de pMW118-attL-Cm-attR. L'amorce P2 contient à la fois une région identique à la région de 30 nucléotides du gène ssrA et une région complémentaire de la région attR de 27 nucléotides de pMW118-attL-Cm-attR. Entre ces deux régions, le codon stop TAA a été inséré dans l'amorce P2. Les conditions pour la PCR étaient les suivantes : dénaturation pendant 5 min à 95°C ; profil pour 30 cycles : 30 s à 95°C, 30 s à 50°C, 1 min à 72°C ; étape finale : 5 min à 72°C. Un produit de PCR de 1709 pb a été obtenu et purifié dans un gel d'agarose et 5 pl de celui-ci ont été utilisés comme matrice pour la seconde réaction de PCR, au moyen des amorces Pl (SEQ ID NO : 9) et P3 (SEQ ID NO : 11). L'amorce P3 contient à la fois une région complémentaire de la région de 36 nucléotides située à l'extrémité 3' du gène tyrA et une région identique à la région de 18 nucléotides située à l'extrémité 5' de l'amorce P2. Les conditions pour la PCR étaient les suivantes : dénaturation pendant 5 min à 95°C ; profil pour 30 cycles : 30 s à 95°C, 30 s à 50°C, 1 min à 72°C ; étape finale : 5 min à 72°C. Un produit de PCR de 1745 pb a été obtenu et purifié dans un gel d'agarose et a été utilisé pour l'électroporation de la souche de E. col/ MG1655atyR, qui contient le plasmide pKD46 qui a une origine de réplication sensible à la température. Le plasmide pKD46 (Datsenko, K. A. et Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 : 12 : 6640-45) inclut un fragment d'ADN de 2154 nucléotides du phage A, (positions de nucléotides 31088 à 33241, numéro d'ordre GenBank ]02459), et contient des gènes du système de recombinaison homologue Red de X (gènes y, (i, exo) sous le contrôle du promoteur Paras inductible par arabinose. Le plasmide pKD46 est nécessaire pour l'intégration du produit de PCR dans le chromosome de la souche de E. col/ MG1655AtyrR à la place du gène pheA natif et des 36 nucléotides situés à l'extrémité 3' de la région du gène tyrA. Des cellules électrocompétentes ont été préparées comme suit : E. col/ MG1655atyrR/pKD46 a été cultivée pendant une nuit à 30°C dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (100 mg/I), et la culture a été diluée 100 fois avec 5 ml de milieu SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) contenant de l'ampicilline et du L-arabinose (10 mM) [l'arabinose a été utilisé pour induire le plasmide codant les gènes du système Red]. Les cellules ont été cultivées avec aération à 30°C jusqu'à une DO600 d'environ 0,6 puis ont été rendues électrocompétentes par concentration 100 fois et lavage 3 fois avec de l'eau désionisée glacée. L'électroporation a été réalisée en utilisant 70 pl de cellules et environ 100 ng de produit de PCR. L'électroporation a été accomplie avec un électroporateur "BioRad" (USA, n° 165-2098, version 2-89) selon les instructions du fabricant. Les cellules ayant subi le choc ont été diluées avec 1 ml de milieu SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), incubées à 37°C pendant 2 h puis étalées sur de la gélose L contenant du chloramphénicol (20 pg/ml) et cultivées à 37°C pour sélectionner les recombinants CmR.
2. Vérification de la délétion du gène pheA par PCR Après 24 h de croissance, les colonies ont été testées pour la présence du marqueur CmR par PCR en utilisant les amorces spécifiques de locus P4 (SEQ ID NO : 12) et P5 (SEQ ID NO : 13). Dans ce but, une colonie fraîchement isolée a été mise en suspension dans l'eau (20 pl) et 1 pl de la suspension obtenue a été utilisé pour la PCR. Le profil de température était le suivant : dénaturation d'ADN initiale à 95°C pendant 5 min ; puis 30 cycles (dénaturation à 95°C pendant 30 s, hybridation à 50°C pendant 30 s, et élongation à 72°C pendant 1 min et 10 s), et élongation finale à 72°C pendant 5 min. Quelques-unes des colonies CmR testées contenaient le fragment d'ADN de 2373 pb requis, ce qui confirme la substitution de la région native de 1869 pb du gène pheA par le gène tyrA-ssrA hybride (voir les figures 1 et 3). La souche mutante résultante a été appelée MG 1655 AtyrR ApheA:: cat tyrA-ssrA.
3. Substitution du gène cat dans la souche E. col/ MG1655 AtyrR ApheA:: cat tyrA-ssrA avec le gène pheA de type sauvage Pour substituer le gène cat, un fragment d'ADN portant le gène pheA de type sauvage a été intégré dans le chromosome de E, col/ MG1655 AtyrR ApheA::cat tyrA-ssrA/pKD46 à la place du gène cat par le procédé décrit par Datsenko, K. A. et Wanner, B. L. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) qui est aussi appelé Intégration médiée par Red" et/ou "intégration commandée par Red", et qui est décrit aussi dans l'exemple 1 (figure 3). Le gène pheA de type sauvage a été obtenu par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de E. col/ MG1655 comme matrice, et les 15 amorces P4 (SEQ ID NO : 12) et P6 (SEQ ID NO : 14). L'amorce P6 contient à la fois une région de 30 nucléotides identique à la région située aux positions de 90 à 119 du gène ssrA ayant le codon stop TAA et une région complémentaire de la région de 19 nucléotides située à l'extrémité 3' du gène pheA. 20 Les conditions pour la PCR étaient les suivantes : dénaturation pendant 5 min à 95°C ; profil pour 30 cycles : 30 s à 95°C, 30 s à 50°C, 1 min à 72°C ; étape finale : 5 min à 72°C. Le fragment d'ADN amplifié a été purifié par électrophorèse en gel d'agarose, extrait avec des colonnes "GenElute Spin Columns" 25 (Sigma", USA) et précipité par l'éthanol. Le fragment d'ADN obtenu a été utilisé pour l'électroporation et l'intégration médiée par Red dans le chromosome bactérien de E. col/ MG1655 AtyrR ApheA::cat tyrA-ssrA/pKD46 comme décrit précédemment. Les souches de E col/ MG1655 AtyrR tyrA-ssrA/pKD46 résultantes ont été sélectionnées sur du 30 milieu minimal M9. L'absence de L-phénylalanine dans le milieu a permis la sélection de colonies qui étaient Phe+ avec des propriétés prototrophes.
4. Vérification de la reconstruction du gène pheA par PCR 35 Après 24 h de croissance, les colonies ont été testées pour la présence du gène pheA par PCR au moyen des amorces spécifiques de locus P4 (SEQ ID NO : 12) et P5 (SEQ ID NO : 13). Dans ce but, une colonie fraîchement isolée a été mise en suspension dans l'eau (20 pI) et 1 pI de la suspension obtenue a été utilisé pour la PCR. Le profil de température était le suivant : dénaturation d'ADN initiale à 95°C pendant 5 min ; puis 30 cycles (dénaturation à 95°C pendant 30 s, hybridation à 50°C pendant 30 s et élongation à 72°C pendant 1 min et 10 s), et élongation finale à 72°C pendant 5 min. Quelques-unes des colonies Phe{ testées contenaient le fragment d'ADN de 1827 pb requis, ce qui confirme la substitution de la région de 2373 pb du gène cat par le gène pheA (voir la figure 2). La souche mutante résultante a été appelée MG1655 AtyrR tyrA-ssrA/pKD46 (figure 4). Puis, pour éliminer le plasmide pKD46, deux passages sur de la gélose L avec Cm à 42°C ont été réalisés et les colonies qui sont 15 apparues ont été testées pour la sensibilité à l'ampicilline. Ainsi, une souche ayant le gène tyrA mutant et dépourvue de gène tyrR a été obtenue. Cette souche a été appelée MG1655 AtyrRtyrA-ssrA.
20 Exemple 2. Effet du marquage ssrA du gène tyrA sur la production de L-phénylalanine Les souches de E. colt MG1655 AtyrR tyrA-ssrA et MG1655 AtyrR ont été cultivées chacune à 37°C pendant 18 h dans un bouillon nutritif, et 0,3 ml de chacune de ces cultures a été inoculé à 3 ml de 25 milieu de fermentation ayant la composition suivante dans un tube à essai de 20 x 200 mm et cultivé à 32°C pendant 72 h avec une secoueuse rotative. Après la culture, les quantités de L-phénylalanine et de L-tyrosine accumulées dans le milieu ont été déterminées par CCM. Une 30 plaque de gel de silice en couche mince (10 x 15 cm) sur laquelle était déposée une portion aliquote (1-2 pl) de bouillon de culture a été développée avec un solvant de développement (propan-2-ol:acétate d'éthyle:ammoniac:eau = 16:16:3:9) et la L-phénylalanine et la L-tyrosine ont été détectées avec le réactif à la ninhydrine. Les résultats 35 de quatre tubes de fermentation sont montrés dans le tableau 1.
La composition du milieu de fermentation (g/l) était la suivante : glucose 40,0 (NH4)2504 16,0 K2HPO4 1,0 MgSO4.7H2O 1,0 MnSO4.5H2O 0,01 FeSO4-7H2O 0,01 Extrait de levure 2,0 CaCO3 30,0 MgSO4"7H2O et CaCO3 ont été stérilisés chacun séparément.
On peut voir d'après le tableau 1 que MG1655 AtyrR tyrA-ssrA provoquait l'accumulation d'une quantité de L-phénylalanine plus 15 élevée et d'une quantité de L-tyrosine plus basse que MG1655 AtyrR.
Tableau 1 Souche D0540 Phe, g/I Tyr, g/l MG1655 AtyrR 28,5 0,6 0,13 0,01 0,017 0,002 MG1655 AtyrR tyrA-ssrA 26,3 0,4 0,46 0,04 traces Exemple 3. Effet du marquage ssrA du gène pgi sur la 20 production de L-histidine Des souches produisant de la L-histidine avec le gène pgi marqué avec les peptides SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 15 ont été obtenues. Ces deux peptides diffèrent par la substitution de l'un des résidus d'aminoacides terminaux, l'alanine ou la valine. Ces souches ont 25 été obtenues comme suit. Tout d'abord, deux variants du gène pgi contenant des séquences nucléotidiques supplémentaires à l'extrémité 3' du gène codant les peptides SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 15 ont été obtenus par PCR avec l'ADN chromosomique de la souche de E col/ MG1655 et les amorces pgil (SEQ ID NO : 16) et pgi- 30 LAA (SEQ ID NO : 17), ou pgi-LVA (SEQ ID NO : 18), respectivement. L'amorce pgil est complémentaire de l'extrémité 5' du gène pgi et contient le site de restriction Saci à son extrémité 5'. Les amorces pgi- LVA et pgi-LAA contiennent des régions de l'extrémité 3' du gène pgi moins le codon-stop, une région codant les courts peptides SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 15, respectivement, un codon-stop, et le site de restriction Xbal à leur extrémité 5'. Deuxièmement, deux fragments de PCR ont été traités séparément avec les enzymes de restriction Sad et Xbal et ligaturés dans le plasmide pMW119 qui avait été traité auparavant avec les mêmes enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été appelés pMW-pgi-ssrAIJ'A et pMWpgi-ssrALl , respectivement. Puis, le gène pgi de type sauvage a été délété dans la souche 10 produisant de la L-histidine 80. Dans ce but, le fragment d'ADN contenant le marqueur CmR codé par le gène cata été obtenu par PCR avec les amorces P7 (SEQ ID NO : 19) et P8 (SEQ ID NO : 20) et le plasmide pMW118-attL-Cm-attR comme matrice (WO 05/010175) (figure 2). L'amorce P7 contient à la 15 fois une région identique à la région de 36 nucléotides située à l'extrémité 5' du gène pgi et une région complémentaire de la région attR de 28 nucléotides de pMW118-attL-Cm-attR. L'amorce P8 contient à la fois une région identique à la région de 36 nucléotides située à l'extrémité 3' du gène pgi et une région complémentaire de la 20 région attL de 28 nucléotides de pMW118-attL-Cm-attR. La PCR et l'électroporation du fragment d'ADN obtenu ont été accomplies comme décrit ci-dessus (voir l'exemple 1, section 1). La délétion du gène pgi a été vérifiée par PCR au moyen des amorces spécifiques de locus P9 (SEQ ID NO : 21) et P10 (SEQ ID NO : 25 22). Dans ce but, une colonie fraîchement isolée a été mise en suspension dans l'eau (20 pi) et 1 pl de cette suspension a été utilisé pour la PCR. Le profil de température était le suivant : dénaturation d'ADN initiale à 95°C pendant 5 min ; puis 30 cycles (dénaturation à 95°C pendant 30 s, hybridation à 50°C pendant 30 s et élongation à 30 72°C pendant 1 min et 10 s), et élongation finale à 72°C pendant 5 min. Quelques colonies CmR testées contenaient le fragment d'ADN de 1709 pb requis, ce qui confirme la substitution de la région native de 1651 pb du gène pgi par le gène cat. La souche mutante résultante a 35 été appelée 80 Apgi.
La souche 80 Apgi obtenue a été transformée avec les plasmides pMW-pgi-ssrAAA et pMWpgi-ssrALvA comme décrit ci-dessus. Les souches résultantes ont été appelées 80 Apgi/pMW-pgi-ssrALAA et 80 Apgi/pMWpgi-ssrAL1 , respectivement.
Pour la fermentation discontinue en mini-récipient, une anse de souche 80, de souche 80 Apgi/pMW-pgi-ssrALAA et de souche 80 Apgi/pMWpgi-ssrAL cultivées sur de la gélose L a été transférée à du bouillon L et cultivée à 30°C sous rotation (140 tr/min) pour atteindre une densité optique de la culture D0540 approximativement égale à 2,0. Puis 25 ml de culture d'ensemencement ont été ajoutés à 250 ml de milieu pour la fermentation et cultivés à 29°C avec rotation (1500 tr/min). La durée de la fermentation discontinue était d'approximativement 35-40 h. Après la culture, la quantité d'histidine qui s'était accumulée dans le milieu a été déterminée par chromatographie sur papier. Le papier a été développé avec une phase mobile : n-butanol:acide acétique:eau = 4:1:1 (v/v). Une solution de ninhydrine (0,5 %) dans l'acétone a été utilisée comme réactif de visualisation. Les résultats sont montrés dans le tableau 2 ci-dessous. On peut voir d'après le tableau 2 que les souches 80 Apgi/pMW-pgi- ssrALAA et 80 Apgi/pMWpgi-ssrAtvA provoquaient l'accumulation d'une quantité de L-histidine plus grande que la souche 80. La composition du milieu de fermentation (pH 6,0) (g/I) est la suivante glucose 25 mameno (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4'7H20 FeSO4.7H2O 30 MnSO4 thiamine bétaïne L-proline L-glutamate 35 L-aspartate adénosine 50,0 0,2 de TN 8,0 0,5 0,4 0,02 0,02 0,001 2,0 0,8 3,0 1,0 0,2 Tableau 2 Souche D0450 Quantité d'histidine, rendement/ 9/1 glucose, °/o 80 (VKPM B-7270) 31,0 9,0 18,0 80 Apgi 20,2 8,1 16,2 80 apgi/pMW-pgi-ssrA A 23,2 10,7 21,4 80 apgi/pMW-pgi-ssrA~vA 22,8 10,6 21,2 Tandis que l'invention a été décrite en détail en se référant à des modes de réalisation préférés, il apparaîtra à l'homme du métier que différents changements peuvent être apportés et que différents équivalents peuvent être employés sans s'écarter du cadre de l'invention. 36

Claims (11)

REVENDICATIONS
1. Bactérie produisant un L-aminoacide de la famille des Enterobacteriaceae caractérisée en ce qu'elle comprend un ADN 5 comprenant : A) un gène codant une enzyme bactérienne qui influence la biosynthèse des L-aminoacides, et B) un fragment d'ADN capable d'être transcrit et codant le peptide de SEQ ID NO : 2, ou un variant de celui-ci, où ledit fragment 10 est fixé audit gène à l'extrémité 3' dudit gène.
2. Bactérie selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle appartient au genre Escherichia.
3. Bactérie selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite bactérie est une bactérie produisant de la L-phénylalanine. 15
4. Bactérie selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'enzyme est la chorismate mutase/préphénate déshydrogénase.
5. Bactérie selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite bactérie est une bactérie produisant de la L-histidine.
6. Bactérie selon la revendication 1 caractérisée en ce que 20 l'enzyme est la phosphoglucose isomérase.
7. Procédé pour produire un L-aminoacide caractérisé en ce qu'il comprend la culture de la bactérie selon l'une quelconque des revendications précédentes dans un milieu de culture et l'isolement du L-aminoacide à partir du milieu de culture. 25
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que ledit L-aminoacide est la L-phénylalanine.
9. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que ledit L-aminoacide est la L-histidine.
10. Procédé pour produire un alkylester inférieur d'a-L- 30 aspartyl-L-phénylalanine caractérisé en ce qu'il comprend la culture de la bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans un milieu de culture pour produire et accumuler de la L-phénylalanine dans le milieu, et la synthèse de l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine à partir d'acide aspartique ou d'un dérivé de celui-ci et de 35 la L-phénylalanine obtenue.
11. Procédé selon la revendication 1D caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'estérification de la L-phénylalanine pour produire un aikylester inférieur de L-phénylalanine, la condensation de l'alkylester inférieur de L-phénylalanine avec le dérivé de l'acide aspartique où le dérivé est un anhydride N-acyl-L-aspartique, la séparation de l'alkylester inférieur de N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine d'avec le mélange réactionnel et l'hydrogénation de l'alkylester inférieur de N-acyl-a-L-aspartyl-L-phénylalanine pour produire l'alkylester inférieur d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine.
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