FR3056989A1 - Procede de production d'acides l-amines - Google Patents

Procede de production d'acides l-amines Download PDF

Info

Publication number
FR3056989A1
FR3056989A1 FR1759214A FR1759214A FR3056989A1 FR 3056989 A1 FR3056989 A1 FR 3056989A1 FR 1759214 A FR1759214 A FR 1759214A FR 1759214 A FR1759214 A FR 1759214A FR 3056989 A1 FR3056989 A1 FR 3056989A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
leu
val
isle
thr
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR1759214A
Other languages
English (en)
Other versions
FR3056989B1 (fr
Inventor
Mika Moriya
Kazuyuki Hayashi
Akari Yokokawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of FR3056989A1 publication Critical patent/FR3056989A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR3056989B1 publication Critical patent/FR3056989B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/28—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/34—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C229/36—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings with at least one amino group and one carboxyl group bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

On met à disposition un procédé de production d'un acide L-aminé tel que l'acide L-glutamique. Un acide L-aminé est produit par la mise en culture d'une bactérie possédant une capacité de production d'acide Laminé , qui a été modifiée de sorte que l'activité d'un transporteur d'acide dicarboxylique C4 tel que DctA, DcuA, et DcuB soit augmentée, dans un milieu, et la collecte de l'acide L-aminé à partir du milieu ou des cellules de la bactérie.

Description

DESCRIPTION
PROCÉDÉ DE PRODUCTION D’ACIDES L-AMI NÉS
Domaine technique [0001]
La présente invention concerne un procédé de production d’un acide L-aminé, tel que l’acide L-glutamique, par une fermentation en utilisant une bactérie. Les acides L-aminés sont utiles sur le plan industriel en tant que matières premières des assaisonnements et ainsi de suite.
Art antérieur [0002]
Les acides L-aminés sont produits de manière industrielle, par exemple, par une fermentation en utilisant des micro-organismes tels que des bactéries possédant une capacité de production d’acides L-aminés (Document non-brevet 1). En tant que tels micro-organismes, par exemple, des souches isolées dans la nature et des souches mutantes de celles-ci ont été utilisées. De plus, une capacité de production d’acides Laminés de micro-organismes peut être améliorée en utilisant des techniques de l’ADN recombinant. Par exemple, en tant que moyen pour améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique de bactéries, on sait qu’il est possible d’améliorer l’activité phosphocétolase (Document de brevet 1) et d’utiliser un gène yggBmutant (Document de brevet 2). [0003]
Divers transporteurs d’acide dicarboxylique C4 ont été observés chez les bactéries. Les bactéries peuvent incorporer et métaboliser des acides dicarboxyliques C4 via ces transporteurs d’acide dicarboxylique C4. Par exemple, on sait que les protéines codées par le gène dctA, le gène dcuA, et le gène dcuB possèdent toutes une capacité d’incorporation d’un acide dicarboxylique C4 tel que l’acide aspartique (Documents non-brevet 2 à 3). On sait également qu’une protéine codée par un gène dctA possède également une capacité d’incorporation d’acide L-glutamique (Document non-brevet 4).
[0004]
En outre, un procédé de production d’un acide L-aminé utilisant une bactérie corynéforme présentant une expression améliorée du gène dctA a été rapporté (Document de brevet 3). Ce document décrit un exemple dans lequel de la L-lysine a été produite en utilisant la même bactérie. Par opposition, même si des acides L-aminés autres que la L-lysine, tel que l’acide L-glutamique, sont également exemplifiés en tant qu’acide L-aminé dans ce document, le fait que des acides L-aminés autres que la L-lysine, tel que l’acide L-glutamique, puissent être produits en utilisant la même bactérie n’a pas été démontré.
[0005]
De plus, on sait qu’une protéine codée par le gène yggB possède une capacité d’excrétion d’acide L-glutamique (Document de brevet 2 et Document non-brevet 5).
Références de l’art antérieur
Documents de brevet [0006]
Document de brevet 1 : W02006/016705
Document de brevet 2 : W02006/070944
Document de brevet 3 : US2002-0106759
Documents non-brevet [0007]
Document non-brevet 1 : Akashi, K. et al., Amino Acid Fermentation. Japan Scientific Societies Press, p.195 à 215, 1986.
Document non-brevet 2 : Karinou E. et al., The Escherichia coli SLC26 homologue YchM (DauA) is a C4-dicarboxylic acid transporter. Mol Microbiol. Février 2013 ; 87(3):623-40.
Document non-brevet 3 : Janausch IG. et al., C4-dicarboxylate carriers and sensors in bacteria. Biochim Biophys Acta. 17 janvier 2002 ; 1553(12):39-56.
Document non-brevet 4 : Youn et al., Characterization of the Dicarboxylate Transporter DctA in Corynebacterium glutamicum. Journal Of Bacteriology. Septembre 2009. 5480-5488.
Document non-brevet 5 : Nakamura et al., Mutations of the Corynebacterium glutamicum NCgl1221 Gene, Encoding a Mechanosensitive Channel Homolog, Induce l-Glutamic Acid Production. Applied And Environmental Microbiology. Juillet 2007 4491-4498.
Résumé de l’invention
Objet devant être atteint par l’invention [0008]
Un objet de la présente invention consiste à développer une nouvelle technique pour améliorer une capacité de production d’acide Laminé d’une bactérie, et ainsi de mettre à disposition un procédé pour efficacement produire un acide L-aminé.
Moyens pour atteindre l’objet [0009]
Afin d’atteindre l’objet susmentionné, les inventeurs de la présente invention ont mené diverses recherches. En conséquence, ils ont découvert qu’une capacité de production d’acide L-aminé d’une bactérie pouvait être améliorée en modifiant la bactérie de sorte que l’expression du gène dctA, gène dcuA, ou gène dcuB, codant pour un transporteur d’acide dicarboxylique C4, soit augmentée, et sont parvenus à la présente invention.
[0010]
Des modes de réalisation de la présente invention peuvent ainsi, par exemple, être les suivants.
[1] Un procédé de production d’un acide L-aminé, le procédé comprenant :
la mise en culture d’une bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé dans un milieu afin d’accumuler un acide Laminé dans le milieu et/ou les cellules de la bactérie ; et la collecte de l’acide L-aminé à partir du milieu et/ou des cellules, où la bactérie a été modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée par comparaison à une souche non modifiée, où le transporteur d’acide dicarboxylique C4 consiste en un ou plusieurs types de protéines sélectionnés parmi des protéines codées par un gène dctA, un gène dcuA, et un gène dcuB, et où l’acide L-aminé est un acide L-aminé autre que l’acide Laspartique, à condition que l’acide L-aminé soit l’acide L-glutamique lorsque le transporteur d’acide dicarboxylique C4 est une protéine codée par un gène dctA.
[2] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel le gène dctA est un gène codant pour une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
(a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 16 ou 18 ;
(b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 16 ou 18, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une activité d’incorporation d’acide L-aspartique ;
(c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 16 ou 18, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique.
[3] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel le gène dcuA est un gène codant pour une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
(a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 20 ;
(b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 20, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique ;
(c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 20, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique.
[4] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel le gène dcuBesl un gène codant pour une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
(a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 22 ;
(b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 22, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique ;
(c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 22, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique.
[5] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’activité du transporteur d’acide dicarboxylique C4 est augmentée en augmentant l’expression d’un gène codant pour le transporteur d’acide dicarboxylique C4.
[6] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’expression du gène est augmentée en augmentant le nombre de copies du gène et/ou en modifiant une séquence de contrôle de l’expression du gène.
[7] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie a en outre été modifiée de sorte que l’activité de la phosphocétolase soit augmentée par comparaison à une souche non modifiée.
[8] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la phosphocétolase consiste en la D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase et/ou la fructose6-phosphate phosphocétolase.
[9] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’activité de la phosphocétolase est augmentée en augmentant l’expression d’un gène codant pour la phosphocétolase.
[10] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie est une bactérie corynéforme ou une bactérie appartenant à la famille Enterobacteriaceae.
[11] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.
[12] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie est Corynebacterium g/utamicum.
[13] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie est une bactérie appartenant au genre Pantoea qu Escherichia.
[14] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie est Pantoea ananatis ou Escherichia coii.
[15] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’acide L-aminé consiste en un acide L-aminé de la famille glutamate et/ou un acide Laminé de la famille aspartate.
[16] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’acide L-aminé de la famille glutamate consiste en un ou plusieurs acides L-aminés sélectionnés parmi l’acide L-glutamique, la L-glutamine, la L-proline, la L-arginine, la Lcitrulline, et la L-ornithine.
[17] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’acide L-aminé de la famille glutamate est l’acide L-glutamique.
[18] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’acide L-glutamique est le L-glutamate monoammonique ou le L-glutamate monosodique.
[19] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’acide L-aminé de la famille aspartate consiste en un ou plusieurs acides L-aminés sélectionnés parmi la L-lysine, la L-thréonine, la L-isoleucine, et la L-méthionine.
[20] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel l’acide L-aminé est un acide L-aminé de la famille glutamate, et dans lequel la bactérie a en outre été modifiée de sorte que l’activité de I’·-cétoglutarate déshydrogénase et/ou la succinate déshydrogénase soit réduite par comparaison à une souche non modifiée.
[21] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la bactérie est une bactérie corynéforme, et dans lequel la bactérie a en outre été modifiée de sorte à abriter un gène yggB mutant.
[22] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel le gène yggB mutant est un gène yggB comportant une mutation qui améliore la capacité de production d’acide L-glutamique de la bactérie corynéforme.
[23] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel le gène yggB mutant est un gène yggB comportant une mutation définie en (1), (2), ou (3) mentionné ci-dessous :
(1) une mutation dans la région codant pour les résidus d’acides aminés aux positions 419 à 533 d’une protéine YggB de type sauvage, (2) une mutation dans la région codant pour une région transmembranaire d’une protéine YggB de type sauvage, et (3) une combinaison de celles-ci.
[24] Le procédé mentionné ci-dessus, dans lequel la protéine YggB de type sauvage est une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
(a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 10 ;
(b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 10, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une propriété selon laquelle une expression augmentée de celle-ci dans la bactérie corynéforme permet d’obtenir une capacité de production d’acide L-glutamique améliorée de la bactérie corynéforme ;
(c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 10, et qui possède une propriété selon laquelle une expression augmentée de celle-ci dans la bactérie corynéforme permet d’obtenir une capacité de production d’acide L-glutamique améliorée de la bactérie corynéforme.
[0011]
Selon la présente invention, une capacité de production d’acide Laminé d’une bactérie peut être améliorée, et un acide L-aminé peut être efficacement produit.
Brève description des dessins [0012] [FIG. 1] Schéma montrant les résultats d’une culture de production d’acide glutamique en utilisant une souche de C. glutamicum présentant une expression améliorée d’un gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 (Cg-dctA, Ec-dctA, Ec-dcuA, ou Ec-dcuB). (A) Quantité d’accumulation d’acide glutamique (Glu), (B) Quantité d’accumulation d’acide aspartique (Asp).
Modes de réalisation de l’invention [0013]
Q-après, la présente invention va être expliquée en détail.
[0014]
Le procédé de la présente invention est un procédé de production d’un acide L-aminé comprenant la mise en culture d’une bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé dans un milieu afin d’accumuler un acide L-aminé dans le milieu et/ou les cellules de la bactérie, et la collecte de l’acide L-aminé à partir du milieu et/ou des cellules de la bactérie, où la bactérie a été modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée. La bactérie utilisée pour ce procédé est également désignée « bactérie de la présente invention >>.
[0015] <1> Bactérie de la présente invention
La bactérie de la présente invention est une bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé, qui a été modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée.
[0016] <1-1> Bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé
Dans la présente invention, le terme « bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé >> fait référence à une bactérie qui possède une capacité à générer et à accumuler un acide L-aminé cible dans un milieu et/ou les cellules de la bactérie dans un degré tel que l’acide L-aminé peut être collecté, lorsque la bactérie est mise en culture dans le milieu. La bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé peut être une bactérie qui est capable d’accumuler un acide Laminé cible dans milieu et/ou les cellules de la bactérie en une quantité plus importante que celle pouvant être obtenue avec une souche non modifiée. Le terme « souche non modifiée >> fait référence à une souche de contrôle qui n’a pas été modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée. Gest-à-dire que des exemples de la souche non modifiée comprennent une souche de type sauvage et une souche parentale. La bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé peut être une bactérie qui est capable d’accumuler un acide L-aminé cible dans un milieu en une quantité de préférence de 0,5 g/l ou plus, de manière davantage préférée de 1,0 g/l ou plus.
[0017]
L’acide L-aminé produit dans la présente invention est un acide Laminé autre que l’acide L-aspartique. Des exemples de l’acide L-aminé autre que l’acide L-aspartique comprennent des acides aminés basiques tels que la L-lysine, la L-ornithine, la L-arginine, la L-histidine, et la Lcitrulline ; des acides aminés aliphatiques tels que la L-isoleucine, la Lalanine, la L-valine, la L-leucine, et la glycine ; des acides aminés qui sont des acides hydroxy-monoaminocarboxyliques tels que la L-thréonine et la L-sérine ; des acides aminés cycliques tels que la L-proline ; des acides aminés aromatiques tels que la L-phénylalanine, la L-tyrosine, et le Ltryptophane ; des acides aminés contenant du soufre tels que la Lcystéine, la L-cystine, et la L-méthionine ; des acides aminés acides tels que l’acide L-glutamique ; et des acides aminés possédant un groupe amide dans la chaîne latérale tels que la L-glutamine et la L-asparagine. Des exemples particuliers de l’acide L-aminé autre que l’acide L-aspartique comprennent un acide L-aminé de la famille glutamate et un acide Laminé de la famille aspartate. Le terme « acide L-aminé de la famille glutamate >> fait collectivement référence à l’acide L-glutamique et à des acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide L-glutamique en tant qu’intermédiaire. Des exemples des acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide L-glutamique en tant qu’intermédiaire comprennent la L-glutamine, la L-proline, la L-arginine, la L-citrulline, et la L-ornithine. Le terme « acide L-aminé de la famille aspartate >> fait collectivement référence à des acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide L-aspartique en tant qu’intermédiaire, et ne comprennent pas l’acide L-aspartique per se. Des exemples des acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide L-aspartique en tant qu’intermédiaire comprennent la L-lysine, la L-thréonine, la L-isoleucine, et la L-méthionine. Des exemples plus particuliers de l’acide L-aminé autre que l’acide Laspartique comprennent l’acide L-glutamique. Par exemple, au moins lorsque le transporteur d’acide dicarboxylique C4 est une protéine codée par le gène dctA, l’acide L-aminé peut être l’acide L-glutamique. La bactérie de la présente invention peut posséder une capacité de production d’un seul type d’acide L-aminé, ou deux types d’acides Laminés ou plus.
[0018]
Dans la présente invention, le terme « acide aminé >> fait référence à un acide L-aminé, sauf indication contraire. Dans la présente invention, le terme « acide L-aminé >> fait référence à un acide L-aminé sous une forme libre, à un sel de celui-ci, ou à un mélange de celui-ci, sauf indication contraire. Des exemples de sel seront décrits plus loin.
[0019]
Des exemples de la bactérie comprennent des bactéries appartenant à la famille Enterobacteriaceae et des bactéries corynéformes.
[0020]
Des exemples de bactéries appartenant à la famille Enterobacteriaceae comprennent des bactéries appartenant au genre Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Morganella, ou analogue. Spécifiquement, des bactéries classées dans la famille des Enterobacteriaceae selon la taxonomie utilisée dans la base de données du NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id= 91347) peuvent être utilisées.
[0021]
Les bactéries Escherichia ne sont pas particulièrement limitées, et des exemples de celles-ci comprennent celles classées dans le genre Escherichia selon la taxonomie connue de l’homme du métier dans le domaine de la microbiologie. Des exemples des bactéries Escherichia comprennent, par exemple, celles décrites dans les travaux de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Dérivations and Génotypes of some mutant dérivatives of Escherichia coii K-12, pp.2460-2488, Tableau 1, dans F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coii and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Seconde Édition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Des exemples des bactéries Escherichia comprennent, par exemple, Escherichia coii. Des exemples spécifiques d’Escherichia coii comprennent, par exemple, les souches d’Escherichia coii K-12 telles que la souche W3110 (ATCC 27325) et la souche MG1655 (ATCC 47076) ; la souche Escherichia coii VS (ATCC 23506) ; les souches B d’Escherichia coii telles que la souche BL21 (DE3) ; et des souches dérivées de celles-ci. [0022]
Les bactéries Enterobacter ne sont pas particulièrement limitées, et des exemples comprennent celles classées dans le genre Enterobacter selon la taxonomie connue de l’homme du métier dans le domaine de la microbiologie. Des exemples de la bactérie Enterobacter comprennent, par exemple, Enterobacter aggiomerans et Enterobacter aerogenes. Des exemples spécifiques d’Enterobacter aggiomerans comprennent, par exemple, la souche Enterobacter aggiomerans ATCC 12287. Des exemples spécifiques d’Enterobacter aerogenes comprennent, par exemple, la souche Enterobacter aerogenes KXCC, 13048, la souche NBRC 12010 (Biotechnol. Bioeng., 27 mars 2007 ; 98(2):340-348), et la souche AJ110637 (FERM BP-10955). Des exemples des bactéries Enterobacter comprennent également, par exemple, les souches décrites dans la demande de brevet européen mise à l’inspection publique (EP-A) n° 0952221. De plus, Enterobacter agg/omerans comprend également certaines souches classées en tant que Pantoea agg/omerans.
[0023]
Les bactéries Pantoea ne sont pas particulièrement limitées, et des exemples comprennent celles classées dans le genre Pantoea selon la taxonomie connue de l’homme du métier dans le domaine de la microbiologie. Des exemples des bactéries Pantoea comprennent, par exemple, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agg/omerans, et Pantoea citrea. Des exemples spécifiques de Pantoea ananatis comprennent, par exemple, la souche Pantoea ananatis LMG20103, la souche AJ13355 (FERM BP-6614), la souche AJ13356 (FERM BP-6615), la souche AJ13601 (FERM BP-7207), la souche SC17 (FERM BP-11091), la souche SG17(0) (VKPM B-9246), et la souche SC17sucA (FERM BP-8646). Certaines des bactéries Enterobacter et des bactéries Erwinia ont été reclassées dans le genre Pantoae (Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989) ; Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)). Par exemple, certaines souches d’Enterobacter agg/omerans ont été récemment reclassées en Pantoea agg/omerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, ou analogue, d’après une analyse de la séquence de nucléotides de l’ARNr 16S, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989)). Dans la présente invention, les bactéries Pantoea comprennent celles reclassées dans le genre Pantoea\.e\ que décrit ci-dessus.
[0024]
Des exemples des bactéries Erwinia comprennent Erwinia amytovora et Erwinia carotovora. Des exemples des bactéries Klebsiella comprennent Klebsiella planticota.
[0025]
Des exemples des bactéries corynéformes comprennent des bactéries appartenant au genre Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, ou analogue.
[0026]
Des exemples spécifiques des bactéries corynéformes comprennent les espèces suivantes.
Corynebacterium acetoacidophitum
Corynebacterium acetogtutamicum
Corynebacterium atkanotyticum
Corynebacterium cattunae
Corynebacterium crenatum
Corynebacterium gtutamicum
Corynebacterium titium
Corynebacterium metassecota
Corynebacterium thermoaminogenes ( Corynebacterium efficient
Corynebacterium hercutis
Brevibacterium divaricatum ( Corynebacterium gtutamicum) Brevibacterium ftavum ( Corynebacterium gtutamicurri) Brevibacterium immariophitum
Brevibacterium tactofermentum ( Corynebacterium gtutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharotyticum Brevibacterium thiogenitatis
Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphitum [0027]
Des exemples spécifiques des bactéries corynéformes comprennent les souches suivantes.
Corynebacterium acetoacidophitum ATCC 13870 Corynebacterium acetogtutamicum ATCC 15806 Corynebacterium atkanotyticum ATCC 21511 Corynebacterium cattunae ATCC 15991 Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium gtutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium titium KXCC, 15990 Corynebacterium metassecota ATCC 17965
Corynebacterium efficiens {Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium hercutis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum {Corynebacterium gtutamicum) ATCC
14020
Brevibacterium ftavum {Corynebacterium gtutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophitum ATCC 14068
Brevibacterium tactofermentum {Corynebacterium gtutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharotyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitatis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes {Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphitum ATCC 15354 [0028]
Les bactéries Corynebacterium comprennent des bactéries qui avaient été précédemment classées dans le genre Brevibacterium, mais sont actuellement réunies dans le genre Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). De plus, Corynebacterium stationis comprend des bactéries qui avaient été précédemment classées en tant que Corynebacterium ammoniagenes, mais sont actuellement reclassées en Corynebacterium stationis d’après une analyse de la séquence de nucléotides de l’ARNr 16S, etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)).
[0029]
Ces souches sont disponibles auprès de, par exemple, l’American Type Culture Collection (Adresse: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ΡΌ. Box 1549, Manassas, VA 20108, États-Unis d’Amérique). C’est-à-dire que les numéros d’enregistrement sont indiqués par rapport aux souches respectives, et que les souches peuvent être commandées en utilisant ces numéros d’enregistrement (se reporter à http://www.atcc.org/). Les numéros d’enregistrement des souches sont listés dans le catalogue de l’American Type Culture Collection. Ces souches peuvent également être obtenues, par exemple, à partir des institutions de dépôt dans lesquels les souches ont été déposées.
[0030]
La bactérie de la présente invention peut être une bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé de manière inhérente, ou peut être une bactérie modifiée de sorte à posséder une capacité de production d’acide L-aminé. La bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé peut être obtenue en conférant une capacité de production d’acide L-aminé à une telle bactérie telle que mentionnée ci-dessus, ou en améliorant une capacité de production d’acide L-aminé d’une telle bactérie telle que mentionnée ci-dessus.
[0031]
Afin de conférer ou d’améliorer une capacité de production d’acide L-aminé, des procédés conventionnellement employés dans la culture de souches productrices d’acides aminés de bactéries corynéformes, de bactéries Escherichia, et ainsi de suite (se reporter à « Amino Acid Fermentation >>, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1ere Édition, publié le 30 mai 1986, pp.77-100), peuvent être utilisés. Des exemples de tels procédés comprennent, par exemple, l’obtention d’une souche mutante auxotrophe, l’obtention d’une souche résistante à un analogue d’acide aminé, l’obtention d’une souche mutante pour une régulation métabolique, et la construction d’une souche recombinante dans laquelle l’activité d’une enzyme de biosynthèse d’un acide L-aminé est améliorée. Lors de la culture de bactéries productrices d’acide L-aminé, une seule des propriétés décrites ci-dessus telles que l’auxotrophie, la résistance à un analogue, et une mutation de régulation métabolique, peut être conférée, ou deux ou trois telles propriétés ou plus peuvent être conférées en combinaison. De plus, lors de la culture de bactéries productrices d’acide L-aminé, l’activité d’une seule des enzymes de biosynthèse d’un acide L-aminé peut être améliorée, ou les activités de deux ou trois telles enzymes ou plus peuvent être améliorée en combinaison. En outre, le fait de conférer une/des propriété(s) telle(s) qu’une auxotrophie, une résistance à un analogue, et une mutation de régulation métabolique peut être combiné à une amélioration de l’activité/des activités d’une/de plusieurs enzyme(s) de biosynthèse.
[0032]
Une souche mutante auxotrophe, une souche résistante à un analogue, ou une souche mutante pour une régulation métabolique possédant une capacité de production d’acide L-aminé peut être obtenue en soumettant une souche parentale ou une souche de type sauvage à un traitement de mutagenèse classique, puis en sélectionnant une souche exhibant une auxotrophie, une résistance à un analogue, ou une mutation de régulation métabolique, et possédant une capacité de production d’acide L-aminé à partir des souches mutantes obtenues. Des exemples du traitement de mutagenèse classique comprennent une irradiation de rayons X ou ultraviolets et un traitement avec un agent mutagène tel que la N-méthyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), et le méthanesulfonate de méthyle (MMS).
[0033]
Une capacité de production d’acide L-aminé peut également être conférée ou améliorée en améliorant l’activité d’une enzyme impliquée dans la biosynthèse d’un acide L-aminé cible. Une activité enzymatique peut être améliorée, par exemple, en modifiant une bactérie de sorte que l’expression d’un gène codant pour l’enzyme soit améliorée. Des procédés pour améliorer l’expression d’un gène sont décrits dans WO00/18935, EP1010755A, et ainsi de suite. Les procédures détaillées pour améliorer l’activité enzymatique seront décrites plus loin.
[0034]
En outre, une capacité de production d’acide L-aminé peut également être conférée ou améliorée en réduisant l’activité d’une enzyme qui catalyse une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse d’un acide L-aminé cible pour générer un composé autre que l’acide L-aminé cible. L’ « enzyme qui catalyse une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse d’un acide L-aminé cible pour générer un composé autre que l’acide L-aminé cible >> à laquelle on fait référence dans la présente comprend une enzyme impliquée dans la décomposition de l’acide aminé cible. Le procédé de réduction d’une activité enzymatique sera décrit plus loin.
[0035]
Ο-après, des bactéries productrices d’acide L-aminé et des procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide Laminé vont être spécifiquement exemplifiés. Toutes les propriétés des bactéries productrices d’acide L-aminé et les modifications pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-aminé peuvent être utilisées indépendamment ou en une quelconque combinaison appropriée. [0036] < Bactéries productrices d’acide L-glutamique>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse d’acide Lglutamique. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la glutamate déshydrogénase (gdhA), la glutamine synthétase (g/nA), la glutamate synthase (gttBD), l’isocitrate déshydrogénase (/ccZ4), l’aconitate hydratase (aczH acnB), la citrate synthase (g/tA), la méthylcitrate synthase (prpQ, la pyruvate carboxylase (pyd), la pyruvate déshydrogénase (aceEF, tpdA), la pyruvate kinase (pykA pykFj, la phosphoénolpyruvate synthase (ppsA), l’énolase (eno), la phosphoglycéromutase (pgmA, pgmf), la phosphoglycérate kinase (pgk), la glycéraldéhyde-3-phophate déshydrogénase (gapA), la triose phosphate isomérase (tpiA), la fructose bisphosphate aldolase (fbp), la glucose phosphate isomérase (pgi), la 6-phosphogluconate déshydratase (edd), la 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase (eda), et la transhydrogénase. Des exemples de gènes codant pour les enzymes sont montrés entre parenthèses après les noms des enzymes (ceci s’appliquera dans les mêmes circonstances ci-après). Il est préférable d’améliorer l’activité ou les activités d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi, par exemple, la glutamate déshydrogénase, la citrate synthase, la phosphoénolpyruvate carboxylase, et la méthylcitrate synthase, parmi ces enzymes.
[0037]
Des exemples de souches appartenant à la famille Enterobacteriaceae et modifiées de sorte que l’expression du gène de la citrate synthase, gène de la phosphoénolpyruvate carboxylase, et/ou gène de la glutamate déshydrogénase soit augmentée comprennent celles décrites dans EP1078989A, EP955368A, et EP952221A. En outre, des exemples de souches appartenant à la famille Enterobacteriaceae et modifiées de sorte que l’expression d’un gène de la voie d’EntnerDoudoroff (edd, eda) soit augmentée comprennent celles décrites dans EP1352966B. Des exemples de bactéries corynéformes modifiées de sorte que l’expression du gène de la glutamate synthétase (gitBD) soit augmentée comprennent celles décrites dans WO99/07853.
[0038]
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités réduite(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes qui catalysent une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse de l’acide L-glutamique pour générer un composé autre que l’acide L-glutamique. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, l’isocitrate lyase (aceA), I’·-cétoglutarate déshydrogénase (sucA, odhA), l’acétolactate synthase (/7//), la formate acétyltransférase (pfi), la lactate déshydrogenase {idh), l’alcool déshydrogénase {adh), la glutamate décarboxylase (gadAB), et la succinate déshydrogénase (sdhABCD). Il est préférable de réduire ou de supprimer, par exemple, l’activité ·cétoglutarate déshydrogénase, parmi ces enzymes.
[0039]
Des bactéries Escherichia possédant une activité «-cétoglutarate déshydrogénase réduite, ou déficientes en activité «-cétoglutarate déshydrogénase, et des procédés pour les obtenir sont décrits dans les brevets U.S. n° 5 378 616 et 5 573 945. En outre, des procédés pour réduire ou supprimer l’activité «-cétoglutarate déshydrogénase de bactéries Enterobacteriaceae telles que des bactéries Pantoea, des bactéries Enterobacter, des bactéries Klebsiella, et des bactéries Erwinia sont décrits dans les brevets U.S. n° 6 197 559, 6 682 912, 6 331 419, et 8 129151, et W02008/075483. Des exemples spécifiques de bactéries Escherichia possédant une activité · -cétoglutarate déshydrogénase réduite ou déficientes en activité «-cétoglutarate déshydrogénase comprennent les souches suivantes.
E coii \N3110su cA: : Kmr
E coiiAJ12624 (FERM BP-3853)
E. coiiAJ12628 (FERM BP-3854)
E. coiiAJ12949 (FERM BP-4881) [0040]
E. coii W3110sucA::Kmr est une souche obtenue par une perturbation du gène sucA codant pour l’« -cétoglutarate déshydrogénase d’E coii W3110. Cette souche est complètement déficiente en activité ·cétoglutarate déshydrogénase.
[0041]
Des bactéries corynéformes dans lesquelles l’activité ·cétoglutarate déshydrogénase est réduite ou éliminée, et des procédés pour obtenir celles-ci, sont décrits dans W02008/075483. Des exemples spécifiques de bactéries corynéformes dans lesquelles l’activité ·cétoglutarate déshydrogénase est réduite ou éliminée comprennent, par exemple, les souches suivantes.
Souche Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermenturri) L30-2 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2006-340603)
Souche Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermenturri} · S (WO95/34672)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermenturri) AJ12821 (FERM BP-4172, brevet français n° 9401748)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium ftavum) AJ12822 (FERM BP-4173, brevet français n° 9401748)
Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, brevet français n° 9401748) [0042]
Des exemples de bactéries productrices d’acide L-glutamique et de souches parentales pour les dériver comprennent également des bactéries Pantoea, telles que la souche Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), la souche Pantoea ananatis SC17 (FERM BP-11091), et la souche Pantoea ananatis SC17(0) (VKPM B-9246). La souche AJ13355 est une souche isolée à partir du sol à Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japon, en tant que souche qui peut proliférer dans un milieu à faible pH contenant de l’acide Lglutamique et une source de carbone. La souche SC17 est une souche sélectionnée en tant que souche mutante faiblement productrice de phlegme issue de la souche AJ13355 (brevet U.S. n° 6 596 517). La souche SC17 a été déposée auprès de l’agence administrative indépendante, le National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 4 février 2009, et a reçu le numéro d’accès FERM BP-11091. La souche AJ13355 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 19 février 1998 et a reçu le numéro d’accès FERM P-16644. Ensuite, le dépôt a été converti en dépôt international conformément aux dispositions du Traité de Budapest le 11 janvier 1999, et a reçu le numéro d’accès FERM BP6614.
[0043]
En outre, des exemples de bactéries productrices d’acide Lglutamique et de souches parentales pour les dériver comprennent également des bactéries Pantoea possédant une activité · -cétoglutarate déshydrogénase réduite ou déficientes en activité «-cétoglutarate déshydrogénase. Des exemples de telles souches comprennent la souche AJ13356 (brevet U.S. n° 6 331 419), qui est une souche déficiente en gène de la sous-unité E1 de Γ·-cétoglutarate déshydrogénase (sucA) de la souche AJ13355, et la souche SC17sucA (brevet U.S. n°6 596 517), qui est une souche déficiente en gène sucA de la souche SC17. La souche AJ13356 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 19 février 1998, et a reçu le numéro d’accès FERM P-16645. Ensuite, le dépôt a été converti en dépôt international conformément aux dispositions du Traité de Budapest le 11 janvier 1999, et a reçu le numéro d’accès FERM BP-6616. La souche SC17sucA a reçu le numéro privé AJ417, et a été déposée auprès de l’agence administrative indépendante, le National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 26 février 2004, sous le numéro d’accès FERM BP-8646.
[0044]
La souche AJ13355 a été identifiée en tant qu’Enterobacter aggtomerans lorsqu’elle a été isolée, mais elle a été récemment reclassée en tant que Pantoea ananatis d’après une analyse de la séquence de nucléotides de l’ARNr 16S et ainsi de suite. Par conséquent, même si les souches AJ13355 et AJ13356 sont déposées auprès de l’institution de dépôt susmentionnée en tant qu’Enterobacter aggtomerans, elles sont désignée Pantoea ananatis dans ce mémoire.
[0045]
En outre, des exemples de bactéries productrices d’acide Lglutamique et de souches parentales pour les dériver comprennent également des bactéries Pantoea telles que la souche Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, la souche Pantoea ananatis AJ13601, la souche Pantoea ananatis NP106, et la souche Pantoea ananatis NA1. La souche SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB a été obtenue en introduisant le plasmide RSFCPG contenant le gène de la citrate synthase (gttA), le gène de la phosphoénolpyruvate carboxylase (ppô), et le gène de la glutamate déshydrogénase (gdhA) dérivés d’Escherichia coti, et le plasmide pSTVCB contenant le gène de la citrate synthase {g/tA) dérivé de Brevibacterium lactofermentum, dans la souche SC17sucA. La souche AJ13601 est une souche sélectionnée à partir de la souche SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB en tant que souche résistante à une forte concentration d’acide L-glutamique à un faible pH. La souche NP106 a été obtenue à partir de la souche AJ13601 par une réticulation des plasmides RSFCPG et pSTVCB. La souche NA1 a été obtenue à partir de la souche NP106 en introduisant le plasmide RSFPPG dans celle-ci (WO2010/027045). Le plasmide RSFPPG possède une structure correspondant au plasmide RSFCPG sauf que le gène g/tA de celui-ci a été remplacé par un gène de la méthylcitrate synthase (prpQ et, par conséquent, il contient le gène prpC, le gène ppc, et le gène gdhA (W02008/020654). La souche AJ13601 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 18 août 1999, et a reçu le numéro d’accès FERM P-17516. Ensuite, le dépôt a été converti en dépôt international conformément aux dispositions du Traité de Budapest le 6 juillet 2000, et a reçu le numéro d’accès FERM BP-7207.
[0046]
Des exemples de bactéries productrices d’acide L-glutamique et de souches parentales pour les driver comprennent également des souches dans lesquelles à la fois l’activité ·-cétoglutarate déshydrogénase (sucA) et l’activité succinate déshydrogénase {sdh) sont réduites ou supprimées (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2010-041920). Des exemples spécifiques de telles souches comprennent, par exemple, une souche doublement déficiente sucAsdhA de la souche Pantoea ananatis NA1 et une souche doublement déficiente odhAsdhA de la souche Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, c’est-à-dire la souche Corynebacterium glutamicum 8L3G· SDH (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2010-041920).
[0047]
Des exemples de bactéries productrices d’acide L-glutamique et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches mutantes auxotrophes. Des exemples spécifiques de souches mutantes auxotrophes comprennent, par exemple, E. coii VL334thrCL (VKPM B8961, EP1172433). E. co/i VL334 (VKPM B-1641) est une souche auxotrophe pour la L-isoleucine et la L-thréonine comportant des mutations dans les gènes thrCel iivA (brevet U.S. n° 4 278 765). E. coii VL334thrCL est une bactérie productrice d’acide L-glutamique auxotrophe pour la L-isoleucine obtenue en introduisant un allèle de type sauvage du gène ZArC’dans la souche VL334. L’allèle de type sauvage du gène thrCa été introduit par le procédé de transduction générale en utilisant un bactériophage P1 mis en culture sur les cellules de la souche E. coii K-12 de type sauvage (VKPM B-7).
[0048]
Des exemples de bactéries productrices d’acide L-glutamique et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches présentant une résistance à un analogue de l’acide aspartique. De telles souches peuvent également être déficientes en activité ·-cétoglutarate déshydrogénase. Des exemples spécifiques de souches présentant une résistance à un analogue de l’acide aspartique et déficientes en activité · cétoglutarate déshydrogénase comprennent, par exemple, E. co//'AJ13199 (FERM BP-5807, brevet U.S. n° 5 908 768), E. coli FFRM P-12379, qui possède en outre une capacité de décomposition de l’acide L-glutamique diminuée (brevet U.S. n° 5 393 671), et E. coli AJ13138 (FERM BP-5565, brevet U.S. n° 6 110 714).
[0049]
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique comprennent également, par exemple, un procédé pour améliorer l’expression d’un gène de sécrétion d’acide Lglutamique, tel qu’un gène yhfK (W02005/085419) ou un gène ybjL (W02008/133161).
[0050]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique pour ou dans des bactéries corynéformes comprennent également des procédés pour conférer une résistance à un analogue d’acide organique, un inhibiteur respiratoire, ou analogue, et des procédés pour conférer une sensibilité à un inhibiteur de la synthèse de la paroi cellulaire. Des exemples spécifiques de tels procédés comprennent, par exemple, le procédé pour conférer une résistance à l’acide monofluoroacétique (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 50-113209), le procédé pour conférer une résistance à l’adénine ou une résistance à la thymine ((brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-065198), le procédé d’atténuation de l’uréase (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 52-038088), le procédé pour conférer une résistance à l’acide malonique (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°52038088), le procédé pour conférer une résistance aux benzopyrones ou aux naphtoquinones (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-1889), le procédé pour conférer une résistance à l’HOQNO (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-140895), le procédé pour conférer une résistance à l’acide ·-cétomalonique (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-2689), le procédé pour conférer une résistance à la guanidine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-35981), le procédé pour conférer une sensibilité à la pénicilline (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°488994), et ainsi de suite.
[0051]
Des exemples spécifiques de telles bactéries résistantes ou sensibles comprennent les souches suivantes.
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium f/avum) AJ3949 (FERM BP-2632, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 50113209)
Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-065198)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium f/avum) AJ11355 (FERM P-5007, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°561889/
Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-1889)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium f/avum) AJ11217 (FERM P-4318, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°572869/
Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-2869)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium f/avum) AJ11564 (FERM BP-5472, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56140895/
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium f/avum) AJ11439 (FERM BP-5136, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 5635981/
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 04-88994)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium tactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-048890)
Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-048890)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium tactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 58-158192) [0052]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique pour ou dans des bactéries corynéformes comprennent également un procédé d’amélioration de l’expression du gène yggBel un procédé d’introduction d’un gène yggB mutant comportant une mutation dans la région codante (W02006/070944). Cest-à-dire que la bactérie de la présente invention peut avoir été modifiée de sorte que l’expression du gène yggB soit augmentée, ou peut avoir été modifiée de sorte à abriter (posséder) un gène yggB mutant.
[0053]
Le gène yggB est un gène codant pour un canal mécano-sensible. Des exemples du gène yggB comprennent des gènes yggB de bactéries corynéformes. Des exemples spécifiques des gènes yggB de bactéries corynéformes comprennent, par exemple, les gènes yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14967, et Corynebacterium meiassecoia ATCC17965 (W02006/070944). Le gène yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 correspond à la séquence complémentaire à la séquence des numéros de nucléotides 1 336 091 à 1 337 692 dans la séquence génomique enregistrée en tant que numéro d’accès GenBank NC_003450 dans la base de données du NCBI, et est également appelé NCgi1221. La protéine YggB codée par le gène yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 est enregistrée en tant que numéro d’accès GenBank NP_600492. De plus, la séquence de nucléotides du gène yggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) et la séquence d’acides aminés de la protéine YggB codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 9 et 10, respectivement.
[0054]
Dans la présente invention, un gène yggB comportant la « mutation spécifique >> décrite plus loin est également désigné « gène yggB mutant », et une protéine codée par celui-ci est également désignée « protéine YggB mutante >>. En outre, dans la présente invention, un gène yggB ne comportant pas la « mutation spécifique >> décrite plus loin est également désigné « gène yggBüe type sauvage », et une protéine codée par celui-ci est également désignée « protéine YggB de type sauvage >>. En conséquence, comme pour la protéine YggB, une modification de la séquence d’acides aminés provoquée par la « mutation spécifique >> dans le gène yggB également désignée « mutation spécifique >>. Le terme « type sauvage >> auquel on fait référence dans la présente est utilisé à des fins de commodité pour différencier le gène yppÆou la protéine YggB « de type sauvage >> du gène yggB cas la protéine YggB « mutant(e) >>, et le gène yggB cas la protéine YggB « de type sauvage >> n’est pas limité(e) à ceux/celles obtenu(e)s en tant que substances naturelles, tant qu’il/elle ne possède pas la « mutation spécifique >>. Des exemples de la protéine YggB de type sauvage comprennent les protéines YggB exemplifiées cidessus, telles qu’une protéine YggB possédant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 10. Des exemples de la protéine YggB de type sauvage comprennent également des variants conservateurs (variants dans lesquels la fonction d’origine de ceux-ci est maintenue) des protéines YggB exemplifiées ci-dessus, à condition que les variants conservateurs ne possèdent pas la « mutation spécifique >>. La « fonction d’origine >> concernant la protéine YggB peut être, par exemple, une fonction comme un canal mécano-sensible ou une propriété selon laquelle une expression augmentée de celle-ci dans une bactérie corynéforme permet d’obtenir une capacité de production d’acide L-glutamique améliorée de la bactérie corynéforme.
[0055]
La « mutation spécifique >> n’est pas particulièrement limitée, tant qu’elle modifie la séquence d’acides aminés de la protéine YggB telle que celles décrites ci-dessus pour ainsi améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique d’une bactérie corynéforme. Des exemples de la « mutation spécifique >> comprennent une mutation sur le côté C-terminal et une mutation dans une région transmembranaire. La « mutation spécifique >> peut également être une combinaison de celles-ci.
[0056] (1) Mutation sur le côté C-terminal
La mutation sur le côté C-terminal est une mutation introduite dans la région du gène yggB 6e type sauvage codant pour les résidus d’acides aminés des positions 419 à 533 de la protéine YggB de type sauvage. La mutation sur le côté C-terminal peut être introduite au niveau d’un ou plusieurs sites dans la région. Le type de modification de la séquence d’acides aminés induite par la mutation sur le côté C-terminal n’est pas particulièrement limité. La mutation sur le côté C-terminal peut être une mutation qui provoque une substitution d’acide aminé (mutation fauxsens), l’insertion d’un résidu d’acide aminé, la délétion d’un résidu d’acide aminé, l’introduction d’un codon stop (mutation non-sens), une mutation de décalage du cadre de lecture, ou une combinaison de celles-ci. La mutation sur le côté C-terminal est de préférence, par exemple, une mutation pour insérer une séquence de nucléotides comme une séquence d’insertion (désormais également désignée « IS >>) ou un transposon. [0057] (1-1) Insertion d’une séquence de nucléotides
Des exemples de la mutation sur le côté C-terminal comprennent, par exemple, une mutation qui insère une séquence de nucléotides au niveau du site codant pour le résidu valine à la position 419 de la protéine YggB de type sauvage (mutation de type 2A-1). La mutation de type 2A-1 peut être, par exemple, une mutation qui provoque une délétion ou une substitution d’une partie ou de l’intégralité des résidus d’acides aminés des positions 419 à 533 de la protéine YggB de type sauvage. Des exemples spécifiques du gène yggB mutant comportant la mutation de type 2A-1 comprennent, par exemple, le gène yggB incluant l’IS insérée suivant le « G >> à la position 1255 dans SEQ ID NO: 9, et codant ainsi pour une protéine YggB mutante ayant une pleine longueur de 423 résidus d’acides aminés, qui est plus courte que celle de la protéine YggB de type sauvage d’origine (SEQ ID NO: 10). La séquence de nucléotides de ce gène yggB mutant (V419::IS) et la séquence d’acides aminés de la protéine YggB mutante codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 11 et 12, respectivement. Dans la SEQ ID NO: 11, les positions 1 à 1269 correspondent à la CDS pour cette protéine YggB mutante (V419::IS). Des exemples spécifiques de la bactérie productrice d’acide L-glutamique comportant le gène yggB mutant (V419::IS) comprennent, par exemple, la souche C. glutamicum 2256· sucA· IdhA yggB* (WO2014/185430).
[0058] (1-2) Substitution de résidus proline
Des exemples de la mutation sur le côté C-terminal comprennent également, par exemple, une mutation qui remplace un résidu proline présent aux positions 419 à 533 de la protéine YggB de type sauvage par un autre résidu d’acide aminé. Des exemples d’un tel résidu proline comprennent les résidus proline aux positions 424, 437, 453, 457, 462, 469, 484, 489, 497, 515, 529, et 533 de la protéine YggB de type sauvage. II est particulièrement préférable de remplacer le(s) résidu(s) proline de la/des position(s) 424 et/ou 437 par un autre/d’autres résidu(s) d’acide(s) aminé(s). L’« autre acide aminé >> n’est pas particulièrement limité tant que c’est un acide aminé survenant à l’état naturel autre que la proline. Des exemples de l’« autre acide aminé >> comprennent Lys, Glu, Thr, Val, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gin, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, Ala, et His. Par exemple, le résidu proline à la position 424 peut être remplacé, de préférence, par un résidu d’acide aminé hydrophobe (Ala, Gly, Val, Leu, ou Ile), de manière davantage préférée un résidu d’acide aminé à chaîne ramifiée (Leu, Val, ou Ile). En outre, par exemple, le résidu proline à la position 437 peut être remplacé, de préférence, par un résidu d’un acide aminé possédant un groupe hydroxyle dans la chaîne latérale (Thr, Ser, ou Tyr), de manière davantage préférée par un résidu Ser.
[0059] (2) Mutation dans une région transmembranaire
On estime que la protéine YggB possède cinq régions transmembranaires. Les régions transmembranaires correspondent aux résidus d’acides aminés des positions 1 à 23 (première région transmembranaire), des positions 25 à 47 (deuxième région transmembranaire), des positions 62 à 84 (troisième région transmembranaire), des positions 86 à 108 (quatrième région transmembranaire), et des positions 110 à 132 (cinquième région transmembranaire) de la protéine YggB de type sauvage. La mutation dans une région transmembranaire est une mutation dans les régions codant pour ces régions transmembranaires du gène yggB de type sauvage. La mutation dans une région transmembranaire peut être introduite dans un ou plusieurs sites dans les régions. La mutation dans une région transmembranaire est de préférence une mutation qui induit une substitution, une délétion, une addition, une insertion ou une inversion d’un ou plusieurs résidus d’acides aminés, mais ne comprend pas de quelconque mutation de décalage du cadre de lecture ou de mutation non-sens. Le nombre désigné par le terme « un ou plusieurs >> est de préférence 1 à 20, de manière davantage préférée 1 à 10, de manière encore davantage préférée 1 à 5, particulièrement de préférence 1 à 3. Des exemples de la mutation dans une région transmembranaire comprennent une mutation qui insère un ou plusieurs résidus d’acides aminés, tel que Cys-Ser-Leu, entre le résidu leucine à la position 14 et le résidu tryptophane à la position 15 ; une mutation qui remplace le résidu alanine à la position 100 par un autre résidu d’acide aminé, comme un résidu d’un acide aminé possédant un groupe hydroxyle dans la chaîne latérale (c’est-à-dire, Thr, Ser, ou Tyr), de préférence un résidu Thr ; une mutation qui remplace le résidu alanine à la position 111 par un autre résidu d’acide aminé comme un résidu d’un acide aminé possédant un groupe hydroxyle dans la chaîne latérale (c’est-à-dire, Thr, Ser, ou Tyr), de préférence un résidu Thr ; dans la protéine YggB de type sauvage. [0060]
Dans la présente invention, un « résidu d’acide aminé à la position X de la protéine YggB de type sauvage >> désigne le résidu d’acide aminé correspondant à celui de la position Xdans SEQ ID NO: 10, sauf indication contraire. La « position X >> dans une séquence d’acides aminés est la Xe position en comptant à partir de l’extrémité N-terminale de la séquence d’acides aminés, et le résidu d’acide aminé de l’extrémité N-terminale est le résidu d’acide aminé de la position 1. Cest-à-dire que les positions susmentionnées des résidus d’acides aminés indiquent des positions relatives, et que les positions absolues de ceux-ci peuvent être décalées en raison d’une délétion, insertion, addition, ou analogue, d’un résidu ou de résidus d’acide(s) aminé(s). Par exemple, le « résidu d’acide aminé à la position 419 de la protéine YggB de type sauvage >> désigne le résidu d’acide aminé correspondant à celui de la position 419 dans SEQ ID NO: 10 et, lorsqu’un seul résidu d’acide aminé est supprimé à une position sur le côté N-terminal de la position 419, le 418e résidu d’acide aminé de l’extrémité N-terminale est le « résidu d’acide aminé à la position 419 de la protéine YggB de type sauvage >>. En outre, lorsqu’un seul résidu d’acide aminé est inséré à une position sur le côté N-terminal de la position 419, le 420e résidu d’acide aminé de l’extrémité N-terminale est « le résidu d’acide aminé à la position 419 de la protéine YggB de type sauvage >>.
Spécifiquement, par exemple, les résidus d’acides aminés des positions 419 à 529 de la protéine YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC14967 correspondent aux résidus d’acides aminés des positions 419 à 533 de la protéine YggB de type sauvage.
[0061]
Le résidu d’acide aminé qui est « le résidu d’acide aminé correspondant à celui de la position X dans SEQ ID NO: 10 >> dans la séquence d’acides aminés d’une protéine YggB arbitraire peut être déterminé par un alignement entre la séquence d’acides aminés de la protéine YggB arbitraire et la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 10. L’alignement peut être réalisé, par exemple, en utilisant un logiciel d’analyse de gène connu. Des exemples spécifiques d’un tel logiciel comprennent DNASIS produit par Hitachi Solutions, GENETYX produit par Genetyx, et ainsi de suite (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomédical Research, 24 (1) 72-96, 1991 ; Barton GJ et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987).
[0062]
Un gène yggB mutant peut être obtenu en modifiant un gène yggB de type sauvage de sorte qu’il comporte la « mutation spécifique >> susmentionnée. La modification de l’ADN peut être réalisée par un procédé connu. Par exemple, une mutation cible peut être introduite dans un site cible d’un ADN par le procédé de mutagenèse dirigée. Des exemples spécifiques du procédé de mutagenèse dirigée comprennent, par exemple, un procédé utilisant une PCR (Higuchi, R., 61, dans PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press, 1989 ; Carter P., Meth. dans Enzymol., 154, 382, 1987), et un procédé utilisant un phage (Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. dans Enzymol., 154, 350, 1987 ; Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987). En outre, un gène yggB mutant peut également être obtenu par synthèse chimique.
[0063]
Une telle modification d’une bactérie de sorte que la bactérie comporte un gène yggB mutant peut être obtenue en introduisant le gène yggB mutant dans la bactérie. Une telle modification d’une bactérie de sorte que la bactérie comporte un gène yggB mutant peut également être obtenue en introduisant une mutation dans le gène yggB de la bactérie par une mutation naturelle ou un traitement avec un mutagène.
[0064]
Les procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-glutamique peuvent également être efficaces pour conférer ou améliorer une capacité à produire des acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide L-glutamique en tant qu’intermédiaire, tels que la L-glutamine, la L-proline, la L-arginine, la L-citrulline, et la Lornithine. Par conséquent, une bactérie possédant une capacité à produire l’un quelconque de ces acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide L-glutamique peut posséder, tel que requis, une telle propriété possédée par une bactérie productrice d’acide L-glutamique telle que mentionnée cidessus. Par exemple, une bactérie possédant une capacité à produire l’un quelconque de ces acides L-aminés qui sont biosynthétisés via l’acide Lglutamique peut avoir été modifiée de sorte que l’activité de I’·cétoglutarate déshydrogénase et/ou la succinate déshydrogénase soit réduite.
[0065] < Bactéries productrices de L-glutamine>
Des exemples du procédé pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-glutamine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que l’activité ou les activités d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-glutamine soit/soient améliorée(s). Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la glutamate déshydrogénase (gdhA) et la glutamine synthétase (g/nAy L’activité glutamine synthétase peut également être améliorée par la perturbation du gène de la glutamine adénylyltransférase (g/nE) ou la perturbation du gène de la protéine de contrôle PII (g/nB) (EP1229121). [0066]
Des exemples du procédé pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-glutamine comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que l’activité ou les activités d’un ou de plusieurs types d’enzymes qui catalysent une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse de la L-glutamine pour générer un composé autre que la L-glutamine soit/soient réduite(s). Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la glutaminase.
[0067]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-glutamine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des bactéries corynéformes dans lesquelles l’activité ou les activités de la glutamate déshydrogénase (gdhA) et/ou la glutamine synthétase (g/nA) (EP1229121, EP1424398) sont améliorées, et des bactéries corynéformes dans lesquelles l’activité glutaminase (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2004-187684) est réduite. Des exemples de bactéries productrices de L-glutamine et de souches parentales pour les dériver comprennent une souche appartenant au genre Escherichia et comportant une glutamine synthétase mutante dans laquelle le résidu tyrosine de la position 397 de la glutamine synthétase a été remplacé par un autre résidu d’acide aminé (US2003/0148474A).
[0068]
Des exemples des procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-glutamine pour ou dans des bactéries corynéformes comprennent également le procédé pour conférer une résistance à la 6-diazo-5-oxo-norleucine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 3-232497), le procédé pour conférer une résistance à un analogue de la purine et une résistance au sulfoxyde de méthionine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 61-202694), et le procédé pour conférer une résistance à l’acide •-cétomalonique (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-151495). Des exemples spécifiques de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-glutamine comprennent, par exemple, les souches suivantes.
Corynebacterium gtutamicum {Brevibacterium ftavum) AJ11573 (FERM P-5492, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°56151495)
Corynebacterium gtutamicum {Brevibacterium ftavum) AJ11576 (FERM BP-10381, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-151495)
Corynebacterium gtutamicum {Brevibacterium ftavum) AJ12212 (FERM P-8123, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°61202694) [0069] < Bactéries productrices de L-proline>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-proline comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-proline. Des exemples de telles enzymes comprennent la glutamate-5-kinase {proBy la •-glutamylphosphate réductase, et la pyroline-5-carboxylate réductase {putA). Afin d’améliorer l’activité d’une telle enzyme, par exemple, le gène proB codant pour une glutamate kinase désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-proline (brevet allemand n° 3127361) peut être de préférence utilisé.
[0070]
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-proline comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité réduite d’une enzyme impliquée dans la décomposition de la L-proline. Des exemples d’une telle enzyme comprennent la proline déshydrogénase et l’ornithine aminotransférase.
[0071]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-proline et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, E. coli NRRL B-12403 et NRRL B-12404 (brevet britannique n° 2075056), E. coli VKPM B-8012 (demande de brevet russe n° 2000124295), les souches mutantes plasmidiques d’E coli décrites dans le brevet allemand n° 3127361, les souches mutantes plasmidiques d’E coli décrites par Bloom F. R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34), la souche E cotn§2 (VKPM B-8011), qui est une souche résistante à la 3,4déhydroxyproline et à l’azétidine-2-carboxylate, et la souche E coli702ilvA (VKPM B-8012), qui est une souche déficiente en gène UvA de la souche 702 (EP1172433).
[0072] < Bactéries productrices de L-thréonine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-thréonine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-thréonine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, l’aspartokinase III (iysQ, l’aspartate semialdéhyde déshydrogénase (asd), l’aspartokinase I (thrA), l’homosérine kinase (thrB), la thréonine synthase (thrQ, et l’aspartate aminotransférase (aspartate transaminase) (aspQ. Parmi ces enzymes, il est préférable d’améliorer l’activité ou les activités d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi l’aspartokinase III, l’aspartate semialdéhyde déshydrogénase, l’aspartokinase I, l’homosérine kinase, l’aspartate aminotransférase, et la thréonine synthase. L’un quelconque des gènes codant pour les enzymes de biosynthèse de la L-thréonine peut être introduit dans une bactérie possédant une capacité réduite à décomposer la thréonine. Des exemples d’une telle souche dans laquelle la décomposition de la thréonine est supprimée comprennent, par exemple, la souche E coli TDH6, qui est déficiente en activité thréonine déshydrogénase (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2001-346578).
[0073]
Les activités des enzymes de biosynthèse de la L-thréonine sont inhibées par le produit final, la L-thréonine. Par conséquent, afin de construire des souches productrices de L-thréonine, il est préférable que les gènes des enzymes de biosynthèse de la L-thréonine soient modifiés de sorte que les enzymes soient désensibilisées à la rétro-inhibition par la L-thréonine. Les gènes thrA, thrB, et thrC susmentionnés constituent l’opéron de la thréonine, qui forme une structure d’atténuation. L’expression de l’opéron de la thréonine est inhibée par l’isoleucine et la thréonine dans le bouillon de culture et est également supprimée par atténuation. Par conséquent, l’expression de l’opéron de la thréonine peut être améliorée en éliminant la séquence leader ou l’atténuateur dans la région d’atténuation (Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, et Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987) ; WO02/26993 ; W02005/049808 ; et W02003/097839).
[0074]
Le promoteur natif de l’opéron de la thréonine est présent en amont de l’opéron de la thréonine, et peut être remplacé par un promoteur non natif (WO98/04715). Également, l’opéron de la thréonine peut être construit de sorte que les gènes de biosynthèse de la thréonine soient exprimés sous le contrôle du répresseur et du promoteur du phage • (EP0593792B). En outre, une bactérie modifiée de sorte qu’elle soit désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-thréonine peut également être obtenue en sélectionnant une souche résistante à l’acide •-amino-·hydroxyisovalérique (AHV), qui est un analogue de la L-thréonine.
[0075]
Il est préférable que la quantité d’expression de l’opéron de la thréonine qui est modifié de sorte à être désensibilisé à la rétro-inhibition par la L-thréonine tel que décrit ci-dessus soit augmentée chez un hôte en augmentant le nombre de copies de celui-ci ou en le ligaturant à un puissant promoteur. Le nombre de copies peut être augmenté en introduisant un plasmide contenant l’opéron de la thréonine dans un hôte. Le nombre de copies peut également être augmenté en transférant l’opéron de la thréonine dans le génome d’un hôte en utilisant un transposon, le phage Mu, ou analogue.
[0076]
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-thréonine comprennent également, par exemple, un procédé pour conférer une résistance à la L-thréonine chez un hôte, et un procédé pour conférer une résistance à la L-homosérine chez un hôte. Une telle résistance peut être conférée, par exemple, en améliorant l’expression d’un gène qui confère une résistance à la L-thréonine ou d’un gène qui confère une résistance à la L-homosérine. Des exemples des gènes qui confèrent la résistance susmentionée comprennent le gène rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), le gène r/7/Z?(EP0994190A), le gène γ/7/£(ΕΡ1013765Α), le gène yfiK, et le gène ye«3S'(EP1016710A). En ce qui concerne les procédés pour conférer une résistance à la L-thréonine chez un hôte, il est possible de se référer à ceux décrits dans EP0994190A et W090/04636.
[0077]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-thréonine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, E.
coti TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996, brevets U.S. n° 5 175 107 et 5 705 371), E coti 472T23/pYN7 (ATCC 98081, brevet U.S. n°
631 157), E. coli NRRL-21593 (brevet U.S. n° 5 939 307), E coiiVEPM BP-3756 (brevet U.S. n° 5 474 918), E coli FERM BP-3519 et FERM BP3520 (brevet U.S. n° 5 376 538), E coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (en russe), 14, 947-956 (1978)), E coli VL643 et VL2055 (EP1149911 A), et E. cotiWEM B-5318 (EP0593792B).
[0078]
La souche VKPM B-3996 est une souche obtenue en introduisant le plasmide pVIC40 dans la souche TDH-6. La souche TDH-6 possède une capacité d’assimilation du saccharose et est déficiente en gène thrC, et le gène iivA de celle-ci comporte une mutation fuyante. La souche TDH-6 comporte également une mutation dans le gène rhtA, qui confère une résistance à une forte concentration de thréonine ou homosérine. Le plasmide pVIC40 est un plasmide obtenu en insérant l’opéron thrA*BC contenant un gène thrA mutant codant pour une aspartokinasehomosérine déshydrogénase I résistante à la rétro-inhibition par la thréonine et les gènes thrBCde type sauvage dans un vecteur dérivé de RSF1010 (brevet U.S. n° 5 705 371). Ce gène thrA mutant code pour une aspartokinase-homosérine déshydrogénase I qui est essentiellement désensibilisée à la rétro-inhibition par la thréonine. La souche B-3996 a été déposée le 19 novembre 1987 auprès du Ail-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscou, Russie) sous le numéro d’accès RI A 1867. Cette souche a également été déposée auprès de la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUPGosNIl Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Russie) le 7 avril 1987 sous le numéro d’accès VKPM B-3996.
[0079]
La souche VKPM B-5318 est prototrophe par rapport à l’isoleucine, et abrite le plasmide pPRT614, qui correspond au plasmide pVIC40 dont la région régulatrice de l’opéron de la thréonine est remplacée par le répresseur C1 et le promoteur PR du phage · sensibles à la température. La souche VKPM B-5318 a été déposée auprès de la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUPGosNIl Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Russie) le 3 mai 1990 sous le numéro d’accès VKPM B-5318.
[0080]
Le gène thrA qui code pour l’aspartokinase-homosérine déshydrogénase I d’E coli a été élucidé (numéros de nucléotides 337 à 2799, accès GenBank NC_000913.2, gi : 49175990). Le gène thrA est localisé entre les gènes thrL et thrBsux le chromosome d’E coti K-12. Le gène thrB qui code pour l’homosérine kinase d’Escherichia coti a été élucidé (numéros de nucléotides 2801 à 3733, accès GenBank
NC_000913.2, gi : 49175990). Le gène thrB est localisé entre les gènes thrAeï thrCsux le chromosome d’E co//K-12. Le gène thrCopù code pour la thréonine synthase d’E co//a été élucidé (numéros de nucléotides 3734 à 5020, accès GenBank NC_000913.2, gi : 49175990). Le gène thrC est localisé entre le gène thrB et le cadre de lecture ouvert de yaaX sur le chromosome d’E coli K-12. L’opéron thrA*BC contenant un gène thrA mutant qui code pour une aspartokinase-homosérine déshydrogénase I résistante à la rétro-inhibition par la thréonine et les gènes thrBCde type sauvage peuvent être obtenus à partir du plasmide bien connu pVIC40, qui est présent dans la souche d’E coli productrice de thréonine VKPM B3996 (brevet U.S. n° 5 705 371).
[0081]
Le gène rhtA d’E coli est localisé à 18 min sur le chromosome d’E coli à proximité de l’opéron gtnHPQ, qui code pour des composants du système de transport de la glutamine. Le gène rhtA est identique à IORF1 (gène ybiF, numéros de nucléotides 764 à 1651, numéro d’accès GenBank AAA218541, gi : 440181) et est localisé entre les gènes pexB et ompX. L’unité exprimant une protéine codée par IORF1 a été désignée gène rhtA (rht : résistance à l’homosérine et à la thréonine). Il a également été révélé que la mutation rhtA23 qui confère une résistance à une forte concentration de thréonine ou d’homosérine est une substitution de A à G à la position -1 par rapport au codon d’initiation ATG (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology conjointement au Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Californie 24-29 août 1997, abrégé n°457 ; EP1013765A).
[0082]
Le gène asd d’E coti a déjà été élucidé (numéros de nucléotides 3572511 à 3571408, accès GenBank NC 000913.1, gi : 16131307), et peut être obtenu par PCR (White, T.J., et al., Trends Genet, 5:185-189, 1989) en utilisant des amorces préparées en se basant sur la séquence de nucléotides du gène. Les gènes asd d’autres micro-organismes peuvent également être obtenus de manière similaire.
[0083]
Le gène aspCdE. coti a également déjà été élucidé (numéros de nucléotides 983742 à 984932, accès GenBank NC_000913.1, gi : 16128895), et peut être obtenu par PCR en utilisant des amorces préparées en se basant sur la séquence de nucléotides du gène. Les gènes aspC d’autres micro-organismes peuvent également être obtenus de manière similaire.
[0084]
En outre, des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-thréonine comprennent, par exemple,
Corynebacterium acetoacidophi/um AJ12318 (FERM BP-1172, brevet U.S. n°5 188 949).
[0085] < Bactéries productrices de L-lysine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-lysine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-lysine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la dihydrodipicolinate synthase (dapA), l’aspartokinase III (tysQ, la dihydrodipicolinate réductase (dapB), la diaminopimélate décarboxylase ÇysAy la diaminopimélate déshydrogénase {ddh) (brevet U.S. n° 6 040 160), la phosphoénolpyruvate carboxylase {ppdp l’aspartate semialdéhyde déshydrogénase (asd), l’aspartate aminotransférase (aspartate transaminase) (aspQ, la diaminopimélate épimérase (dapF), la tétrahydrodipicolinate succinylase (dapD), la succinyl diaminopimélate désacylase (dapE), et l’aspartase (aspA) (EP1253195A). Il est préférable d’améliorer l’activité ou les activités d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi, par exemple, la dihydrodipicolinate réductase, la diaminopimélate décarboxylase, la diaminopimélate déshydrogénase, la phosphoénolpyruvate carboxylase, l’aspartate aminotransférase, la diaminopimélate épimérase, l’aspartate semialdéhyde déshydrogénase, la tétrahydrodipicolinate succinylase, et la succinyl diaminopimélate désacylase, parmi ces enzymes. En outre, des bactéries productrices de Llysine et des souches parentales pour les dériver peuvent exprimer un taux augmenté du gène impliqué dans l’efficacité énergétique (cyo) (EP1170376A), du gène codant pour la nicotinamide nucléotide transhydrogénase (pntAB) (brevet U.S. n° 5 830 716), du gène ybjE (W02005/073390), ou de combinaisons de ceux-ci. Étant donné que l’aspartokinase III ÇysQ est sensible à la rétro-inhibition par la L-lysine, un gène //sCmutant codant pour une aspartokinase III désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-lysine (brevet U.S. n° 5 932 453) peut être utilisé pour améliorer l’activité de cette enzyme. Des exemples de l’aspartokinase III désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-lysine comprennent l’aspartokinase III dérivée d’Escherichia edi et comportant une ou plusieurs mutations sélectionnées parmi une mutation pour remplacer le résidu méthionine à la position 318 par un résidu isoleucine ; une mutation pour remplacer le résidu glycine à la position 323 par un résidu acide aspartique ; et une mutation pour remplacer le résidu thréonine à la position 352 par un résidu isoleucine (brevets U.S. n° 5 661 012 et 6 040 160). En outre, étant donné que la dihydrodipicolinate synthase (dapA) est sensible à la rétro-inhibition par la L-lysine, un gène dapA mutant codant pour dihydrodipicolinate synthase désensibilisée à la rétroinhibition par la L-lysine peut être utilisé pour améliorer l’activité de cette enzyme. Des exemples de la dihydrodipicolinate synthase désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-lysine comprennent la dihydrodipicolinate synthase dérivée d’Escherichia coii et comportant une mutation pour remplacer le résidu histidine à la position 118 par un résidu tyrosine (brevet U.S. n° 6 040 160).
[0086]
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-lysine comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités réduite(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes qui catalysent une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse de la L-lysine pour générer un composé autre que la L-lysine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, l’homosérine déshydrogénase, la lysine décarboxylase (brevet U.S. n° 5 827 698), et l’enzyme malique (W02005/010175).
[0087]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-lysine pour ou dans des bactéries corynéformes comprennent également un procédé de modification des bactéries de sorte que l’activité d’un système d’excrétion de la lysine ÇysE) soit augmentée (WO97/23597). Le gène iysE de Corynebacterium giutamicum ATCC 13032 correspond à la séquence complémentaire à la séquence des numéros de nucléotides 1 329 712 à 1 330 413 dans la séquence génomique enregistrée en tant que n° d’accès GenBank NC 006958 (VERSION NC 006958.1 Gl : 62388892) dans la base de données du NCBI. La protéine LysEde Corynebacterium giutamicum ATCC 13032 est enregistrée en tant que n° d’accès GenBank YP_225551 (YP_225551.1 Gl : 62390149).
[0088]
Des exemples de bactéries productrices de L-lysine et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches mutantes présentant une résistance à un analogue de L-lysine. Les analogues de Llysine inhibent la croissance de bactéries telles que les bactéries de la famille Enterobacteriaceae et les bactéries corynéformes, mais cette inhibition est complètement ou partiellement libérée lorsque de la L-lysine est présente dans le milieu. Des exemples de ces analogues de L-lysine comprennent, sans particulièrement s’y limiter, l’oxalysine, la lysine hydroxamate, la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine (AEC), la •-méthyllysine, et I’· -chlorocaprolactame. Des souches mutantes présentant une résistance à ces analogues de la lysine peuvent être obtenues en soumettant une bactérie à un traitement de mutagenèse artificielle conventionnel.
[0089]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-lysine et de souches parentales pour les dériver comprennent E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, brevet U.S n° 4 346 170) et E coliVUo\ 1. Dans ces souches, l’aspartokinase est désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-lysine.
[0090]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-lysine et de souches parentales pour les dériver comprennent également la souche E. coli WC196. La souche WC196 a été obtenue en conférant une résistance à l’AEC à la souche W3110, qui a été dérivée d’E coli K-12 (brevet U.S. n° 5 827 698). La souche WC196 a été désignée E coli AJ13069 et a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 6 décembre 1994, et a reçu le numéro d’accès FERM P-14690. Ensuite, le dépôt a été converti en dépôt international conformément aux dispositions du Traité de Budapest le 29 septembre 1995, et a reçu le numéro d’accès FERM BP-5252 (brevet U.S. n° 5 827 698).
[0091]
Des exemples préférés de bactéries productrices de L-lysine comprennent E. οοϋ\ΝΟΛ§§· cadA· Idc et E. co//WC196· cadA· ldc/pCABD2 (WO2010/061890). E. coli WC196· cadA· Idc est une souche construite à partir de la souche WC196 par une perturbation des gènes cadA et idcC codant pour la lysine décarboxylase. La souche WC196· cadA· ldc/pCABD2 a été construite en introduisant le plasmide pCABD2 contenant les gènes de l’enzyme de biosynthèse de la lysine (brevet U.S. n° 6 040 160) dans la souche WC196· cadA· Idc. La souche WC196· cadA· Idc, désignée AJ110692, a été déposée auprès de l’agence administrative indépendante, le National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (actuellement, agence administrative indépendante, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 7 octobre 2008 en tant que dépôt international, et a reçu le numéro d’accès FERM BP-11027. Le plasmide pCABD2 contient un gène dapA mutant dérivé d’Escherichia coli et codant pour une dihydrodipicolonate synthase (DDPS) comportant une mutation pour une désensibilisation à la rétro-inhibition par la L-lysine (H118Y), un gène iysC mutant dérivé d’Escherichia coli et codant pour l’aspartokinase III comportant une mutation pour une désensibilisation à la rétro-inhibition par la L-lysine (T352I), le gène dapB dérivé d’Escherichia coii et codant pour la dihydrodipicolonate réductase, et le gène ddh dérivé de Brevibacterium iactofermentum et codant pour la diaminopimélate déshydrogénase.
[0092]
Des exemples préférés de bactéries productrices de L-lysine comprennent également E. coii AJIK01 (NITE BP-01520). La souche AJIK01 a été désignée E coii AJ111046, et a été déposée auprès de l’agence administrative indépendante, le National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (n°122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) le 29 janvier 2013. Ensuite, elle a été convertie en dépôt international conformément aux dispositions du Traité de Budapest le 15 mai 2014, et a reçu le numéro d’accès NITE BP-01520.
[0093]
Des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-lysine comprennent, par exemple, les souches mutantes résistantes à l’AEC (la souche Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium iactofermentum AJ11082) (NRRL B-11470), etc., publications de brevet japonais (Kokoku) n° 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437, et 7-112438) ; des souches mutantes nécessitant un acide aminé tel que la L-homosérine pour leur croissance (publications de brevet japonais n° 48-28078 et 56-6499); des souches mutantes montrant une résistance à l’AEC et nécessitant en outre un acide aminé tel que la L-leucine, la L-homosérine, la L-proline, la L-sérine, la L-arginine, la L-alanine, et la L-valine (brevets U.S. n° 3 708 395 et 3 825 472) ; des souches mutantes montrant une résistance au DL-· -amino-·caprolactame, à r«-amino-lauryllactame, à un analogue de l’acide aspartique, un médicament sulfa, un quinoïde, et la N-lauroylleucine ; des souches mutantes montrant une résistance à un inhibiteur de l’oxaloacétate décarboxylase ou un inhibiteur d’une enzyme de la chaîne respiratoire (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°5053588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 5632995, 56-39778, publications de brevet japonais n° 53-43591 et 531833) ; des souches mutantes nécessitant de l’inositol ou de l’acide acétique (brevets japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 55-9784 et 56-8692) ; des souches mutantes qui sont sensibles à l’acide fluoropyruvique ou à une température de 34 °C ou plus (brevets japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 55-9783 et 53-86090) ; et des souches mutantes montrant une résistance à l’éthylène glycol (brevet U.S. n°4 411 997).
[0094] < Bactéries productrices de L-arginine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-arginine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-arginine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la N-acétylglutamate synthase (argA), la N-acétylglutamate kinase, (argB), la N-acétylglutamyl phosphate réductase (argQ, l’acétylornithine transaminase (argD), l’acétylornithine désacétylase (argE), l’ornithine carbamoyltransférase (argF, argt}, l’argininosuccinate synthétase (argG), l’argininosuccinate lyase (argH), l’ornithine acétyltransférase (argJ), et la carbamoyl-phosphate synthétase (carAB). En tant que gène de la Nacétylglutamate synthase, par exemple, un gène codant pour une Nacétylglutamate synthase mutante désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-arginine par une substitution des résidus d’acides aminés correspondant aux positions 15 à 19 de l’enzyme de type sauvage (EP1170361 A) peut être de préférence utilisé.
[0095]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-arginine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, la souche E coti 237 (VKPM B-7925, US2002/058315A1), des souches dérivées de celle-ci dans lesquelles le gène argA codant pour une N-acétyl glutamate synthase mutante a été introduit (demande de brevet russe n° 2001112869, EP1170361A1), la souche E. co/f 3Q2 dérivée de la souche 237 et possédant une capacité d’assimilation d’acide acétique améliorée (VKPM B-7926, EP1170358A1), et la souche E coti 382ilvA+, qui est une souche obtenue à partir de la souche 382 en introduisant le gène itvA de type sauvage de la souche E coti K-12 dans celle-ci. La souche E. coti237 a été déposée auprès de la Ftussian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUP GosNIl Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Russie) le 10 avril 2000 sous le numéro d’accès VKPM B7925, et le dépôt a été converti en dépôt international conformément aux dispositions du Traité de Budapest le 18 mai 2001. La souche E. coti 332 a été déposée auprès de la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUP GosNIl Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Russie) le 10 avril 2000 sous le numéro d’accès VKPM B7926.
[0096]
Des exemples de bactéries productrices de L-arginine et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches présentant une résistance à des analogues d’acides aminés, et ainsi de suite. Des exemples de telles souches comprennent des souches mutantes d’E coli présentant une résistance à Γ·-méthylméthionine, la pfluorophénylalanine, la D-arginine, l’arginine hydroxamate, la S-(2aminoéthyl)-cystéine, I’·-méthylsérine, la •-2-thiénylalanine, ou la sulfaguanidine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56106598).
[0097]
Des exemples de bactéries productrices de L-arginine et de souches parentales pour les dériver comprennent également de telles bactéries corynéformes en tant que souche déficiente en ArgR, qui est un répresseur de l’arginine (US2002-0045223A), et une souche dans laquelle l’activité glutamine synthétase est augmentée (US2005-0014236A).
[0098]
Des exemples de bactéries productrices de L-arginine et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches mutantes de bactéries corynéformes, les souches mutantes présentant une résistance à un analogue d’acide aminé ou similaire. Des exemples de telles souches comprennent, par exemple, des souches présentant une résistance à la 2-thiazoléalanine et exhibant en outre une auxotrophie pour la L-histidine, la L-proline, la L-thréonine, la L-isoleucine, la Lméthionine, ou le L-tryptophane (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 54-44096); des souches résistantes à l’acide cétomalonique, l’acide fluoromalonique, ou l’acide monofluoroacétique (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-18989) ; des souches résistantes à l’argininol (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 62-24075) ; des souches résistantes à la X-guanidine (X représente une chaîne aliphatique ou un dérivé de celle-ci, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2-186995); et des souches résistantes à l’arginine hydroxamate et à la 6-azauracile (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-150381). Des exemples spécifiques de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-arginine comprennent les souches suivantes.
Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium f/avum) AJ11169 (FERM BP-6892)
Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium lactofermentum) AJ12092 (FERM BP-6906)
Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium f/avum) AJ11336 (FERM BP-6893)
Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium f/avum) AJ11345 (FERM BP-6894)
Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium lactofermentum) AJ12430 (FERM BP-2228) [0099] < Bactéries productrices de L-citrulline et bactéries productrices de Lornithine>
La L-citrulline et la L-ornithine sont des intermédiaires de la voie de biosynthèse de la L-arginine. Par conséquent, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-citrulline et/ou L-ornithine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-arginine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la Nacétylglutamate synthase (argA), la N-acétylglutamate kinase, (argB), la N-acétylglutamyl phosphate réductase (argQ, l’acétylornithine transaminase (argD), l’acétylornithine désacétylase (argE), l’ornithine carbamoyltransférase (argF, argl), l’ornithine acétyltransférase {argJ), et la carbamoyl-phosphate synthétase {carAB), pour la L-citrulline. En outre, des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la N-acétylglutamate synthase \argA), la N-acétylglutamate kinase, (argB), la N-acétylglutamyl phosphate réductase {argQ, l’acétylornithine transaminase (argD), l’acétylornithine désacétylase (argE), et l’ornithine acétyltransférase {argJ), pour la L-ornithine.
[0100]
Une bactérie productrice de L-citrulline peut être facilement obtenue, par exemple, à partir d’une bactérie productrice de L-arginine telle que la souche E coti 382 (VKPM B-7926) en réduisant l’activité de l’argininosuccinate synthétase codée par le gène argG. De plus, une bactérie productrice de L-ornithine peut être facilement obtenue, par exemple, à partir d’une bactérie productrice de L-arginine telle que la souche E. coti 382 (VKPM B-7926) en réduisant l’activité de l’ornithine carbamoyltransférase codée par les gènes argFel argl.
[0101]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-citrulline et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des souches appartenant au genre Escherichia, telles que les souches d’E co/i 237/pMADS11, 237/pMADS12, et 237/pMADS13, qui possèdent une Nacétylglutamate synthase mutante (brevet russe n° 2 215 783, brevet U.S. n° 6 790 647, et EP1170361B1), les souches d’E co/i333 (VKPM B-8084) et 374 (VKPM B-8086), qui possèdent une carbamoyl-phosphate synthétase résistante à la rétro-inhibition (brevet russe n° 2 264 459), des souches d’E co/i possédant une activité augmentée de I’·-cétoglutarate synthase et possédant une activité modifiée de la ferrédoxine NADP* réductase, la pyruvate synthase, et/ou I’·-cétoglutarate déshydrogénase (EP2133417A) ; et la souche P. ananatis NAIsucAsdhA, qui possède une activité réduite de la succinate déshydrogénase et Γ· -cétoglutarate déshydrogénase (US2009-286290A1).
[0102] < Bactéries productrices de L-histidine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-histidine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-histidine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, l’ATP phosphoribosyltransférase {hisQ), la phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase (hisi), la phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase (hisi), la phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomérase (hisA), l’amidotransférase {hisHy l’histidinol phosphate aminotransférase {hisQ, l’histidinol phosphatase {hisBy et l’histidinol déshydrogénase (hisD).
[0103]
Parmi ces enzymes, les enzymes de biosynthèse de la L-histidine codées par hisG et hisBHAFI sont connues pour être inhibées par la Lhistidine. Par conséquent, la capacité de production de L-histidine peut être conférée ou améliorée, par exemple, en introduisant une mutation conférant une résistance à la rétro-inhibition dans le gène codant pour l’ATP phosphoribosyltransférase {hisG) (brevets russes n° 2 003 677 et 2 119 536).
[0104]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-histidine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des souches appartenant au genre Escherichia, telles que la souche E. coii 24 (VKPM B-5945, RU2003677), E. co/ZNRRL B-12116 à B-12121 (brevet U.S. n° 4 388 405), E co/ZH-9342 (FERM BP-6675) et H-9343 (FERM BP-6676, brevet U.S. n° 6 344 347), E. co/ZH-9341 (FERM BP-6674, EP1085087), E coli AI80/pFM201 (brevet U.S. n° 6 258 554), E coli FERM P-5038 et FERM P-5048, dans lesquelles un vecteur portant un ADN codant pour une enzyme de biosynthèse de la L-histidine a été introduit (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 56-005099), des souches d’E coii dans lesquelles un gène de transport d’acides aminés a été introduit (EP1016710A), et la souche E. coii 80, pour laquelle une résistance à la sulfaguanidine, la DL-1,2,4-triazole-3-alanine, et la streptomycine (VKPM B-7270, brevet russe n° 2119536) a été conférée.
[0105] < Bactéries productrices de L-cystéine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-cystéine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-cystéine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la sérine acétyltransférase (cysE) et la 3-phosphoglycérate déshydrogénase (serA). L’activité sérine acétyltransférase peut être améliorée, par exemple, en introduisant un gène g/sFmutant codant pour une sérine acétyltransférase mutante résistante à la rétro-inhibition par la cystéine dans une bactérie. Une telle sérine acétyltransférase mutante est décrite, par exemple, dans le brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 11-155571 et US2005-0112731A. En outre, l’activité 3phosphoglycérate déshydrogénase peut être améliorée, par exemple, en introduisant un gène serA mutant codant pour une 3-phosphoglycérate déshydrogénase mutante résistante à la rétro-inhibition par la sérine dans une bactérie. Une telle 3-phosphoglycérate déshydrogénase mutante est décrite, par exemple, dans le brevet U.S. n° 6 180 373.
[0106]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-cystéine comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités réduite(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes qui catalysent une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse de la L-cystéine pour générer un composé autre que la L-cystéine. Des exemples de telles enzymes comprennent, par exemple, des enzymes impliquées dans la décomposition de la L-cystéine. Des exemples des enzymes impliquées dans la décomposition de la L-cystéine comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la cystathionine-·-lyase (metC, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 11-155571 ; Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069), la tryptophanase (tnaA, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2003-169668 ; Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965) 1211-1218), l’O-acétylsérine sulfhydrylase B (cysM, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2005-245311), le produit du gène maiY (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2005-245311), le produit du gène d0191 de Pantoea ananatis (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2009-232844), et la cystéine désulfhydrase (aecD, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2002-233384.
[0107]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-cystéine comprennent également, par exemple, un procédé d’amélioration du système d’excrétion de L-cystéine, et un procédé d’amélioration du système de transport du suifate/thiosulfate. Des exemples de protéines du système d’excrétion de L-cystéine comprennent la protéine codée par le gène ydeD (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2002-233384), la protéine codée par le gène yfiK (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2004-49237), les protéines codées par les gènes emrAB, emrKY, yojlH, acrEF, ber, et cusA (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2005-287333), et la protéine codée par le gène yeaS (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2010-187552). Des exemples des protéines du système de transport du sulfate/thiosulfate comprennent les protéines codées par le cluster de gènes cysPTWAM.
[0108]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-cystéine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, E. coli JM15 transformée avec différents allèles cysEcodant pour des sérine acétyltransférases résistantes à la rétro-inhibition (brevet U.S. n° 6 218 168, demande de brevet russe 2003121601), E co/i W3110 comportant un gène surexprimé codant pour une protéine appropriée pour la sécrétion d’une substance cytotoxique (brevet U.S. n° 5 972 663), des souches d’E coli possédant une activité cystéine désulfohydrase réduite (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 11-155571), et E coli W3110 possédant une activité augmentée d’un régulateur positif de la transcription pour le régulon de la cystéine codé par le gène cysE(W001/27307A1).
[0109]
En outre, des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-cystéine comprennent des bactéries corynéformes comportant une sérine acétyltransférase désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-cystéine, pour ainsi montrer une activité sérine acétyltransférase intracellulaire améliorée (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2002-233384).
[0110] < Bactéries productrices de L-sérine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-sérine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-sérine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la 3-phosphoglycérate déshydrogénase (serA), la phosphosérine transaminase (serQ, et la phosphosérine phosphatase (serB) (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 11-253187). L’activité 3phosphoglycérate déshydrogénase peut être augmentée, par exemple, en introduisant un gène serA mutant codant pour une 3-phosphoglycérate déshydrogénase mutante résistante à la rétro-inhibition par la L-sérine dans une bactérie. La 3-phosphoglycérate déshydrogénase mutante est décrite, par exemple, dans le brevet U.S. n° 6 180 373.
[0111]
Des exemples de bactéries productrices de L-sérine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des bactéries corynéformes résistantes à l’azasérine ou la ·-(2-thiényl)-DL-alanine et déficientes en capacité de décomposition de la L-sérine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 10-248588). Des exemples spécifiques de telles bactéries corynéformes comprennent, par exemple, Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavurri) AJ13324 (FERM P16128), qui est résistante à l’azasérine et déficiente en capacité de décomposition de la L-sérine, et Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavurri) AJ13325 (FERM P-16129), qui est résistante à la la ·-(2-thiényl)-DL-alanine et déficience en capacité de décomposition de la L-sérine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°10248588).
[0112] < Bactéries productrices de L-méthionine>
Des exemples de bactéries productrices de L-méthionine et de souches parentales pour les dériver comprennent des souches auxotrophes pour la L-thréonine et des souches mutantes résistantes à la norleucine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2000139471). Des exemples de bactéries productrices de L-méthionine et de souches parentales pour les dériver comprennent également une souche contenant une homosérine transsuccinylase mutante résistante à la rétro-inhibition par la L-méthionine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2000-139471, US2009-0029424A). Étant donné que la L-méthionine est biosynthétisée via la L-cystéine en tant qu’intermédiaire, la capacité de production de L-méthionine peut également être améliorée en améliorant la capacité de production de la L-cystéine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2000139471, US2008-0311632A).
[0113]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de Lméthionine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, E. coii AJ11539 (NRRL B-12399), E coii AJ11540 (NRRL B12400), E coiiAJ11541 (NRRL B-12401), E coiiAJ11542 (NRRL B-12402, brevet britannique n° 2075055), la souche d’E coii 218 (VKPM B-8125, brevet russe n° 2209248) et la souche 73 (VKPM B-8126, brevet russe n° 2215782), qui sont résistantes à la norleucine, qui est un analogue de la L-méthionine, et E. co//AJ13425 (FERMP-16808, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2000-139471). La souche AJ13425 est une souche auxotrophe pour la L-thréonine dérivée d’E coti W3110, dans laquelle le répresseur de la méthionine est supprimé, l’activité Sadénosylméthionine synthétase intracellulaire est atténuée, et l’activité homosérine transsuccinylase intracellulaire, l’activité cystathionine ·synthase, et l’activité aspartokinase-homosérine déshydrogénase II sont améliorées.
[0114] < Bactéries productrices de L-leucine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-leucine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la Lleucine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, les enzymes codées par les gènes de l’opéron leuABCD. En outre, afin d’améliorer l’activité d’une telle enzyme, par exemple, le gène teuA mutant codant pour une isopropyl-maléate synthase désensibilisée à la rétro-inhibition par la L-leucine (brevet U.S. n° 6 403 342) peut être de préférence utilisé.
[0115]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-leucine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des souches appartenant au genre Escherichia, tel que des souches d’E coii résistantes à la leucine (par exemple, la souche 57 (VKPM B-7386, brevet U.S. n° 6 124 121)), des souches d’E coii résistantes à un analogue de la leucine tel que la •-2-thiénylalanine, la 3-hydroxyleucine, la 4-azaleucine, and la 5,5,5-trifluoroleucine (publication de brevet japonais (Kokoku) n° 62-34397 et brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 870879), des souches d’E coii obtenues par une technique de génie génétique décrite dans WO96/06926, et E coii H-9068 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 8-70879).
[0116]
Des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-leucine comprennent, par exemple, Corynebacterium gtutamicum (Brevibacterium tactofermentum) AJ3718 (FERM P-2516), qui est résistante à la 2-thiazolalanine et à la ·-hydroxyleucine et auxotrophe pour l’isoleucine et la méthionine.
[0117] < Bactéries productrices de L-isoleucine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-isoleucine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’une ou de plusieurs enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-isoleucine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la thréonine désaminase et l’acétohydroxy acide synthase (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2-458, EP0356739A, brevet U.S. n° 5 998 178).
[0118]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-isoleucine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des bactéries Escherichia telles que des souches mutantes présentant une résistance à la 6-diméthylaminopurine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 5-304969), des souches mutantes présentant une résistance à un analogue d’isoleucine tel que la thiaisoleucine et l’isoleucine hydroxamate, et des souches mutantes présentant une résistance à un tel analogue d’isoleucine et présentant en outre une résistance à la DL-éthionine et/ou l’arginine hydroxamate (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 5-130882).
Des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-isoleucine comprennent, par exemple, la bactérie corynéforme dans laquelle le gène brnE codant pour une protéine d’excrétion d’acide aminé à chaîne ramifiée est amplifié (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2001-169788), la bactérie corynéforme pour laquelle une capacité de production de L-isoleucine est conférée par une fusion de protoplastes avec une bactérie productrice de L-lysine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°6274293), la bactérie corynéforme dans laquelle l’homosérine déshydrogénase est améliorée (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 62-91193), la souche résistante à la thréonine hydroxamate (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n°62195293, la souche résistante à l’acide ·-cétomalonique (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 61-15695), la souche résistante à la méthyllysine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 61-15696), et Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium fiavum) AJ12149 (FERM BP-759, brevet U.S. n° 4 656 135).
[0120] < Bactéries productrices de L-valine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-valine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse de la L-valine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, les enzymes codées par les gènes de l’opéron HvGMEDA et les enzymes codées par l’opéron HvBNC. Le gène iivBN code pour l’acétohydroxy acide synthase, et le gène HvC code pour une isoméroréductase (WO00/506214). Les expressions de l’opéron HvGMEDA et de l’opéron iivBNC sorti supprimées (atténuées) par la L-valine, la Lisoleucine, et/ou la L-leucine. Par conséquent, afin d’améliorer l’activité d’une telle enzyme, il est préférable que la suppression de l’expression par la L-valine produite soit libérée en éliminant ou en modifiant une région requise pour l’atténuation. En outre, la thréonine désaminase codée par le gène UvA est une enzyme qui catalyse la réaction de désamination de la Lthréonine pour générer de l’acide 2-cétobutyrique, qui est l’étape limitante du système de biosynthèse de la L-isoleucine. Par conséquent, pour la production de L-valine, il est préférable que le gène UvA soit, par exemple, perturbé, et ainsi l’activité thréonine désaminase est réduite.
[0121]
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-valine comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités réduite(s) d’un ou de plusieurs types d’enzymes sélectionnées parmi les enzymes qui catalysent une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse de la L-valine pour générer un composé autre que la L-valine. Des exemples de telles enzymes comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la thréonine déshydratase impliquée dans la synthèse de la L-leucine, et les enzymes impliquées dans la synthèse de l’acide D-pantothénique (WO00/50624). [0122]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-valine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, des souches d’E coii modifiées de sorte à surexprimer l’opéron HvGMEDA (brevet U.S. n° 5 998 178).
[0123]
Des exemples de bactéries productrices de L-valine et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches mutantes comportant une mutation dans l’aminoacyl-ARNt synthétase (brevet U.S. n° 5 658 766). Des exemples de telles souches comprennent, par exemple, E coii VL19, qui comporte une mutation dans le gène iieS codant pour l’isoleucine ARNt synthétase. E coii VL1970 a été déposée auprès de la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUP GosNIl Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Russie) le 24 juin 1988 sous le numéro d’accès VKPM B-4411. Des exemples de bactéries productrices de L-valine et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches mutantes nécessitant de l’acide lipoïque pour leur croissance et/ou dépourvues de H+-ATPase (WO96/06926).
[0124]
Des exemples de bactéries productrices de L-valine et de souches parentales pour les dériver comprennent également des souches résistantes à un analogue d’acide aminé ou similaire. Des exemples de telles souches comprennent, par exemple, les souches de bactéries corynéformes qui sont auxotrophes pour la L-isoleucine et la L-méthionine, et résistantes au D-ribose, au ribonucléoside purine, ou au ribonucléoside pyrimidine, et possèdent une capacité de production de L-valine (FERM P1841, FERM P-29) (publication de brevet japonais n° 53-025034), des souches de bactéries corynéformes résistantes à des polycétides (FERM P1763, FERM P-1764) (publication de brevet japonais n° 06-065314), et des souches de bactéries corynéformes résistantes à la L-valine dans un milieu contenant de l’acide acétique en tant qu’unique source de carbone et sensibles aux analogues de l’acide pyruvique (acide fluoropyruvique, etc.) dans un milieu contenant du glucose en tant qu’unique source de carbone (FERM BP-3006, BP-3007) (brevet japonais n° 3006929).
[0125] < Bactéries productrices de L-alanine>
Des exemples de bactéries productrices de L-alanine et de souches parentales pour les dériver comprennent les bactéries corynéformes déficientes en H+-ATPase (Appl. Microbiol. Biotechnol., novembre 2001, 57(4):534-40) et des bactéries corynéformes dans lesquelles l’activité aspartate · -décarboxylase est améliorée (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 07-163383).
[0126] < Bactéries productrices de L-tryptophane, bactéries productrices de Lphénylalanine, et bactéries productrices de L-tyrosine>
Des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production de L-tryptophane, une capacité de production de L-phénylalanine, et/ou une capacité de production de L-tyrosine comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’une ou de plusieurs enzymes sélectionnées parmi les enzymes de biosynthèse du L-tryptophane, de la L-phénylalanine et/ou de la Ltyrosine.
[0127]
Des exemples d’enzymes communes aux systèmes de biosynthèse de ces acides aminés aromatiques comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la 3-désoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase {aroQ), la 3-déshydroquinate synthase (aroB), la shikimate déshydrogénase {aroE), la shikimate kinase (aroL), la 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (aroA), et la chorismate synthase {aroQ (EP763127B). Les expressions des gènes codant pour ces enzymes sont contrôlées par le répresseur de la tyrosine (tyrR), et les activités de ces enzymes peuvent être améliorées en supprimant le gène Zyr/?(EP763127B).
[0128]
Des exemples des enzymes de biosynthèse du L-tryptophane comprennent, sans particulièrement s’y limiter, l’anthranilate synthase {trpE), la tryptophane synthase (trpAB), et la phosphoglycérate déshydrogénase (serA). Par exemple, en introduisant un ADN contenant l’opéron du tryptophane, une capacité de production de L-tryptophane peut être conférée ou améliorée. La tryptophane synthase consiste en des sous-unités · et · codées par les gènes trpA et trpB, respectivement. Étant donné que l’anthranilate synthase est sensible à la rétro-inhibition par le L-tryptophane, un gène codant pour cette enzyme dans lequel une mutation de désensibilisation à la rétro-inhibition a été introduite peut être utilisé pour améliorer l’activité de cette enzyme. Étant donné que la phosphoglycérate déshydrogénase est sensible à la rétro-inhibition par la L-sérine, un gène codant pour cette enzyme dans lequel une mutation de désensibilisation à la rétro-inhibition a été introduite peut être utilisé pour améliorer l’activité de cette enzyme. En outre, en augmentant l’expression de l’opéron (opéron ace) consistant en le gène de la maléate synthase (aceB), le gène de l’isocitrate lyase (aceA), et le gène de l’isocitrate déshydrogénase kinase/phosphatase (aceK), une capacité de production de L-tryptophane peut être conférée ou améliorée (W02005/103275). [0129]
Des exemples des enzymes de biosynthèse de la L-phénylalanine comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la chorismate mutase et la préphénate déshydratase. La chorismate mutase et la préphénate déshydratase sont codées par le gène pheA en tant qu’enzyme bifonctionnelle. Étant donné que la chorismate mutase et la préphénate déshydratase sont sensibles à la rétro-inhibition par la L-phénylalanine, des gènes codant pour ces enzymes dans lesquels une mutation de désensibilisation à la rétro-inhibition a été introduite peuvent être utilisés pour améliorer les activités de ces enzymes.
[0130]
Des exemples des enzymes de biosynthèse de la L-tyrosine comprennent, sans particulièrement s’y limiter, la chorismate mutase et la préphénate déshydrogénase. La chorismate mutase et la préphénate déshydrogénase sont codées par le gène tyrA en tant qu’enzyme bifonctionnelle. Étant donné que la chorismate mutase et la préphénate déshydrogénase sont sensibles à la rétro-inhibition par la L-tyrosine, des gènes codant pour ces enzymes dans lesquels une mutation de désensibilisation à la rétro-inhibition a été introduite peuvent être utilisés pour améliorer les activités de ces enzymes.
[0131]
Les bactéries productrices de L-tryptophane, L-phénylalanine, et/ou L-tyrosine peuvent être modifiées de sorte que la biosynthèse d’un acide aminé aromatique autre que l’acide aminé aromatique cible soit réduite. En outre, les bactéries productrices de L-tryptophane, L-phénylalanine, et/ou L-tyrosine peuvent être modifiées de sorte qu’un système d’incorporation de produit secondaire soit amélioré. Des exemples du produit secondaire comprennent des acides aminés aromatiques autres que l’acide aminé aromatique cible. Des exemples du gène codant pour un tel système d’incorporation de produit secondaire comprennent, par exemple, tnaB et mtr, qui sont des gènes codant pour le système d’incorporation du L-tryptophane, pheP, qui est un gène codant pour le système d’incorporation de la L-phénylalanine, et tyrP, qui est un gène codant pour le système d’incorporation de la L-tyrosine (EP1484410).
[0132]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-trytophane et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, E. coti JP4735/pMU3028 (DSM10122) et JP6015/pMU91 (DSM10123), qui possèdent un gène trpS mutant codant pour une tryptophanyl-ARNt synthétase partiellement inactivée (brevet U.S. n° 5 756 345), E. coti SV164, qui possède un allèle trpEcodant pour une anthranilate synthase désensibilisée à la rétro-inhibition par le tryptophane, E. coti SV164 (pGH5), qui possède un allèle serA codant pour une phosphoglycérate déshydrogénase désensibilisée à la rétro-inhibition par la sérine et un allèle trpE codant pour une anthranilate synthase désensibilisée à la rétroinhibition par le tryptophane (brevet U.S. n° 6 180 373), une souche dans laquelle un opéron du tryptophane contenant un allèle trpE codant pour une anthranilate synthase désensibilisée à la rétro-inhibition par le tryptophane a été introduit (brevets japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-71397 et 62-244382, brevet U.S. n° 4 371 614), E coti AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) et AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), qui sont déficientes en tryptophanase (brevet U.S. n° 4 371 614), E coti AGX17/pGX50,pACKG4-pps, qui possède une capacité de production de phosphoénolpyruvate augmentée (WO97/08333, brevet U.S n° 6 319 696), et des souches appartenant au genre Escherichia possédant une activité augmentée de la protéine codée par le gène yedA ou yrW(US2003-0148473A1 et US2003-0157667A1).
[0133]
Des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-tryptophane comprennent, par exemple, Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM BP-478, brevet japonais n° 1681002), qui est résistante à la sulfaguanidine, la souche dans laquelle l’opéron du tryptophane a été introduit (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 63-240794), et la souche dans laquelle un gène codant pour la shikimate synthase dérivée d’une bactérie corynéforme a été introduit (brevet japonais n° 1994749).
[0134]
Des exemples spécifiques de bactéries productrices de Lphénylalanine et de souches parentales pour les dériver comprennent, par exemple, E coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), qui est déficiente en chorismate mutase-préphénate déshydrogénase et en répresseur de la tyrosine (W003/044191), E co//'HW1089 (ATCC 55371), qui contient un gène pheA34 mutant codant pour une chorismate mutasepréphénate déshydratase désensibilisée à la rétro-inhibition (brevet U.S. n° 5 354 672), E coli MWEC101-b (KR8903681), E coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, et NRRL B-12147 (brevet U.S. n°4 407 952). Des exemples spécifiques de bactéries productrices de Lphénylalanine et de souches parentales pour les dériver comprennent également, par exemple, E co//K-12 <W3110(tyrA)/pPHAB> (FERM BP3566), E coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHAD> (FERM BP-12659), E coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHATerm> (FERM BP-12662), et E coli K-12 AJ12604 <W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB> (FERM BP-3579), qui contient un gène codant pour une chorismate mutase-préphénate déshydratase désensibilisée à la rétro-inhibition ( EP488424B1 ). Des exemples spécifiques de bactéries productrices de L-phénylalanine et de souches parentales pour les dériver comprennent en outre, par exemple, des souches appartenant au genre Escherichia possédant une activité augmentée de la protéine codée par le gène yedA ou le gène yddG (US2003-0148473A, US2003-0157667A, W003/044192).
[0135]
Des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-phénylalanine comprennent, par exemple, les souches Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP2062), and K78 (FERM BP-2063) (EP331145A, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 02-303495), dont l’activité phosphoénolpyruvate carboxylase ou pyruvate kinase est réduite, et la souche auxotrophe pour la tyrosine (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 05-049489).
[0136]
Des exemples de bactéries corynéformes possédant une capacité de production de L-tyrosine comprennent, par exemple, Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836, publication de brevet japonais n°26517), et Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium iactofermentum) AJ12081 (FERM P-7249, brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 60-70093).
[0137]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-aminé comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité augmentée pour sécréter un acide L-aminé à partir d’une cellule bactérienne. Une telle activité pour sécréter un acide L-aminé peut être augmentée, par exemple, en augmentant l’expression d’un gène codant pour une protéine responsable de la sécrétion de l’acide L-aminé. Des exemples de gènes codant pour les protéines responsables de la sécrétion de divers acides aminés comprennent, par exemple, le gène b2682 (ygaZ), le gène b2683 (ygaH), le gène b1242 (ychEp et le gène b3434 (yhgN) (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2002-300874).
[0138]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité de production d’acide L-aminé comprennent également, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que la bactérie possède une activité ou des activités augmentée(s) d’une ou de plusieurs protéines sélectionnées parmi des protéines impliquées dans le glycométabolisme et des protéines impliquées dans le métabolisme énergétique.
[0139]
Des exemples des protéines impliquées dans le glycométabolisme comprennent des protéines impliquées dans l’incorporation de saccharides et les enzymes du système de glycolyse. Des exemples de gènes codant pour une protéine impliquée dans le glycométabolisme comprennent le gène de la glucose-6-phosphate isomérase (pgi, WO01/02542), le gène de la pyruvate carboxylase (pyc, WO99/18228, EP1092776A), le gène de la phosphoglucomutase (pgm, WO03/04598), le gène de la fructose bisphosphate aldolase (pfkB, fbp, WO03/04664), le gène de la transaldolase (ta!B, W003/008611), le gène de la fumarase (fum, W001/02545), le gène d’incorporation du saccharose non-PTS (esc, EP1149911A), et le gène d’assimilation du saccharose (opéron scrAB, brevet U.S. n° 7 179 623).
[0140]
Des exemples de gènes codant pour les protéines impliquées dans le métabolisme énergétique comprennent le gène de la transhydrogénase (pntAB, brevet U.S. n° 5 830 716) et le gène de la cytochrome bo oxydase (cyoB, EP1070376A).
[0141]
En outre, des exemples de procédés pour conférer ou améliorer une capacité à produire des substances utiles telles que des acides Laminés comprennent, par exemple, un procédé de modification d’une bactérie de sorte que l’activité de la phosphocétolase soit augmentée (W02006/016705). Par conséquent, la bactérie de la présente invention peut avoir été modifiée de sorte que l’activité de la phosphocétolase soit augmentée. Ce procédé peut être particulièrement efficace pour conférer ou améliorer une capacité de production d’un acide L-aminé de la famille glutamate tel que l’acide L-glutamique. Des exemples de phosphocétolase comprennent la D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase et la fructose-6-phosphate phosphocétolase. L’une quelconque de l’activité D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase et l’activité fructose-6-phosphate phosphocétolase peut être améliorée, ou les deux peuvent être améliorées.
[0142]
Le terme « activité D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase >> fait référence à une activité pour convertir le xylulose-5-phosphate en glycélaldéhyde-3-phosphate et phosphate d’acétyle en consommant de l’acide phosphorique afin de libérer une molécule d’H2O. Cette activité peut être mesurée par le procédé décrit par Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520, 1996) ou le procédé décrit par L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001). Des exemples de D-xylulose-5phosphate phosphocétolase comprennent celles de bactéries appartenant aux genres Acetobacter, Bifidobacterium, Lactobacillus, Thiobacillus, Streptococcus, Methy/ococcus, Butyrivibrio, et Fibrobacter, et d’une levure appartenant aux genres Candida, Rhodotoruia, Rhodosporidium, Rchia, Yarrowia, Hansenu/a, Kiuyveromyces, Saccharomyces, Trichosporon, et Wingea. Des exemples spécifiques de D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase et de gènes les codant sont décrits dans W02006/016705.
[0143]
Le terme « activité fructose-6-phosphate phosphocétolase >> fait référence à une activité pour convertir le fructose-6-phosphate en érythrose-4-phosphate et phosphate d’acétyle en consommant de l’acide phosphorique afin de libérer une molécule d’H2O. Cette activité peut être mesurée par le procédé décrit par Ftacker, E. (Methods Enzymol., 5, 276280, 1962) ou le procédé décrit par L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001). Des exemples de fructose-6-phosphate phosphocétolase comprennent celles de bactéries appartenant aux genres Acetobacter, Bifidobacterium, Chiorobium, Bruceiia, Methy/ococcus, et Gardnereiia, et d’une levure appartenant aux genres Rhodotoruia, Candida, et Saccharomyces. Des exemples spécifiques de fructose-6-phosphate phosphocétolase et de gènes les codant sont décrits dans W02006/016705.
[0144]
À la fois l’activité D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase et l’activité fructose-6-phosphate phosphocétolase peuvent également être conservées par une seule enzyme (c’est-à-dire la D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase/fructose-6-phosphate phosphocétolase).
[0145]
La séquence de nucléotides du gène de la phosphocétolase (gène xfp) de Bifidobacterium longum JCM1217 et la séquence d’acides aminés de la phosphocétolase codée par le gène (protéine Xfp) sont montrées dans SEQ ID NO: 13 et 14, respectivement.
[0146]
Les gènes et les protéines utilisés pour la culture de bactéries productrices d’acide L-aminé peuvent posséder, par exemple, les séquences de nucléotides et les séquences d’acides aminés de gènes et de protéines connus, tels que ceux/celles exemplifié(e)s ci-dessus, respectivement. De plus, les gènes et les protéines utilisés pour la culture de bactéries productrices d’acide L-aminé peuvent être des variants conservateurs de gènes et de protéines connus, tels que ceux/celles exemplifié(e)s ci-dessus, respectivement. Spécifiquement, par exemple, les gènes utilisés pour la culture de bactéries productrices d’acides Laminés peuvent être chacun un gène codant pour une protéine possédant une séquence d’acides aminés d’une protéine connue, mais comprenant une substitution, une délétion, une insertion, ou une addition d’un ou de plusieurs résidus d’acides aminés au niveau d’une ou de plusieurs positions, tant que la fonction d’origine de celle-ci est maintenue. Pour les variants conservateurs des gènes et des protéines, les descriptions concernant des variants conservateurs du gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 et le transporteur d’acide dicarboxylique C4 mentionné plus loin peuvent être appliquées, mutatis mutandis.
[0147] <1-2> Amélioration de l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4
La bactérie de la présente invention a été modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée. La bactérie de la présente invention a été modifiée spécifiquement de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée par comparaison à une souche non modifiée. La bactérie de la présente invention peut être obtenue en modifiant une bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée. La bactérie de la présente invention peut également être obtenue en modifiant une bactérie de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée, puis en conférant ou en améliorant une capacité de production d’acide L-aminé. La bactérie de la présente invention peut également être une bactérie qui a acquis une capacité de production d’acide L-aminé en étant modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée. La bactérie de la présente invention peut posséder, tel que requis, une telle propriété possédée par une bactérie productrice d’acide L-aminé telle que susmentionnée, ainsi qu’être modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée. Par exemple, la bactérie de la présente invention peut avoir été modifiée de sorte que l’activité de la phosphocétolase soit augmentée. Les modifications pour construire la bactérie de la présente invention peuvent être réalisées dans un ordre arbitraire.
[0148]
En modifiant une bactérie de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée, une capacité de production d’acide L-aminé de la bactérie peut être améliorée, et c’est-à-dire que la production d’un acide L-aminé en utilisant la bactérie peut être augmentée. Particulièrement, en modifiant une bactérie de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée, on s’attend à ce qu’une capacité de production d’acide L-aminé de la bactérie, dans des conditions dans lesquelles de l’acide L-aspartique est produit en tant que produit secondaire, puisse être améliorée, et c’est-à-dire que la production d’un acide L-aminé en utilisant la bactérie peut être augmentée. Des exemples de l’« augmentation de la production d’un acide L-aminé >> comprennent une amélioration (augmentation) de la quantité d’accumulation de l’acide L-aminé dans un milieu. Cest-à-dire qu’en raison d’une augmentation de l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 tel qu’une protéine DctA, plus spécifiquement, en raison d’une augmentation de l’expression d’un gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 tel qu’un gène dctA, par exemple, la quantité d’accumulation d’un acide L-aminé tel que l’acide L-glutamique dans un milieu peut être améliorée (augmentée). En outre, particulièrement, en modifiant une bactérie de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée, on s’attend à ce qu’une production secondaire d’acide L-aspartique puisse être réduite.
[0149]
Ci-après, les transporteurs d’acide dicarboxylique C4 et les gènes les codant vont être expliqués.
[0150]
Le terme « transporteur d’acide dicarboxylique C4 >> fait référence à une protéine possédant une activité d’incorporation d’acide dicarboxylique C4. Le terme « activité d’incorporation d’acide dicarboxylique C4 >> fait référence à une activité d’incorporation d’un acide dicarboxylique C4 (acide carboxylique possédant 4 carbones) depuis l’extérieur d’une cellule vers l’intérieur de la cellule. Des exemples de l’acide dicarboxylique C4 comprennent l’acide aspartique. Un gène codant pour un transporteur d’acide dicarboxylique C4 est également désigné « gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 >>.
[0151]
Des exemples du gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 comprennent le gène dctA, le gène dcuA, et le gène dcuB. Les protéines codées par le gène dctA, le gène dcuA, et le gène obz/Esont également désignées «protéine DctA», «protéine DcuA», et «protéine DcuB», respectivement. Toutes ces protéines possèdent une activité d’incorporation d’acide aspartique. Dans la présente invention, l’activité d’un seul type de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être augmentée, ou les activités de deux types de transporteurs d’acide dicarboxylique C4 ou plus peuvent être augmentées. Cest-à-dire que le transporteur d’acide dicarboxylique C4 dont l’activité est augmentée peut spécifiquement consister en un ou plusieurs types de protéines sélectionnées parmi une protéine DctA, une protéine DcuA, et une protéine DcuB. L’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être augmentée, par exemple, en augmentant l’expression d’un gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4. Cest-à-dire que l’expression « l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 est augmentée » peut signifier, par exemple, que l’expression d’un gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 est augmentée. L’expression « l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 est augmentée » peut également signifier, spécifiquement, par exemple, que l’expression d’un ou de plusieurs types de gènes sélectionnés parmi un gène dctA, un gène dctB, et un gène dcuBedi augmentée.
[0152]
Des exemples du gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 comprennent des gènes de divers organismes tels que des bactéries appartenant à la famille Enterobacgeriaceae et des bactéries corynéformes. Les séquences de nucléotides des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 dérivés de divers organismes et les séquences d’acides aminés des transporteurs d’acide dicarboxylique C4 codées par celles-ci peuvent être obtenues, par exemple, à partir de bases de données publiques telles que le NCBI. Des exemples spécifiques de gène dctA comprennent, par exemple, le gène dctA (NCgl2506) de C. glutamicum et le gène dctA d’E coti. Des exemples spécifiques de gène dcuA comprennent, par exemple, le gène dcuA d’E coti. Des exemples spécifiques de gène dcuB comprennent, par exemple, le gène dcuB d’E coti. La séquence de nucléotides du gène dctA (NCgl2506) de C. glutamicum 2256 (ATCC 13869) et la séquence d’acides aminés de la protéine codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 15 et 16, respectivement. La séquence de nucléotides du gène dctA (NCBI GenelD : 948039) d’E coti K-12 MG1655 et la séquence d’acides aminés de la protéine codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 17 et 18, respectivement. La séquence de nucléotides du gène dcuA (NCBI GenelD : 948659) d’E coti K-12 MG1655 et la séquence d’acides aminés de la protéine codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 19 et 20, respectivement. La séquence de nucléotides du gène dcuB (NCBI GenelD : 948641) d’E coti K-12 MG1655 et la séquence d’acides aminés de la protéine codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 21 et 22, respectivement. Gest-à-dire que le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être, par exemple, un gène possédant la séquence de nucléotides de l’un quelconque des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4, tel que la séquence de nucléotides montrée en tant que SEQ ID NO: 15, 17, 19, ou 21. De plus, le transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être, par exemple, une protéine possédant la séquence d’acides aminés de l’un quelconque des transporteurs d’acide dicarboxylique C4 exemplifiés ci-dessus, telle que la séquence d’acides aminés montrée en tant que SEQ ID NO: 16, 18, 20, ou 22. L’expression « un gène ou une protéine possède une séquence de nucléotides ou d’acides aminés >> signifie qu’un gène ou une protéine comprend la séquence de nucléotides ou d’acides aminés, sauf indication contraire, et comprend également les cas où un gène ou une protéine consiste en la séquence de nucléotides ou d’acides aminés.
[0153]
Le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être un variant de l’un quelconque des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 exemplifiés ci-dessus (par exemple, un gène possédant la séquence de nucléotides montrée en tant que SEQ ID NO: 15, 17, 19, ou 21), tant que sa fonction d’origine est maintenue. De manière similaire, le transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être un variant de l’un quelconque des transporteurs d’acide dicarboxylique C4 exemplifiés cidessus (par exemple, une protéine possédant la séquence d’acides aminés montrée en tant que SEQ ID NO: 16, 18, 20, ou 22), tant que sa fonction d’origine est maintenue. Un tel variant qui maintient sa fonction d’origine est également désigné « variant conservateur >>. Les termes « gène dctA», « gène dcuA», et « gène dcuB» comprennent non seulement le gène dctA, le gène dcuA, et le gène dcuB exemplifiés ci-dessus, respectivement, mais comprend également des variants conservateurs de ceux-ci. De manière similaire, les termes «protéine DctA», «protéine DcuA», et «protéine DcuB» comprennent non seulement la protéine DctA, la protéine DcuA, et la protéine DcuB exemplifiées ci-dessus, respectivement, mais comprennent également des variants conservateurs de celles-ci. Des exemples des variants conservateurs comprennent, par exemple, des homologues et des versions artificiellement modifiées des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 et des transporteurs d’acide dicarboxylique C4 exemplifiés ci-dessus.
[0154]
L’expression « la fonction d’origine est maintenue >> signifie qu’un variant d’un gène ou d’une protéine possède une fonction (comme une activité ou une propriété) correspondant à la fonction (comme une activité ou une propriété) du gène ou de la protéine d’origine. L’expression « la fonction d’origine est maintenue >> utilisée pour un gène signifie qu’un variant du gène code pour une protéine qui maintient la fonction d’origine. Gest-à-dire que l’expression « la fonction d’origine est maintenue >> utilisée pour le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 signifie qu’un variant du gène code pour une protéine possédant une activité d’incorporation d’acide dicarboxylique C4, comme une activité d’incorporation d’acide aspartique. En outre, l’expression « la fonction d’origine est maintenue >> utilisée pour le transporteur d’acide dicarboxylique C4 signifie qu’un variant de la protéine possède une activité d’incorporation d’acide dicarboxylique C4, comme une activité d’incorporation d’acide aspartique.
[0155]
L’activité d’incorporation d’acide dicarboxylique C4 d’une protéine peut être mesurée, par exemple, en incubant des cellules bactériennes exprimant la protéine avec un acide dicarboxylique C4, et en mesurant l’incorporation protéine-dépendante de l’acide dicarboxylique C4 dans les cellules.
[0156]
Q-après, des exemples les variants conservateurs vont être expliqués.
[0157]
Des homologues des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 ou des homologues des transporteurs d’acide dicarboxylique C4 peuvent être facilement obtenus à partir de bases de données publiques, par exemple, par une recherche BLAST ou une recherche FASTA en utilisant l’une quelconque des séquences de nucléotides des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 exemplifiées ci-dessus ou l’une quelconque des séquences d’acides aminés des transporteurs d’acide dicarboxylique C4 exemplifiés ci-dessus en tant que séquence de requête. En outre, des homologues des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peuvent être obtenus, par exemple, par une PCR en utilisant un chromosome de divers organismes en tant que matrice, et des oligonucléotides préparés en se basant sur l’une quelconque des séquences de nucléotides de ces gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 connus en tant qu’amorces.
[0158]
Le transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être un gène codant pour une protéine possédant l’une quelconque des séquences d’acides aminés susmentionnées (par exemple, la séquence d’acides aminés montrée en tant que SEQ ID NO: 16, 18, 20, ou 22), mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition d’un ou de plusieurs résidus d’acides aminés au niveau d’une ou plusieurs positions, tant que la fonction d’origine est maintenue. Par exemple, l’extrémité N-terminale et/ou l’extrémité C-terminale de la protéine codée peut être rallongée ou raccourcie. Bien que le nombre désigné par le terme « une ou plusieurs >> mentionné ci-dessus puisse différer en fonction des positions des résidus d’acides aminés dans la structure tridimensionnelle de la protéine ou des types de résidus d’acides aminés, spécifiquement, il est, par exemple, de 1 à 50, 1 à 40, ou 1 à 30, de préférence de 1 à 20, de manière davantage préférée de 1 à 10, encore de manière davantage préférée de 1 à 5, particulièrement de préférence de 1 à 3.
[0159]
La substitution, délétion, insertion, et/ou addition d’un ou plusieurs résidus d’acides aminés susmentionnée(s) sont/est une mutation conservatrice qui maintient la fonction normale de la protéine. Des exemples typiques de la mutation conservatrice sont des substitutions conservatrices. La substitution conservatrice est une mutation dans laquelle la substitution se produit mutuellement parmi Phe, Trp, et Tyr, si le site de substitution est un acide aminé aromatique ; parmi Leu, Ile, et Val, si c’est un acide aminé hydrophobe ; entre Gin et Asn, si c’est un acide aminé polaire ; parmi Lys, Arg, et His, si c’est un acide aminé basique ; entre Asp et Glu, si c’est un acide aminé acide ; et entre Ser et Thr, si c’est un acide aminé possédant un groupe hydroxyle. Des exemples de substitutions considérées comme des substitutions conservatrices comprennent, spécifiquement, une substitution de Ser ou Thr à Ala, une substitution de Gin, His, ou Lys à Arg, une substitution de Glu, Gin, Lys, His, ou Asp à Asn, une substitution de Asn, Glu, ou Gin à Asp, une substitution de Ser ou Ala à Cys, une substitution de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg à Gin, une substitution de Gly, Asn, Gin, Lys, ou Asp à Glu, une substitution de Gly, Asn, Gin, Lys, ou Asp à Glu, une substitution de Pro à Gly, une substitution de Asn, Lys, Gin, Arg, ou Tyr à His, une substitution de Leu, Met, Val, ou Phe à Ile, une substitution de Ile, Met, Val, ou Phe à Leu, une substitution de Asn, Glu, Gin, His, ou Arg à Lys, une substitution de Ile, Leu, Val, ou Phe à Met, une substitution de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu à Phe, une substitution de Thr ou Ala à Ser, une substitution de Ser ou Ala à Thr, une substitution de Phe ou Tyr à Trp, une substitution de His, Phe, ou Trp à Tyr, et une substitution de Met, Ile, ou Leu à Val. En outre, une telle substitution, délétion, insertion, ou addition de résidus d’acides aminés telle que mentionnée ci-dessus comprend une mutation survenant à l’état naturel en raison d’une différence individuelle, ou d’une différence d’espèce de l’organisme à partir duquel le gène est dérivé (mutant ou variant).
[0160]
Le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être un gène codant pour une protéine possédant une séquence d’acides aminés montrant une homologie de, par exemple, 50 % ou plus, 65 % ou plus, ou 80 % ou plus, de préférence 90 % ou plus, de manière davantage préférée 95 % ou plus, de manière encore davantage préférée 97 % ou plus, particulièrement de préférence de 99 % ou plus, avec la séquence d’acides aminés totale de l’une quelconque des séquences d’acides aminés susmentionnées, tant que la fonction d’origine est maintenue. Dans cette description, « homologie >> signifie « identité >>.
[0161]
Le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut également être un ADN qui est capable de s’hybrider dans des conditions stringentes avec une sonde qui peut être préparée à partir de l’une quelconque des séquences de nucléotides susmentionnées (par exemple, la séquence de nucléotides montrée en tant que SEQ ID NO: 15, 17, 19, ou 21), comme une séquence complémentaire à une séquence partielle ou entière de l’une quelconque des séquences de nucléotides susmentionnées, tant que la fonction d’origine est maintenue. Le terme « conditions stringentes >> fait référence à des conditions dans lesquelles ce qu’on appelle un hydride spécifique est formé, et un hybride non spécifique n’est pas formé. Des exemples des conditions stringentes comprennent celles dans lesquelles des ADN fortement homologues s’hybrident l’un à l’autre, par exemple, des ADN au minimum 50 %, 65 %, ou 80 % homologues, de préférence au minimum 90 % homologues, de manière davantage préférée au minimum 95 % homologues, de manière encore davantage préférée au minimum 97 % homologues, particulièrement de préférence au minimum 99 % homologues, s’hybrident l’un à l’autre, et des ADN moins homologues que ceux-ci-dessus ne s’hybrident pas l’un à l’autre, ou des conditions de lavage d’une hybridation de Southern typique, c’est-à-dire des conditions de lavage à raison d’une seule fois, de préférence 2 ou 3 fois, à une concentration en sel et à une température correspondant à du SSC 1x, SDS à 0,1 % à 60 °C, de préférence SSC 0,1x, SDS à 0,1 % à 60 °C, de manière davantage préférée SSC0,1x, SDS à 0,1 % à 68 °C. [0162]
La sonde utilisée pour l’hybridation susmentionnée peut faire partie d’une séquence qui est complémentaire au gène tel que décrit ci-dessus. Une telle sonde peut être préparée par PCR en utilisant des oligonucléotides préparés en se basant sur une séquence de gène connue en tant qu’amorces et un fragment d’ADN contenant l’un quelconque des gènes susmentionnés en tant que matrice. En tant que sonde, par exemple, un fragment d’ADN possédant une longueur d’environ 300 pb peut être utilisé. Lorsqu’un fragment d’ADN possédant une longueur d’environ 300 pb est utilisé en tant que sonde, les conditions de lavage de l’hybridation peuvent être, par exemple, 50 °C, SSC2x et SDSà 0,1 %. [0163]
En outre, étant donné que la dégénérescence des codons diffère en fonction de l’hôte, des codons arbitraires dans le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peuvent être remplacés par des codons équivalents respectifs. Cest-à-dire que le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être un variant de l’un quelconque des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 exemplifiés ci-dessus en raison de la dégénérescence du code génétique. Par exemple, le gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 peut être un gène modifié de sorte qu’il possède des codons optimaux en fonction des fréquences des codons chez un hôte devant être utilisé.
[0164]
Le pourcentage de l’identité de séquence entre deux séquences peut être déterminé, par exemple, en utilisant un algorithme mathématique. Des exemples non limitatifs d’un tel algorithme mathématique comprennent l’algorithme de Myers et Miller 1988) CABIOS 4:11-17, l’algorithme d’homologie locale de Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, l’algorithme d’alignement d’homologie de Needleman et Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, le procédé de recherche d’homologie de Pearson et Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:24442448, et une version modifiée de l’algorithme de Karlin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, tel que celui décrit dans Karlin et Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
[0165]
En utilisant un programme basé sur un tel algorithme mathématique, une comparaison de séquences (c’est-à-dire un alignement) pour déterminer l’identité de séquence peut être réalisée. Le programme peut être exécuté de manière appropriée par un ordinateur. Des exemples d’un tel programme comprennent, sans s’y limiter, le programme CLUSTAL de PC/Gene (disponible auprès de Intelligenetics, Mountain View, Calif.), le programme ALIGN (Version 2.0), et GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, et TFASTA du progiciel de Wisconsin Genetics, Version 8 (disponible auprès de Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., États-Unis). Un alignement en utilisant ces programmes peut être réalisé en utilisant, par exemple, les paramètres initiaux. Le programma CLUSTAL est bien décrit dans Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, et Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331.
[0166]
Afin d’obtenir une séquence de nucléotides homologue à une séquence de nucléotides cible, en particulier, par exemple, une recherche de nucléotides par BLAST peut être réalisée en utilisant le programme BLASTN avec un score de 100 et une longueur de mot de 12. Afin d’obtenir une séquence d’acides aminés homologue à une protéine cible, en particulier, par exemple, une recherche de protéines par BLAST peut être réalisée en utilisant le programme BLASTX avec un score de 50 et une longueur de mot de 3. Voir http://www.ncbi.nlm.nih.gov pour une recherche de nucléotides par BLAST et une recherche de protéines par BLAST. De plus, Gapped BLAST (BLAST 2.0) peut être utilisé afin d’obtenir un alignement comprenant une/des brèche(s) à des fins de comparaison. De plus, PSI-BLAST peut être utilisé afin de réaliser une recherche répétitive pour détecter des relations distantes entre des séquences. Voir Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 pour Gapped BLAST et PSI-BLAST. Lors de l’utilisation de BLAST, Gapped BLAST, ou PSI-BLAST, les paramètres initiaux de chaque programme (par exemple, BLASTN pour les séquences de nucléotides, et BLASTX pour les séquences d’acides aminés) peuvent être utilisés. Un alignement peut également être réalisé manuellement.
[0167]
L’identité de séquence entre deux séquences est calculée en tant que rapport des résidus correspondants dans les deux séquences lors d’un alignement des deux séquences de sorte qu’elles montrent une correspondance maximale l’une avec l’autre.
[0168]
Les descriptions susmentionnées concernant des variants conservateurs des gènes et des protéines peuvent être appliquées mutatis mutandis aux variants de protéines arbitraires telles que les enzymes d’un système de biosynthèse d’acide L-aminé et les gènes les codant.
[0169] <1-3> Procédés pour augmenter l’activité d’une protéine
Ci-après, les procédés pour augmenter l’activité d’une protéine telle que le transporteur d’acide dicarboxylique C4 vont être expliqués.
[0170]
L’expression « l’activité d’une protéine est augmentée >> signifie que l’activité de la protéine est augmentée par comparaison à une souche non modifiée. Spécifiquement, l’expression « l’activité d’une protéine est augmentée >> signifie que l’activité de la protéine par cellule est augmentée par comparaison à celle d’une souche non modifiée. Le terme « souche non modifiée >> utilisé dans la présente fait référence à une souche de contrôle qui n’a pas été modifiée de sorte que l’activité d’une protéine cible soit augmentée. Des exemples de la souche non modifiée comprennent une souche de type sauvage et une souche parentale. Des exemples spécifiques de la souche non modifiée comprennent les souches de type respectif des espèces de bactéries. Des exemples spécifiques de la souche non modifiée comprennent également des souches exemplifiées cidessus par rapport à la description des bactéries. Cest-à-dire que, dans un mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut être augmentée par comparaison à une souche de type, c’est-à-dire la souche de type de l’espèce à laquelle la bactérie de la présente invention appartient. Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être augmentée par comparaison à la souche C. glutamicum ATCC 13032. Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être augmentée par comparaison à la souche C. glutamicum 2256 (ATCC 13869). Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être augmentée par comparaison à la souche E coii K-12 MG1655. Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être augmentée par comparaison à la souche P. ananatis AJ13355. L’état selon lequel « l’activité d’une protéine est augmentée >> peut également être exprimé par « l’activité d’une protéine est améliorée >>. Plus spécifiquement, l’expression « l’activité d’une protéine est augmentée >> peut signifier que le nombre de molécules de la protéine par cellule est augmenté, et/ou que la fonction de chaque molécule de la protéine est augmentée par comparaison à celles d’une souche non modifiée. Cest-à-dire que le terme « activité >> dans l’expression « l’activité d’une protéine est augmentée >> n’est pas limité à l’activité catalytique de la protéine, mais peut également désigner la quantité de transcription d’un gène (c’est-à-dire la quantité d’ARNm) codant pour la protéine, ou la quantité de traduction de la protéine (c’està-dire la quantité de la protéine). En outre, l’état selon lequel « l’activité d’une protéine est augmentée >> comprend non seulement un état selon lequel l’activité d’une protéine cible est augmentée dans une souche possédant l’activité de la protéine cible de manière inhérente, mais également un état selon lequel l’activité d’une protéine cible est conférée à une souche ne possédant pas l’activité de la protéine cible de manière inhérente. En outre, tant que l’activité de la protéine est en fin de compte augmentée, l’activité d’une protéine cible contenue de manière inhérente dans un hôte peut être atténuée et/ou éliminée, puis un type approprié de la protéine cible peut être conféré à l’hôte.
[0171]
Le degré d’augmentation de l’activité d’une protéine n’est pas particulièrement limité, tant que l’activité de la protéine est augmentée par comparaison à une souche non modifiée. L’activité de la protéine peut être augmentée, par exemple, de 1,5 fois ou plus, 2 fois ou plus, ou 3 fois ou plus par rapport à celle d’une souche non modifiée. En outre, lorsque la souche non modifiée ne possède pas l’activité de la protéine cible, il est suffisant que la protéine soit produite en conséquence de l’introduction du gène codant pour la protéine et, par exemple, la protéine peut être produite dans une mesure telle que son activité peut être mesurée.
[0172]
La modification pour augmenter l’activité d’une protéine peut être obtenue, par exemple, en augmentant l’expression d’un gène codant pour la protéine. L’expression « l’expression d’un gène est augmentée >> signifie que l’expression du gène est augmentée par comparaison à une souche non modifiée comme une souche de type sauvage et une souche parentale. Spécifiquement, l’expression « l’expression d’un gène est augmentée >> signifie que la quantité d’expression du gène par cellule est augmentée par comparaison à celle d’une souche non modifiée. Plus spécifiquement, l’expression « l’expression d’un gène est augmentée >> peut signifier que la quantité de transcription du gène (c’est-à-dire la quantité d’ARNm) est augmentée, et/ou que la quantité de traduction du gène (c’est-à-dire la quantité de la protéine exprimée à partir du gène) est augmentée. L’état selon lequel « l’expression d’un gène est augmentée >> peut également être désigné « l’expression d’un gène est améliorée >>. L’expression d’un gène peut être augmentée, par exemple, de 1,5 fois ou plus, 2 fois ou plus, ou 3 fois ou plus par rapport à celle d’une souche non modifiée. En outre, l’état selon lequel « l’expression d’un gène est augmentée >> comprend non seulement un état selon lequel la quantité d’expression d’un gène cible est augmentée dans une souche qui exprime le gène cible de manière inhérente, mais également un état selon lequel le gène est introduit dans une souche qui n’exprime pas le gène cible de manière inhérente, et qu’il est exprimé dans celle-ci. Cest-à-dire que la phrase « l’expression d’un gène est augmentée >> peut également signifier, par exemple, qu’un gène cible est introduit dans une souche qui ne possède pas le gène, et qu’il est exprimé dans celle-ci.
[0173]
L’expression d’un gène peut être augmentée, par exemple, en augmentant le nombre de copies du gène.
[0174]
Le nombre de copies d’un gène peut être augmenté en introduisant le gène dans le chromosome d’un hôte. Un gène peut être introduit dans un chromosome, par exemple, en utilisant une recombinaison homologue (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Des exemples du procédé de transfert de gène utilisant une recombinaison homologue comprennent, par exemple, un procédé d’utilisation d’un ADN linéaire tel qu’une intégration dirigée par Red (Datsenko, K.A., et Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:66406645 (2000)), un procédé utilisant un plasmide contenant une origine de réplication sensible à la température, un procédé utilisant un plasmide capable de transfert par conjugaison, un procédé utilisant un vecteur suicide ne possédant pas d’origine de réplication qui fonctionne chez un hôte, et un procédé de transduction en utilisant un phage. Une seule copie, ou deux copies ou plus d’un gène peuvent être introduites. Par exemple, en réalisant une recombinaison homologue en utilisant une séquence qui est présente en de multiples copies sur un chromosome en tant que cible, de multiples copies d’un gène peuvent être introduites dans le chromosome. Des exemples d’une telle séquence qui est présente en de multiples copies sur un chromosome comprennent des ADN répétitifs, et des répétitions inversées localisées aux deux extrémités d’un transposon. En variante, une recombinaison homologue peut être réalisée en utilisant une séquence appropriée sur un chromosome comme un gène non nécessaire à la production d’une substance cible en tant que cible. En outre, un gène peut également être introduit de manière aléatoire dans un chromosome en utilisant un transposon ou un Mini-Mu (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2-109985, brevet U.S. n° 5 882 888, EP805867B1).
[0175]
L’introduction d’un gène cible dans un chromosome peut être confirmée par une hybridation de Southern en utilisant une sonde possédant une séquence complémentaire au gène entier ou à une partie de celui-ci, une PCR en utilisant des amorces préparées en se basant sur la séquence du gène, ou analogue.
[0176]
En outre, le nombre de copies d’un gène peut également être augmenté en introduisant un vecteur contenant le gène dans un hôte. Par exemple, le nombre de copies d’un gène cible peut être augmenté en ligaturant un fragment d’ADN contenant le gène cible avec un vecteur qui fonctionne chez un hôte afin de construire un vecteur d’expression du gène, et en transformant l’hôte avec le vecteur d’expression. Le fragment d’ADN contenant le gène cible peut être obtenu, par exemple, par PCR en utilisant l’ADN génomique d’un micro-organisme possédant le gène cible en tant que matrice. En tant que vecteur, un vecteur capable de réplication autonome dans la cellule de l’hôte peut être utilisé. Le vecteur est de préférence un vecteur à copies multiples. En outre, le vecteur possède de préférence un marqueur comme un gène de résistance aux antibiotiques pour la sélection du transformant. En outre, le vecteur peut comporter un promoteur et/ou un terminateur pour exprimer le gène introduit. Le vecteur peut être, par exemple, un vecteur dérivé d’un plasmide bactérien, un vecteur dérivé d’un plasmide de levure, un vecteur dérivé d’un bactériophage, un cosmide, un phagémide, ou analogue. Des exemples spécifiques de vecteur capable de réplication autonome dans des bactéries Enterobacteriaceae telles qu’Escherichia coti comprennent, par exemple, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (tous étant disponibles auprès de Takara Bio), pACYC184, pMW219 (NIPPON GENE), pTrc99A (Pharmacia), les vecteurs de la série pPROK (Qontech), pKK233-2 (Qontech), les vecteurs de la série pET (Novagen), les vecteurs de la série pQE (QIAGEN), pCold TF DNA (Takara Bio), les vecteurs de la série pACYC, et le vecteur à vaste spectre d’hôtes RSF1010. Des exemples spécifiques de vecteurs capables de réplication autonome dans des bactéries corynéformes comprennent, par exemple, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)) ; pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)) ; des plasmides obtenus en améliorant ceux-ci et possédant un gène de résistance à un médicament ; le plasmide pCRY30 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 3-210184; les plasmides pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, et pCRY3KX (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2-72876 et brevet U.S. n° 5 185 262) ; les plasmides pCRY2 et pCRY3 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 1-191686); pAJ655, pAJ611, et pAJ1844 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 58-192900) ; pCG1 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-134500) ; pCG2 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 58-35197) ; pCG4 et pCG11 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 57-183799) ; pVK7 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 10-215883) ; pVK9 (US2006-0141588) ; pVC7 (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 9-070291); pVS7 (WO2013/069634).
[0177]
Lorsqu’un gène est introduit, il est suffisant que le gène soit abrité de manière exprimable par un hôte. Spécifiquement, il est suffisant que le gène soit abrité par un hôte de sorte qu’il soit exprimé sous le contrôle d’un promoteur qui fonctionne chez l’hôte. Le promoteur n’est pas particulièrement limité tant qu’il fonctionne chez l’hôte. Le terme « promoteur qui fonctionne chez un hôte >> fait référence à un promoteur qui montre une activité promotrice chez l’hôte. Le promoteur peut être un promoteur dérivé de l’hôte, ou un promoteur hétérogène. Le promoteur peut être le promoteur natif du gène devant être introduit, ou un promoteur d’un autre gène. En tant que promoteur, par exemple, un tel promoteur plus puissant tel que mentionné plus loin peut également être utilisé.
[0178]
Un terminateur pour la terminaison de la transcription d’un gène peut être localisé en aval du gène. Le terminateur n’est pas particulièrement limité tant qu’il fonctionne chez l’hôte. Le terminateur peut être un terminateur dérivé de l’hôte, ou un terminateur hétérogène. Le terminateur peut être le terminateur natif du gène devant être introduit, ou un terminateur d’un autre gène. Des exemples spécifiques du terminateur comprennent, par exemple, le terminateur T7, le terminateur T4, le terminateur du phage fd, le terminateur tet, et le terminateur trpA [0179]
Des vecteurs, promoteurs, et terminateurs disponibles dans divers micro-organismes sont décrits en détail dans « Fundamental Microbiology Vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987 », et ceux-ci peuvent être utilisés.
[0180]
En outre, lorsque deux des gènes ou plus sont introduits, il est suffisant que les gènes soient chacun abrités de manière exprimable par l’hête. Par exemple, tous les gènes peuvent être portés par un seul vecteur d’expression ou un chromosome. En outre, les gènes peuvent être séparément portés par deux vecteurs d’expression ou plus, ou être séparément portés par un seul ou deux vecteurs d’expression ou plus et un chromosome. Un opéron constitué de deux gènes ou plus peut également être introduit. Le cas d’une « introduction de deux gènes ou plus » comprend, par exemple, des cas d’introduction de gènes respectifs codant pour deux types de protéines ou plus (telles que des enzymes), l’introduction de gènes respectifs codant pour deux sous-unités ou plus constituant un seul complexe protéique (comme un complexe enzymatique), et une combinaison des susdits cas.
[0181]
Le gène devant être introduit n’est pas particulièrement limité tant qu’il code pour une protéine qui fonctionne chez l’hôte. Le gène devant être introduit peut être un gène dérivé de l’hôte, ou peut être un gène hétérogène. Le gène devant être introduit peut être obtenu, par exemple, par PCR en utilisant des amorces conçues en se basant sur la séquence de nucléotides du gène, et en utilisant l’ADN génomique d’un organisme possédant le gène, d’un plasmide portant le gène, ou analogue, en tant que matrice. Le gène devant être introduit peut également être totalement synthétisé, par exemple, en se basant sur la séquence de nucléotides du gène (Gene, 60(1), 115-127 (1987)). Le gène obtenu peut être utilisé tel quel, ou après avoir été modifié tel que requis. Un gène peut être modifié par une technique connue. Par exemple, une mutation cible peut être introduite dans un site cible d’un ADN par le procédé de mutagenèse dirigée. Gest-à-dire que la région codante d’un gène peut être modifiée par le procédé de mutagenèse dirigée de sorte qu’un site spécifique de la protéine codée comprenne une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de résidus d’acides aminés. Des exemples du procédé de mutagenèse dirigée comprennent le procédé utilisant une PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989) ; Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)), et le procédé utilisant un phage (Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987) ; Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
[0182]
En conséquence, lorsqu’une protéine fonctionne comme un complexe consistant en une pluralité de sous-unités, une partie ou l’intégralité de la pluralité de sous-unités peut être modifiée, tant que l’activité de la protéine est en fin de compte augmentée. Cest-à-dire, par exemple, que lorsque l’activité d’une protéine est augmentée en augmentant l’expression d’un gène, l’expression d’une partie ou de l’intégralité de la pluralité de gènes qui codent pour les sous-unités peut être améliorée. Il est généralement préférable d’améliorer l’expression de l’intégralité de la pluralité des gènes codant pour les sous-unités. En outre, les sous-unités constituant le complexe peuvent être dérivées d’un seul type d’organisme ou de deux types d’organismes ou plus, tant que le complexe possède une fonction de la protéine cible. Cest-à-dire, par exemple, que des gènes du même organisme codant pour une pluralité de sous-unités peuvent être introduits chez un hôte, ou que des gènes de différents organismes codant pour une pluralité de sous-unités peuvent être introduits chez un hôte.
[0183]
En outre, l’expression d’un gène peut être augmentée en améliorant l’efficacité de la transcription du gène. De plus, l’expression d’un gène peut également être augmentée en améliorant l’efficacité de la traduction du gène. L’efficacité de la transcription du gène et l’efficacité de la traduction du gène peuvent être améliorées, par exemple, en modifiant une séquence de contrôle de l’expression du gène. Le terme « séquence de contrôle de l’expression >> fait collectivement référence à des sites qui affectent l’expression d’un gène. Des exemples de la séquence de contrôle de l’expression comprennent, par exemple, un promoteur, une séquence Shine-Dalgarno (SD) (également désignée site de fixation du ribosome (RBS)), et une région espaceur entre le RBS et le codon d’initiation. Des séquences de contrôle de l’expression peuvent être identifiées en utilisant un vecteur de recherche de promoteur ou un logiciel d’analyse de gène tel que GENETYX. Ces séquences de contrôle de l’expression peuvent être modifiées, par exemple, par un procédé utilisant un vecteur sensible à la température, ou le procédé d’intégration dirigé par Red (W02005/010175).
[0184]
L’efficacité de la transcription d’un gène peut être améliorée, par exemple, en remplaçant le promoteur du gène sur un chromosome par un promoteur plus puissant. Le terme « promoteur plus puissant >> fait référence à un promoteur qui permet d’obtenir une transcription améliorée d’un gène par comparaison à un promoteur de type sauvage du gène existant de manière inhérente. Des exemples de promoteurs plus puissants comprennent, par exemple, les promoteurs d’expression élevée connus tels que le promoteur T7, le promoteur trp, le promoteur lac, le promoteur thr, le promoteur tac, le promoteur trc, le promoteur tet, le promoteur araBAD, le promoteur rpoH, le promoteur msrA, le promoteur Pm1 (dérivé du genre Bifidobacteriurri), le promoteur PR, et le promoteur PL. Des exemples de promoteurs plus puissants pouvant être utilisés dans des bactéries corynéformes comprennent, par exemple, le promoteur P546 modifié de manière artificielle (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)), les promoteurs pta, aceA, aceB, adh, et 5/77/Finductibles dans les bactéries corynéformes avec de l’acide acétique, de l’éthanol, de l’acide pyruvique, ou analogues, les promoteurs cspB, SOD, et tuf (EF-Tu), qui sont de puissants promoteurs capables d’entraîner une quantité d’expression importante dans des bactéries corynéformes (Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323; Appl. Environ. Microbiol., décembre 2005 ; 71 (12):8587-96), ainsi que le promoteur tac, le promoteur tac, et le promoteur trc. En outre, en tant que promoteur plus puissant, un type hautement actif de promoteur existant peut également être obtenu en utilisant divers gènes rapporteurs. Par exemple, en faisant en sorte que les régions -35 et -10 d’une région de promoteur soient plus proches de la séquence consensus, l’activité du promoteur peut être améliorée (WO00/18935). Des exemples de promoteur de type hautement actif comprennent divers promoteurs de type tac (Katashkina Jl et al., demande de brevet de la Fédération de Russie n° 2006134574) et le promoteur pntp8 (WO2010/027045). Des procédés pour évaluer la puissance de promoteurs et des exemples de puissants promoteurs sont décrits dans l’article de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), et ainsi de suite.
[0185]
L’efficacité de la traduction d’un gène peut être améliorée, par exemple, en remplaçant la séquence Shine-Dalgarno (SD) (également désignée site de fixation du ribosome (RBS)) du gène sur un chromosome par une séquence SD plus puissante. La « séquence SD plus puissante >> désigne une séquence SD qui permet d’obtenir une traduction améliorée d’un ARNm par comparaison à la séquence SD de type sauvage du gène existant de manière inhérente. Des exemples de séquences SD plus puissantes comprennent, par exemple, le RBS du gène 10 dérivé du phage T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). En outre, on sait qu’une substitution, insertion, ou délétion de plusieurs nucléotides dans une région espaceur entre un RBS et le codon d’initiation, particulièrement dans une séquence immédiatement en amont du codon d’initiation (UTR5’), affecte significativement la stabilité et l’efficacité de la traduction d’un ARNm et, par conséquent, l’efficacité de la traduction d’un gène peut également être améliorée en les modifiant.
[0186]
L’efficacité de la traduction d’un gène peut également être améliorée, par exemple, en modifiant des codons. Par exemple, l’efficacité de la traduction du gène peut être améliorée en remplaçant un codon rare présent dans le gène par un codon synonyme utilisé plus fréquemment. Cest-à-dire que le gène devant être introduit peut être modifié, par exemple, de sorte à contenir des codons optimaux en fonction des fréquences des codons observées chez un hôte devant être utilisé. Des codons peuvent être remplacés, par exemple, par le procédé de mutagenèse dirigée. En variante, un fragment de gène dans lequel des codons cibles sont remplacés peut être totalement synthétisé. Les fréquences des codons dans divers organismes sont décrites dans la « Codon Usage Database >> (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
[0187]
En outre, l’expression d’un gène peut également être augmentée en amplifiant un régulateur qui augmente l’expression du gène, ou en supprimant ou en atténuant un régulateur qui réduit l’expression du gène. [0188]
De tels procédés pour augmenter l’expression d’un gène tel que susmentionné peuvent être utilisés indépendamment ou en une combinaison arbitraire.
[0189]
En outre, la modification qui augmente l’activité d’une protéine peut également être obtenue, par exemple, en améliorant l’activité spécifique de l’enzyme. Une amélioration de l’activité spécifique comprend également une désensibilisation à la rétro-inhibition. Cest-à-dire que lorsqu’une protéine est sensible à une rétro-inhibition par un métabolite, l’activité de la protéine peut être augmentée en faisant en sorte que la bactérie abrite un gène codant pour une protéine mutante qui a été désensibilisée à la rétro-inhibition. Dans la présente invention, le terme « désensibilisation à la rétro-inhibition >> comprend une élimination complète de la rétroinhibition, et une atténuation de la rétro-inhibition, sauf indication contraire. De plus, un état de « désensibilisation à la rétro-inhibition >>, c’est-à-dire un état selon lequel la rétro-inhibition est éliminée ou atténuée, peut également être désigné « tolérance à la rétro-inhibition >>. Une protéine montrant une activité spécifique améliorée peut être obtenue, par exemple, par une recherche de divers organismes. En outre, un type hautement actif d’une protéine existante peut également être obtenu en introduisant une mutation dans la protéine existante. La mutation devant être introduite peut être, par exemple, une substitution, une délétion, une insertion, ou une addition d’un ou de plusieurs résidus d’acides aminés au niveau d’une ou de plusieurs positions de la protéine. La mutation peut être introduite, par exemple, par un tel procédé de mutagenèse dirigée tel que mentionné ci-dessus. La mutation peut également être introduite, par exemple, par un traitement de mutagenèse. Des exemples du traitement de mutagenèse comprennent une irradiation de rayons X, une irradiation d’ultraviolets, et un traitement avec un agent mutagène tel que la N-méthyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), et le méthanesulfonate de méthyle (MMS). En outre, une mutation aléatoire peut être induite en traitant directement un ADN in vitro avec de l’hydroxylamine. Une amélioration de l’activité spécifique peut être indépendamment utilisée, ou peut être utilisée en une combinaison arbitraire avec de tels procédés d’amélioration de l’expression d’un gène tels que mentionnés ci-dessus.
[0190]
Le procédé de transformation n’est pas particulièrement limité, et des procédés conventionnellement connus peuvent être utilisés. On peut utiliser, par exemple, un procédé de traitement de cellules receveuses avec du chlorure de calcium afin d’augmenter leur perméabilité pour l’ADN, qui a été rapporté pour la souche Escherichia coliK-12 ((Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162), et un procédé de préparation de cellules compétentes à partir de cellules qui sont en phase de croissance, suivi d’une transformation avec un ADN, qui a été rapporté pour Baciiius subtiiis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. et Young, F.E., Gene, 1977, 1:153-167). En variante, on peut également utiliser un procédé de fabrication de cellules receveuses d’ADN dans des protoplastes ou des sphéroplastes, qui peuvent facilement incorporer un ADN recombinant, suivi de l’introduction d’un ADN recombinant dans les cellules receveuses d’ADN, qui est connu pour être applicable à Baciiius subtiiis, aux actinomycètes, et aux levures (Chang, S. et Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. et Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398-400 ; Hinnen, A., Hicks, J.B. et Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933). En outre, le procédé utilisant des impulsions électriques rapporté pour des bactéries corynéformes (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 2-207791) peut également être utilisé.
[0191]
Une augmentation de l’activité d’une protéine peut être confirmée en mesurant l’activité de la protéine.
[0192]
Une augmentation de l’activité d’une protéine peut également être confirmée en confirmant une augmentation de l’expression d’un gène codant pour la protéine. Une augmentation de l’expression d’un gène peut être confirmée en confirmant une augmentation de la quantité de transcription du gène, ou en confirmant une augmentation de la quantité d’une protéine exprimée à partir du gène.
[0193]
Une augmentation de la quantité de transcription d’un gène peut être confirmée en comparant la quantité d’ARNm transcrit à partir du gène avec celle d’une souche non modifiée telle qu’une souche de type sauvage ou une souche parentale. Des exemples du procédé pour évaluer la quantité d’ARNm comprennent une hybridation de Northern, une RT-PCR, et ainsi de suite (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Troisième édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (États-Unis), 2001). La quantité d’ARNm peut augmenter, par exemple, de 1,5 fois ou plus, 2 fois ou plus, ou 3 fois ou plus par rapport à celle d’une souche non modifiée.
[0194]
Une augmentation de la quantité d’une protéine peut être confirmée par un transfert de Western en utilisant des anticorps (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (États-Unis), 2001). La quantité de la protéine (comme le nombre de molécules de la protéine par cellule) peut augmenter, par exemple, de
1,5 fois ou plus, 2 fois ou plus, ou 3 fois ou plus par rapport à celle d’une souche non modifiée.
[0195]
Les procédés susmentionnés pour augmenter l’activité d’une protéine peuvent être utilisés pour l’amélioration des activités de protéines arbitraires telles que des enzymes de biosynthèse d’acide L-aminé, et l’amélioration de l’expression de gènes arbitraires tels que des gènes codant pour ces protéines arbitraires, en plus de l’amélioration de l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4.
[0196] <1-4> Procédé pour réduire l’activité d’une protéine
Ci-après, les procédés pour réduire l’activité d’une protéine vont être expliqués.
[0197]
L’expression « l’activité d’une protéine est réduite >> signifie que l’activité de la protéine est réduite par comparaison à une souche non modifiée. Spécifiquement, l’expression « l’activité d’une protéine est réduite >> signifie que l’activité de la protéine par cellule est réduite par comparaison à celle d’une souche non modifiée. Le terme « souche non modifiée >> utilisé dans la présente fait référence à une souche de contrôle qui n’a pas été modifiée de sorte que l’activité d’une protéine cible soit réduite. Des exemples de la souche non modifiée comprennent une souche de type sauvage et une souche parentale. Des exemples spécifiques de la souche non modifiée comprennent les souches de type respectif des espèces de bactéries. Des exemples spécifiques de la souche non modifiée comprennent également des souches exemplifiées ci-dessus par rapport à la description des bactéries. Cest-à-dire que, dans un mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut être réduite par comparaison à une souche de type, c’est-à-dire la souche de type de l’espèce à laquelle la bactérie de la présente invention appartient. Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être réduite par comparaison à la souche C. glutamicum ATCC 13032. Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être réduite par comparaison à la souche C. glutamicum 2256 (ATCC 13869). Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être réduite par comparaison à la souche E coii K-12 MG1655. Dans un autre mode de réalisation, l’activité d’une protéine peut également être réduite par comparaison à la souche P. ananatis AJ13355. L’état selon lequel « l’activité d’une protéine est réduite » comprend également un état selon lequel l’activité de la protéine a complètement disparu. Plus spécifiquement, l’expression « l’activité d’une protéine est réduite » peut signifier que le nombre de molécules de la protéine par cellule est réduit, et/ou que la fonction de chaque molécule de la protéine est réduite par comparaison à celles d’une souche non modifiée. Cest-à-dire que le terme « activité » dans l’expression « l’activité d’une protéine est réduite » n’est pas limité à l’activité catalytique de la protéine, mais peut également désigner la quantité de transcription d’un gène (c’est-à-dire la quantité d’ARNm) codant pour la protéine ou la quantité de traduction de la protéine (c’est-à-dire la quantité de la protéine). L’état selon lequel « le nombre de molécules de la protéine par cellule est réduit » comprend également un état selon lequel la protéine n’existe pas du tout. L’état selon lequel « la fonction de chaque molécule de la protéine est réduite » comprend également un état selon lequel la fonction de chaque molécule de protéine a complètement disparu. Le degré de réduction de l’activité d’une protéine n’est pas particulièrement limité, tant que l’activité est réduite par comparaison à celle d’une souche non modifiée. L’activité d’une protéine peut être réduite, par exemple, à 50 % ou moins, 20 % ou moins, 10 % ou moins, 5 % ou moins, ou 0 % de celle d’une souche non modifiée.
[0198]
La modification pour réduire l’activité d’une protéine peut être obtenue, par exemple, en réduisant l’expression d’un gène codant pour la protéine. L’expression « l’expression d’un gène est réduite » signifie que l’expression du gène est réduite par comparaison à une souche non modifiée telle qu’une souche de type sauvage et une souche parentale. Spécifiquement, l’expression « l’expression d’un gène est réduite >> signifie que l’expression du gène par cellule est réduite par comparaison à celle d’une souche non modifiée. Plus spécifiquement, l’expression « l’expression d’un gène est réduite >> peut signifier que la quantité de transcription du gène (c’est-à-dire la quantité d’ARNm) est réduite, et/ou que la quantité de traduction du gène (c’est-à-dire la quantité de la protéine exprimée à partir du gène) est réduite. L’état selon lequel « l’expression d’un gène est réduite >> comprend également un état selon lequel le gène n’est pas exprimé du tout. L’état selon lequel « l’expression d’un gène est réduite >> est également désigné « l’expression d’un gène est atténuée >>. L’expression d’un gène peut être réduite, par exemple, à 50 % ou moins, 20 % ou moins, 10 % ou moins, 5 % ou moins, ou 0 % de celle d’une souche non modifiée.
[0199]
La réduction de l’expression d’un gène peut être due, par exemple, à une réduction de l’efficacité de la transcription, une réduction de l’efficacité de la traduction, ou une combinaison de celles-ci. L’expression d’un gène peut être réduite en modifiant une séquence de contrôle de l’expression du gène comme un promoteur, une séquence Shine-Dalgarno (SD) (également désignée site de fixation du ribosome (RBS)), et une région espaceur entre le RBS et le codon d’initiation du gène. Lorsqu’une séquence de contrôle de l’expression est modifiée, de préférence un ou plusieurs nucléotides, de manière davantage préférée deux nucléotides ou plus, particulièrement de préférence trois nucléotides ou plus, de la séquence de contrôle de l’expression sont modifiés. Par exemple, l’efficacité de la transcription d’un gène peut être réduite, par exemple, en remplaçant le promoteur du gène sur un chromosome par un promoteur plus faible. Le terme « promoteur plus faible >> désigne un promoteur entraînant une transcription atténuée d’un gène par comparaison à un promoteur de type sauvage du gène existant de manière inhérente. Des exemples de promoteurs plus faibles comprennent, par exemple, des promoteurs inductibles. Cest-à-dire qu’un promoteur inductible peut fonctionner comme un promoteur plus faible dans une condition non induite, tel qu’en l’absence de l’inducteur correspondant. En outre, une partie ou l’intégralité d’une séquence de contrôle de l’expression peut être supprimée. L’expression d’un gène peut également être réduite, par exemple, en manipulant un facteur responsable du contrôle de l’expression. Des exemples du facteur responsable du contrôle de l’expression comprennent des petites molécules responsables du contrôle de la transcription ou de la traduction (inducteurs, inhibiteurs, etc.), des protéines responsables du contrôle de la transcription ou de la traduction (facteur de transcription, etc.), des acides nucléiques responsables du contrôle de la transcription ou de la traduction (ARNsi, etc.), et ainsi de suite. En outre, l’expression d’un gène peut également être réduite, par exemple, en introduisant une mutation qui réduit l’expression du gène dans la région codante du gène. Par exemple, l’expression d’un gène peut être réduite en remplaçant un codon dans la région codante du gène par un codon synonyme utilisé moins fréquemment dans un hôte. En outre, par exemple, l’expression d’un gène peut être réduite en raison d’une perturbation d’un gène tel que décrit plus loin.
[0200]
La modification pour réduire l’activité d’une protéine peut également être obtenue, par exemple, en perturbant un gène codant pour la protéine. L’expression « un gène est perturbé >> signifie qu’un gène est modifié de sorte qu’une protéine qui peut normalement fonctionner n’est pas produite. L’état selon lequel « une protéine qui normalement fonctionne n’est pas produite >> comprend un état selon lequel la protéine n’est pas produite du tout à partir du gène, et un état selon lequel la protéine dont la fonction (comme une activité ou une propriété) par molécule est réduite ou éliminée est produite à partir du gène.
[0201]
La perturbation d’un gène peut être obtenue, par exemple, par une délétion du gène sur un chromosome. Le terme « délétion d’un gène >> fait référence à la délétion d’une région partielle ou entière de la région codante du gène. En outre, l’intégralité d’un gène comprenant des séquences en amont et en aval de la région codante du gène sur un chromosome peut être supprimée. La région devant être supprimée peut être une région quelconque, comme une région N-terminale (région codant pour une région N-terminale d’une protéine), une région interne, ou une région C-terminale (région codant pour une région C-terminale d’une protéine), tant que l’activité de la protéine peut être réduite. La délétion d’une région plus longue peut généralement plus certainement inactiver le gène. La région devant être supprimée peut être, par exemple, une région possédant une longueur de 10 % ou plus, 20 % ou plus, 30 % ou plus, 40 % ou plus, 50 % ou plus, 60 % ou plus, 70 % ou plus, 80 % ou plus, 90 % ou plus, ou 95 % ou plus de la longueur totale de la région codante du gène. En outre, il est préférable que les cadres de lecture des séquences en amont et en aval de la région devant être supprimée ne soient pas les mêmes. Une non-correspondance des cadres de lecture peut provoquer un décalage du cadre de lecture en aval de la région devant être supprimée.
[0202]
La perturbation d’un gène peut également être obtenue, par exemple, en introduisant une mutation pour une substitution d’acide aminé (mutation faux-sens), un codon stop (mutation non-sens), une addition ou la délétion d’un ou de deux résidus de nucléotides (mutation de décalage du cadre de lecture), ou analogue dans la région codante du gène sur un chromosome (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997) ; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 55115515 (1998) ; Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).
[0203]
La perturbation d’un gène peut également être obtenue, par exemple, en insérant une autre séquence de nucléotides dans une région codante du gène sur un chromosome. Le site de l’insertion peut être dans une quelconque région du gène, et l’insertion d’une séquence de nucléotides plus longue peut généralement plus certainement inactiver le gène. Il est préférable que les cadres de lecture des séquences en amont et en aval du site d’insertion ne soient pas les mêmes. Une noncorrespondance des cadres de lecture peut provoquer un décalage du cadre de lecture en aval de la région devant être supprimée. L’autre séquence de nucléotides n’est pas particulièrement limitée tant qu’une séquence qui réduit ou élimine l’activité de la protéine codée est choisie, et des exemples de celle-ci comprennent, par exemple, un gène marqueur tel que des gènes de résistance aux antibiotiques, et un gène utile pour la production d’une substance cible.
[0204]
Particulièrement, la perturbation d’un gène peut être réalisée de sorte que la séquence d’acides aminés de la protéine codée soit supprimée. En d’autres termes, la modification pour réduire l’activité d’une protéine peut être obtenue, par exemple, en supprimant la séquence d’acides aminés de la protéine, spécifiquement en modifiant un gène de sorte à coder pour une protéine dont la séquence d’acides aminés est supprimée. Le terme « délétion de la séquence d’acides aminés d’une protéine >> fait référence à la délétion d’une région partielle ou entière de la séquence d’acides aminés de la protéine. De plus, le terme « délétion de la séquence d’acides aminés d’une protéine >> signifie que la séquence d’acides aminés originale disparaît dans la protéine, et comprend également les cas dans lesquels la séquence d’acides aminés originale est modifiée en une autre séquence d’acides aminés. Cest-à-dire, par exemple, qu’une région qui a été modifiée en une autre séquence d’acides aminés par un décalage du cadre de lecture peut être considérée comme une région supprimée. Lorsque la séquence d’acides aminés d’une protéine est supprimée, la longueur totale de la protéine est typiquement raccourcie, mais il peut également exister des cas dans lesquels la longueur totale de la protéine n’est pas modifiée ou est allongée. Par exemple, par la délétion d’une région partielle ou entière de la région codante d’un gène, une région codée par la région supprimée peut être supprimée dans la protéine codée. De plus, par exemple, par l’introduction d’un codon stop dans la région codante d’un gène, une région codée par la région en aval du site d’introduction peut être supprimée dans la protéine codée. De plus, par exemple, par un décalage du cadre de lecture dans la région codante d’un gène, une région codée par la région de décalage du cadre de lecture peut être supprimée dans la protéine codée. Les descriptions susmentionnées concernant la position et la longueur de la région devant être supprimée dans la délétion d’un gène peuvent être appliquées mutatis mutandis à la position et à la longueur de la région devant être supprimée dans la délétion de la séquence d’acides aminés d’une protéine.
[0205]
Une telle modification d’un gène sur un chromosome tel que décrit ci-dessus peut être obtenue, par exemple, en préparant un gène de type perturbation modifié de sorte qu’il soit incapable de produire une protéine qui normalement fonctionne, et en transformant un hôte avec un ADN recombinant contenant le gène de type perturbation afin de provoquer une recombinaison homologue entre le gène de type perturbation et le gène de type sauvage sur un chromosome et d’ainsi substituer le gène de type perturbation au gène de type sauvage sur le chromosome. Dans cette procédure, si un gène marqueur sélectionné en fonction des caractéristiques de l’hôte, comme une auxotrophie, est inclus dans l’ADN recombinant, l’opération devient plus simple. Des exemples du gène de type perturbation comprennent un gène dont une région partielle ou entière de la région codante est supprimée, un gène comprenant une mutation faux-sens, un gène comprenant une mutation non-sens, un gène comprenant une mutation de décalage du cadre de lecture, et un gène dans lequel une séquence d’insertion comme un transposon ou un gène marqueur a été introduite. La protéine codée par le gène de type perturbation possède une conformation différente de celle de la protéine de type sauvage, même si elle est produite et, ainsi, sa fonction est réduite ou éliminée. Une telle perturbation de gène basée sur la substitution d’un gène en utilisant une recombinaison homologue a déjà été établie, et il existe des procédés utilisant ADN linéaire tel qu’un procédé appelé « Intégration dirigée par Red >> Datsenko, K.A, et Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), et un procédé utilisant l’intégration dirigée par Red en combinaison avec un système d’excision dérivé du phage · (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (se reporter à W02005/010175), un procédé utilisant un plasmide comportant une origine de réplication sensible à la température, un procédé utilisant un plasmide capable de transfert par conjugaison, un procédé utilisant un vecteur suicide ne comportant pas d’origine de réplication qui fonctionne dans un hôte (brevet U.S. n° 6 303 383), brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 05-007491), et ainsi de suite.
[0206]
Une modification pour réduire l’activité d’une protéine peut également être obtenue, par exemple, par un traitement de mutagenèse. Des exemples du traitement de mutagenèse comprennent une irradiation de rayons X ou d’ultraviolets et un traitement avec un agent mutagène tel que la N-méthyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), et le méthanesulfonate de méthyle (MMS).
[0207]
De tels procédés pour réduire l’activité d’une protéine tels que mentionnés ci-dessus peuvent être utilisés indépendamment ou en une combinaison arbitraire.
[0208]
Lorsqu’une protéine fonctionne comme un complexe consistant en une pluralité de sous-unités, une partie ou l’intégralité de la pluralité de sous-unités peut être modifiée, tant que l’activité de la protéine est en fin de compte réduite. Gest-à-dire, par exemple, qu”une partie ou l’intégralité d’une pluralité de gènes qui codent pour les sous-unités respectives peut être perturbée ou analogue. En outre, lorsqu’il existe une pluralité d’isozymes d’une protéine, une partie ou l’intégralité des activités de la pluralité d’isozymes peut être réduite, tant que l’activité de la protéine est en fin de compte réduite. Gest-à-dire, par exemple, qu’une partie ou l’intégralité d’une pluralité de gènes qui codent pour les isozymes respectives peut être perturbée ou analogue.
[0209]
Une réduction de l’activité d’une protéine peut être confirmée en mesurant l’activité de la protéine.
[0210]
Une réduction de l’activité d’une protéine peut également être confirmée en confirmant une réduction de l’expression d’un gène codant pour la protéine. Une réduction de l’expression d’un gène peut être confirmée en confirmant une réduction de la quantité de transcription du gène ou une réduction de la quantité de la protéine exprimée à partir du gène.
[0211]
Une réduction de la quantité de transcription d’un gène peut être confirmée en comparant la quantité d’ARNm transcrit à partir du gène avec celle d’une souche non modifiée. Des exemples du procédé pour évaluer la quantité d’ARNm comprennent une hybridation de Northern, une RT-PCR, et ainsi de suite (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (États-Unis), 2001). La quantité d’ARNm est de préférence réduite, par exemple, à 50 % ou moins, 20 % ou moins, 10 % ou moins, 5 % ou moins, ou 0 % de celle d’une souche non modifiée.
[0212]
Une réduction de la quantité d’une protéine peut être confirmée par un transfert de Western en utilisant des anticorps (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (États-Unis), 2001). La quantité de la protéine (comme le nombre de molécules de la protéine par cellule) est de préférence réduite, par exemple, à 50 % ou moins, 20% ou moins, 10% ou moins, 5% ou moins, ou 0% de celle d’une souche non modifiée.
[0213]
La perturbation d’un gène peut être confirmée en déterminant la séquence de nucléotides d’une partie ou de l’intégralité du gène, une cartographie d’enzymes de restriction, la pleine longueur, ou analogue, du gène en fonction du moyen utilisé pour la perturbation.
[0214]
Les procédés susmentionnés pour réduire l’activité d’une protéine peuvent tels que mentionnés ci-dessus peuvent être appliqués à la réduction des activités de protéines arbitraires comme une enzyme qui catalyse une réaction qui s’éloigne de la voie de biosynthèse d’un acide Laminé cible pour générer un composé autre que l’acide L-aminé cible, et la réduction de l’expression de gènes arbitraires tels que des gènes codant pour ces protéines arbitraires.
[0215] <2> Procédé de production d’acide L-aminé de la présente invention
Le procédé de la présente invention est un procédé de production d’un acide L-aminé comprenant la mise en culture de la bactérie de la présente invention dans un milieu pour accumuler un acide L-aminé dans le milieu et/ou les cellules de la bactérie, et la collecte de l’acide L-aminé à partir du milieu et/ou des cellules de la bactérie. L’acide L-aminé produit dans la présente invention est un acide L-aminé autre que l’acide Laspartique. Dans la présente invention, un type d’acide L-aminé peut être produit, ou deux types d’acides L-aminés ou plus peuvent être produits. [0216]
Le milieu devant être utilisé n’est pas particulièrement limité, tant que la bactérie de la présente invention peut proliférer dans celui-ci, et qu’un acide L-aminé cible peut être produit. En tant que milieu, par exemple, un milieu classique utilisé pour la culture de bactéries telles que des bactéries corynéformes et des bactéries Enterobacteriaceae peut être utilisé. En tant que milieu, par exemple, un milieu contenant une source de carbone, une source d’azote, une source de phosphore, et une source de soufre, ainsi que des composants sélectionnés parmi divers autres composants organiques et composants inorganiques, tel que requis, peuvent être utilisés. Les types et les concentrations des composants du milieu peuvent être déterminés de manière appropriée en fonction de diverses conditions telles que le type de bactérie devant être utilisée.
[0217]
Des exemples spécifiques de la source de carbone comprennent, par exemple, des saccharides tels que le glucose, le fructose, le saccharose, le lactose, le galactose, le xylose, l’arabinose, des mélasses de cuisine, des hydrolysats d’amidons, et des hydrolysats de biomasse, des acides organiques tels que l’acide acétique, l’acide fumarique, l’acide citrique, et l’acide succinique, des alcools tels que le glycérol, le glycérol brut, et l’éthanol, et des acides aliphatiques. En tant que source de carbone, un matériel dérivé d’une plante peut être de préférence utilisé. Des exemples de la plante comprennent, par exemple, le maïs, le riz, le blé, le soja, la canne à sucre, la betterave, et le coton. Des exemples du matériel dérivé d’une plante comprennent, par exemple, des organes tels qu’une racine, une tige, un tronc, une branche, une feuille, une fleur, et une graine, les corps végétaux les comprenant, et des produits de décomposition de ces organes de plante. Les formes du matériel dérivé d’une plante au moment de son utilisation ne sont pas particulièrement limitées, et il peut être utilisé sous une forme quelconque, comme un produit non traité, un jus, un produit broyé, et un produit purifié. Des pentoses tels que le xylose, des hexoses tels que le glucose, ou des mélanges de ceux-ci, peuvent être obtenus à partir, par exemple, d’une biomasse végétale, et être utilisés. Spécifiquement, ces saccharides peuvent être obtenus en soumettant une biomasse végétale à un tel traitement comme un traitement à la vapeur, une hydrolyse avec un acide concentré, une hydrolyse avec un acide dilué, une hydrolyse avec une enzyme telle que la cellulase, et un traitement alcalin. Étant donné que l’hémicellulose est généralement plus facilement hydrolysée par comparaison à la cellulose, l’hémicellulose dans une biomasse végétale peut être hydrolysée à l’avance afin de libérer des pentoses, puis la cellulose peut être hydrolysée afin de générer des hexoses. En outre, du xylose peut être obtenu par une conversion à partir d’hexoses, par exemple, en conférant une voie pour convertir un hexose, tel que le glucose, en xylose pour la bactérie de la présente invention. En tant que source de carbone, un seul type de source de carbone peut être utilisé, ou deux types de sources de carbone ou plus peuvent être utilisés en combinaison.
[0218]
Des exemples spécifiques de la source d’azote comprennent, par exemple, des sels d’ammonium tels que le sulfate d’ammonium, le chlorure d’ammonium, et le phosphate d’ammonium, des sources d’azote organiques telles que la peptone, un extrait de levure, un extrait de viande, et des produits de décompositions de protéine de soja, l’ammoniac, et l’urée. De l’ammoniac gazeux ou de l’ammoniac aqueux utilisé pour ajuster le pH peut également être utilisé en tant que source d’azote. En tant que source d’azote, un seul type de source d’azote peut être utilisé, ou deux types de sources d’azote ou plus peuvent être utilisés en combinaison.
[0219]
Des exemples spécifiques de la source de phosphate comprennent, par exemple, des sels d’acide phosphorique comme le dihydrogénophosphate de potassium et l’hydrogénophosphate de dipotassium, et des polymères d’acide phosphorique comme l’acide pyrophosphorique. En tant que source de phosphate, un seul type de source de phosphate peut être utilisé, ou deux types de sources de phosphate ou plus peuvent être utilisés en combinaison.
[0220]
Des exemples spécifiques de la source de soufre comprennent, par exemple, des composés de soufre inorganiques tels que des sulfates, des thiosulfates, et des sulfites, et des acides aminés contenant du soufre tels que la cystéine, la cystine, et le glutathion. En tant que source de soufre, un seul type de source de soufre peut être utilisé, ou deux types de sources de soufre ou plus peuvent être utilisés en combinaison.
[0221]
Des exemples spécifiques de divers autres composants organiques et composants inorganiques comprennent, par exemple, des sels inorganiques tels que le chlorure de sodium et le chlorure de potassium ; des métaux traces tels que le fer, le manganèse, la magnésium, et le calcium; des vitamines telles que la vitamine B1, la vitamine B2, la vitamine B6, l’acide nicotinique, le nicotinamide, et la vitamine B12 ; des acides aminés ; des acides nucléiques ; et des composants organiques contenant ceux-ci tels que la peptone, un acide casaminé, un extrait de levure, et un produit de décomposition de protéine de soja. En tant que divers autres composants organiques et composants inorganiques, un seul type de composant peut être utilisé, ou deux types de composants ou plus peuvent être utilisés en combinaison.
[0222]
En outre, lorsqu’un mutant auxotrophe qui nécessite un acide aminé ou analogue pour sa croissance est utilisé, il est préférable de fournir un nutriment requis au milieu.
[0223]
En outre, il est également préférable, par exemple, de restreindre la quantité de biotine dans le milieu, ou d’ajouter un tensioactif ou de la pénicilline au milieu.
[0224]
Les conditions de culture ne sont pas particulièrement limitées tant que la bactérie de la présente invention peut proliférer, et qu’un acide Laminé cible peut être produit. La culture peut être réalisée, par exemple, dans des conditions classiques utilisées pour la culture de bactéries telles que des bactéries corynéformes et des bactéries Enterobacteriaceae. Les conditions de culture peuvent être définies de manière appropriée en fonction de diverses conditions telles que le type de bactérie devant être utilisée.
[0225]
La culture peut être réalisée en utilisant un milieu liquide. Au moment de la culture, la bactérie de la présente invention mise en culture sur un milieu solide tel qu’un milieu de gélose peut être directement inoculée dans un milieu liquide, ou la bactérie de la présente invention mise en culture dans un milieu liquide en tant que culture d’ensemencement peut être inoculée dans un milieu liquide pour la culture principale. Cest-à-dire que la culture peut être réalisée séparément en tant que culture d’ensemencement et culture principale. Dans un tel cas, les conditions de culture de la culture d’ensemencement et la culture principale peuvent être les mêmes ou non. La quantité de la bactérie de la présente invention contenue dans le milieu au moment du début de la culture n’est pas particulièrement limitée. La culture principale peut être réalisée, par exemple, en inoculant un bouillon de culture d’ensemencement dans un milieu pour la culture principale en une quantité de 1 à 50 % (v/v).
[0226]
La culture peut être réalisée sous forme de culture discontinue, culture discontinue alimentée, culture continue, ou une combinaison de celles-ci. Le milieu utilisé au moment du début de la culture est également désigne « milieu de départ >>. Le milieu fourni à un système de culture (cuve de fermentation) dans une culture discontinue alimentée ou une culture continue est également désigné « milieu d’alimentation >>. En outre, le fait de fournir un milieu d’alimentation à un système de culture dans une culture discontinue alimentée ou une culture continue est également désigné « alimentation >>. En outre, lorsque la culture est réalisée séparément en tant que culture d’ensemencement et culture principale, par exemple, à la fois la culture d’ensemencement et la culture principale peuvent être réalisées sous forme de culture discontinue. En variante, par exemple, la culture d’ensemencement peut être réalisée sous forme de culture discontinue, et la culture principale peut être réalisée sous forme de culture discontinue alimentée ou de culture continue.
[0227]
Dans la présente invention, les composants du milieu peuvent être chacun contenus dans le milieu de départ, le milieu d’alimentation, ou les deux. Les types des composants contenus dans le milieu de départ peuvent être les mêmes, ou non, que les types des composants contenus dans le milieu d’alimentation. La concentration de chaque composant contenu dans le milieu de départ peut être la même, ou non, que la concentration du composant contenu dans le milieu d’alimentation. En outre, deux types de milieux d’alimentation ou plus contenant différents types et/ou différentes concentrations de composants peuvent être utilisés. Par exemple, lorsque le milieu est alimenté par intermittence une pluralité de fois, les types et/ou concentrations des composants contenus dans le milieu d’alimentation peuvent être les mêmes, ou non, pour chaque alimentation.
[0228]
La concentration de la source de carbone dans le milieu n’est pas particulièrement limitée, tant que la bactérie de la présente invention peut proliférer et produire un acide L-aminé. La concentration de la source de carbone dans le milieu peut être aussi élevée que possible dans une plage telle que la production de l’acide L-aminé ne soit pas inhibée. La concentration de la source de carbone dans le milieu peut être, en tant que concentration initiale (la concentration dans le milieu de départ), par exemple, de 1 à 30 % (p/v), de préférence 3 à 10 % (p/v). En outre, la source de carbone peut être en outre fournie au milieu tel que requis. Par exemple, la source de carbone peut être en outre fournie au milieu proportionnellement à la consommation de la source de carbone accompagnant la progression de la fermentation.
[0229]
La culture peut être réalisée, par exemple, dans une condition aérobie. Le terme « condition aérobie >> fait référence à une condition dans laquelle la concentration en oxygène dissous dans le milieu liquide n’est pas moins de 0,33 ppm, qui est la limite de détection pour la détection avec une électrode à membrane pour l’oxygène, ou peut de préférence faire référence à une condition dans laquelle la concentration en oxygène dissous dans le milieu liquide n’est pas moins de 1,5 ppm. La concentration en oxygène peut être contrôlée, par exemple, à 5 à 50 %, de préférence environ 10%, de la concentration d’oxygène saturé. Spécifiquement, la culture dans une condition aérobie peut être réalisée par une culture sous aération, une culture sous mélange-agitation, une culture sous agitation, ou une combinaison de celles-ci. Le pH du milieu peut être, par exemple, de 3 à 10, de préférence 4,0 à 9,5. Pendant la culture, le pH du milieu peut être ajusté tel que requis. Le pH du milieu peut être ajusté en utilisant diverses substances alcalines et acides telles que l’ammoniac gazeux, l’ammoniac aqueux, le carbonate de sodium, le bicarbonate de sodium, le carbonate de potassium, le bicarbonate de potassium, le carbonate de magnésium, l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de calcium, et l’hydroxyde de magnésium. La température de la culture peut être, par exemple, de 20 à 45 °C, de préférence 25 à 37 °C. La période de culture peut être, par exemple, de 10 à 120 heures. La culture peut être poursuivie, par exemple, jusqu’à ce que la source de carbone contenue dans le milieu soit consommée, ou jusqu’à ce que la bactérie de la présente invention perde l’activité. Par une mise en culture de la bactérie de la présente invention dans ces conditions telles que décrites ci-dessus, un acide L-aminé est accumulé dans le milieu et/ou les cellules de la bactérie.
[0230]
De plus, lorsque de l’acide L-glutamique est produit, la culture peut être réalisée en utilisant un milieu liquide ajusté pour satisfaire à une condition dans laquelle l’acide L-glutamique est précipité, tout en précipitant l’acide L-glutamique dans le milieu. Des exemples de la condition dans laquelle l’acide L-glutamique est précipité comprennent, par exemple, un pH de 5,0 à 4,0, de préférence un pH de 4,5 à 4,0, de manière davantage préférée un pH de 4,3 à 4,0, particulièrement de préférence environ un pH 4,0 (EP1078989A).
[0231]
La production d’un acide L-aminé peut être confirmée par des procédés connus utilisés pour la détection ou l’identification de composés. Des exemples de tels procédés comprennent, par exemple, la HPLC, LC/MS, GC/MS, et RMN. Ces procédés peuvent être indépendamment utilisés, ou peuvent être utilisés en une combinaison appropriée.
[0232]
L’acide L-aminé produit peut être collecté à partir du bouillon de fermentation par des procédés connus utilisés pour la séparation et la purification de composés. Des exemples de tels procédés comprennent, par exemple, un procédé utilisant une résine échangeuse d’ions (Nagai, H. et al., Séparation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), une précipitation, une séparation sur membrane (brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 9-164323 et brevet japonais mis à l’inspection publique (Kokai) n° 9-173792), et une cristallisation (W02008/078448 et W02008/078646). Ces procédés peuvent être indépendamment utilisés, ou peuvent être utilisés en une combinaison appropriée. Lorsque l’acide L-aminé est accumulé dans les cellules de la bactérie, par exemple, les cellules peuvent être lysées avec des ondes ultrasonores ou analogue, un surnageant peut être obtenu en éliminant les cellules de la suspension contenant des cellules lysées par centrifugation, et l’acide L-aminé peut être collecté à partir du surnageant par le procédé utilisant une résine échangeuse d’ions ou analogue. L’acide
L-aminé devant être collecté peut être un composé libre, un sel de celui-ci, ou un mélange de ceux-ci. Des exemples du sel comprennent, par exemple, un sulfate, un hydrochlorure, un carbonate, un sel d’ammonium, un sel de sodium, et un sel de potassium. Lorsque de l’acide L-glutamique est produit, l’acide L-glutamique devant être collecté peut être spécifiquement, par exemple, de l’acide L-glutamique libre, du L-glutamate de sodium (L-glutamate monosodique, MSG), du L-glutamate d’ammonium, (L-glutamate monoammonique), ou un mélange de ceux-ci. Par exemple, du L-glutamate monosodique (MSG) peut être obtenu en ajoutant un acide au bouillon de fermentation afin de cristalliser le Lglutamate d’ammonium contenu dans celui-ci, puis en ajoutant une quantité équimolaire d’hydroxyde de sodium aux cristaux. De plus, une décoloration peut être réalisée en utilisant du charbon actif avant et/ou après la cristallisation (voir, Tetsuya KAWAKITA, « Industrial Crystallization for Monosodium L-Glutamate. », Bulletin of the Society of Sea Water Science, Japon, Vol.56:5). Le cristal de L-glutamate monosodique peut être utilisé, par exemple, en tant qu’assaisonnement umami. Le cristal de L-glutamate monosodique peut également être utilisé en tant qu’assaisonnement en combinaison avec un acide nucléique tel que la guanylate de sodium et l’inosinate de sodium, qui possèdent également un goût umami.
[0233]
Lorsque l’acide L-aminé est précipité dans le milieu, il peut être collecté par centrifugation, filtration, ou analogue. L’acide L-aminé précipité dans le milieu peut également être isolé avec l’acide L-aminé qui se dissout dans le milieu, après que l’acide L-aminé qui se dissout dans le milieu soit cristallisé.
[0234]
L’acide L-aminé collecté peut contenir des composants tels que des cellules bactériennes, des composants du milieu, de l’humidité, et des métabolites de produit secondaire de la bactérie en plus de l’acide Laminé. L’acide L-aminé collecté peut également être purifié à un degré souhaité. La pureté de l’acide L-aminé collecté peut être, par exemple, de 50 % (p/p) ou plus, de préférence 85 % (p/p) ou plus, particulièrement de préférence de 95% (p/p) ou plus (JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358,
USP6,238,714, et US2005/0025878).
Exemples [0235]
Ci-après, la présente invention va être expliquée de manière plus spécifique en se référant aux exemples. En revanche, la présente invention n’est pas limitée par ces exemples.
[0236]
Exemple : Culture de production d’acide glutamique en utilisant une souche de Corynebacterium glutamicum présentant une expression améliorée d’un gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4
Dans cet exemple, la production d’acide glutamique a été réalisée en utilisant une souche de C. glutamicum productrice d’acide glutamique dans laquelle un gène codant pour un transporteur d’acide dicarboxylique C4 possédant une capacité d’incorporation d’acide aspartique (Cg-dctA, Ec-dctA, Ec-dcuA, ou Ec-dcuB) a été introduit, et l’effet d’une expression améliorée du gène de transporteur d’acide dicarboxylique C4 sur la production d’acide glutamique a été évalué.
[0237] (1) Matériel
Le matériel utilisé dans cet exemple est le suivant.
[0238]
Tableau 1 <Amorces utilisées>
Amorce SEQ ID NO Séquence de nucléotides (5'· 3')
1 1 CCAAGCTTGCATGCCAGGAGGATTATAATGGATTCAAACACAGAATCTTC
2 2 CGGTACCCGGGGATCCTAGTGGTCTTCTTCTAACTCCAC
3 3 CCAAGCTTGCATGCCAGGAGGATTATAATGAAAACCTCTCTGTTTAAAAGCi
4 4 CGGTACCCGGGGATCTTAAGAGGATAATTCGTGCG
5 5 CCAAGCTTGCATGCCAGGAGGATTATAATGCTAGTTGTAGAACTCATCATAi
6 6 CGGTACCCGGGGATCTTACAGCATGAAGCTACCCAGCACG
7 7 CCAAGCTTGCATGCCAGGAGGATTATAATGTTATTTACTATCCAACTTATC
8 8 CGGTACCCGGGGATCTTATAAGAACCCGTACATCGCGGCG
[0239] < Plasmides utilisés>
pVK9 (KmR ; US2006-0141588) pVK9-Cg-dctA (KmR ; présente demande) pVK9-Ec-dctA (KmR ; présente demande) pVK9-Ec-dcuA (KmR ; présente demande) pVK9-Ec-dcuB (KmR ; présente demande) [0240]
2256· sucA· IdhA yggB*/pVK9-Cg-dctA (présente
2256· sucA· IdhA ygg B* / p VK9- Ec-dct A (présente
2256· sucA· IdhA ygg B* / pVK9- Ec-dcu A (présente
2256· sucA· IdhA ygg B* / p VK9- Ec-dcu B (présente
< Souches utilisées>
C. glutamicum 225Q· sucA· IdhA yggB* (WO2014/185430)
C. glutamicum 2256· sucA· IdhA yggB*/pVK9 (présente demande)
C. glutamicum demande)
C. glutamicum demande)
C. glutamicum demande)
C. glutamicum demande) [0241] (2) Construction de plasmides et de souches
Une PCR a été réalisée en utilisant l’ADN génomique de la souche
C. glutamicum 2256 (ATCC 13869) en tant que matrice, et les amorces 1 et 2, afin d’amplifier un fragment d’ADN contenant le gène dctA de C. glutamicum (Cg-dctA). Le fragment d’ADN obtenu et pVK9 (US20060141588) digéré avec BamR et Psi\ ont été mutuellement ligaturés en utilisant le kit de clonage ln-fusion HD de Clontech (TaKaRa Inc.), afin de construire pVK9-Cg-dctA, qui est un plasmide d’expression de Cg-dctA. [0242]
De la même manière, une PCR a été réalisée en utilisant l’ADN génomique de la souche E co//K-12 MG1655 (ATCC 47076) en tant que matrice, en combinaison avec les amorces 3 et 4 afin d’amplifier un fragment d’ADN contenant le gène dctA d’E coli (Ec-dctA), les amorces 5 et 6 afin d’amplifier un fragment d’ADN contenant le gène dcuA d’E coli (Ec-dcuA), et les amorces 7 et 8 afin d’amplifier un fragment d’ADN contenant le gène dcuB d’E coli (Ec-dcuB), et les fragments d’ADN obtenus ont chacun été ligaturés avec pVK9, afin de construire pVK9-EcdctA, pVK9-Ec-dcuA, et pVK9-Ec-dcuB, qui sont les plasmides d’expression de ces gènes.
[0243]
Les plasmides construits ont chacun été introduits dans la souche C. glutamicum 2256· sucA· IdhA yggB* (WO2014/185430), afin de construire des souches présentant une expression améliorer des gènes de transporteur d’acide dicarboxylique C4 respectifs. La souche 2256· sucA· IdhA yggB* est une souche productrice d’acide glutamique dérivée de la souche C. glutamicum 2256 (ATCC 13869). La souche 256· sucA· IdhA yggB* est déficiente en gènes IdhA et sucA, et comporte une mutation IS (V419::IS) dans le gène yggB. La séquence de nucléotides de ce gène yggB mutant (V419::IS) et la séquence d’acides aminés de la protéine YggB mutante (V419::IS) codée par le gène sont montrées dans SEQ ID NO: 11 et 12, respectivement.
[0244] (3) Culture de production d’acide glutamique
La culture de production d’acide glutamique a été réalisée en utilisant chaque souche. La composition du milieu utilisé est montrée dans le Tableau 2.
[0245]
Tableau 2 : Composition du milieu
Glucose 80 g/i
(NH4)2SO4 30 g/i
KH2PO4 1 g/i
MgSO4«7H2O 0,4 g/i
FeSO4«7H2O 0,01 g/i
MnSO4«5H2O 0,01 g/i
VB1 200 • g/l
Biotine 300 • g/l
Mameno 0,48 g/i
CaCO3 50 g/i
Acide succinique 1 gj
Le milieu de la composition susmentionnée ajusté à un pH 8,0 avec du KOH a été préparé, et a été stérilisé par autoclave (115 °C, 10 min). Du CaCCb stérilisé par chaleur sèche (180 °C, 6 heures) a été ajouté au milieu stérilisé à une concentration finale de 50 g/l, et a été utilisé pour la culture.
[0246]
Chaque souche a été inoculée dans 5 ml du milieu contenant 50 g/l de CaCO3 contenu dans un grand tube à essai, et a été mis en culture à
31,5 °C sous agitation à 120tr/min en utilisant un agitateur (ABLE ML190). À 18 heures après le début de la culture, le bouillon de culture a été échantillonné. Les concentrations d’acide glutamique et d’acide aspartique dans le bouillon de culture ont été quantifiées en utilisant un analyseur AS-310 de Biotech (SAKURA SI), et un analyseur d’acide aminé L-8800A (HITACHI), respectivement.
[0247]
Les résultats sont montrés sur la Rg. 1. L’accumulation d’acide glutamique (Glu) a été améliorée par une expression améliorée de CgdctA, Ec-dctA, Ec-dcuA, ou Ec-dcuB. De plus, une production secondaire d’acide aspartique a été réduite par une expression améliorée de Cg-dctA, Ec-dctA, Ec-dcuA, ou Ec-dcuB.
[0248]
Tel que décrit ci-dessus, même si un procédé de production d’un d’acide L-aminé utilisant une bactérie corynéforme présentant une expression améliorée du gène dctA a déjà été rapporté et que l’acide Lglutamique soit exemplifié en tant qu’acide L-aminé, le fait que de l’acide L-glutamique puisse être produit en utilisant la même bactérie n’a pas été démontré (document de brevet 3). À l’inverse, en considérant le fait qu’une protéine codée par un gène dctA possède une capacité d’incorporation d’acide L-glutamique (document non-brevet 4), l’homme du métier devrait prédire qu’une expression améliorée du gène dctA favorise l’incorporation d’acide L-glutamique dans des cellules, et ainsi la quantité d’accumulation d’acide L-glutamique dans un milieu est réduite. Cest-à-dire que l’homme du métier ne peut pas prédire que la production d’acide L-glutamique soit améliorée par une expression améliorée du gène dctA et, par conséquent, le document de brevet 3 ne décrit pas essentiellement un procédé de production d’acide L-glutamique utilisant une bactérie corynéforme présentant une expression améliorée du gène dctA. De plus, pour la même raison, il était difficile d’améliorer l’expression du gène dctA pour la production d’acide L-glutamique.
[0249]
En outre, bien qu’une protéine codée par le gène dctA possède une capacité d’incorporation d’acide L-glutamique (document non-brevet 4), une protéine codée par le gène yggB possède une capacité d’excrétion d’acide L-glutamique (document non-brevet 5). L’homme du métier ne peut pas prédire que l’utilisation du gène dctA et du gène yggB en combinaison, qui possèdent de telles fonctions contraires, soit utile pour la production d’acide L-glutamique et, par conséquent, il était également difficile d’utiliser le gène dctA et un gène yggB mutant en combinaison pour la production d’acide L-glutamique.
[0250]
Explication de la liste des séquences
SEQ ID NO:
1-8 : Amorces : Séquence de nucléotides du gène yggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) : Séquence d’acides aminés de la protéine YggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) : Séquence de nucléotides du gène yggB mutant (V419::IS) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) : Séquence d’acides aminés de la protéine codée par le gène yggB mutant (V419::IS) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) : Séquence de nucléotides du gène xfp de Bifidobacterium longum JCM1217 : Séquence d’acides aminés de la protéine Xfp de Bifidobacterium longum JCM1217
15: Séquence de nucléotides du gène dctA de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
16: Séquence d’acides aminés de la protéine DctA de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
17: Séquence de nucléotides du gène dctA d’Escherichia edi K-12 MG1655 18: Séquence d’acides aminés de la protéine DctA d’Escherichia edi K-12 MG1655
19: Séquence de nucléotides du gène dcuA d’Escherichia edi K-12 MG1655
20: Séquence d’acides aminés de la protéine DcuA d’Escherichia edi K-12 MG1655
21: Séquence de nucléotides du gène dcuB d’Escherichia edi K-12 MG1655
22: Séquence d’acides aminés de la protéine DcuB d’Escherichia edi K-12 MG1655

Claims (24)

  1. REVENDICATIONS
    1. Procédé de production d’un acide L-aminé, le procédé comprenant : la mise en culture d’une bactérie possédant une capacité de production d’acide L-aminé dans un milieu afin d’accumuler un acide Laminé dans le milieu et/ou les cellules de la bactérie ; et la collecte de l’acide L-aminé à partir du milieu et/ou des cellules, où la bactérie a été modifiée de sorte que l’activité d’un transporteur d’acide dicarboxylique C4 soit augmentée par comparaison à une souche non modifiée, où le transporteur d’acide dicarboxylique C4 consiste en un ou plusieurs types de protéines sélectionnés parmi des protéines codées par un gène dctA, un gène dcuA, et un gène dcuB, et où l’acide L-aminé est un acide L-aminé autre que l’acide Laspartique, à condition que l’acide L-aminé soit l’acide L-glutamique lorsque le transporteur d’acide dicarboxylique C4 est une protéine codée par un gène dctA.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le gène dctA est un gène codant pour une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
    (a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 16 ou 18 ;
    (b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 16 ou 18, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une activité d’incorporation d’acide L-aspartique ;
    (c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 16 ou 18, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le gène dcuA est un gène codant pour une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
    (a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 20 ;
    (b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 20, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une activité d’incorporation d’acide L-aspartique ;
    (c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 20, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique.
  4. 4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le gène dcuBest un gène codant pour une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné ci-dessous :
    (a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 22 ;
    (b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 22, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique ;
    (c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 22, et qui possède une activité d’incorporation d’acide aspartique.
  5. 5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’activité du transporteur d’acide dicarboxylique C4 est augmentée en augmentant l’expression d’un gène codant pour le transporteur d’acide dicarboxylique C4.
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l’expression du gène est augmentée en augmentant le nombre de copies du gène et/ou en modifiant une séquence de contrôle de l’expression du gène.
  7. 7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la bactérie a en outre été modifiée de sorte que l’activité de la phosphocétolase soit augmentée par comparaison à une souche non modifiée.
  8. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la phosphocétolase consiste en la D-xylulose-5-phosphate phosphocétolase et/ou la fructose6-phosphate phosphocétolase.
  9. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel l’activité de la phosphocétolase est augmentée en augmentant l’expression d’un gène codant pour la phosphocétolase.
  10. 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la bactérie est une bactérie corynéforme ou une bactérie appartenant à la famille Enterobacteriaceae.
  11. 11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la bactérie est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.
  12. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel la bactérie est Corynebacterium glutamicum.
  13. 13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la bactérie est une bactérie appartenant au genre Pantoea ou Escherichia.
  14. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la bactérie est Pantoea ananatis ou Escherichia coti.
  15. 15. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel l’acide L-aminé consiste en un acide L-aminé de la famille glutamate et/ou un acide L-aminé de la famille aspartate.
  16. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l’acide L-aminé de la famille glutamate consiste en un ou plusieurs acides L-aminés sélectionnés parmi l’acide L-glutamique, la L-glutamine, la L-proline, la L-arginine, la Lcitrulline, et la L-ornithine.
  17. 17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel l’acide Laminé de la famille glutamate est l’acide L-glutamique.
  18. 18. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 17, dans lequel l’acide L-glutamique est le L-glutamate monoammonique ou le Lglutamate monosodique.
  19. 19. Procédé selon l’une quelconque des revendications 15 à 18, dans lequel l’acide L-aminé de la famille aspartate consiste en un ou plusieurs acides L-aminés sélectionnés parmi la L-lysine, la L-thréonine, la Lisoleucine, et la L-méthionine.
  20. 20. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel l’acide L-aminé est un acide L-aminé de la famille glutamate, et dans lequel la bactérie a en outre été modifiée de sorte que l’activité de I’·-cétoglutarate déshydrogénase et/ou la succinate déshydrogénase soit réduite par comparaison à une souche non modifiée.
  21. 21. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 et 15 à 20, dans lequel la bactérie est une bactérie corynéforme, et dans lequel la bactérie a en outre été modifiée de sorte à abriter un gène yggB mutant.
  22. 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel le gène yg^Emutant est un gène yggB comportant une mutation qui améliore la capacité de production d’acide L-glutamique de la bactérie corynéforme.
  23. 23. Procédé selon la revendication 21 ou 22, dans lequel le gène yggB mutant est un gène yggB comportant une mutation définie en (1), (2), ou (3) mentionné ci-dessous :
    (1) une mutation dans la région codant pour les résidus d’acides aminés aux positions 419 à 533 d’une protéine YggB de type sauvage, (2) une mutation dans la région codant pour une région transmembranaire d’une protéine YggB de type sauvage, et (3) une combinaison de celles-ci.
  24. 24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel la protéine YggB de type sauvage est une protéine définie en (a), (b), ou (c) mentionné cidessous :
    (a) une protéine comprenant la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 10 ;
    (b) une protéine comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 10, mais qui comprend une substitution, une délétion, une insertion, et/ou une addition de 1 à 10 résidus d’acides aminés, et qui possède une propriété selon laquelle une expression augmentée de celle-ci dans la bactérie corynéforme permet d’obtenir une capacité de production d’acide L-glutamique améliorée de la bactérie corynéforme ;
    (c) une protéine comprenant une séquence d’acides aminés montrant une identité de 90 % ou plus avec la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO: 10, et qui possède une propriété selon laquelle une expression augmentée de celle-ci dans la bactérie corynéforme permet d’obtenir une capacité de production d’acide L-glutamique améliorée de la bactérie corynéforme.
    1/1 [Fig. 1] (A)
    18h Glu(g/L) /pvk9-Cg-dctA /pvk9-Ec-dctA /pvk9-Ee-dcuA /pvk9-Ec-dcuB (B)
    18h Asp(g/L) yggB*/pvk9 yggB· /pvk9-Cg-detA yggB* /pvk9-Ec-detA yggB* /pvk9-Ec-dcuA yggB* /pvk9-Ec-dcuB
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt LISTING DES SÉQUENCES <110> Ajinomoto Co., inc.
    <120> PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'ACIDES L-AMINÉS <130> D935-173O8 <150> JP2016-195818 <151> 03-10-2016 <160> 22 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 50 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220>
    <223> amorce <400> 1 ccaagcttgc atgccaggag gattataatg gattcaaaca cagaatcttc 50 <210> 2 <211> 39 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220>
    <223> amorce <400> 2 cggtacccgg ggatcctagt ggtcttcttc taactccac 39 <210> 3 <211> 52 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220>
    <223> amorce <400> 3 ccaagcttgc atgccaggag gattataatg aaaacctctc tgtttaaaag cc 52 <210> 4 <211> 35 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220>
    <223> amorce <400> 4 cggtacccgg ggatcttaag aggataattc gtgcg 35 <210> 5 <211> 52 <212> ADN <213> Séquence artificielle
    Pge p
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt <220>
    <223> amorce <400> 5
    ccaagcttgc atgccaggag gattataatg ctagttgtag aactcatcat ag 52 <210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> amorce <400> 6 cggtacccgg ggatcttaca gcatgaagct acccagcacg 40 <210> 7 <211> 51 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> amorce <400> 7 ccaagcttgc atgccaggag gattataatg ttatttacta tccaacttat c 51 <210> 8 <211> 40 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> amorce <400> 8 cggtacccgg ggatcttata agaacccgta catcgcggcg 40 <210> 9 <211> 1602 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 9 atgattttag gcgtacccat tcaatatttg ctctattcat tgtggaattg gattgtcgat 60 accggttttg atgtagcaat tatcctggtc ttggcgtttt tgattccacg tatcggccga 120 ctggccatgc gtattatcaa gcagcgagtg gagtctgcag ccgatgcgga caccactaag 180 aaccagctcg cgttcgctgg cgttggcgtt tatatcgcgc aaattgtggc gtttttcatg 240 cttgccgtct ccgcgatgca ggcttttggt ttctctctcg cgggcgctgc gattccggca 300 accattgcgt cagctgccat tggtcttggt gcgcagtcga ttgttgcgga cttcttggcc 360 ggatttttca tcctgacgga aaagcaattc ggcgtgggtg actgggtgcg ctttgagggc 420 aacggcatcg ttgttgaagg caccgtcatt gagatcacca tgcgcgcgac caaaattcgc 480 acgattgcac aagagaccgt gatcatcccg aactccacgg cgaaagtgtg catcaacaat 540 tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg ttctgaaaac 600 atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg ccaggagaaa 660 atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt cacaccgcca 720 acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt caccgccggc 780 aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcaacgaatt ctgggaagaa 840 tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt tgagcatgaa 900 gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 960 gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcgtctaacg acgatgcaga caatgcagac 1020 gcctcggcga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080 gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140 Pge p
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc cgcatgagca cttccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag caagcacgcc ttcgatgaca gtgcccacta cggtggagga gaccccaacg atggaatcta gcgtcgaaac gcagcaggaa acctcaaccc ctgcaaccgc aacgccccag cgagccgaca ccatcgaacc gaccgaggaa gccacgtcgc aggaggaaac gactgcatcg cagacgcagt ctccagcagt ggaagcacca accgcggtcc aagaaacagt tgcgccgacg tccacccctt ag txt
    1200
    1260
    1320
    1380
    1440
    1500
    1560
    1602 <210> 10 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 10
    Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gin Tyr Leu Leu Tyr ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp île val Asp Thr Gly Phe Asp Val Al a Ile Ile Leu val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg île Gly Arg Leu Al a Met Arg île Ile Lys Gin 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gin Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly val Gly val Tyr Ile Al a Gin Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gin Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Al a 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Al a Al a île Gly Leu Gly Ala Gin 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe île Leu Thr Gl u Lys 115 120 125 Gin Phe Gly val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly île Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys île Arg 145 150 155 160 Thr Ile Al a Gin Glu Thr Val île Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala val Val Val île Pro 180 185 190 île Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val île Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Al a Thr Arg Arg Al a Leu Gly Gin Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 île Leu Gly Glu Leu Asp val Hi s Pro Al a Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr val Val Gly Met Pro Trp Met val Thr Met Arg Phe Leu val Gin 245 250 255 val Thr Ala Gly Asn Gin Trp Leu val Glu Arg Al a île Arg Thr Glu 260 265 270 île Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu Hi s Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu île Asp Ala Ser Pro Gin Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Al a Ala Al a Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Al a ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gin Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Al a Lys Pro Asp Hi s Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gin Lys île Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415
    Pge p
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt
    Phe Lys Val Met 420 Thr val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gin 425 Asn 430 Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Al a Thr Ser Thr Al a Val Thr Thr Ser 435 440 445 Glu Thr Ser Al a Pro Al a Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr 450 455 460 val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gin Gin Glu 465 470 475 480 Thr Ser Thr Pro Al a Thr Al a Thr Pro Gin Arg Al a Asp Thr Ile Glu 485 490 495 Pro Thr Glu Glu Al a Thr Ser Gin Glu Glu Thr Thr Al a ser Gin Thr 500 505 510 Gin Ser Pro Al a Val Glu Al a Pro Thr Al a Val Gin Glu Thr val Al a 515 520 525 Pro Thr Ser Thr Pro 530
    <210> 11 <211> 3063 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <220>
    <221> CDS <222> (1)..(1269) <400> 11
    atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg etc tat tca ttg tgg aat 48 Met île Leu Gly val Pro Ile Gin Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg 96 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp val Al a île île Leu val Leu Al a 20 25 30 ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag 144 Phe Leu île Pro Arg île Gly Arg Leu Al a Met Arg Ile île Lys Gin 35 40 45 cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag etc gcg 192 Arg val Glu ser Al a Al a Asp Al a Asp Thr Thr Lys Asn Gin Leu Al a 50 55 60 ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg 240 Phe Al a Gly Val Gly Val Tyr Ile Al a Gin Ile val Al a Phe Phe Met 65 70 75 80 ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct etc gcg ggc gct 288 Leu Al a Val Ser Al a Met Gin Al a Phe Gly Phe Ser Leu Al a Gly Al a 85 90 95 gçg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag 336 Al a île Pro Al a Thr Ile Al a Ser Al a Al a Ile Gly Leu Gly Al a Gin 100 105 110 tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag 384 Ser île Val Al a Asp Phe Leu Al a Gly Phe Phe île Leu Thr Glu Lys 115 120 125 caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt 432 Gin Phe Gly Val Gly Asp Trp val Arg Phe Glu Gly Asn Gly île Val 130 135 140 gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc 480 val Glu Gly Thr val Ile Glu Ile Thr Met Arg Al a Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg 528 Thr île Al a Gin Glu Thr val île Ile Pro Asn Ser Thr Al a Lys val 165 170 175 tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg 576 cys île Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Al a Val val val île Pro 180 185 190 atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct 624 île Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp val île Al a Arg Ser 195 200 205
    Pge p
    33008! 520 ! 1102 FR 1 3N_ ! Frem ch si 2quei ice 1 i sf ing_OP-l! 7308-FR. . txt gaa gçt gcg act cgt cgc gea Ctt ggc cag gag aaa atc gea ccg gaa 672 Glu Al a Al a Thr Arg Arg Al a Leu Gly Gin Glu Lys île Al a Pro Glu 210 215 220 atc etc ggt gaa etc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca 720 île Leu Gly Glu Leu Asp val Hi s pro Al a Thr Glu val Thr Pro Pro 225 230 235 240 acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc etc gtg caa 768 Thr val val Gly Met Pro Trp Met val Thr Met Arg Phe Leu Val Gin 245 250 255 gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa 816 Val Thr Al a Gly Asn Gin Trp Leu val Glu Arg Al a île Arg Thr Glu 260 265 270 atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc age gea acc act aca tcg 864 Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Al a Thr Thr Thr Ser 275 280 285 gga acc etc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc 912 Gly Thr Leu Ile Asp ser Leu Hi s Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag 960 Ser Leu île Asp Al a ser Pro Gin Al a Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 gct gcg gcg acg gtt gea tcg cta gct gea tcg tet aac gac gat gea 1008 Al a Al a Al a Thr val Al a Ser Leu Al a Al a Ser Ser Asn Asp Asp Al a 325 330 335 gac aat gea gac gcc tcg gcg atc aat gça ggc aat cca gag aag gaa 1056 Asp Asn Al a Asp Al a Ser Al a Ile Asn Al a Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa etc tcc age gaa gaa ccg gaa 1104 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gin Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 gaa aca gea aaa cca gat cac tet etc ega ggc ttc ttc cgc act gat 1152 Glu Thr Al a Lys Pro Asp Hi s Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc 1200 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gin Lys île Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 cgc atg age act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg etc ttg ctg tca cta 1248 Arg Met ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Al a Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 ttt aag ggg etc ttc ctg ttt tagagtgcat tgatcttatg gaccaactgc 1299 Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe 420
    cctgaatgga taaggcaccg cagaatgtag tggttcaaat tacggaaacc tagagcaatc 1359 ccacgcaaat gctccaaccg tccgttgatc gcttcgaccg gaccgttgga gacaccaaca 1419 tcgaaatacg ccaacacatc accaagtcgt ttaaacaaac tacgacccaa ctgcgcgagt 1479 tccttattcg gccccttcaa cacccgaagc tgatcaataa tggtccgcat tttcttcttc 1539 gcttcacgct tattacccat ctgataacaa tcaataatcg cctgatacgc aagccacgca 1599 agctttaaca ccccgtagtc tttgtcatac gcccacaact gctccaagct ttcttgctga 1659 cgaggactca accacttgtg cgtggtcaac aaggtcttcc ggtttttata caacggatcc 1719 tggcttaaac cacgacgctg gtatttctcc cgctggaggc gttgccggca ggcggtgagc 1779 ttgtcaccag caagccgcac aacatggaat ggatccatca cgcgacgagc agaaggaatg 1839 agttctttac ttgctgtggc gtagccttgg aacccatcca tggacacgat ccgtatctga 1899 ttgcggaact gttcaccgcg ggaaccaagc caggaccgta aagcatcagc actacgacct 1959 gggacgacat ctaataaccg ggcaggacac cgtgagtcat accgatgccc ggtcatatcg 2019 acaatcacgg tgacaaaccc atcaccatgc ttagccctat tatgtgacca cttatgctca 2079 tccaccccaa tgacatacac tccatcaaga tggtgaggat cgttatagac cagctcacgg 2139 cacatatcga gggctagttg gcaggttaaa tcccacccta gcccaagtgc tttcgcggtt 2199 gcgtgaacac tcatccggtc aatagcaagg cgttgcaaaa tccagcgggt gacccggtgg 2259 gtgacctttt taccgtggtc agcgcagctt agttctgctt ggaaatactt ttgcttacat 2319 gtcgggttgg tgcagcggta gcgaggtaga cggataaaca gtttggtggg aaacccgacg 2379 atgggtaaat caatgagcat ccggtgggtg tgatgacgaa acaccccagg ttgggagcat 2439 tctgggcagg tggaggtata gtcgagtgcg tctgcttcga tcagggtgta atcacctgca 2499 tcggaagcgc cggtgatggt gagtcctagt tccgcagtgc ggcagatggt gtcagcgatg 2559 atgttgccgg tagacttcat gggtagagcc ttttgttggt gtttggttag cttagatacc 2619 taaaccttaa ccctgacaaa aggctcgttt attttcgggt ctacaccgct agcccaggtt 2679 ctgtgatgta ccccaaaacc ggaagggcca tttaaggtca tgactgtgga accaagtgag 2739 aattggcaaa actccagtgg atggctgtca ccaagcactg ccacctcaac tgcggtgacc 2799 acctccgaaa cttccgcgcc agcaagcacg ccttcgatga cagtgcccac tacggtggag 2859 pge p
    3IOO852O 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt gagaccccaa cgatggaatc tagcgtcgaa acgcagcagg aaacctcaac ccctgcaacc 2919 gcaacgcccc agcgagccga caccatcgaa ccgaccgagg aagccacgtc gcaggaggaa 2979 acgactgcat cgcagacgca gtctccagca gtggaagcac caaccgcggt ccaagaaaca 3039 gttgcgccga cgtccacccc ttag 3063 <210> 12 <211> 423 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 12
    Met Ile Leu Gly val Pro Ile Gin Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Al a Ile Ile Leu val Leu Al a 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Al a Met Arg Ile Ile Lys Gin 35 40 45 Arg val Glu Ser Al a Al a Asp Al a Asp Thr Thr Lys Asn Gin Leu Al a 50 55 60 Phe Al a Gly val Gly Val Tyr Ile Al a Gin Ile Val Al a Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Al a Val Ser Al a Met Gin Al a Phe Gly Phe Ser Leu Al a Gly Al a 85 90 95 Al a Ile Pro Al a Thr île Al a Ser Al a Al a île Gly Leu Gly Al a Gin 100 105 110 Ser Ile Val Al a Asp Phe Leu Al a Gly Phe Phe île Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gin Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val île Glu île Thr Met Arg Al a Thr Lys île Arg 145 150 155 160 Thr île Al a Gin Glu Thr Val île île Pro Asn Ser Thr Al a Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Al a val val val île Pro 180 185 190 île Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp val île Al a Arg Ser 195 200 205 Glu Al a Al a Thr Arg Arg Al a Leu Gly Gin Glu Lys Ile Al a Pro Glu 210 215 220 île Leu Gly Glu Leu Asp val Hi s Pro Al a Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu val Gin 245 250 255 Val Thr Al a Gly Asn Gin Trp Leu val Glu Arg Al a île Arg Thr Glu 260 265 270 île Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Al a Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu île Asp Ser Leu Hi s Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu île Asp Al a Ser Pro Gin Al a Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Al a Al a Al a Thr val Al a Ser Leu Al a Al a Ser Ser Asn Asp Asp Al a 325 330 335 Asp Asn Al a Asp Al a Ser Al a Ile Asn Al a Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp val Leu Glu Gin Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Al a Lys Pro Asp Hi s Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gin Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Al a Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe 420
    Pge p
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt <210> 13 <211> 2478 <212> ADN <213> Bifidobacterium longum <400> 13 atgacgagtc ctgttattgg caccccttgg aagaagctca acgctccggt ttccgaggaa 60 gccctcgaag gcgttgacaa gtactggcgc gttgccaact acctttccat cggccagatt 120 tatctgcgtt ccaacccgct gatgaaggag cccttcaccc gcgaagatgt gaagcaccgt 180 ctggtgggcc actggggcac tacccctggc ctgaacttcc tcatcggcca catcaaccgt 240 ttcattgctg accacggcca gaacaccgtg atcatcatgg gcccgggcca cggtggcccg 300 gccggtacct cccagtccta cctggacggc acctacaccg agaccttccc gaagatcacc 360 aaggacgaag ctggtctgca gaagttcttc cgtcagttct cttacccggg cggcattccg 420 tcccacttcg ctccggagac cccgggctcc atccacgagg gtggtgagct gggttacgct 480 ctgtcccacg cttacggcgc catcatggac aacccgagcc tgtttgtccc ggccatcgtc 540 ggcgacggcg aggctgagac cggcccgctg gctaccggct ggcagtccaa caagctcgtg 600 aacccgcgca ccgacggtat cgtgctgccg atcctgcacc tcaacggcta caagatcgcc 660 aacccgacca tcctgtcccg catctccgac gaagagctcc acgagttctt ccacggcatg 720 ggttacgagc cctacgagtt cgtcgctggc ttcgatgatg aggaccacat gtccatccac 780 cgtcgcttcg ccgagctgtg ggagaccatc tgggacgaga tctgcgacat caaggccacc 840 gctcagaccg acaacgtgca ccgtccgttc tacccgatgc tgatcttccg caccccgaag 900 ggctggacct gcccgaagta catcgacggc aagaagaccg agggctcctg gcgttcccac 960 caggtgccgc tggcttccgc ccgcgacacc gaggcccact tcgaggttct caagaactgg 1020 ctcgagtcct acaagccgga agagctgttc gacgccaacg gtgctgtcaa ggacgacgtc 1080 cttgccttca tgccgaaggg cgagctgcgt atcggtgcca acccgaacgc caacggtggt 1140 gtgatccgca acgacctgaa gctgccgaac ctcgaggact acgaggtcaa ggaagtggct 1200 gagtacggcc acggctgggg ccagctcgag gccacccgta ccctgggtgc ctacactcgc 1260 gacatcatca agaacaaccc gcgcgacttc cgcatcttcg gaccggatga gaccgcttcc 1320 aaccgtctgc aggcttccta cgaagtcacc aacaagcagt gggatgccgg ctacatctcc 1380 gacgaggtcg acgagcacat gcacgtctcc ggccaggtcg ttgagcagct gtccgagcac 1440 cagatggaag gcttcctcga ggcttacctg ctgaccggtc gtcacggcat ctggagctcc 1500 tacgagtcct tcgtccacgt gatcgactcc atgctgaacc agcacgccaa gtggcttgag 1560 gctaccgtcc gcgagattcc gtggcgcaag ccgattgcct ccatgaacct gctggtctcc 1620 tcccacgttt ggcgtcagga ccacaacggc ttctcccacc aggatccggg tgtcacctcc 1680 gtcctgctga acaagtgctt ccacaacgac cacgtcatcg gcatctactt cgccaccgat 1740 gcgaacatgc tgctggccat cgccgagaag tgctacaagt ccaccaacaa gatcaacgcc 1800 atcatcgctg gtaagcagcc tgctgccacc tggctgaccc tggacgaggc tcgtgccgag 1860 ctcgagaagg gtgccgccgc ttgggattgg gcttccaccg ccaagaacaa cgatgaggcc 1920 gaggtcgtgc ttgccgccgc cggcgatgtc ccgactcagg agatcatggc tgcttccgac 1980 aagctgaagg aactgggcat caagttcaag gttgtgaacg ttgccgacct gctctccctg 2040 cagtccgcca aggagaacga cgaggctctg accgacgagg agttcgccga catcttcacc 2100 gccgacaagc cggtgctgtt cgcgtaccac tcctacgctc acgacgtgcg tggcctgatc 2160 tacgaccgtc cgaaccacga caacttcaac gtccacggct acgaggagga gggctccacc 2220 accaccccgt acgacatggt tcgtgtcaac cgcatcgacc gctacgagct gaccgctgag 2280 gctctgcgca tgatcgacgc cgacaagtac gccgacaaga tcgacgagct cgagaagttc 2340 cgtgatgagg ccttccagtt cgccgtcgac aacggctacg atcacccgga ctacaccgac 2400 tgggtgtact ccggcgtgaa caccgacaag aagggtgccg tcaccgctac cgccgctacc 2460 gctggcgaca acgagtga 2478 <210> 14 <211> 825 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 14
    Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Al a Pro 15 10 15 val Ser Glu Glu Al a Leu Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Val Al a
    20 25 30
    Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gin Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met
    35 40 45
    Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu val Gly His
    50 55 60
    Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg
    65 70 75 80
    Phe île Ala Asp His Gly Gin Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly
    85 90 95
    Pge p
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt
    Hi s Gly Gly Pro Al a Gly Thr 100 Ser Gin Ser 105 Tyr Leu Asp Gly 110 Thr Tyr Thr Glu Thr Phe Pro Lys Ile Thr Lys Asp Glu Al a Gly Leu Gin Lys 115 120 125 Phe Phe Arg Gl n Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser Hi s Phe Al a 130 135 140 Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile Hi s Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Al a 145 150 155 160 Leu Ser Hi s Al a Tyr Gly Al a Ile Met Asp Asn Pro Ser Leu Phe val 165 170 175 Pro Al a île val Gly Asp Gly Glu Al a Glu Thr Gly Pro Leu Al a Thr 180 185 190 Gly Trp Gin Ser Asn Lys Leu Val Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val 195 200 205 Leu Pro Ile Leu Hi s Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Al a Asn Pro Thr île 210 215 220 Leu Ser Arg île Ser Asp Glu Glu Leu Hi s Glu Phe Phe Hi s Gly Met 225 230 235 240 Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Al a Gly Phe Asp Asp Glu Asp Hi s 245 250 255 Met Ser île Hi s Arg Arg Phe Al a Glu Leu Trp Glu Thr île Trp Asp 260 265 270 Glu île Cys Asp Ile Lys Al a Thr Al a Gin Thr Asp Asn Val Hi s Arg 275 280 285 Pro Phe Tyr Pro Met Leu île Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr cys 290 295 300 Pro Lys Tyr île Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His 305 310 315 320 Gin val Pro Leu Al a Ser Al a Arg Asp Thr Glu Al a Hi s Phe Glu Val 325 330 335 Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Al a 340 345 350 Asn Gly Al a Val Lys Asp Asp Val Leu Al a Phe Met Pro Lys Gly Glu 355 360 365 Leu Arg Ile Gly Al a Asn Pro Asn Al a Asn Gly Gly Val île Arg Asn 370 375 380 Asp Leu Lys Leu Pro Asn Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Al a 385 390 395 400 Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gin Leu Glu Al a Thr Arg Thr Leu Gly 405 410 415 Al a Tyr Thr Arg Asp île Ile Lys Asn Asn Pro Arg Asp Phe Arg Ile 420 425 430 Phe Gly Pro ASp Glu Thr Al a Ser Asn Arg Leu Gin Al a Ser Tyr Glu 435 440 445 Val Thr Asn Lys Gin Trp Asp Al a Gly Tyr Ile Ser ASp Glu Val Asp 450 455 460 Glu His Met Hi s Val ser Gly Gin Val Val Glu Gin Leu Ser Glu His 465 470 475 480 Gin Met Glu Gly Phe Leu Glu Al a Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly 485 490 495 île Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His val Ile Asp Ser Met Leu 500 505 510 Asn Gin Hi s Al a Lys T rp Leu Glu Al a Thr val Arg Glu Ile Pro Trp 515 520 525 Arg Lys Pro île Al a Ser Met Asn Leu Leu val Ser Ser His Val Trp 530 535 540 Arg Gin Asp His Asn Gly Phe Ser His Gin Asp Pro Gly Val Thr Ser 545 550 555 560 val Leu Leu Asn Lys cys Phe Hi s Asn Asp Hi s val île Gly île Tyr 565 570 575 Phe Al a Thr Asp Al a Asn Met Leu Leu Al a Ile Al a Glu Lys cys Tyr 580 585 590 Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Al a Ile Ile Al a Gly Lys Gin Pro Al a 595 600 605 Al a Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Al a Arg Al a Glu Leu Glu Lys Gly 610 615 620 Al a Al a Al a Trp Asp Trp Al a Ser Thr Al a Lys Asn Asn Asp Glu Al a 625 630 635 640
    Pge p
    3JOO852O 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt Glu Val val Leu Al a Al a Al a Gly Asp Val Pro Thr Gin Glu Ile Met
    645 650 655
    Al a Al a Ser Asp Lys Leu Lys Glu Leu Gly Ile Lys Phe Lys val Val
    660 665 670
    Asn Val Al a Asp Leu Leu Ser Leu Gin Ser Al a Lys Glu Asn Asp Glu
    675 680 685
    Al a Leu Thr Asp Glu Glu Phe Al a Asp île Phe Thr Al a Asp Lys Pro
    690 695 700 val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala His Asp val Arg Gly Leu Ile
    705 710 715 720
    Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn val His Gly Tyr Glu Glu
    725 730 735
    Glu Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met val Arg val Asn Arg Ile
    740 745 750
    Asp Arg Tyr Glu Leu Thr Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp
    755 760 765
    Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asp Glu Leu Glu Lys Phe Arg Asp Glu Ala
    770 775 780
    Phe Gin Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp
    785 790 795 800
    Trp val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asp Lys Lys Gly Ala Val Thr Ala
    805 810 815
    Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu
    820 825 <210> 15 <211> 1341 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 15 atggattcaa acacagaatc ttcaagtgtt gaggtcaaaa acgaacacat taaagttcaa 60 aagccgccga agaaggaccg cactcactgg ctctacattg cggtcattat cgcattgatt 120 ggcggtatta ccctaggcct gatttcaccg gagttgggca aagaattcaa gattttgggc 180 accatgtttg tgtccttgat caagatgatt atcgctccag ttattttctg caccatcgtc 240 atcggaatcg gttcagtcaa ggcagcggca acagtcggac gcgctggtgg catcgccctt 300 gcgtacttca tcacgatgtc cacattcgca ctcgcagttg gcctgctagt cggtaacttc 360 atccagccag gtagcggact gaacatctca gttgatgaag aatcttcatt cgcatccaca 420 gagagcagcc ctgaaggact cttgggattc atccactcga tcatccctga aacgttcttc 480 tctgcattta ctgatggttc ggtgctgcag gtactgttca tcgccatcct cgtgggcttt 540 gcagctcagt cgatgggtga aaagggacag cccatccttg atttcgtatc ccatctgcag 600 aagctcatct tcaagatttt gaactggatt ctgtggctcg ccccagtcgg tgcattcggt 660 gcaatggccg gcgtcgttgg cgaaacaggc tttgatgccg ttgttcagct cggtattttg 720 atcctcgcct tttacgtcac ctgcgtgatc ttcatctttg gcgtgctggg cgccgtactg 780 aaggtgttca ccggcgtgaa tatcttcaag ctggtcaagt accttgccaa ggaattcctg 840 ctgatctttg ctacctcatc ctctgaatct gccttgccaa acctcatgcg caagatggaa 900 cacatcggtg tggctaaacc aaccgtcgga atcgtggtcc caaccggcta ttccttcaac 960 ttggacggca ccgcaattta cctcaccatg gcatctatct tcattgccga cgcgatgaat 1020 atgccgatga gcctcggcga gcaggtcggt ctgcttgtct tcatgatcat cgcatccaag 1080 ggcgctgctg gtgtctcggg tgccggtatt gcaacgttgg ctgccggatt gtcttcacac 1140 cgcccagaac ttctgcacgg cgttgacgtg attgtgggca tcgataaatt catgtctgaa 1200 gcccgcgcac taaccaactt cgccggaaac tccgtggcaa cactgctggt cggcaagtgg 1260 actggcaccg tggacatgaa ccaagtccat gacgttttga atggaaaatc tccatttgtg 1320 gagttagaag aagaccacta g 1341 <210> 16 <211> 446 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 16
    Met Asp Ser Asn Thr Glu Ser Ser Ser Val Glu val Lys Asn Glu His 15 10 15
    Ile Lys val Gin Lys Pro Pro Lys Lys Asp Arg Thr His Trp Leu Tyr
    20 25 30 île Ala val Ile Ile Ala Leu Ile Gly Gly Ile Thr Leu Gly Leu île
    Pge p
    3JOO852O 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt 35 40 45
    Ser Pro Glu 50 Leu Gly Lys Glu Phe Lys Ile Leu 55 Gly Thr Met 60 Phe Val Ser Leu île Lys Met île île Al a Pro Val île Phe cys Thr Ile val 65 70 75 80 Ile Gly île Gly Ser val Lys Al a Al a Al a Thr val Gly Arg Al a Gly 85 90 95 Gly Ile Al a Leu Al a Tyr Phe Ile Thr Met Ser Thr Phe Al a Leu Al a 100 105 110 Val Gly Leu Leu val Gly Asn Phe Ile Gin Pro Gly Ser Gly Leu Asn 115 120 125 île Ser Val Asp Glu Glu Ser Ser Phe Al a Ser Thr Glu Ser Ser Pro 130 135 140 Glu Gly Leu Leu Gly Phe île Hi s Ser île île Pro Glu Thr Phe Phe 145 150 155 160 Ser Al a Phe Thr Asp Gly Ser val Leu Gin Val Leu Phe île Al a Ile 165 170 175 Leu Val Gly Phe Al a Al a Gin Ser Met Gly Glu Lys Gly Gin Pro Ile 180 185 190 Leu Asp Phe Val Ser Hi s Leu Gin Lys Leu Ile Phe Lys île Leu Asn 195 200 205 Trp île Leu Trp Leu Al a Pro Val Gly Al a Phe Gly Al a Met Al a Gly 210 215 220 val Val Gly Glu Thr Gly Phe Asp Al a Val val Gin Leu Gly île Leu 225 230 235 240 île Leu Al a Phe Tyr val Thr cys val île Phe Ile Phe Gly val Leu 245 250 255 Gly Al a Val Leu Lys val Phe Thr Gly Val Asn Ile Phe Lys Leu val 260 265 270 Lys Tyr Leu Al a Lys Glu Phe Leu Leu île Phe Al a Thr Ser Ser Ser 275 280 285 Glu Ser Al a Leu Pro Asn Leu Met Arg Lys Met Glu Hi s Ile Gly val 290 295 300 Al a Lys Pro Thr val Gly Ile val val Pro Thr Gly Tyr Ser Phe Asn 305 310 315 320 Leu Asp Gly Thr Al a Ile Tyr Leu Thr Met Al a Ser Ile Phe île Al a 325 330 335 Asp Al a Met Asn Met Pro Met Ser Leu Gly Glu Gin Val Gly Leu Leu 340 345 350 Val Phe Met Ile Ile Al a Ser Lys Gly Al a Al a Gly Val Ser Gly Al a 355 360 365 Gly île Al a Thr Leu Al a Al a Gly Leu Ser Ser Hi s Arg Pro Glu Leu 370 375 380 Leu Hi s Gly val Asp val Ile Val Gly île Asp Lys Phe Met ser Glu 385 390 395 400 Al a Arg Al a Leu Thr Asn Phe Al a Gly Asn Ser Val Al a Thr Leu Leu 405 410 415 Val Gly Lys Trp Thr Gly Thr Val Asp Met Asn Gin val Hi s Asp val 420 425 430 Leu Asn Gly Lys Ser Pro Phe val Glu Leu Glu Glu Asp Hi s 435 440 445
    <210> 17 <211> 1287 <212> ADN <213> Escherichia coii <400> 17 atgaaaacct ctctgtttaa aagcctttac tttcaggtcc tgacagcgat agccattggt 60 attctccttg gccatttcta tcctgaaata ggcgagcaaa tgaaaccgct tggcgacggc 120 ttcgttaagc tcattaagat gatcatcgct cctgtcatct tttgtaccgt cgtaacgggc 180 attgcgggca tggaaagcat gaaggcggtc ggtcgtaccg gcgcagtcgc actgctttac 240 tttgaaattg tcagtaccat cgcgctgatt attggtctta tcatcgttaa cgtcgtgcag 300 cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt agcggtttac 360 gccgatcagg cgaaagacca gggcattgtc gccttcatta tggatgtcat cccggcgagc 420 gtcattggcg catttgccag cggtaacatt ctgcaggtgc tgctgtttgc cgtactgttt 480 ggttttgcgc tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga tttttaacgt catcgaaagt 540
    Pge p
    3JOO852O 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt ttctcgcagg tcatcttcgg catcatcaat atgatcatgc gtctggcacc tattggtgcg 600 ttcggggcaa tggcgtttac catcggtaaa tacggcgtcg gcacactggt gcaactgggg 660 cagctgatta tctgtttcta cattacctgt atcctgtttg tggtgctggt attgggttca 720 atcgctaaag cgactggttt cagtatcttc aaatttatcc gctacatccg tgaagaactg 780 ctgattgtac tggggacttc atcttccgag tcggcgctgc cgcgtatgct cgacaagatg 840 gagaaactcg gctgccgtaa atcggtggtg gggctggtca tcccgacagg ctactcgttt 900 aaccttgatg gcacatcgat atacctgaca atggcggcgg tgtttatcgc ccaggccact 960 aacagtcaga tggatatcgt ccaccaaatc acgctgttaa tcgtgttgct gctttcttct 1020 aaaggggcgg caggggtaac gggtagtggc tttatcgtgc tggcggcgac gctctctgcg 1080 gtgggccatt tgccggtagc gggtctggcg ctgatcctcg gtatcgaccg ctttatgtca 1140 gaagctcgtg cgctgactaa cctggtcggt aacggcgtag cgaccattgt cgttgctaag 1200 tgggtgaaag aactggacca caaaaaactg gacgatgtgc tgaataatcg tgcgccggat 1260 ggcaaaacgc acgaattatc ctcttaa 1287 <210> 18 <211> 428 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 18
    Met Lys Thr Ser Leu Phe Lys Ser Leu Tyr Phe Gin val Leu Thr Al a 1 5 10 15 Ile Al a île Gly île Leu Leu Gly Hi s Phe Tyr Pro Glu Ile Gly Glu 20 25 30 Gin Met Lys Pro Leu Gly Asp Gly Phe val Lys Leu Ile Lys Met Ile 35 40 45 Ile Al a Pro val Ile Phe cys Thr val val Thr Gly Ile Al a Gly Met 50 55 60 Glu Ser Met Lys Al a val Gly Arg Thr Gly Al a val Al a Leu Leu Tyr 65 70 75 80 Phe Glu Ile val Ser Thr Ile Al a Leu Ile Ile Gly Leu Ile Ile Val 85 90 95 Asn Val val Gin Pro Gly Al a Gly Met Asn val Asp Pro Al a Thr Leu 100 105 110 Asp Al a Lys Al a val Al a Val Tyr Al a Asp Gin Al a Lys Asp Gin Gly 115 120 125 Ile Val Al a Phe île Met Asp val Ile Pro Al a Ser Val île Gly Al a 130 135 140 Phe Al a Ser Gly Asn île Leu Gin Val Leu Leu Phe Al a val Leu Phe 145 150 155 160 Gly phe Al a Leu Hi s Arg Leu Gly Ser Lys Gly Gin Leu île Phe Asn 165 170 175 Val île Glu Ser Phe Ser Gin Val île Phe Gly île île Asn Met Ile 180 185 190 Met Arg Leu Al a Pro Ile Gly Al a Phe Gly Al a Met Al a Phe Thr Ile 195 200 205 Gly Lys Tyr Gly val Gly Thr Leu val Gin Leu Gly Gin Leu Ile île 210 215 220 Cys Phe Tyr Ile Thr cys Ile Leu Phe val val Leu Val Leu Gly Ser 225 230 235 240 île Al a Lys Al a Thr Gly Phe Ser île Phe Lys Phe Ile Arg Tyr île 245 250 255 Arg Glu Glu Leu Leu île Val Leu Gly Thr Ser Ser Ser Glu Ser Al a 260 265 270 Leu Pro Arg Met Leu Asp Lys Met Glu Lys Leu Gly Cys Arg Lys Ser 275 280 285 Val Val Gly Leu val île Pro Thr Gly Tyr Ser Phe Asn Leu ASp Gly 290 295 300 Thr Ser île Tyr Leu Thr Met Al a Al a Val Phe Ile Al a Gin Al a Thr 305 310 315 320 Asn Ser Gin Met Asp Ile val Hi s Gin île Thr Leu Leu île val Leu 325 330 335 Leu Leu Ser Ser Lys Gly Al a Al a Gly Val Thr Gly Ser Gly Phe Ile 340 345 350 val Leu Al a Al a Thr Leu Ser Al a Val Gly Hi s Leu Pro val Al a Gly 355 360 365 Leu Al a Leu Ile Leu Gly Ile Asp Arg Phe Met Ser Glu Al a Arg Al a
    Pge p
    3JOO852O 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt
    370 375 380
    Leu Thr Asn Leu Val Gly Asn Gly Val Al a Thr île Val Val Al a Lys
    385 390 395 400
    Trp val Lys Glu Leu Asp His Lys Lys Leu Asp Asp val Leu Asn Asn
    405 410 415
    Arg Ala Pro Asp Gly Lys Thr His Glu Leu Ser Ser
    420 425 <210> 19 <211> 1302 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 19 atgctagttg tagaactcat catagttttg ctggcgatct tcttgggcgc cagattgggg 60 ggaataggta ttggttttgc aggcggattg ggggtgctgg ttcttgccgc tattggcgtt 120 aaacccggta acatcccgtt cgatgtcatc tccattatca tggcggttat cgccgctatt 180 tctgccatgc aggttgctgg cggtctggac tatctggttc atcagacaga aaagctgctg 240 cgccgtaacc cgaaatacat cacgatcctc gcaccgatcg tgacctattt cctgactatc 300 tttgctggta ctggcaacat ctctctggcg acactgccag ttatcgctga agttgcgaag 360 gaacaaggcg ttaaaccttg ccgtccgctg tctactgcag tggtatccgc gcagattgcg 420 atcaccgcat cgccaatctc agcggcagtg gtttacatgt cttccgtgat ggaaggtcat 480 ggcatcagct acctccatct gctctccgtg gtcatcccgt ccaccctgct ggcggttctg 540 gtgatgtcct tcctggtcac tatgctgttc aactccaaac tctctgacga tccgatttat 600 cgcaagcgtc tggaagaggg cctggttgaa ctgcgcggtg aaaagcagat tgaaatcaaa 660 tccggtgcaa aaacgtccgt ctggctgttc ctgctgggcg tagttggcgt ggttatctat 720 gcaatcatca acagcccaag catgggtctg gttgaaaaac cgctgatgaa caccaccaac 780 gcaatcctga tcatcatgct cagcgttgca actctgacca ccgttatctg taaagtcgat 840 accgacaaca tcctcaactc cagcaccttc aaagcaggta tgagcgcctg tatttgtatc 900 ctgggtgttg cgtggctggg cgatactttc gtttccaaca acatcgactg gatcaaagat 960 accgctggtg aagtgattca gggtcatccg tggctgctgg ccgtcatctt cttctttgct 1020 tctgctctgc tgtactctca ggctgcaacc gcaaaagcac tgatgccgat ggctctggca 1080 ctgaacgttt caccgctgac cgctgttgct tctttcgctg cggtgtctgg tctgttcatt 1140 ctgccgacct acccgacgct ggttgctgcg gtacagatgg atgacacggg tactacccgt 1200 atcggtaaat tcgtcttcaa ccatccgttc ttcatcccgg gtactctggg tgttgccctg 1260 gccgtttgct tcggcttcgt gctgggtagc ttcatgctgt aa 1302 <210> 20 <211> 433 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 20
    Met Leu val Val Glu Leu Ile île val Leu Leu Ala Ile Phe Leu Gly 15 10 15
    Ala Arg Leu Gly Gly Ile Gly Ile Gly Phe Ala Gly Gly Leu Gly val
    20 25 30
    Leu val Leu Ala Ala Ile Gly val Lys Pro Gly Asn île Pro Phe Asp
    35 40 45
    Val Ile Ser île Ile Met Ala val Ile Ala Ala Ile Ser Ala Met Gin
    50 55 60
    Val Ala Gly Gly Leu Asp Tyr Leu Val His Gin Thr Glu Lys Leu Leu
    65 70 75 80
    Arg Arg Asn Pro Lys Tyr Ile Thr île Leu Ala Pro île Val Thr Tyr
    85 90 95
    Phe Leu Thr Ile Phe Ala Gly Thr Gly Asn Ile Ser Leu Ala Thr Leu
    100 105 110
    Pro Val île Ala Glu val Ala Lys Glu Gin Gly Val Lys Pro Cys Arg
    115 120 125
    Pro Leu Ser Thr Ala val Val Ser Ala Gin Ile Ala Ile Thr Ala Ser
    130 135 140
    Pro Ile Ser Ala Ala val Val Tyr Met Ser Ser val Met Glu Gly His
    145 150 155 160
    Gly île Ser Tyr Leu His Leu Leu Ser Val Val Ile Pro Ser Thr Leu
    165 170 175
    Leu Ala val Leu val Met ser Phe Leu Val Thr Met Leu Phe Asn Ser pge p
    3JOO852O 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt 180 185 190
    Lys Leu ser Asp Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Arg Leu Glu Glu Gly Leu 195 200 205
    Val Glu Leu Arg Gly Glu Lys Gin Ile Glu Ile Lys Ser Gly Al a Lys
    210 215 220
    Thr Ser Val Trp Leu Phe Leu Leu Gly val Val Gly val Val île Tyr
    225 230 235 240
    Al a Ile Ile Asn Ser Pro Ser Met Gly Leu Val Glu Lys Pro Leu Met
    245 250 255
    Asn Thr Thr Asn Al a île Leu Ile Ile Met Leu Ser val Al a Thr Leu
    260 265 270
    Thr Thr Val île Cys Lys val Asp Thr Asp Asn île Leu Asn Ser Ser
    275 280 285
    Thr Phe Lys Ala Gly Met Ser Ala cys Ile Cys Ile Leu Gly val Ala
    290 295 300
    Trp Leu Gly Asp Thr Phe Val Ser Asn Asn Ile Asp Trp île Lys Asp
    305 310 315 320
    Thr Ala Gly Glu Val île Gin Gly His Pro Trp Leu Leu Ala Val Ile
    325 330 335
    Phe Phe Phe Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Ser Gin Ala Ala Thr Ala Lys
    340 345 350
    Ala Leu Met Pro Met Ala Leu Ala Leu Asn Val Ser Pro Leu Thr Ala
    355 360 365
    Val Ala Ser Phe Ala Ala Val Ser Gly Leu Phe Ile Leu Pro Thr Tyr
    370 375 380
    Pro Thr Leu Val Ala Ala Val Gin Met Asp Asp Thr Gly Thr Thr Arg
    385 390 395 400
    Ile Gly Lys Phe Val Phe Asn His Pro Phe Phe Ile Pro Gly Thr Leu
    405 410 415
    Gly Val Ala Leu Ala val Cys Phe Gly Phe val Leu Gly Ser Phe Met
    420 425 430
    Leu <210> 21 <211> 1341 <212> ADN <213> Escherichia coii <400> 21 atgttattta ctatccaact tatcataata ctgatatgtc tgttttatgg tgccagaaag 60 ggtggtatcg cgctgggttt attaggcggt atcggtctgg tcattctggt cttcgtcttc 120 caccttcagc caggtaaacc accagttgat gtcatgctgg ttatcattgc ggtggtggcg 180 gcatcggcga ccttgcaagc ttcgggcggt cttgatgtca tgctgcaaat tgccgagaag 240 ctgctgcgcc gcaacccgaa atatgtctca attgtcgcgc cgtttgtgac ctgtacactg 300 accattcttt gcggtacggg tcatgtggtt tacaccattc tgccgatcat ctacgacgtc 360 gccattaaga acaacatccg tccggaacgt ccgatggcgg caagttctat cggtgcacag 420 atggggatta tcgccagtcc ggtgtcggtt gcggtcgtgt ctctggttgc gatgctgggt 480 aatgtcacct ttgatggtcg ccatcttgag ttcctcgatc tgctggcaat caccattcca 540 tcgacgttaa tcggtatcct ggcgatcggt atcttcagct ggttccgcgg taaagatctg 600 gataaagacg aagagttcca gaaattcatc tccgtaccgg aaaaccgtga gtatgtttac 660 ggtgataccg cgacgctgct ggataaaaaa ctgccgaaaa gcaactggct ggcaatgtgg 720 attttcctcg gggcaatcgc tgtagtcgcc cttcttggtg ctgattcgga cctgcgtcca 780 tccttcggcg gcaaaccgct gtcgatggta ctggttattc agatgtttat gctgctgacc 840 ggggcgctga ttattatcct gaccaaaacc aatcccgcgt ctatctcaaa aaacgaagtc 900 ttccgttccg gtatgatcgc catcgtggcg gtgtacggta tcgcatggat ggcagaaacc 960 atgttcggtg cgcatatgtc tgaaattcag ggcgtactgg gtgaaatggt gaaagagtat 1020 ccgtgggcct atgccattgt tctgctgctg gtttccaagt ttgtaaactc tcaggctgcg 1080 gcgctggcgg cgattgttcc ggtcgcgctg gcgatcggcg ttgatccggc atacatcgtg 1140 gcttcagcac cggcttgcta cggttattac atcctgccga cttatccgag cgatctggca 1200 gcgattcagt ttgaccgttc cggcaccacc cacatcggtc gcttcgtcat caaccacagc 1260 tttattctgc cggggttgat tggtgtgagc gtatcgtgcg tcttcggctg gatcttcgcc 1320 gcgatgtacg ggttcttata a 1341 <210> 22 <211> 446
    Pge p
    33008520 1102 FR BN_ French sequence listing_OP-17308-FR.txt <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22
    Met Leu Phe Thr Ile Gin Leu Ile Ile Ile Leu Ile Cys Leu Phe Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Lys Gly Gly Ile Ala Leu Gly Leu Leu Gly Gly Ile Gly 20 25 30 Leu val Ile Leu Val Phe val Phe Hi s Leu Gin Pro Gly Lys Pro Pro 35 40 45 Val Asp val Met Leu Val Ile Ile Ala Val Val Al a Ala Ser Ala Thr 50 55 60 Leu Gin Al a Ser Gly Gly Leu Asp Val Met Leu Gin Ile Al a Glu Lys 65 70 75 80 Leu Leu Arg Arg Asn Pro Lys Tyr Val Ser Ile Val Ala Pro Phe Val 85 90 95 Thr cys Thr Leu Thr île Leu cys Gly Thr Gly Hi s Val Val Tyr Thr 100 105 110 Ile Leu Pro Ile Ile Tyr Asp val Ala Ile Lys Asn Asn île Arg Pro 115 120 125 Glu Arg Pro Met Al a Ala Ser Ser île Gly Ala Gin Met Gly île île 130 135 140 Ala Ser Pro Val Ser Val Al a Val val Ser Leu Val Ala Met Leu Gly 145 150 155 160 Asn Val Thr Phe Asp Gly Arg Hi s Leu Glu Phe Leu Asp Leu Leu Ala 165 170 175 Ile Thr île Pro Ser Thr Leu île Gly Ile Leu Ala île Gly Ile Phe 180 185 190 Ser Trp Phe Arg Gly Lys Asp Leu ASp Lys Asp Glu Glu Phe Gin Lys 195 200 205 Phe île Ser val Pro Glu Asn Arg Glu Tyr val Tyr Gly Asp Thr Ala 210 215 220 Thr Leu Leu Asp Lys Lys Leu Pro Lys Ser Asn Trp Leu Ala Met Trp 225 230 235 240 Ile Phe Leu Gly Ala Ile Al a val val Ala Leu Leu Gly Al a Asp Ser 245 250 255 Asp Leu Arg Pro Ser Phe Gly Gly Lys Pro Leu Ser Met Val Leu Val 260 265 270 île Gin Met Phe Met Leu Leu Thr Gly Al a Leu Ile île Ile Leu Thr 275 280 285 Lys Thr Asn Pro Al a Ser Ile Ser Lys Asn Glu Val Phe Arg Ser Gly 290 295 300 Met Ile Ala île Val Al a Val Tyr Gly île Ala Trp Met Ala Glu Thr 305 310 315 320 Met Phe Gly Ala Hi s Met Ser Glu île Gin Gly val Leu Gly Glu Met 325 330 335 Val Lys Glu Tyr Pro Trp Ala Tyr Ala Ile val Leu Leu Leu val Ser 340 345 350 Lys Phe val Asn Ser Gin Ala Ala Al a Leu Ala Al a Ile Val Pro val 355 360 365 Ala Leu Al a Ile Gly val Asp Pro Ala Tyr Ile val Ala Ser Ala Pro 370 375 380 Al a Cys Tyr Gly Tyr Tyr Ile Leu Pro Thr Tyr Pro Ser Asp Leu Ala 385 390 395 400 Ala île Gin Phe Asp Arg Ser Gly Thr Thr Hi s île Gly Arg Phe Val 405 410 415 Ile Asn Hi s Ser Phe Ile Leu Pro Gly Leu Ile Gly Val Ser Val Ser 420 425 430 Cys Val Phe Gly Trp Ile Phe Ala Ala Met Tyr Gly Phe Leu 435 440 445
    Pge p
FR1759214A 2016-10-03 2017-10-03 Procede de production d'acides l-amines Active FR3056989B1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016195818 2016-10-03
JP2016195818 2016-10-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR3056989A1 true FR3056989A1 (fr) 2018-04-06
FR3056989B1 FR3056989B1 (fr) 2021-03-12

Family

ID=61701255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR1759214A Active FR3056989B1 (fr) 2016-10-03 2017-10-03 Procede de production d'acides l-amines

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10428359B2 (fr)
JP (1) JP2018057376A (fr)
CN (1) CN107893089B (fr)
BR (1) BR102017020967A2 (fr)
FR (1) FR3056989B1 (fr)
PE (1) PE20180743A1 (fr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109007846A (zh) * 2018-06-20 2018-12-18 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种限制性氨基酸营养复合包及其制备方法
CN109020854B (zh) * 2018-10-17 2020-10-27 浙江工业大学 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法
KR102075160B1 (ko) * 2018-12-13 2020-02-10 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
CN111334486B (zh) * 2019-04-30 2021-10-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用
CN111363694B (zh) * 2020-01-21 2022-05-06 中国科学院城市环境研究所 一株停滞棒杆菌、筛选方法及其用途
CN111471638B (zh) * 2020-05-22 2021-11-23 江南大学 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
CN112695036B (zh) * 2021-03-23 2021-07-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用
CN114829380B (zh) * 2021-04-12 2023-05-02 Cj第一制糖株式会社 新蛋白变体及使用其生产l-赖氨酸的方法
CN113046398A (zh) * 2021-05-18 2021-06-29 通辽梅花生物科技有限公司 一种稳定高效生产l-异亮氨酸的发酵方法及发酵稳定剂
CN114107141B (zh) * 2021-08-19 2022-07-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产l-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产l-脯氨酸的方法
CN116814514A (zh) * 2021-08-27 2023-09-29 胡丹 提高大肠杆菌l-赖氨酸发酵产量的方法
KR20230042953A (ko) * 2021-09-23 2023-03-30 씨제이제일제당 (주) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
CN116536226A (zh) * 2022-01-26 2023-08-04 廊坊梅花生物技术开发有限公司 产苏氨酸工程菌的构建方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030124685A1 (en) * 1999-02-01 2003-07-03 Yoko Kuwabara Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing l-arginine
AU2001293731A1 (en) 2000-09-19 2002-04-02 Degussa A.G. Nucleotide sequences coding for the dcta gene
DE10162650A1 (de) 2001-12-20 2003-07-03 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE10163167A1 (de) * 2001-12-21 2003-07-03 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und Verwendung coryneformer Bakterien
RU2268300C2 (ru) * 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
ATE463564T1 (de) 2004-08-10 2010-04-15 Ajinomoto Kk Verwendung von phosphoketolase zur herstellung geeigneter metabolite
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
CN101090911B (zh) 2004-12-28 2014-05-07 味之素株式会社 产生l-谷氨酸的微生物和产生l-谷氨酸的方法
CN101278041A (zh) * 2005-08-05 2008-10-01 密执安州大学 来自actinobacillus succinogenes130z（atcc 55618）用于从a.succinogenes c4－途径生产化学产品的基因
CN101374953B (zh) * 2006-01-27 2011-09-28 味之素株式会社 用于产生l-氨基酸的方法
JP2010041920A (ja) * 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
WO2014185430A1 (fr) 2013-05-13 2014-11-20 味の素株式会社 Procédé de fabrication d'acide aminé l
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP6623690B2 (ja) 2015-10-30 2019-12-25 味の素株式会社 グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
BR102017020967A2 (pt) 2019-01-22
US10428359B2 (en) 2019-10-01
JP2018057376A (ja) 2018-04-12
US20180094285A1 (en) 2018-04-05
FR3056989B1 (fr) 2021-03-12
PE20180743A1 (es) 2018-04-27
CN107893089A (zh) 2018-04-10
CN107893089B (zh) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107893089B (zh) 用于生产l-氨基酸的方法
EP3385389B1 (fr) Procédé de production d&#39;acides aminés l à partir de fructose
US11198894B2 (en) Method of producing an l-amino acid involving a carotenoid biosynthesis enzyme
US10787691B2 (en) Method for producing L-amino acid
US10563234B2 (en) Method for producing L-amino acids
US8313933B2 (en) L-amino acid producing bacterium and method for producing L-amino acid
US9487806B2 (en) Method for producing L-amino acid
US20150211033A1 (en) Method for Producing L-Amino Acid
JP2010200645A (ja) Ｌ−アミノ酸の製造法
US20150218605A1 (en) Method for Producing L-Amino Acid

Legal Events

Date Code Title Description
PLFP Fee payment

Year of fee payment: 2

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 3

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 4

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 5

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 6

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 7