KR20090033148A

KR20090033148A - 엔테로박테리아세애 과의 세균을 사용하여 아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20090033148A
Application number: KR1020080095229A
Authority: KR
Inventors: 루스템 사이도비치 샤쿨로프; 엘레나 비탈리에브나 클리아치코; 베라 게오르기에브나 도로셴코; 라리사 고틀리보브나 아이리흐
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2007-09-27
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2009-04-01
Also published as: CN101402935B; JP2009112300A; FR2922218A1; KR101094087B1; US20160265019A1; US20090137010A1; FR2922218B1; RU2007135818A; RU2396336C2; DE102008049533A1; CN101402935A; US9376695B2; JP5217850B2; US9708637B2

Abstract

전사될 수 있고, 서열번호 2에 제시된 펩티드 또는 이의 변이체, 특히 ssrA 유전자의 일부를 암호화하는 DNA 단편을, 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제 또는 포스포글루코스 이소머라제와 같이 L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 부착시켜 변형된 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 세균을 사용하여 발효에 의해, L-아미노산, 예를 들면, L-페닐알라닌 및 L-히스티딘을 생산하는 방법이 기술된다.

엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), ssrA-태그화, 코리스메이트 뮤타제, 프레페네이트 데하이드로게나제, 포스포글루코스 이소머라제, L-아미노산, L-페닐알라닌, L-히스티딘

Description

엔테로박테리아세애 과의 세균을 사용하여 아미노산을 생산하는 방법{Method for producing amino acids using bacterium of the Enterobacteriaceae family}

본 발명은 발효에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법, 및 보다 구체적으로는 이러한 발효에 도움을 주는 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자는 L-아미노산, 특히 L-페닐알라닌 및 L-히스티딘의 생산을 개선하는데 유용하다.

통상적으로, L-아미노산은 천연 공급원으로부터 수득한 미생물 균주 또는 이의 돌연변이체를 사용하는 발효 방법에 의해 산업적으로 생산한다. 통상적으로, 미생물을 변형시켜 L-아미노산의 생산 수율을 향상시킨다.

재조합 DNA를 사용한 미생물의 형질전환을 포함하여, L-아미노산 생산 수율을 향상시키는 많은 기술이 보고되었다[참조: 미국특허 제4,278,765호]. 생산 수율을 향상시키기 위한 다른 기술에는 아미노산 생합성에 관련된 효소의 활성을 증가시키는 방법 및/또는 생성되는 L-아미노산에 의한 피드백 억제(feedback inhibition)의 표적 효소를 탈감작화(desensitizing)시키는 방법[참조: 국제공개공 보 제WO 95/16042호 또는 미국특허 제4,346,170호, 제5,661,012호 및 제6,040,160호] 및 다른 경로에 대한 표적 화합물의 전구체를 사용하는 유전자에 결함이 있는 세균 균주를 생성시키는 방법 또는 표적 화합물의 분해를 담당하는 유전자에 결함이 있는 세균 균주를 생성시키는 방법이 포함된다.

일반적으로 이러한 조작으로 인해, 성장할 수 없거나, 상당히 감소된 속도로만 성장하거나, 아미노산과 같은 추가적인 영양소를 필요로 하는 균주가 생성된다. 예를 들면, 일부 유전자의 발현 향상이 과도해질 수 있고, 세균 성장이 상당히 억제되어, 그 결과, 표적 화합물을 생산하는 세균의 능력이 더 낮아질 수 있다.

상기한 문제를 방지할 수 있는 접근법은 탄소, 질소 또는 인 흐름(flux)의 분포 또는 세균 세포 외부로의 표적 물질의 배출에 관련된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 최적화시키는 것이다.

이러한 목표는 돌연변이를 아미노산- 또는 핵산-생합성 유전자의 프로모터 서열 속으로 도입하여[참조: 유럽특허원 제EP1033407A1호], 상이한 길이를 갖는 합성 프로모터의 라이브러리를 수득하고[참조: Jensen P.R., and Hammer K., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, No.1. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5], 인공 프로모터의 라이브러리를 생성하는 방법으로 종종 달성되었다[참조: PCT 출원 제WO03089605호].

SsrA RNA에 의해 암호화된 ssrA 펩티드 태그로 단백질을 태그화하면 태그화된 단백질이 단백질분해되도록 마킹(marking)된다는 것이 공지되어 있다[참조: Gottesmann S. and al, Genes&Dev.,12:1338-1347(1998)]. Ssr RNA (동의어: SsrA, tmRNA, 10Sa RNA, 트랜스퍼-메신저(transfer-messenger) RNA, SipB, B2621)는 "트랜스-해독(trans-translation)" 기전을 사용하여, tRNA 및 mRNA 둘 모두로서 작용하여 종결 코돈이 없는 "붕괴된(broken)" mRNA의 말단으로부터 정지된(stalled) 리보좀을 방출시키는 기능을 한다. SsrA는 또한 적당한 tRNA의 부재로 인하여 정지된 리보좀의 방출을 매개한다[참조: Hayes C.S. and al, PNAS, 99(6):3440-3445(2002)]. 다른 해독 문제도 SsrA 활성을 유도할 수 있다. 또한, SsrA RNA는 결함이 있는 mRNA의 분해를 자극한다[참조: Yamamoto Y. et al, RNA, 9:408-418(2003)].

SsrA RNA는 RNase P에 의해 프로세싱되고 알라닐-tRNA 신테타제에 의해 충전된 tRNA-유사 구조 영역을 함유한다[참조: Komine Y et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(20):9223-7(1994)]. SsrA RNA는, 메신저 RNA로서 작용하고, 초기의(nascent) 단백질에 부가되어 이러한 단백질이 분해되도록 표적화시키는 해독된 태그를 암호화하는 영역을 갖는다[참조: Tu G.-F. and al, J Biol Chem, 270(16):9322-9326(1995)]. SsrA RNA의 구조 및 해독 기전은 상세히 검사되었다[참조: Corvaisier S. et al, J Biol Chem, 278(17):14788-97(2003)]. SsrA RNA는 큰 전구체 RNA로서 전사되고 나서, 프로세싱되어 성숙한 RNA를 형성한다.

SsrA는 마이코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)[참조: Muto A. and al, Genes Cells, 7(5):509-19 (2002)], 디켈로박터 노도수스(Dichelobacter nodosus), 시네코코커스 종(Synechococcus sp.) 균주 PCC6301 및 PCC6803, 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium)으로부터의 RNA, 및 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus)로부터의 2-부분(two-piece) RNA와 유사하다. tmRNA 유전자는 세균 종의 확인을 위한 프로브로서 사용되었다[참조: Schonhuber W. and al, BMC Microbiology, 1(1):20 (2001)].

하지만, L-아미노산 생산, 예를 들면, L-페닐알라닌 또는 L-히스티딘 생산을 위한 ssrA-태그화의 사용을 기술한 보고는 없었다. 특히, L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소를 암호화하는 유전자의 바로 하류에 부착된, 서열번호 2의 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 DNA를 함유하는 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 세균의 사용은 이전에 기술되지 않았다.

본 발명의 양상은 A) L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소를 암호화하는 유전자, 및 B) 전사될 수 있고, 서열번호 2의 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하며, 상기 유전자의 3' 말단에서 상기 유전자에 부착된 DNA 단편을 포함하는 DNA를 포함하는, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 세균이 에스케리키아(Escherichia) 속(屬)에 속하는, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 세균이 L-페닐알라닌 생산 세균인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 효소가 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 세균이 L-히스티딘 생산 세균인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 효소가 포스포글루코스 이소머라제인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 상기의 세균을 배양 배지 중에서 배양하고, 배양 배지로부터 L-아미노산을 분리함을 포함하여, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 L-아미노산이 L-페닐알라닌인, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 L-아미노산이 L-히스티딘인, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 상기의 세균을 배양 배지 중에서 배양하여, 배지 중에 L-페닐알라닌이 생산되어 축적되게 하고, 아스파르트산 또는 이의 유도체 및 수득된 L-페닐알라닌으로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 합성함을 포함하여, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 L-페닐알라닌을 에스테르화시켜 L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생성시키고, N-아실-L-아스파르트산 무수물인 아스파르트산 유도체와 상기 L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 축합시켜, 반응 혼합물로부터 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 분리하고, 상기 N- 아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 수소화시켜, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생성시킴을 추가로 포함하여, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 양상에는 L-아미노산 생산 균주의 생산성을 향상시키는 것과 이러한 균주를 사용하여 L-아미노산을 생산하는 방법이 포함된다. 상기 양상은, 생합성 경로에서 다른 아미노산과 공통적인 단계를 공유하는 표적 아미노산의 생합성에 관련된 효소를 SsrA-태그화하여, 공통적인 생합성 단계 및/또는 전구체를 갖는 아미노산을 소비하면서 표적 아미노산의 생산을 향상시킬 수 있다는 연구결과에 의해 달성되었다. 상이한 해당(glycolysis) 경로 (예: 펜토스 포스페이트 및 엔트너-듀오도로프(Entner-Duodoroff) 경로) 사이의 탄소 흐름의 분포에 관련된 효소를 SsrA-태그화하여, 해당 경로 중 하나에서 생산된 전구체를 갖는 이러한 아미노산의 생산을 향상시킬 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 두 경우에, 변형된 세균의 독립영양(prototrophic) 특성이 유지된다는 것이 밝혀졌다.

이러한 목표는 새로운 변이 tyrA 유전자 및 새로운 변이 pgi 유전자를 작제하여, 생성되는 두 단백질이 ssrA 유전자의 일부에 의해 암호화된 C-말단의 짧은 펩티드 서열을 갖도록 하여 달성되었다. 천연 tyrA 유전자 대신에 돌연변이 tyrA -ssrA 유전자를 L-페닐알라닌 생산 균주의 세포 속으로 도입시키는 경우, 이러한 돌 연변이 TyrA-ssrA의 사용으로 L-페닐알라닌 생산이 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 천연 pgi 유전자 대신에 돌연변이 pgi - ssrA 유전자를 L-히스티딘 생산 균주의 세포 속으로 도입시키는 경우, 이러한 돌연변이 Pgi-ssrA의 사용으로 L-히스티딘 생산이 향상될 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 이와 같이, 본 발명이 완성되었다.

1. 본 발명의 세균

방향족 아미노산, 분지쇄 아미노산 등과 같은 일부 L-아미노산은 세포에 의한 생합성 과정에서 공통적인 전구체를 갖는다. 이러한 아미노산을 세균 균주에서 생산하는 경우, 표적화된 아미노산과 공통적인 전구체를 갖는 다른 아미노산에 대해 영양요구성(auxotrophic)인 균주를 제조하는 것이 유용하다. 이는 공통적인 전구체가 상기 표적화된 아미노산의 생합성 경로와 다른 방향으로 생합성을 지시하는 것을 방지할 수 있다.

공통적인 전구체를 갖는 아미노산에 대하여, 표적화된 아미노산의 생산을 보장하는 다른 방법은, 공통적인 전구체로부터의 다른 아미노산의 생산을 담당하는 효소에서 소위 "누출(leaky)" 돌연변이를 생성시키는 것이다. 이 경우에, 세균에서 이러한 L-아미노산의 합성이 억제되므로, 다른 L-아미노산(들)을 세균에 공급할 필요가 없다.

효소를 SsrA-태그화하면 효소 활성이 감소되는데, 그 이유는 전사된 ssrA-태그화된 RNA에 의해 RNase P를 통해 효소가 분해되고[참조: Komine Y et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(20):9223-7 (1994)], ssrA-태그화된 효소가 ClpXP 및 ClpAP 프로테아제에 의해 단백질분해되기 때문이다[참조: Wah D.A. et al, Chem. Biol., 9(11):1237-45 (2002)]. ssrA-태그화에 의한 이러한 변형은, 누출형 표현형을 나타내면서, 변형된 세균의 독립영양 특성이 유지되게 한다. 또한, ssrA-태그화는 이러한 부산물의 생합성에 관련된 하나 또는 다수의 효소의 활성을 감소시켜 부산물의 수준을 감소시킨다.

본 발명에서, "L-아미노산 생산 세균"은 세균을 배지 중에서 배양시키는 경우 배지 중에 L-아미노산이 축적되게 하는 능력을 갖는 세균을 의미한다. L-아미노산 생산 능력은 육종(breeding)에 의해 부여되거나 향상될 수 있다. 본원에서 사용되는 "L-아미노산 생산 세균"이라는 말은 이.콜라이(E. coli) 야생형 또는 모(母) 균주, 예를 들면 이.콜라이 K-12보다 많은 양으로 배양 배지 중에서 L-아미노산을 생산하여 축적되게 할 수 있는 세균을 또한 의미하고, 바람직하게는 미생물이 배지 중에 0.5 g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0 g/L 이상의 양의 표적 L-아미노산이 축적되게 할 수 있다는 것을 의미한다. "L-아미노산"이라는 용어에는 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린이 포함된다. L-히스티딘이 특히 바람직하다. 방향족 아미노산, 예를 들면, L-페닐알라닌, L-트립토판 및 L-티로신이 보다 바람직하고 L-페닐알라닌이 특히 바람직하다.

엔테로박테리아세애 과에는 에스케리키아(Escherichia), 엔테로박 터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 모르가넬라(Morganella) 등의 속에 속하는 세균이 포함된다. 구체적으로는, NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)에서 사용된 분류법에 따라 엔테로박테리아세애로 분류된 세균이 사용될 수 있다. 에스케리키아 또는 판토에아 속에 속하는 세균이 바람직하다.

"에스케리키아 속에 속하는 세균"이라는 말은 미생물학 분야의 숙련자에게 공지된 분류법에 따라 에스케리키아 속으로 분류된 세균을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 에스케리키아 속에 속하는 세균의 예에는 에스케리키아 콜라이(이.콜라이)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용될 수 있는 에스케리키아 속에 속하는 세균은 특별하게 제한되지 않는다; 하지만, 예를 들면, 문헌[참조: Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1]에 기술된 세균이 본 발명에 포함된다.

본 발명의 세균에는 L-아미노산을 생산하는 능력을 갖고, ssrA 유전자의 일부를 갖는 DNA 단편을 세균 효소를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 부착시켜 변형 된 엔테로박테리아세애 과의 균주가 포함된다. 상기 ssrA 유전자의 일부는 서열번호 2에 제시된 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하고, 상기 세균 효소는 표적화된 L-아미노산과 공통적인 전구체를 갖는 L-아미노산의 생합성 경로에 관련되어 있다. 또한, 본 발명의 세균에는 L-아미노산을 생산하는 능력을 갖고, ssrA 유전자의 일부를 암호화하는 DNA 단편으로 형질전환되어 DNA 단편에 의해 암호화된 펩티드의 구성요소가 발현되는 엔테로박테리아세애 과의 균주가 포함된다.

ssrA 유전자 (동의어: ECK2617, b2621, sipB)는 tmRNA (동의어: SsrA, 10Sa RNA, 트랜스퍼-메신저 RNA, SipB, B2621)를 암호화한다. ssrA 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 2753615번 내지 2753977번)는 이.콜라이 K-12의 염색체상에서 smpB와 i ntA 유전자 사이에 위치한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 ssrA 유전자는 서열번호 1에 제시되어 있다. tmRNA-암호화된 단백질분해 유도 펩티드 태그의 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다. 당해 펩티드는 서열번호 1에 제시된 ssrA 유전자의 90번 내지 119번 위치의 뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 다른 ssrA 유전자도 다음과 같이 밝혀졌다: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 플루레센스(Pseudomonas flurescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터의 tmRNA-암호화된 단백질분해 유도 펩티드 태그.

공통적인 전구체를 갖는 2개의 L-아미노산을 동시에 생산할 수 있는 세균을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적은 2개의 아미노산, 즉 L-페닐알라닌 및 L-티로신을 동시에 생산하도록 이전에 변형된 균주를 사용하여 달성되었다. 이러한 균주는 표준 레드 드리븐(Red-driven) 재조합 방법에 의해 전사 이중 조절인자, 즉 tyrR 유전자를 파괴시켜 수득할 수 있다. tyrR 유전자의 결실은 형질전환된 균주의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여 PCR에 의해 확인할 수 있다. L-아미노산을 생산할 수 있는 세균, 바람직하게는 페닐알라닌 및 티로신을 동시에 생산할 수 있는 세균이 사용될 수 있다. 이.콜라이MG1655 ΔtyrR은 이러한 균주의 예이다. 이.콜라이 균주 MG1655 ΔtyrR은 염색체 tyrR 유전자를 Cm 마커를 함유하는 DNA 카세트(cassette)로 대체하고 나서, 국제공개공보 제WO 05/010175호에 기술된 표준 기술을 사용하여 마커를 절단함에 의해 수득되었다. 또한, pgi 유전자를 ssrA-태그화에 의해 변형시켜 펜토스 포스페이트 경로로의 D-글루코스-6-포스페이트의 흐름이 증가되어 L-히스티딘의 생산성이 향상된 L-히스티딘 생산 균주도 포함되고 기술된다.

"전사될 수 있고, 서열번호 2의 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하며, 상기 유전자의 3' 말단에서 상기 유전자에 부착된 DNA 단편"이라는 말은 세균 효소를 암호화하는 유전자가 비-변형된 유전자 (예: 야생형 균주의 유전자)와 비교하여 3' 말단에 부가적인 뉴클레오티드 잔기를 갖도록 변형되었다는 것을 의미한다. 세균 효소를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 상기 DNA 단편 (서열번호 2 또는 이의 변이체를 암호화함)이 존재하면 태그화된 mRNA 종류가 형성되고, 해독된 상응하는 단백질은 단백질의 C-말단에 태그화되거나 부착된 부가적인 펩티드를 갖는다. 세균 효 소는 유전자 재조합, C-말단 연장, C-말단 융합 등을 포함하는 방법에 의해 변형될 수 있다. 변형된 효소 단백질의 길이는, 예를 들면, 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯(Western blot), 단백질 서열결정 등에 의해 측정할 수 있다. "서열번호 2의 펩티드 또는 이의 변이체를 단백질의 카복실 말단에 부착한다"는 말은 해독된 변형된 단백질이 제어가능한 속도로 분해되는 방식으로 세균에서 발현된다는 것을 의미할 수도 있다[참조: McGinness K.E. and al, Molecular Cell, 22:701-707 (2006)].

"전사될 수 있는 DNA 단편"이라는 말은 세균 효소를 암호화하는 유전자의 종결 코돈을 제거하고 필요한 DNA 단편을 유전자의 마지막 코돈 바로 다음에 도입시키는 방식으로 DNA 단편이 세균 효소를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 부착된 것을 의미한다. 이러한 DNA 작제물은 목적하는 DNA 단편을 태그화하는 하나의 전사 단위로서 관심대상(세균 효소)의 유전자의 mRNA로 전사된다. 이는 또한 ssrA-태그화된 단백질을 발현한다.

본 발명에서 사용되는 "이의 변이체"라는 말은 아미노산의 결실, 삽입, 부가 또는 치환이든지 간에 서열 내에 변화가 있지만, 목적하는 활성을 유용한 (예: 태그화된 단백질의 활성을 감소시켜 결과적으로 L-아미노산의 생산을 향상시키는데 유용한) 수준으로 여전히 유지하는 펩티드를 의미한다. 변이 펩티드 내의 변화의 수는 펩티드의 1차 구조에서 아미노산 잔기의 위치 또는 종류에 따라 달라진다. 변화의 수는 서열번호 2로서 열거된 펩티드의 경우 1개 내지 4개, 및 바람직하게는 1개 내지 2개일 수 있다. 변이체 내의 이러한 변화는 펩티드의 기능에 결정적이지 않은 펩티드의 영역 내에 존재할 수 있다. 그 이유는 일부 아미노산들은 서로에 대한 상동성이 높아서 활성이 이러한 변화에 의해 영향을 받지 않기 때문이다. 그러므로, 펩티드 변이체는, ssrA-태그화된 단백질이 이후의 분해를 일으키는 프로테아제에 의해 인식되는 한, 서열번호 2에 제시된 전체 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 및 보다 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 2개의 아미노산 서열 간의 상동성은 익히 공지된 방법을 사용하여, 예를 들면, 3개의 변수 (점수, 동일성 및 유사성)을 계산하는 컴퓨터 프로그램 BLAST 2.0을 사용하여 계산할 수 있다.

하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 활성이 유지되도록 보존적 돌연변이(들)이어야 한다. 대표적인 보존적 돌연변이는 보존적 치환이다. 보존적 치환의 예에는 Ala의 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg의 Gln, His 또는 Lys으로의 치환, Asn의 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp의 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys의 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln의 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg으로의 치환, Glu의 Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly의 Pro으로의 치환, His의 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr으로의 치환, Ile의 Leu, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Lue의 Ile, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Lys의 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg으로의 치환, Met의 Ile, Leu, Val 또는 Phe으로의 치환, Phe의 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu으로의 치환, Ser의 Thr 또는 Ala으로의 치환, Thr의 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp의 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr의 His, Phe 또는 Trp으로의 치환, 및 Val의 Met, Ile 또는 Leu으로의 치환이 포함된다.

바실러스 서브틸리스(BACSU), 바실러스 스테아로써모필루스(BACST), 세라티아 마르세센스(SERMA), 에스케리키아 콜라이(ECOLI), 슈도모나스 플루레센스(PSEFL), 슈도모나스 클로로라피스(PSECL), 슈도모나스 푸티다(PSEUPU)로부터의 tmRNA-암호화된 단백질분해 유도 펩티드 태그의 1차 서열을 비교하는 데이터는 C-말단에서 아미노산 서열 "YALAA"의 높은 수준의 상동성을 보여준다 (도 5 참조). 펩티드 활성을 저하시키지 않으면서 유사한 아미노산 잔기 (콜론(:)으로 표시되어 있음)를 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것이 가능하다. 하지만, 다른 비-보존된 아미노산 잔기를 변형시켜도 tmRNA-암호화된 단백질분해 유도 펩티드 태그의 활성이 변화되지 않을 수 있다. 문헌[참조: McGinness K.E. et al., Molecular Cell, 22:701-707 (2006)]에 언급된 펩티드 태그화된 아미노산 서열도 본 발명의 펩티드 변이체로서 고려될 수 있다.

태그 펩티드의 구성요소와 실질적으로 동일한 펩티드를 암호화하는 DNA는, 예를 들면, 태그 펩티드의 구성요소를 암호화하는 DNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 1)을 변형시켜, 예를 들면, 특정한 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하도록 부위-지시된 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 상기한 바와 같이 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해 수득할 수 있다. 이러한 처리에는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 하이드록실아민으로 처리하거나, DNA를 함유하는 세균을 UV 조사 또는 시약 (예: N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 아질산)으로 처리하는 것이 포함된다. 태그 펩티드와 실질적으로 동일한 펩티드를 암 호화하는 DNA는 상기한 돌연변이를 갖는 DNA를 적당한 세포에서 발현시키고 발현된 산물의 활성을 조사하여 수득할 수 있다. 태그 펩티드와 실질적으로 동일한 펩티드를 암호화하는 DNA는, 예를 들면, 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브와 엄중한(stringent) 조건 하에서 하이브리드화될 수 있고, 태그 펩티드의 활성을 갖는 펩티드를 암호화는 DNA를 분리하여 수득할 수도 있다. 본원에서 말하는 "엄중한 조건"은 소위 특이적인 하이브리드는 형성되고, 비-특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 예를 들면, 엄중한 조건은 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들면, 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 및 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화될 수 있지만, 이보다 낮은 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화될 수 없는 조건으로 예시될 수 있다. 또한, 엄중한 조건은 DNA가 서던 하이브리드화에서의 통상적인 세척 조건, 즉 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS (60℃에서)와 동등한 염 농도에서 하이브리드화될 수 있는 조건으로 예시될 수 있다. 세척 지속시간은 블롯팅에 사용되는 막의 종류 및, 일반적으로, 제조업자가 권장하는 것에 따라 달라진다. 예를 들면, 권장되는 세척 지속시간은, 예를 들면, Hybond™ N+ 나일론 막 [판매원: Amersham]의 경우, 엄중한 조건 하에서 대략 15분이다. 바람직하게는, 세척은 2 내지 3회 수행할 수 있다.

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분적인 서열도 프로브로서 사용될 수 있다. 프로브는, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 프라이머를 사용하 고, 주형으로서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 단편을 사용하여 PCR에 의해 제조할 수 있다.

상기한 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 또는 부가에는 태그 펩티드의 구성요소를 함유하는 세균의 종 또는 속에서의 변종으로 인하여 자연적으로 존재하는 돌연변이 (돌연변이체 또는 변이체)도 포함된다.

유전자의 3'-말단에 부착된 서열번호 2에 제시된 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 DNA 단편을 갖는 세균 유전자의 발현은, 펩티드를 암호화하는 DNA로 세균을 형질전환시킴에 의해, 및 보다 정확하게는, 암호화 프레임(frame)을 교란시키지 않으면서 세균 염색체에서 단백질을 암호화하는 유전자의 하류 속으로 DNA 단편을 도입시킴에 의해, 또는 바람직하게는, 통상적인 방법을 사용하여 천연 염색체 유전자를 태그화된 단백질을 암호화하는 돌연변이 유전자로 대체함에 의해 달성될 수 있다. DNA로 세균의 형질전환시키면 본 발명의 연장된 단백질을 암호화하는 새로운 염색체 돌연변이 유전자가 형성될 것이다. 형질전환 방법에는 현재까지 보고된 임의의 공지된 방법이 포함된다.

예를 들면, 다음의 방법을 사용하여 유전자 재조합에 의해 돌연변이 유전자를 암호화하는 DNA를 도입시킬 수 있다. 돌연변이 유전자를 제조하고, 세균을 돌연변이 유전자를 함유하는 DNA 단편으로 형질전환시킨다. 이어서, 염색체 상의 천연 유전자를 상동 재조합에 의해 돌연변이 유전자로 대체하여, 생성된 균주를 선별한다. 상동 재조합에 의한 이러한 유전자 대체는 "레드 드리븐(Red-driven) 통합"으로 공지된 선형 DNA를 사용하거나 [참조: Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)], 온도 민감성 복제를 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법에 의해 수행할 수 있다 [참조: 미국특허 제6,303,383호 또는 일본특허원 제JP 05-007491 A호]. DNA에 대한 세포의 투과성을 증가시키기 위하여, 수용 세포(recipient cell)를 염화칼슘으로 처리하는 방법이 에스케리키아 콜라이 K-12의 경우에 보고되었고 [참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol . Biol ., 53, 159 (1970)] 이러한 방법을 사용할 수 있다.

플라스미드 DNA의 제조 방법에는 DNA의 분해 및 연결, 형질전환, 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 선별 등, 또는 당업자에게 익히 공지된 기타 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술되어 있다.

본 발명에서, "L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소"라는 말은 바람직하지 않은 산물, 예를 들면, 표적화된 L-아미노산과 공통적인 전구체를 공유하는 산물의 생합성 경로에 관련된 효소를 의미한다. "바람직하지 않은 산물의 생합성 경로에 관련된 세균 효소"라는 말은 표적화된 L-아미노산의 공통적인 전구체 및 바람직하지 않은 산물로 전환되고 있는 바람직하지 않은 산물의 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 이는 효소가 바람직하지 않은 산물이 생산되게 하는 생합성 경로의 분지 이후로 반응을 지시하기 때문에 발생한다. "L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소"라는 말은 또한 표적화된 L-아미노산의 부산물의 생합성 경로에 관 련된 효소를 의미한다. 이러한 부산물의 존재는 정제 동안에 상당한 기술적 문제를 일으키고 L-아미노산 생산에 부정적인 영향을 줄 수 있다.

L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소를 암호화하는 유전자는 본 발명의 관심대상의 유전자이다. 이러한 유전자에는 대표적으로 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 tyrA 유전자, 포스포글루코스 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자, 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 ilvE 유전자, 트레오닌 데하이드라타제를 암호화하는 ilvA 및 tdcB 유전자, L-트레오닌 데아미나제를 암호화하는 sdaA 및 sdaB 유전자, N-아세틸글루타메이트 신타제를 암호화하는 argA 유전자, 아르기니노석시네이트 신타제를 암호화하는 argG 유전자, γ-글루타밀 키나제를 암호화하는 proB 유전자, 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자, 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 표적 L-아미노산의 경로로부터 벗어나서 생성되는 대사물질이 생산되게 하고/하거나 부산물의 형성에 관련된 효소를 암호화하는 임의의 유전자는 본 발명의 관심대상의 유전자이다.

코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제 (동의어: B2600, TyrA)는 티로신의 생합성 경로에서 중간 화합물인 코리스메이트와 프레페네이트 사이의 가역적인 전환 및 프레페네이트와 p-하이드록시페닐피루베이트 사이의 가역적인 전환을 촉매한다. 코리스메이트 전환은 티로신 및 페닐알라닌의 생합성에서 첫번째 단계이다. ssrA-태그화에 의한 TyrA 단백질의 변형은 L-티로신 생합성 경로로의 프레페네이트의 흐름을 감소시키고 L-페닐알라닌의 생산을 향상시키는데 유용할 수 있다. 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제의 활성은 2.5 mM 코리스메이트의 존재 하에서 정지 시간 검정(stopped-time assay)을 사용하거나, 0.8% 아가로스로 제조한 플레이트에서 효소-항체 복합체의 면역확산 분석에 의해 측정할 수 있다[참조: Rood J.I., Perrot B. et al., Eur J Biochem.; 124, 513-519 (1982)]. 에스케리키아 콜라이로부터 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 야생형 tyrA 유전자 (동의어: ECK2597, b2600)가 밝혀졌다. tyrA 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 2736970번 내지 2738091번에 대해 상보적인 뉴클레오티드)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 pheA와 aroF 유전자 사이에 위치한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 tyrA 유전자는 서열번호 3에 제시되어 있고, tyrA 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시되어 있다.

페닐알라닌의 생합성 경로에서, 프레페네이트와 페닐피루베이트 사이의 가역적인 전환은 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드라타제 (동의어: B2599, PheA)에 의해 촉매되고, 이의 서브유닛(subunit)은 이.콜라이에서 pheA 유전자 (동의어: ECK2596, b2599)에 의해 암호화된다. pheA 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2 gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 2735767번 내지 2736927번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 pheA 유전자 리더(leader) 펩티드와 tyrA 유전자 사이에 위치한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 pheA 유전자는 서열번호 5에 제시되어 있고, pheA 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시되어 있다. ssrA-태그화에 의한 TyrA 및 PheA 단백질의 동시적인 변형은 L-티로신 및 L-티로신 생합성 경로로의 코리스메이트의 흐름을 감소시키고 L-페닐알라닌의 생산을 향상시키는데 유용할 수 있다.

포스포글루코스 이소머라제 (동의어: B4025, Pgi, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, D-글루코스-6-포스페이트-케톨-이소머라제)는 글루코스신생합성(gluconeogenesis) 및 해당 경로에서 β-D-글루코스-6-포스페이트와 D-프럭토스-6-포스페이트 사이의 가역적인 전환을 촉매한다. 포스포글루코스 이소머라제 활성을 감소시키면 히스티딘 전구체 대사산물 5-포스포리보실 1-피로포스페이트가 생성되는 펜토스 포스페이트 경로로 탄소 흐름이 재분포된다. 포스포글루코스 이소머라제의 활성은, 예를 들면, G6P 데하이드로게나제를 사용하여 결합 검정 (coupled assay)에서 문헌[참조: Friedberg I., J Bacteriol., 112,3:1201-1205 (1972)]에 기술된 방법에 의해 검출할 수 있다[참조: Winkler H.H., J Bacteriol., 101, 2:470-475 (1970)]. 에스케리키아 콜라이로부터 글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 야생형 pgi 유전자 (동의어: ECK4017, b4025)가 밝혀졌다. pgi 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 4,231,781번 내지 4,233,430번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 lysC와 y jbE 유전자 사이에 위치한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 pgi 유전자는 서열번호 7에 제시되어 있고, pgi 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다.

분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 (동의어: B3770, IlvE)는 일련의 아미노기 전달반응을 촉매하는데, 각각의 반응에서 α-케토글루타레이트 및 3개의 지방 족 분지쇄 아미노산 중 하나가 생성된다. ssrA-태그화에 의한 IlvE 단백질의 변형은 L-발린 생합성 경로로의 2-케토이소발레레이트의 흐름을 감소시키고 (이는 또한 부산물로서의 L-이소류신의 양을 감소시킨다) L-류신의 생산을 향상시키는데 유용할 수 있다. 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제의 활성은, 예를 들면, 문헌[참조: Lee-Peng FC et al., J. Bacteriol., 139(2); 339-45 (1979)]에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 야생형 ilvE 유전자 (동의어: ECK3762, b3770, 트레오닌 데아미나제, L-트레오닌 하이드로리아제)가 밝혀졌다. ilvE 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 3,950,507번 내지 3,951,436번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 ilvM과 i lvD 유전자 사이에 위치한다.

트레오닌 데하이드라타제 (동의어: B3772, Ile, IlvA)는 L-트레오닌의 탈아미노화를 촉매한다. ssrA-태그화에 의한 IlvA 단백질의 변형은 L-아르기닌 생산에 유용할 뿐만 아니라, L-트레오닌 분해를 방지하고 L-이소류신 생합성 경로로의 L-트레오닌의 흐름을 감소시키는데 유용할 수 있다. 트레오닌 데하이드라타제의 활성은, 예를 들면, 문헌[참조: Eisenstein, E., J. Biol. Chem., 266(9);5801-7 (1991)]에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 트레오닌 데하이드라타제를 암호화하는 야생형 ilvA 유전자 (동의어: ECK3764, b3772, ile)가 밝혀졌다. ilvA 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 3,953,354번 내지 3,954,898번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 ilvD와 ilvY 유전자 사이에 위치한다.

트레오닌 데하이드라타제 (동의어: B3117, Tdc, TdcB, 트레오닌 데아미나제, L-세린 데하이드라타제, 세린 데아미나제, L-트레오닌 하이드로리아제)는 L-트레오닌의 탈아미노화를 촉매한다. ssrA-태그화에 의한 TdcB 단백질의 변형은 L-트레오닌 분해를 방지하고 L-이소류신 생합성 경로로의 L-트레오닌의 흐름을 감소시키는데 유용할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 트레오닌 데하이드라타제를 암호화하는 야생형 tdcB 유전자 (동의어: ECK3106, b3117, tdc)가 밝혀졌다. tdcB 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 3,263,061번 내지 3,264,050번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 tdcC와 t dcA 유전자 사이에 위치한다.

트레오닌 데아미나제 SdaA (동의어: B1814, SdaA, SDH1, L-SD, L-트레오닌 데아미나제 I, L-세린 데하이드라타제 1, SDH-1, L-SD1, L-하이드록시아미노산 데하이드라타제 1, L-세린 데아미나제 1, L-세린 하이드로-리아제 1) 및 SdaB (동의어: B2797, SdaB, L-트레오닌 데아미나제 II, L-세린 데아미나제 2, L-세린 데하이드라타제 2, SDH-2, L-SD2, L-세린 하이드로리아제 2)는 L-트레오닌의 탈아미노화를 촉매한다. ssrA-태그화에 의한 트레오닌 데아미나제 단백질의 변형은 L-트레오닌 분해를 방지하고 L-이소류신 생합성 경로로의 L-트레오닌의 흐름을 감소시키는데 유용할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 트레오닌 데아미나제를 암호화하는 야생형 sdaA 유전자 (동의어: ECK1812, b1814) 및 sdaB 유전자 (동의어: ECK2792, b2797)가 밝혀졌다. sdaA 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 1,894,956번 내지 1,896,320번)는 이.콜라이 K- 12의 염색체 상에서 yeaB와 yoaD 유전자 사이에 위치한다. sdaB 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 2,927,598번 내지 2,928,965번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 sdaC와 x ni 유전자 사이에 위치한다.

N-아세틸글루타메이트 신타제 (동의어: B2818, ArgA, NAGS, 아세틸-CoA:L-글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제, 아미노산-N-아세틸트랜스퍼라제)는 L-글루타메이트 및 아세틸-CoA로부터 N-아세틸글루타메이트의 합성을 촉매하는데, 이는 아르기닌 및 오르니틴 생합성의 수퍼경로(superpathway)에서 첫번째 단계이다. ssrA-태그화에 의한 ArgA 단백질의 변형은 L-프롤린 생산을 위한 글루타메이트를 축적시키는데 유용할 수 있다. N-아세틸글루타메이트 신타제의 활성은, 예를 들면, 문헌[참조: Marvil, D.K. and Leisinger, T., J. Biol. Chem., 252(10); 3295-303 (1977)]에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 N-아세틸글루타메이트 신타제를 암호화하는 야생형 argA 유전자 (동의어: ECK2814, Arg2, Arg1, b2818)가 밝혀졌다. argA 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 2,947,264번 내지 2,948,595번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 amiC와 recD 유전자 사이에 위치한다.

아르기니노석시네이트 신타제 (동의어: B3172, ArgG, 아르기니노석시네이트 신테타제, 시트룰린-아스파르테이트 리가제, L-시트룰린:L-아스파르테이트 리가제)는 L-아스파르테이트 및 시트룰린으로부터 아르기니노석시네이트의 합성을 촉매한다. ssrA-태그화에 의한 ArgG 단백질의 변형은 시트룰린 생산에 유용할 수 있다. 에스케리키아콜라이로부터 아르기니노석시네이트 신타제를 암호화하는 야생형 argG 유전자 (동의어: ECK3161, b3172)가 밝혀졌다. argG 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 3,316,659번 내지 3,318,002번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 argR과 yhbX 유전자 사이에 위치한다.

γ-글루타밀 키나제 (동의어: B0242, ProB, 글루타메이트 5-키나제, GK, ATP:L-글루타메이트 5-포스포트랜스퍼라제, G5K)는 글루타메이트 인산화 반응을 촉매하는데, 이는 프롤린의 합성에서 첫번째 반응이다. ssrA-태그화에 의한 ProB 단백질의 변형은 L-아르기닌 생산을 위한 글루타메이트를 축적시키는데 유용할 수 있다. γ-글루타밀 키나제의 활성은, 예를 들면, 문헌[참조: Smith, C.J. et al., J. Bacteriol., 157(2); 545-51 (1984)]에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 γ-글루타밀 키나제를 암호화하는 야생형 proB 유전자 (동의어: ECK0243, pro(2), b0242, pro2)가 밝혀졌다. proB 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 259,612번 내지 260,715번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 phoE와 p roA 유전자 사이에 위치한다.

호모세린 키나제 (동의어: B0003, ThrB, ATP:L-호모세린 O-포스포트랜스퍼라제)는 호모세린 인산화 반응을 촉매한다. ssrA-태그화에 의한 ThrB 단백질의 변형은 L-메티오닌 생산에 유용할 수 있다. 호모세린 키나제의 활성은, 예를 들면, 문헌[참조: Shames, S.L. and Wedler, F.C., Arch. Biochem. Biophys., 235(2); 359-70 (1984)]에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 호모세린 키나제를 암호화하는 야생형 thrB 유전자 (동의어: ECK0003, b0003)가 밝혀 졌다. thrB 유전자 (GenBank 등록번호 NC_000913.2, gi: 49175990의 서열에서 뉴클레오티드 2,801번 내지 3,733번)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상에서 thrA와 t hrC 유전자 사이에 위치한다.

호모세린 데하이드로게나제는 호모세린으로부터 L-아스파르테이트-세미알데히드의 형성 반응을 촉매한다. 에스케리키아 콜라이에서, 호모세린 데하이드로게나제는 thrA 유전자에 의해 암호화된 아스파르테이트 키나제/호모세린 데하이드로게나제 단백질의 일부이다. 하지만, 코리네박테리아(Corynebacteria)와 같은 다른 미생물에서, 호모세린 데하이드로게나제는 별도의 효소이다. ssrA-태그화에 의한 호모세린 데하이드로게나제의 변형은 L-리신 생산에 유용할 수 있다.

ssrA, tyrA, pheA, pgi, ilvE, ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, argA, agrG, proB, thrB 및 기타 관심대상의 유전자는 유전자의 공지된 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 제조된 프라이머를 사용하여 PCR (폴리머라제 연쇄 반응, 참조: White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989))에 의해 수득할 수 있다. 다른 미생물로부터의 태그 펩티드를 암호화하는 유전자는 유사한 방식으로 수득할 수 있다.

서열번호 2에 제시된 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사될 수 있는 DNA 단편을 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제 및 포스포글루코스 이소머라제를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 부착하기 위한 상기한 기술 및 설명은 기타 관심대상의 유전자로부터 전사된 다른 단백질의 활성을 변형시키는데 유사하게 적용될 수 있다.

본 발명의 세균은 앞서 언급한 DNA를 본래 L-아미노산을 생산하는 능력을 갖 는 세균 속으로 도입시켜 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 이미 상기 DNA를 함유하는 세균에 L-아미노산 생산 능력을 부여하여 수득할 수 있다.

L-아미노산 생산 세균

방향족 또는 비-방향족 L-아미노산을 생산할 수 있는 세균이 본 발명에서 사용될 수 있다.

L-페닐알라닌 생산 세균

본 발명의 L-페닐알라닌 생산 세균을 유도하기 위한 모(母) 균주의 예에는 에스케리키아 속에 속하는 균주, 예를 들면, 이.콜라이 AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197); 돌연변이 pheA34 유전자를 보유하는 이.콜라이 HW1089 (ATCC 55371) [참조: 미국특허 제5,354,672]; 이.콜라이 MWEC101-b (KR8903681); 이.콜라이 NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147 [참조: 미국특허 제4,407,952호]이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 모 균주로서, 이.콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), 이.콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), 이.콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) 및 AJ 12604로 명명된 이.콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)가 사용될 수 있다[참조: 유럽특허 제EP 488424 B1호]. 또한, yedA 유전자 또는 yddG 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성이 향상된 에스케리키아 속에 속하는 L-페닐알라닌 생산 세균도 사용될 수 있다[참조: 미국특허원 제2003/0148473 A1호 및 제2003/0157667 A1호].

L-히스티딘 생산 세균

본 발명의 L-히스티딘 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 에스케리키아 속에 속하는 균주, 예를 들면, 이.콜라이 균주 24 (VKPM B-5945, 러시아특허원 제RU2003677호), 이.콜라이 균주 80 (VKPM B-7270, 러시아특허 제RU2119536호); 이.콜라이 NRRL B-12116 내지 B-12121 [참조: 미국특허 제4,388,405호]; 이.콜라이 H-9342 (FERM BP-6675) 및 H-9343 (FERM BP-6676) [참조: 미국특허 제6,344,347호]; 이.콜라이 H-9341 (FERM BP-6674) [참조: 유럽특허 제EP1085087호]; 이.콜라이 AI80/pFM201 [참조: 미국특허 제6,258,554호] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 L-히스티딘 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현이 향상된 균주도 포함된다. 이러한 유전자의 예에는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로하이드롤라제 (hisI), 포스포리보실 ATP 피로포스포하이드롤라제 (hisIE), 포스포리보실포름이미노-5-아미노이미다졸 카복스아미드 리보티드 이소머라제 (hisA), 아미도트랜스퍼라제 (hisH), 히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (hisC), 하스티디놀 포스파타제 (hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제 (hisD) 등을 암호화하는 유전자가 포함된다.

hisG 및 hisBHAFI에 의해 암호화된 L-히스티딘 생합성 효소는 L-히스티딘에 의해 억제된다는 것이 공지되어 있으므로, L-히스티딘 생산 능력은 피드백 억제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이를 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 속으로 도입시킴에 의해 효율적으로 향상될 수도 있다[참조: 러시아특허 제2003677호 및 제2119536호].

L-히스티딘 생산 능력을 갖는 균주의 구체적인 예에는 L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 DNA를 보유하는 벡터가 도입된 이.콜라이 FERM-P 5038 및 5048 [참조: 일본특허 제JP 56-005099 A호], 아미노산 배출(export) 유전자인 rht가 도입된 이.콜라이 균주 [유럽특허 제EP1016710A호], 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신-내성이 부여된 이.콜라이 80 균주 (VKPM B-7270, 참조: 러시아특허 제2119536호) 등이 포함된다.

L-트립토판 생산 세균

본 발명의 L-트립토판 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 에스케리키아 속에 속하는 균주, 예를 들면, 돌연변이 trpS 유전자에 의해 암호화된 트립토파닐-tRNA 신테타제에 결함이 있는 이.콜라이 JP4735/pMU3028 (DSM10122) 및 JP6015/pMU91 (DSM10123) [참조: 미국특허 제5,756,345호]; 세린에 의해 피드백 억제되지 않는 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 serA 대립유전자(allele) 및 트립토판에 의해 피드백 억제되지 않는 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 trpE 대립유전자를 갖는 이.콜라이 SV164 (pGH5) [참조: 미국특허 제6,180,373호]; 트립토파나제 효소에 결함이 있는 이.콜라이 AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) [참조: 미국특허 제4,371,614호]; 포스포에놀피루베이트 생산 능력이 향상된 이.콜라이 AGX17/pGX50,pACKG4-pps [참조: 국제공개공보 제WO9708333, 미국특허 제6,319,696호] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. yedA 유전자 또는 yddG 유전자에 의해 암호화된 확인된 단백질의 활성이 향상된 에스케리키아 속에 속하는 L-트립토판 생산 세균도 사용될 수 있다[참조: 미국특허원 제2003/0148473 A1호 및 제2003/0157667 A1호].

본 발명의 L-트립토판 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 안트라닐레이트 신타제, 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 및 트립토판 신타제로부터 선택되는 효소의 하나 이상의 활성이 향상된 균주도 포함된다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 둘 모두는 L-트립토판 및 L-세린에 의해 피드백 억제되므로, 피드백 억제를 탈감작화시키는 돌연변이를 이러한 효소 속으로 도입시킬 수 있다. 이러한 돌연변이를 갖는 균주의 구체적인 예에는 탈감작화된 안트라닐레이트 신타제를 보유하는 이.콜라이 SV164, 및 피드백-탈감작화된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 돌연변이 serA 유전자를 함유하는 플라스미드 pGH5를 이.콜라이 SV164 속으로 도입시켜 수득된 형질전환된 균주가 포함된다[참조: 국제공개공보 제WO 94/08031호].

본 발명의 L-트립토판 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 탈감작화된 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 트립토판 오페론(operon)이 도입된 균주도 포함된다[참조: 일본특허 제JP 57-71397 A호, 제JP 62-244382 A호, 미국특허 제4,371,614호]. 또한, L-트립토판 생산 능력은, 트립토 판 오페론 (trpBA) 중에서 트립토판 신타제를 암호화하는 유전자의 발현을 향상시켜 부여될 수 있다. 트립토판 신타제는 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 암호화된 α 및 β 서브유닛으로 이루어진다. 또한, 이소시트레이트 리아제-말레이트 신타제 오페론의 발현을 향상시켜 L-트립토판 생산 능력을 개선시킬 수 있다[참조: 국제공개공보 제WO2005/103275호].

L-발린 생산 세균

본 발명의 L-발린 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 ilvGMEDA 오페론을 과발현하도록 변형된 균주가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다[참조: 미국특허 제5,998,178호]. 약화(attenuation)에 필요한 ilvGMEDA 오페론의 영역을 제거하여, 생산되는 L-발린에 의해 오페론의 발현이 약화되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 오페론 내의 ilvA 유전자를 파괴시켜 트레오닌 데아미나제 활성이 감소되게 한다.

본 발명의 L-발린 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 아미노-아실 t-RNA 신테타제의 돌연변이를 갖는 돌연변이체도 포함된다[참조: 미국특허 제5,658,766호]. 예를 들면, 이소류신 tRNA 신테타제를 암호화하는 ileS 유전자에 돌연변이를 갖는 이.콜라이 VL1970을 사용할 수 있다. 이.콜라이 VL1970은 러시안 내셔널 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오가니즘스(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny Proezd, 1)에 1988년 6월 24일에 수탁번호 VKPM B-4411 하에 기탁되었다.

또한, 성장하는데 리포산이 필요하고/하거나 H⁺-ATPase가 결핍된 돌연변이체도 모 균주로서 사용될 수 있다[참조: 국제공개공보 제WO96/06926호].

L- 이소류신 생산 세균

본 발명의 L-이소류신 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 6-디메틸아미노퓨린에 대해 내성을 갖는 돌연변이체[참조: 일본특허 제JP 5-304969 A호], 티아이소류신 및 이소류신 하이드록사메이트와 같은 이소류신 유사체에 대해 내성을 갖는 돌연변이체, 및 DL-에티오닌 및/또는 아르기닌 하이드록사메이트에 대해 추가적으로 내성을 갖는 돌연변이체[참조: 일본특허 제JP 5-130882 A호]가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 트레오닌 데아미나제 및 아세토하이드록세이트 신타제와 같이 L-이소류신 생합성에 관련된 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 균주도 모 균주로서 사용될 수 있다[참조: 일본특허 제JP 2-458 A호, 프랑스 특허원 제FR 0356739호 및 미국특허 제5,998,178호].

L-류신 생산 세균

본 발명의 L-류신 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 에스케리키아 속에 속하는 균주, 예를 들면, 류신에 대해 내성인 이.콜라이 균주 (예를 들면, 균주 57 (VKPM B-7386, 미국특허 제6,124,121호)) 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신을 포함하는 류신 유사체에 대해 내성인 이.콜라이 균주[참조: 일본특허 제JP 62-34397 B호 및 제JP 8-70879 A호]; 국제공개공보 제WO96/06926호에 기술된 유전자 조작 방법에 의해 수득된 이.콜라이 균주; 이.콜라이 H-9068[참조: 일본특허 제JP 8-70879 A호] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

L-류신 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자의 발현을 향상시켜, 본 발명의 세균을 개선시킬 수 있다. 이러한 유전자의 예에는 leuABCD 오페론의 유전자가 포함되고, 이는 바람직하게는 L-류신에 의해 피드백 억제되지 않는 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 돌연변이 leuA 유전자로 대표된다[참조: 미국특허 제6,403,342호]. 또한, 세균 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 향상시켜, 본 발명의 세균을 개선시킬 수 있다. 이러한 유전자의 예에는 b2682 및 b2683 유전자 (ygaZH 유전자)가 포함된다[참조: 유럽특허 제EP 1239041 A2호].

L-아르기닌 생산 세균

본 발명의 L-아르기닌 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 에스케리키아 속에 속하는 균주, 예를 들면, 이.콜라이 균주 237(VKPM B-7925)[참조: 미국특허원 제2002/058315 A1호] 및 돌연변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 보유하는 이의 유도 균주[참조: 러시아 특허원 제2001112869호], 이.콜라이 균주 382(VKPM B-7926)[참조: 유럽특허 제EP1170358A1호], N-아세틸글루타메이트 신테타제를 암호화하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산 균주[참조: 유럽특허 제EP1170361A1호] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 L-아르기닌 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 L-아르기닌 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현이 향상된 균주도 포함된다. 이러한 유전자의 예에는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 (argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제 (argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 (argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 (argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제 (argF), 아르기니노석신산 신테타제 (argG), 아르기니노석신산 리아제 (argH) 및 카바모일 포스페이트 신테타제 (carAB)를 암호화하는 유전자가 포함된다.

L- 시트룰린 생산 세균

본 발명의 L-시트룰린 생산 세균을 유도하기 위한 모 균주의 예에는 돌연변이체 피드백 내성 카바모일포스페이트 신테타제를 함유하는 에스케리키아 속에 속하는 균주 [참조: 미국특허 제6,991,924호] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

2. 본 발명의 방법

본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지 중에서 배양하여, L-아미노산이 생산되어 배지 속으로 배출되게 하고, 배지로부터 L-아미노산을 수거함에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법이다.

본 발명에서, 배양, 배지로부터 L-아미노산의 수거 및 정제 등은 세균을 사용하여 아미노산을 생산하는 통상적인 발효 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있 다.

배양에 사용되는 배지는, 탄소원 및 질소원 및 미네랄, 및 필요한 경우, 세균이 성장하는데 필요한 적당량의 영양소가 포함되는 한, 합성 또는 천연 배지일 수 있다. 탄소원에는 글루코스 및 수크로스와 같은 다양한 탄수화물 및 다양한 유기산이 포함될 수 있다. 사용되는 미생물의 동화(assimilation) 방식에 따라, 에탄올 및 글리세롤을 포함하는 알콜이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아 및 황산암모늄과 같은 다양한 암모늄염; 아민과 같은 기타 질소 화합물; 펩톤, 대두 가수분해물 및 분해된 발효 미생물과 같은 천연 질소원이 사용될 수 있다. 미네랄로서, 일인산칼륨 또는 이인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 염화칼슘 등이 사용될 수 있다. 비타민으로서, 티아민, 효모 추출물 등이 사용될 수 있다.

배양은 바람직하게는 통기시키면서 하는 진탕 배양 및 교반 배양과 같이, 호기 상태 하에서, 20 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 38℃의 온도에서 수행한다. 배양물의 pH는 일반적으로 5 내지 9, 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양물의 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 다양한 산, 다양한 염기 및 완충액으로 조절할 수 있다. 일반적으로, 1 내지 5일간 배양하면 표적 L-아미노산이 액체 배지 중에 축적된다.

배양한 후, 세포와 같은 고체를 원심분리 또는 막여과에 의해 액체 배지로부터 제거하고 나서, L-아미노산을 수거하여 이온 교환, 농축 및/또는 결정화 방법에 의해 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 페닐알라닌은, 예를 들면, α-L-아스파르틸- L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르("아스파르탐"이라고도 함)를 생산하는데 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 L-페닐알라닌을 원료로서 사용하여 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생산하는 것을 포함한다. 당해 방법은 상기한 본 발명의 방법에 의해 생산된 L-페닐알라닌 및 아스파르트산 또는 이의 유도체로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 합성함을 포함한다. 저급 알킬 에스테르로서, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 및 프로필 에스테르 등이 언급될 수 있다.

본 발명의 방법에서, L-페닐알라닌 및 아스파르트산 또는 이의 유도체로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 합성하는 공정은 특별하게 제한되지 않고, L-페닐알라닌 또는 이의 유도체가 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르의 합성에 사용될 수 있는 한, 임의의 통상적인 방법을 적용할 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르는 다음의 공정에 의해 생산될 수 있다[참조: 미국특허 제3,786,039호]. L-페닐알라닌을 에스테르화시켜 L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 수득한다. 이어서, L-페닐알라닌 알킬 에스테르를 아미노 그룹 및 β-카복실 그룹이 보호된 L-아스파르트산 유도체화 반응시키고, α-카보닐 그룹을 에스테르화시켜 활성화시킨다. 유도체에는 N-포르밀-, N-카보벤즈옥시- 또는 N-p-메톡시카보벤즈옥시-L-아스파르트산 무수물과 같은 N-아실-L-아스파르트산 무수물이 포함된다. 축합 반응에 의해, N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 및 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 혼합물이 수득된다. 37℃에서 10^-4 이하의 산 해리 상수를 갖는 유기산의 존재 하에서 축합 반응을 수행하면, 혼합물 중에서 α 형태 대 β 형태의 비가 증가한다[참조: 일본특허공개공보 제51-113841호]. 이어서, N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌을 혼합물로부터 분리하고 나서, 수소화시켜 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌을 수득한다.

본 발명은 다음의 비제한적 실시예를 참조하여 아래에 보다 구체적으로 설명될 것이다.

실시예 1. 돌연변이 tyrA - ssrA 유전자를 함유하는 이. 콜라이 균주 MG1655 △ tyrRtyrA-ssrA 의 작제

1. 이.콜라이에서 천연 pheA 유전자 및 tyrA 유전자 영역의 3' 말단에 위치한 36-nt의 돌연변이 tyrA - ssrA 유전자로의 대체

천연 pheA 유전자 및 tyrA 유전자 영역의 3' 말단에 위치한 36-nt를 대체하기 위하여, 1) pheA 유전자의 5' 말단에 위치한 36-nt, 2) attL 및 attR 부위를 갖는 cat 유전자, 3) 클로람페니콜 내성 마커(Cm^R)를 암호화하는 DNA 단편, 4) 종결 코돈 TAA, 5) ssrA 유전자의 90번 내지 119번 위치에 위치한 30-nt, 및 6) tyrA 유전자의 3' 말단에 위치한 36-nt를 보유하는 DNA 단편을, "레드(Red)-매개된 통합" 및/또는 "레드-드리븐 통합"이라고도 하는 문헌[참조: Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645]에 기술된 방법에 의해 천연 pheA 유전자 및 3'-말단 tyrA 유전자 영역 대신에 이.콜라이 MG1655 △tyrR의 염색체 속으로 통합시켰다 (도 1).

상기 DNA 단편은, 제1 PCR로부터의 5㎕의 증폭 산물을 제2 PCR을 위한 주형으로서 사용한 연속적인 2회의 PCR 수행에서 수득하였다.

cat 유전자에 의해 암호화된 Cm^R 마커를 함유하는 제1 DNA 단편은 프라이머 P1 (서열번호 9) 및 P2 (서열번호 10) 및 주형으로서의 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다[참조: 국제공개공보 제WO 05/010175호] (도 2). 프라이머 P1은 pheA 유전자의 5' 말단에 위치한 36-nt 영역과 동일한 영역 및 pMW118-attL-Cm-attR의 27-nt attL 영역에 대해 상보적인 영역 둘 모두를 함유한다. 프라이머 P2는 ssrA 유전자의 30-nt 영역과 동일한 영역 및 pMW118-attL-Cm-attR의 27-nt attR 영역에 대해 상보적인 영역 둘 모두를 함유한다. 상기 두 영역 사이에, 종결 코돈 TAA를 프라이머 P2에 삽입하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 5분 동안 95℃에서 변성; 30 사이클의 프로파일: 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분; 최종 단계: 72℃에서 5분.

1709-bp PCR 산물을 수득하여 아가로스 겔에서 정제하고, 이의 5㎕를 프라이머 P1 (서열번호 9) 및 P3 (서열번호 11)을 사용한 제2 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 프라이머 P3은 tyrA 유전자의 3' 말단에 위치한 36-nt 영역에 대해 상보적인 영역 및 프라이머 P2의 5'-말단에 위치한 18-nt 영역과 동일한 영역 둘 모두를 함유한다. PCR 조건은 다음과 같았다: 5분 동안 95℃에서 변성; 30 사 이클의 프로파일: 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분; 최종 단계: 72℃에서 5분.

1745-bp PCR 산물을 수득하여 아가로스 겔에서 정제하고, 온도 민감성 복제 오리진(replication origin)을 갖는 플라스미드 pKD46을 함유하는 이.콜라이 균주 MG1655△tyrR의 전기천공(electroporation)에 사용하였다. 플라스미드 pKD46[참조: Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45]은 파지 λ의 2,154 뉴클레오티드 DNA 단편 (GenBank 등록번호 J02459, 뉴클레오티드 31088번 내지 33241번 위치)을 포함하고, 아라비노스-유도성 P_araB 프로모터의 조절하에 있는 λ 레드 상동 재조합 시스템의 유전자 (γ, β, exo 유전자)를 함유한다. 플라스미드 pKD46은 천연 pheA 유전자 및 tyrA 유전자 영역의 3' 말단에 위치한 36-nt 대신에 PCR 산물을 이.콜라이 균주 MG1655△tyrR의 염색체 속으로 통합시키는데 필요하다.

일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포를 다음과 같이 제조하였다: 이.콜라이 MG1655△tyrR/pKD46을 암피실린(100mg/l)을 함유하는 LB 배지 중에서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시키고, 배양물을 암피실린 및 L-아라비노스(10mM)를 함유하는 [아라비노스는 레드 시스템 유전자를 암호화하는 플라스미드를 유도하기 위하여 사용되었다] SOB 배지 5 ml로 100배 희석시켰다[참조: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. 세포를 OD₆₀₀이 약 0.6이 될 때까지 30℃에서 통기시키면서 성장시 키고 나서, 100배 농축시키고 빙냉 탈이온 H₂O로 3회 세척하여 일렉트로컴피턴트 세포로 만들었다. 70㎕의 세포 및 약 100 ng의 PCR 산물을 사용하여 전기천공을 수행하였다. 전기천공은 "바이오래드(BioRad)" 전기천공기 (USA, 제품번호 165-2098, 버전 2-89)를 제조업자의 지침서에 따라 사용하여 수행하였다. 충격된 세포를 1ml의 SOC 배지로 희석시켜[참조: Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 37℃에서 2시간 동안 항온배양하고 나서, 클로람페니콜(20㎍/ml)을 함유하는 L-한천 상에 스프레딩(spreading)하고 37℃에서 성장시켜 Cm^R 재조합체를 선별하였다.

2. PCR에 의한 pheA 유전자 결실의 확인

24시간의 성장 후, 좌(locus)-특이적 프라이머 P4 (서열번호 12) 및 P5 (서열번호 13)를 사용하여 PCR에 의해 Cm^R 마커의 존재에 대해 콜로니를 검사하였다. 이를 위하여, 새롭게 분리한 콜로니를 물(20㎕)에 현탁시켜, 수득된 현탁액 중 1㎕를 PCR에 사용하였다. 온도 프로파일은 다음과 같았다: 95℃에서 5분 동안 초기 DNA 변성; 이후 30 사이클 (95℃에서 30초 동안 변성, 50℃에서 30초 동안 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분 10초 동안 연장) 및 72℃에서 5분 동안 최종 연장.

검사한 Cm^R 콜로니 중 소수의 콜로니는, 필요한 2373-bp DNA 단편을 함유하 여, 하이브리드 tyrA-ssrA 유전자에 의한 pheA 유전자의 1869-bp 천연 영역의 대체가 확인되었다 (도 1 및 3을 참조). 생성된 돌연변이 균주를 MG1655 △tyrR △pheA::cat tyrA - ssrA라고 명명하였다.

3. 이.콜라이 MG1655 △tyrR △pheA::cat tyrA - ssrA 균주에서 cat 유전자의 야생형 pheA 유전자로의 대체

cat 유전자를 대체하기 위하여, 야생형 pheA 유전자를 보유하는 DNA 단편을, "레드-매개된 통합" 및/또는 "레드-드리븐 통합"이라고도 하는 문헌[참조: Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645]에 기술된 방법에 의해 cat 유전자 대신에 이.콜라이 MG1655 △tyrR △pheA::cat tyrA-ssrA/pKD46의 염색체 속으로 통합시켰고, 이는 실시예 1에도 기술되어 있다 (도 3).

야생형 pheA 유전자는 주형으로서의 이.콜라이 MG1655의 염색체 DNA 및 프라이머 P4 (서열번호 12) 및 P6 (서열번호 14)을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다.

프라이머 P6은 종결 코돈 TAA를 갖는 ssrA 유전자의 90번 내지 119번 위치에 위치한 영역과 동일한 30-nt 영역 및 pheA 유전자의 3' 말단에 위치한 19-nt 영역에 대해 상보적인 영역 둘 모두를 함유한다.

PCR 조건은 다음과 같았다: 5분 동안 95℃에서 변성; 30 사이클의 프로파일: 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분; 최종 단계: 72℃에서 5분.

증폭된 DNA 단편을 아가로스 겔-전기영동에 의해 정제하여, "진일루트 스핀 칼럼(GenElute Spin Columns)"[판매원: "시그마(Sigma)", USA]을 사용하여 추출하고, 에탄올에 의해 침전시켰다. 수득된 DNA 단편은, 이전에 기술된 바와 같이 전기천공 및 이.콜라이 MG1655 △tyrR △pheA::cat tyrA - ssrA/pKD46의 세균 염색체 속으로의 레드-매개된 통합에 사용하였다. 생성된 이.콜라이 균주 MG1655 △tyrR tyrA -ssrA/pKD46을 최소 배지 M9 상에서 선별하였다. 배지 중의 L-페닐알라닌의 부재는 Phe⁺이고 독립영양 특성을 갖는 콜로니의 선별을 가능하게 하였다.

4. PCR에 의한 pheA 유전자 재작제의 확인

24시간의 성장 후, 좌-특이적 프라이머 P4 (서열번호 12) 및 P5 (서열번호 13)를 사용하여 PCR에 의해 pheA 유전자의 존재에 대해 콜로니를 검사하였다. 이를 위하여, 새롭게 분리한 콜로니를 물(20㎕)에 현탁시켜, 수득된 현탁액 중 1㎕를 PCR에 사용하였다. 온도 프로파일은 다음과 같았다: 95℃에서 5분 동안 초기 DNA 변성; 이후 30 사이클 (95℃에서 30초 동안 변성, 50℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 10초 동안 연장) 및 72℃에서 5분 동안 최종 연장.

검사한 Phe⁺ 콜로니 중 소수의 콜로니는, 필요한 1827-bp DNA 단편을 함유하여, pheA 유전자에 의한 cat 유전자의 2373-bp 영역의 대체가 확인되었다 (도 2를 참조). 생성된 돌연변이 균주를 MG1655 △tyrR tyrA - ssrA/pKD46이라고 명명하였다 (도 4).

이어서, pKD46 플라스미드를 제거하기 위하여, 42℃에서 Cm을 갖는 L-한천 상에서 2회 계대배양을 수행하여 나타난 콜로니를 암피실린에 대한 민감성에 대해 검사하였다.

이어서, 돌연변이 tyrA 유전자를 갖고 tyrR 유전자가 없는 균주를 수득하였다. 상기 균주를 MG1655△tyrRtyrA - ssrA라고 명명하였다.

실시예 2. tyrA 유전자의 ssrA 태그화가 L-페닐알라닌 생산에 미치는 영향

이어서, 이.콜라이 균주 MG1655 △tyrR tyrA - ssrA 및 MG1655 △tyrR을 각각 37℃에서 18시간 동안 영양 브로쓰(broth) 중에서 배양하고, 0.3ml의 각각의 상기 배양물을 20x200 mm 시험관 내에 다음의 조성을 갖는 3ml의 발효 배지 속에 접종하여, 32℃에서 72시간 동안 회전 진탕기로 배양하였다.

배양 후, 배지 중의 L-페닐알라닌 및 L-티로신의 축적량을 TLC로 측정하였다. 분취량(1 내지 2㎕)의 배양 브로쓰로 스폿팅(spotting)한 박층 실리카겔 플레이트(10x15cm)를 현상 용매 (2-프로판올 : 에틸 아세테이트 : 암모니아 : 물 = 16 : 16 : 3 : 9)로 현상하고, L-페닐알라닌 및 L-티로신을 닌히드린 시약으로 검출하였다. 4개의 관의 발효 결과는 표 1에 제시되어 있다.

발효 배지의 조성은 다음과 같았다 (g/l):

글루코스	40.0
(NH₄)₂SO₄	16.0
K₂HPO₄	1.0
MgSO₄·7H₂O	1.0
MnSO₄·5H₂O	0.01
FeSO₄·7H₂O	0.01
효모 추출물	2.0
CaCO₃	30.0

MgSO₄·7H₂O 및 CaCO₃를 각각 별도로 멸균시켰다.

표 1에서 MG1655 △tyrR tyrA - ssrA는 MG1655 △tyrR과 비교하여 L-페닐알라닌은 더 많은 양을 축적하고 L-티로신은 더 적은 양을 축적하였다는 것을 볼 수 있다.

실시예 3. pgi 유전자의 ssrA 태그화가 L-히스티딘 생산에 미치는 영향

펩티드 서열번호 2 또는 서열번호 15로 태그화된 pgi 유전자를 갖는 L-히스티딘 생산 균주를 수득하였다. 상기 두 펩티드는 말단 아미노산 잔기 중 하나의 치환, 즉 알라닌 또는 발린이 상이하다. 상기 균주는 다음과 같이 수득하였다. 첫번째로, 펩티드 서열번호 2 또는 서열번호 15를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 추가적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 pgi 유전자의 2개의 변이체를, 이.콜라이 균주 MG1655의 염색체 DNA 및 프라이머 pgi1 (서열번호 16) 및 pgi-LAA (서열번호 17) 또는 pgiLVA (서열번호 18)를 각각 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 프라이머 pgi1은 pgi 유전자의 5' 말단에 대해 상보적이고 이의 5'-말단에 SacI 제한 부위를 함유한다. 프라이머 pgi-LVA 및 pgi-LAA는 종결 코돈이 없는 pgi 유전자의 3'-말단의 영역, 짧은 펩티드 서열번호 2 또는 서열번호 15를 각각 암호화하는 영역, 종결 코돈, 및 이의 5'-말단에 XbaI 제한 부위를 함유한다. 두번째로, 2개의 PCR 단편을 개별적으로 SacI 및 XbaI 리스트릭타제(restrictase)로 처리하여, 동일한 리스트릭타제로 이전에 처리한 pMW119 플라스미드 속에 연결시켰다. 생성된 플 라스미드를 pMW-pgi-ssrA^LAA 및 pMWpgi-ssrA^LVA라고 각각 명명하였다.

이어서, 야생형 pgi 유전자를 L-히스티딘 생산 균주 80에서 결실시켰다.

이를 위하여, cat 유전자에 의해 암호화된 Cm^R 마커를 함유하는 DNA 단편을, 프라이머 P7 (서열번호 19) 및 P8 (서열번호 20) 및 주형으로서의 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다[참조: 국제공개공보 제WO 05/010175호] (도 2). 프라이머 P7은 pgi 유전자의 5' 말단에 위치한 36-nt 영역과 동일한 영역 및 pMW118-attL-Cm-attR의 28-nt attR 영역에 대해 상보적인 영역 둘 모두를 함유한다. 프라이머 P8은 pgi 유전자의 3' 말단에 위치한 36-nt 영역과 동일한 영역 및 pMW118-attL-Cm-attR의 28-nt attL 영역에 대해 상보적인 영역 둘 모두를 함유한다. 수득된 PCR 단편의 PCR 및 전기천공을 상기한 바와 같이 수행하였다 (실시예 1의 1번 항목을 참조).

pgi 유전자의 결실을 좌-특이적 프라이머 P9 (서열번호 21) 및 서열번호 P10 (서열번호 22)을 사용하여 PCR에 의해 확인하였다. 이를 위하여, 새롭게 분리한 콜로니를 물(20㎕)에 현탁시켜, 당해 현탁액 중 1㎕를 PCR에 사용하였다. 온도 프로파일은 다음과 같았다: 95℃에서 5분 동안 초기 DNA 변성; 이후 30 사이클 (95℃에서 30초 동안 변성, 50℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 10초 동안 연장) 및 72℃에서 5분 동안 최종 연장.

검사한 Cm^R 콜로니 중 소수의 콜로니는, 필요한 1709-bp DNA 단편을 함유하여, cat 유전자에 의한 pgi 유전자의 1651-bp 천연 영역의 대체가 확인되었다. 생 성된 돌연변이 균주를 80 △pgi라고 명명하였다.

수득된 균주 80 △pgi를 상기한 바와 같이 플라스미드 pMW-pgi-ssrA^LAA 및 pMW-pgi-ssrA^LVA로 형질전환시켰다. 생성된 균주를 80 △pgi/pMW-pgi-ssrA^LAA 및 80 △pgi/pMW-pgi-ssrA^LVA라고 각각 명명하였다.

소형병 배치 발효(mini-jar batch-fermentation)를 위하여, L-한천 상에서 성장시킨 각각의 균주 80, 80 △pgi/pMW-pgi-ssrA^LAA 및 80 △pgi/pMW-pgi-ssrA^LVA의 하나의 루프(loop)를 L-브로쓰로 옮기고, 배양물의 광학 밀도 OD₅₄₀이 약 2.0에 도달할 때까지 30℃에서 회전시키면서(140 rpm) 배양하였다. 이어서, 25 ml의 시드(seed) 배양물을 250 ml의 발효용 배지에 첨가하여 29℃에서 회전시키면서(1500 rpm) 배양하였다. 배치 발효의 지속시간은 대략 35 내지 40시간이었다. 배양 후, 배지 중에 축적된 히스티딘의 양을 종이 크로마토그래피로 측정하였다. 종이를 이동상, 즉 n-부탄올 : 아세트산 : 물 = 4 : 1 : 1 (v/v)로 전개시켰다. 아세톤 중의 닌히드린의 용액(0.5%)을 가시화 시약으로서 사용하였다. 결과가 표 2에 제시되어 있다. 표 2에서 균주 80 △pgi/pMW-pgi-ssrA^LAA 및 80 △pgi/pMW-pgi-ssrA^LVA는 균주 80과 비교하여 더 많은 양의 L-히스티딘을 축적하였다는 것을 볼 수 있다.

발효 배지(pH 6.0)의 조성은 다음과 같았다 (g/l):

글루코스	50.0
마메노(Mameno)	0.2의 TN
(NH₄)₂SO₄	8.0
KH₂PO₄	0.5
MgSO₄ 7H₂O	0.4
FeSO₄ 7H₂O	0.02
MnSO₄	0.02
티아민	0.001
베타인	2.0
L-프롤린	0.8
L-글루타메이트	3.0
L-아스파르테이트	1.0
아데노신	0.2

본 발명을 이의 바람직한 양태를 참조하여 상세하게 기술하였지만, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서, 다양한 변화가 이루어질 수 있고 동등물이 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 본 출원의 일부로서 참조로서 인용된다.

도 1은 tyrA 유전자 연장에 관한 도식을 보여준다.

도 2는 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR 상에서 프라이머 P1 및 P2의 상대적인 위치를 보여준다.

도 3은 결실된 pheA 유전자를 갖는 염색체 DNA 단편의 작제를 보여준다.

도 4는 pheA 유전자를 사용한 cat 유전자 좌의 대체에 관한 도식을 보여준다.

도 5는 바실러스 서브틸리스(BACSU), 바실러스 스테아로써모필루스(BACST), 세라티아 마르세센스(SERMA), 에스케리키아 콜라이(ECOLI), 슈도모나스 플루레센스(PSEFL), 슈도모나스 클로로라피스(PSECL), 슈도모나스 푸티다(PSEUPU)로부터의 tmRNA-암호화된 단백질분해-유도 펩티드 태그의 1차 서열의 정렬을 보여준다. 정렬은 PIR 다중 정렬(Multiple Alignment) 프로그램(http://pir.georgetown.edu)을 사용하여 수행하였다. 동일한 아미노산은 별표(*)로 표시되어 있고, 유사한 아미노산은 콜론(:)으로 표시되어 있다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for producing amino acids using bacterium of the Enterobacteriaceae family <130> ssrA <150> RU2007135818 <151> 2007-09-27 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 ggggctgatt ctggattcga cgggatttgc gaaacccaag gtgcatgccg aggggcggtt 60 ggcctcgtaa aaagccgcaa aaaatagtcg caaacgacga aaactacgct ttagcagctt 120 aataacctgc ttagagccct ctctccctag cctccgctct taggacgggg atcaagagag 180 gtcaaaccca aaagagatcg cgtggaagcc ctgcctgggg ttgaagcgtt aaaacttaat 240 caggctagtt tgttagtggc gtgtccgtcc gcagctggca agcgaatgta aagactgact 300 aagcatgtag taccgaggat gtaggaattt cggacgcggg ttcaactccc gccagctcca 360 cca 363 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Ala Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 1122 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1122) <223> tyrA <400> 3 atg gtt gct gaa ttg acc gca tta cgc gat caa att gat gaa gtc gat 48 Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp 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Gly Ala Arg Leu His Arg Ile 225 230 235 240 agc gcc gtc gag cac gat cag aat atg gcg ttt att cag gca ctg cgc 768 Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg 245 250 255 cac ttt gct act ttt gct tac ggg ctg cac ctg gca gaa gaa aat gtt 816 His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val 260 265 270 cag ctt gag caa ctt ctg gcg ctc tct tcg ccg att tac cgc ctt gag 864 Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu 275 280 285 ctg gcg atg gtc ggg cga ctg ttt gct cag gat ccg cag ctt tat gcc 912 Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala 290 295 300 gac atc att atg tcg tca gag cgt aat ctg gcg tta atc aaa cgt tac 960 Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr 305 310 315 320 tat aag cgt ttc ggc gag gcg att gag ttg ctg gag cag ggc gat aag 1008 Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys 325 330 335 cag gcg ttt att gac agt ttc cgc aag gtg gag cac tgg ttc ggc gat 1056 Gln Ala Phe Ile Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp 340 345 350 tac gca cag cgt ttt cag agt gaa agc cgc gtg tta ttg cgt cag gcg 1104 Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Ser Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gln Ala 355 360 365 aat gac aat cgc cag taa 1122 Asn Asp Asn Arg Gln 370 <210> 4 <211> 373 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp 1 5 10 15 Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu 20 25 30 Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu 50 55 60 Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg 65 70 75 80 Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro 85 90 95 Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg 100 105 110 Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu 115 120 125 Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly 130 135 140 Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His Val Thr Glu Gln Val Ile Gly 145 150 155 160 Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser 165 170 175 Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala 195 200 205 Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gln 210 215 220 Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile 225 230 235 240 Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg 245 250 255 His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val 260 265 270 Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu 275 280 285 Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala 290 295 300 Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr 305 310 315 320 Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys 325 330 335 Gln Ala Phe Ile Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp 340 345 350 Tyr Ala Gln 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Asp Leu Ser Thr Ile Asn Thr Val Tyr Ser 195 200 205 cat ccg cag cca ttc cag caa tgc agc aaa ttc ctt aat cgt tat ccg 672 His Pro Gln Pro Phe Gln Gln Cys Ser Lys Phe Leu Asn Arg Tyr Pro 210 215 220 cac tgg aag att gaa tat acc gaa agt acg tct gcg gca atg gaa aag 720 His Trp Lys Ile Glu Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Ala Ala Met Glu Lys 225 230 235 240 gtt gca cag gca aaa tca ccg cat gtt gct gcg ttg gga agc gaa gct 768 Val Ala Gln Ala Lys Ser Pro His Val Ala Ala Leu Gly Ser Glu Ala 245 250 255 ggc ggc act ttg tac ggt ttg cag gta ctg gag cgt att gaa gca aat 816 Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Leu Gln Val Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn 260 265 270 cag cga caa aac ttc acc cga ttt gtg gtg ttg gcg cgt aaa gcc att 864 Gln Arg Gln Asn Phe Thr Arg Phe Val Val Leu Ala Arg Lys Ala Ile 275 280 285 aac gtg tct gat cag gtt ccg gcg aaa acc acg ttg tta atg gcg acc 912 Asn Val Ser Asp Gln Val Pro Ala Lys Thr Thr Leu Leu Met Ala Thr 290 295 300 ggg caa caa gcc ggt gcg ctg gtt gaa gcg ttg ctg gta ctg cgc aac 960 Gly Gln Gln Ala Gly Ala Leu Val Glu Ala Leu Leu Val Leu Arg Asn 305 310 315 320 cac aat ctg att atg acc cgt ctg gaa tca cgc ccg att cac ggt aat 1008 His Asn Leu Ile Met Thr Arg Leu Glu Ser Arg Pro Ile His Gly Asn 325 330 335 cca tgg gaa gag atg ttc tat ctg gat att cag gcc aat ctt gaa tca 1056 Pro Trp Glu Glu Met Phe Tyr Leu Asp Ile Gln Ala Asn Leu Glu Ser 340 345 350 gcg gaa atg caa aaa gca ttg aaa gag tta ggg gaa atc acc cgt tca 1104 Ala Glu Met Gln Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gly Glu Ile Thr Arg Ser 355 360 365 atg aag gta ttg ggc tgt tac cca agt gag aac gta gtg cct gtt gat 1152 Met Lys Val Leu Gly Cys Tyr Pro Ser Glu Asn Val Val Pro Val Asp 370 375 380 cca acc tga 1161 Pro Thr 385 <210> 6 <211> 386 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Thr Ser Glu Asn Pro Leu Leu Ala Leu Arg Glu Lys Ile Ser Ala 1 5 10 15 Leu Asp Glu Lys Leu Leu Ala Leu Leu Ala Glu Arg Arg Glu Leu Ala 20 25 30 Val Glu Val Gly Lys Ala Lys Leu Leu Ser His Arg Pro Val Arg Asp 35 40 45 Ile Asp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Arg Leu 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gac tgg gtt ggc ggc cgt tac tct 816 Thr Ala Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser 260 265 270 ttg tgg tca gcg att ggc ctg tcg att gtt ctc tcc atc ggc ttt gat 864 Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Ser Ile Val Leu Ser Ile Gly Phe Asp 275 280 285 aac ttc gtt gaa ctg ctt tcc ggc gca cac gcg atg gac aag cat ttc 912 Asn Phe Val Glu Leu Leu Ser Gly Ala His Ala Met Asp Lys His Phe 290 295 300 tcc acc acg cct gcc gag aaa aac ctg cct gta ctg ctg gcg ctg att 960 Ser Thr Thr Pro Ala Glu Lys Asn Leu Pro Val Leu Leu Ala Leu Ile 305 310 315 320 ggc atc tgg tac aac aat ttc ttt ggt gcg gaa act gaa gcg att ctg 1008 Gly Ile Trp Tyr Asn Asn Phe Phe Gly Ala Glu Thr Glu Ala Ile Leu 325 330 335 ccg tat gac cag tat atg cac cgt ttc gcg gcg tac ttc cag cag ggc 1056 Pro Tyr Asp Gln Tyr Met His Arg Phe Ala Ala Tyr Phe Gln Gln Gly 340 345 350 aat atg gag tcc aac ggt aag tat gtt gac cgt aac ggt aac gtt gtg 1104 Asn Met Glu Ser Asn Gly Lys Tyr Val Asp Arg Asn Gly Asn Val Val 355 360 365 gat tac cag act 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Gln Asp Leu Ala Lys Glu Cys Asp Leu Ala Gly Ala Ile Lys 65 70 75 80 Ser Met Phe Ser Gly Glu Lys Ile Asn Arg Thr Glu Asn Arg Ala Val 85 90 95 Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro Ile Leu Val Asp 100 105 110 Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Ala Val Leu Glu Lys Met Lys 115 120 125 Thr Phe Ser Glu Ala Ile Ile Ser Gly Glu Trp Lys Gly Tyr Thr Gly 130 135 140 Lys Ala Ile Thr Asp Val Val Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu 145 150 155 160 Gly Pro Tyr Met Val Thr Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Lys Asn His Leu 165 170 175 Asn Met His Phe Val Ser Asn Val Asp Gly Thr His Ile Ala Glu Val 180 185 190 Leu Lys Lys Val Asn Pro Glu Thr Thr Leu Phe Leu Val Ala Ser Lys 195 200 205 Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Met Thr Asn Ala His Ser Ala Arg Asp 210 215 220 Trp Phe Leu Lys Ala Ala Gly Asp Glu Lys His Val Ala Lys His Phe 225 230 235 240 Ala Ala Leu Ser Thr Asn Ala Lys Ala Val Gly Glu Phe Gly Ile Asp 245 250 255 Thr Ala Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser 260 265 270 Leu Trp Ser Ala 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caggcaaacg acgaaaacta cgctttagca gcttaatcag gttggatcaa caggc 55 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 15 Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Val Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence:primer pgi1 <400> 16 ctcgagctca gagcgatact tcgctactat 30 <210> 17 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence:primer pgi-LVA <400> 17 ctctctagaa ttaagctgct aaagcgtagt tttcgtcgtt tgctgcaggc ctaccgcgcc 60 acgctttata g 71 <210> 18 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence:primer pgi-LAA <400> 18 ctctctagaa ttaagctact aaagcgtagt tttcgtcgtt tgctgcaggc ctaccgcgcc 60 acgctttata g 71 <210> 19 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence:primer P7 <400> 19 aatgaaaaac atcaatccaa cgcagaccgc tgcctgcgct caagttagta taaaaaagct 60 gaac 64 <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence:primer P8 <400> 20 ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagacctgaa gcctgctttt ttatactaag 60 ttgg 64 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence:primer P9 <400> 21 aatgaaaaac 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Claims

A) L-아미노산 생합성에 영향을 주는 세균 효소를 암호화하는 유전자, 및

B) 전사될 수 있고, 서열번호 2의 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하며, 상기 유전자의 3' 말단에서 상기 유전자에 부착된 DNA 단편을 포함하는 DNA를 포함하는,

엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 L-아미노산 생산 세균.
제1항에 있어서, 세균이 에스케리키아(Escherichia) 속(屬)에 속하는, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균.
제1항에 있어서, 세균이 L-페닐알라닌 생산 세균인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균.
제1항에 있어서, 효소가 코리스메이트 뮤타제/프레페네이트 데하이드로게나제인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균.
제1항에 있어서, 세균이 L-히스티딘 생산 세균인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균.
제1항에 있어서, 효소가 포스포글루코스 이소머라제인, 엔테로박테리아세애 과의 L-아미노산 생산 세균.
제1항에 따른 세균을 배양 배지 중에서 배양하고, 배양 배지로부터 L-아미노산을 분리함을 포함하여, L-아미노산을 생산하는 방법.
제7항에 있어서, L-아미노산이 L-페닐알라닌인, L-아미노산을 생산하는 방법.
제7항에 있어서, L-아미노산이 L-히스티딘인, L-아미노산을 생산하는 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따른 세균을 배양 배지 중에서 배양하여, 배지 중에 L-페닐알라닌이 생산되어 축적되게 하고, 아스파르트산 또는 이의 유도체 및 수득된 L-페닐알라닌으로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 합성함을 포함하여, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생산하는 방법.
제10항에 있어서, L-페닐알라닌을 에스테르화시켜 L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생성시키고, N-아실-L-아스파르트산 무수물인 아스파르트산 유도체와 상기 L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 축합시켜, 반응 혼합물로부터 N-아실- α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 분리하고, 상기 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 수소화시켜, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생성시킴을 추가로 포함하여, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬 에스테르를 생산하는 방법.