KR920006868B1

KR920006868B1 - 인터페론의 제조방법

Info

Publication number: KR920006868B1
Application number: KR1019840007522A
Authority: KR
Inventors: 가즈아끼 기따노; 시게루 후지모또
Original assignee: 다께다야꾸힝고오교 가부시끼가이샤; 구라바야시 이꾸시로
Priority date: 1983-11-30
Filing date: 1984-11-29
Publication date: 1992-08-21
Also published as: CA1256814A; US4656131A; JPH0515435B2; EP0144064A2; ATE44047T1; DE3478699D1; EP0144064B1; JPS60118196A; EP0144064A3; KR850003735A

Abstract

내용 없음.

Description

인터페론의 제조방법

본 발명은 인터페론의 제조방법에 관한 것이다.

인터페론(이후 "IFN"으로 약칭한다.)은 고등동물의 세포를 비루스 또는 핵산으로 자극 시킴으로써 제조된 단백질이며, 항비루스, 항종양 및 기타의 활성을 나타낸다.

오늘날, 인체 IFN은 특성이 서로 다른 3종류, 즉 α, β및 γ형으로 분류된다. α 및 β형은 비루스 또는 핵산에 의해 유도되며, γ형은 유사분열 유발물질(미토겐)에 의해 유도된다. 그러므로, 인체 IFN은 인체세포나 주화 세포계를 배양함으로써 제조될 수 있으나, 그 양은 매우 소량이기 때문에 대규모의 임상적 시험 또는 치료제로 사용하기 위해 충분량의 인체 IFN을 공급하는 것은 불가능하다. 그러나, 최근 유전자 조작 기술의 발달로 인해, IFN의 구조적 유전자가 삽입된 형질발현 벡타를 운반하는 에스케리키아콜리 또는 기타의 미생물을 배양함으로써 생물학적으로 활성인 단백질의 형태로 상당히 용이한 방법으로 어떤 종류의 α, β 및 γ형의 인터페론도 수득할 수가 있다.[Nature,

316(1980); Nature,

411(1980); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(이후 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.로 약칭한다.),

5230(1980); Nucleic Acids Research,

4057(1980); Nature,

503(1982)] 그러나, 이와 같은 방법은 생산 수율의 면에서 인체 IFN 생산의 공업적 방법으로서 항상 만족스러운 것은 아니다.

이런 상황하에서, 본 발명자들은 IFN의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 벡타를 운반하는 미생물의 배양 방법에 관해 광범위한 연구를 수행한 결과, 유기 질소원이 대부분 천연 생성물인 공지의 배지 대신에 특별한 합성 배지에서 배양을 수행함으로써 현저하게 고수율의 IFN을 수득할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기의 발견 및 계속된 연구의 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 인터페론의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 벡타를 운반하는 미생물을 L-글루탐산 및 철이온원을 함유한 합성 배지에서 배양하고, 그 배양액으로부터 인터페론을 회수함을 특징으로 하는 인터페론의 제조방법을 제공한다.

인체 인터페론으로는, 세종류 α, β 및 γ가 공지이다. 특히, α형은 다수의 분자종이 있으며, 인터페론 A, B, C, D, F, H, I 및 J와 같은 유전자가 에스케리키아 콜리에서 클로닝 및 형질 발현된다는 것은 공지이다(유럽특허 출원공고 제43980호). β형 IFN 유전자(유럽 특허 출원공고 제48970호) 및 γ형 IFN 유전자(유럽 특허 출원공고 제77670호)의 형질 발현은 이미 에스케리키아 콜리에서 성공되었다. 이들 유전자 및 숙주미생물에서 형질 발현할 수 있는 기타 인체 IFN 유전자는 본 발명의 IFN 제조에 사용될 수 있다.

숙주 미생물 특히 에스케리키아 콜리에서 효과적인 IFN 유전자 형질 발현을 위해, 형질 발현 벡타용 플라스미드로써

EI-유도 pBR 322[Gene,

, 95(1977)]가 보통 많이 사용된다. 그리고 에스케리키아 콜리에서 복제 및 유지할 수 있다면 어떤 다른 플라스미드도 사용될 수 있다. 예를들면 pBR 313[Gene,

75(1977)], pBR 324, pBR 325[Gene,

121(1978)], pBR 327, pBR 328[Gene,

287(1980)], pKY 2289[Gene,

1(1978)], pKY 2700[Biochemistry

770(1980)], pACYC 177, pACYC 184[Journal of Bacteriology,

1141(1978)], pRK 248, pRK 646 및 pDF 41[Methods in Enzymology,

268(1979)]가 있다.

또한, λ 파아지로부터 유도된 λgt 류의 λgt·λC[Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,

4579(1974)], λgt·λB[Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,

3416(1975)], λDam[Gene,

255(1977)], 샤론벡타[Science,

161(1977); Journal of virology,

555(1979)]와 같은 박테리오파아지 유도 벡타 및 선상 파아지 유도 벡타가 사용될 수 있다.

IFN의 구조적 유전자는 프로모터의 아래쪽에 연결되는 것이 바람직하다. 상기 프로모터는 트립토판(trp) 프로모터, 락토오즈(lac) 프로모터, 단백질 사슬 연장 인자 Tu(tuf B) 프로모터, rec A 프로모터, 및 λ 파아지의 성장에 관여하는 λ P_L및 λ P_R프로모터가 있다. 이들중 어떤 것이 사용될 수도 있다.

IFN의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 벡타의 형성은 공지의 방법으로 수행될 수 있다. α형 IFN을 위해서는, 내쳐

411(1980), DNA

125(1982), 핵산 연구

2927(1983) 및 유럽 특허출원공고 제43980호에 기재된 방법이 있으며; β형 IFN을 위해서는, 핵산연구,

4057(1980), Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,

5230(1980), 핵산연구,

4677(1983) 및 유럽 특허출원공고 제48970호에 기재된 방법이 있으며; γ형 IFN을 위해서는, 내쳐,

503(1982), 유럽 특허출원공고 제77670호, 일본국 특허출원 공개 제189197/1983호, 일본국 특허출원 제176090/1983호(일본국 특허출원공개 제186995/1984호, 유럽 특허 출원공고 제110,044호) 및 일본국 특허출원 제45723/1983호(일본국 특허출원공개 제169494/1984호)에 기재된 방법이 있다.

IFN의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 벡타가 도입될 숙주 미생물로는 에스케리키아 콜리가 사용된다. 그중에서도, 에스케리키아 콜리 K-12-유도 균주가 취급 및 안전성의 면에서 특히 바람직하다. 상기 에스케리키아 콜리 K-12-유도 균주에는 에스케리키아 콜리 균주 294, W 3110, C-600 및 X 1776이 있으며, 이들 균주의 변이주가 사용될 수도 있다.

상기 균주 294는 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73, 4174(1976)에 기재된 균주이며, 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(이후 ATCC로 약칭함) 균주 I의 카탈로그 15판 1982에 ATCC 31446으로 기재된 균주이다. 상기 균주 294는 또한 일본국 재단 법인 발효 연구소에 1982년 3월 23일에 IFO 14171로 기탁되어 있다(유럽 특허출원공고 제89,676호).

상기 균주 W 3110은 ATCC 균주 I의 카탈로그, 15판, 1982에 ATCC 27325로 기재된 균주이다.

상기 균주 C-600은 ATCC 균주 I의 카탈로그, 15판, 1982에 ATCC 23724로 기재된 균주이다.

상기 균주 X 1776은 문헌[The Journal of Infections Diseases,

668(1978)]에 기재된 균주이다. 이 균주 X 1776은 또한 미국 특허 제4190494호에 ATCC 31244(ATCC 균주 I의 카탈로그, 15판, 1982)로 기재된 균주이다.

IFN의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 벡타(플라스미드 벡타 또는 파아지 벡타)를 숙주 미생물에 도입하는 것을 공지의 방법으로 수행될 수 있다.[Journal of Molecular Biology,

159(1970), Methods in Enzymology,

253(1979), 및 Gene,

279(1978).]

본 발명의 실시에 사용된 합성 배지는 모든 성분이 공지인 배지이다. 상기의 합성 기본 배지로는 주로 무기염으로 구성된 공지의 배지[예. M-9 배지(표 1참조), 데이비스 배지(표 2 참조)]가 사용될 수 있다. 하기 표 3에 기재된 무기염의 조성을 갖는 TSM-3 배지가 유리하게 사용될 수 있다.

종배양 배지로는 영양 브로스 또는 L-브로스와 같은 통상의 영양배지가 사용될 수 있다. 표 4에 기재된 합성 배지(SS-1 배지)가 유리하게 사용될 수 있다.

[표 1]

[M-9 배지]

[표 2]

[데이비스 배지]

[표 3]

[TSM-3 배지]

[표 4]

[SS-1 배지]

본 발명에 따라 사용된 L-글루탐산은 염의 형태일 수 있다. 염은 예를들면 소듐염, 포타슘염 또는 암모늄염이다. 상기 L-글루탐산 또는 그의 염은 합성 배지 1ℓ당 약 0.1∼10g(L-글루탐산) 농도로 사용된다.

발명의 실시에 사용된 철이온 원은 용해될 때 철이온을 낼 수 있는 물질 또는 용해될 때 철이온의 형태로 이용될 수 있는 물질이다. 철이온원의 예로는 염화제1철, 염화제2철, 황산제1철, 황산제2철, 인산제2철, 질산제2철, 시트르산제2철 및 락트산제1철이 있다. 상기 철이온 원은 합성 배지 1ℓ당 양 10^-5∼10^-3몰(철이온)을 가한다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 아연 이온원, 구리이온원, 또는 아연 이온원+구리이온원을 합성 배지에 가하여 생성물의 수율을 증가시킬 수 있다.

상기 아연 이온원은 용해될 때 아연 이온을 낼 수 있는 물질 또는 용해될 때 아연 이온 형태로 이용될 수 있는 물질이다. 아연 이온원의 예로는 염화아연, 염기성 탄산 아연, 질산아연, 황산 아연 및 인산 아연이 있다. 아연 이온원은 합성 배지 1ℓ당 약 10^-5∼10^-3몰(아연 이온)을 가한다.

상기 구리이온원은 용해될 때 구리이온을 낼 수 있는 물질 또는 용해될 때 구리이온의 형태로 이용될 수 있는 물질이다. 구리이온원의 예로는 황산구리, 염화제2구리, 염화제1구리, 탄산구리 및 아세트산구리가 있다. 구리이온원은 합성 배지 1ℓ당 약 10^-5∼10^-3몰(구리이온)을 가한다.

숙주 미생물이 아미노산-영양 요구 변이주일 때, 필요한 아미노산(예. L-리신, L-아르기닌, L-메티오닌, L-류신, L-프롤린, L-이소류신, L-발린, L-트립토판)을 약 10∼1000㎎/ℓ의 량으로 적당히 가해야 한다. 비타민(예. 칼슘 판토테네이트, 콜린클로라이드, 폴산, i-이노시톨, 니코틴아미드, 피리독살히드로클로라이드, 리보 플라빈, 비타민 B₁)은 비타민 필요 변이주가 사용되지 않는다면 필수적인 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, 약 1∼100㎎/ℓ의 비타민 B₁을 가하면 발효 공정이 안정화 되기 때문에, 적당량을 가하는 것이 필요하다. 숙주 미생물이 비타민을 필요로 할때, 필요한 비타민 약 1∼100㎎/ℓ를 가하는 것이 필요하다.

숙주 미생물이 핵산에 관련된 화합물을 필요로 할 때, 필요한 화합물을 약 1∼100㎎/ℓ 량으로 배양 배지에 가할 수 있다.

배지에 탄소원을 가하는데 있어, 전 배양 기간을 통해 탄소원의 농도를 약 0.1∼5％ w/v로 유지시키면, 많은 양의 필요한 IFN을 축적시킬 수 있다. 탄소원으로는 글루코오즈, 글리세롤, 말토오즈 및 소르비톨이 있다.

인터페론의 구조적 유전자가 삽입된 플라스미드는 일반적으로 항생 물질에 저항성을 갖는 선택적 마크를 운반한다. 이 경우, 항생물질(예. 테트라시클린, 암피실린)을 가하면 플라스미드를 함유한 균주만이 성장할 수 있기 때문에 유리하다.

배양은 일반적으로 진탕 배양으로 수행된다. 배지의 산소 농도를 용해된 산소의 포화 농도의 약 5％(v/v) 이상으로 유지시키면서 배양을 수행하는 것이 바람직하며, 이 경우, 필요한 IFN의 수율이 증가된다. 이런 목적을 위해, 배양 도중에 공기 및 순수 산소의 혼합물을 공급하는 것이 효과적이다.

본 발명에 따라 배양을 수행하는데 있어, 배지의 pH를 약 5∼7.5로 조절하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 약 15∼45℃이며, 바람직하게는 약 20∼42℃이다. 필요한 IFN의 수율을 증가시키기 위해, 처음에는 37℃±5℃의 온도에서 배양을 수행하고, 세포의 성장에 따라 온도를 단계적으로 또는 일정하게 하강시켜 최종적으로 23℃±5℃에서 배양하는 것이 바람직하다. 더 구체적으로 및 바람직하게는, 최초 온도는 37℃±2℃이고; 세포가 최대 성장의 20∼40％로 성장했을 때, 온도를 33℃±2℃로 하강시키고; 세포가 최대 성장의 40∼60％로 성장했을 때, 온도를 29℃±2℃로 하강시키고; 세포가 최대 성장의 60∼75％로 성장했을 때, 온도를 25℃±2℃로 하강시키고, 배양을 계속하여 충분량의 필요한 IFN을 수득하거나, 세포가 최대 성장의 75∼90％로 성장했을 때, 온도를 20℃±2℃로 하강시키고, 배양을 계속하여 충분량의 필요한 IFN을 수득한다. 배양 기간은 약 3∼72시간이다.

본 발명에 따른 발효 방법에 있어서, IFN은 일반적으로 미생물 세포내에 축적된다. 이렇게 축적된 IFN을 배양액에서 회수하기 위해, 먼저 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 수거하고, 그로부터 IFN을 추출한다. 효과적인 IFN의 추출을 위해, 예를들면 초음파처리, 리소짐 처리 또는 표면활성제와 같은 화학 물질 처리를 수행한다.

추출된 IFN을 단백질 또는 펩티드에 사용하는 공지의 정제방법, 예를들면 황산 암모늄으로 염석, 알콜로 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 셀룰로오즈 컬럼 크로마토그래피 및/또는 겔 여과에 의해 정제한다. 특히, 이 방법을 모노크로날 항체 방법과 합하여 사용할 때, 고순도의 시료가 수득될 수 있다.

즉, 배양액으로부터의 추출물을 원심 분리하고, 상층액을 모노크로날 항체 컬럼에 넣은 후, 항체를 세척하고, 0.2M 아세트산, 0.1％ 트리톤 X 100(폴리옥시 에틸렌글리콜-p-t-옥틸페닐에테르) 및 0.15M NaCl로 용출시킨다. 이 방법에서, 인터페론이 모노크로날 항체 컬럼에 흡착되므로, 고순도의 시료가 수득될 수 있다.[α형 IFN의 정제, Scientific American,

(4), 56(1980); 일본 특허출원 제176091/1983호, 유럽 특허출원공고 제103,898호.]

이렇게 수득된 인체 백혈구 IFN αA 단백질은 소의 신장-유도 MDBK 세포에서 수포성 구염 비루스(VSV)의 세포 병리 효과의 저해 시험에 의한 항비루스 활성 측정시 10⁸U/㎎ 이상의 비활성을 나타내며, 수득된 인체 면역 IFN 단백질은 인체 양수 유도 WISH 세포에서 수포성 구염 비루스(VSV)의 세포 병리 효과의 저해 시험에 의한 항비루스 활성 측정시 10⁷U/㎎ 이상의 비활성을 나타낸다.[cf. 일본 특허출원 제176091/1983호(유럽 특허출원공고 제103, 898)]

본 발명에 따라 제조된 인체 IFN 단백질은 같은 형질 전환체를 영양배지에 배양함으로써 수득된 것과 같은 물리-화학적 및 생물적 특성을 갖는다.

그러므로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 IFN은 공지의 방법에 의해 제조된 IFN과 같은 목적을 위해 같은 방법으로 사용될 수 있다.

IFN은 항비루스, 항종양, 항증식 및 면역 역가 및 기타의 활성을 나타내므로, 동물(예. 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 생쥐)의 비루스 감염 및 종양 등의 치료에 사용될 수 있다. IFN을 항비루스, 항종양, 항증식 또는 면역 증강제로 사용할 때, IFN을 공지의 약학적으로 수용할 수 있는 담체, 부형제, 또는 희석제와 혼합하여 정맥내 또는 근육 주사 또는 기타의 경로에 의해 비경구 투여한다. 일일 투여량은 보통 성인 1인당 약 10만∼1억 단위, 바람직하게는 1백만∼5천만 단위이다. 인간 이외의 동물의 경우, 투여량은 2000∼2백만 단위/㎏/일, 바람직하게는 약 2만∼1백만 단위/㎏/일이다.

하기의 시험예 및 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[시험예 1]

상술한 M-9 배지 또는 TSM-3 배지에 탄소원으로 글루코오즈를 10g/ℓ 가한다. 이 배지에 소듐 글루타메이트를 가하거나 가하지 않고 에스케리키아 콜리 294(ATCC 31446)/pLe IF A trp 25(유럽 특허출원공고 제43980호)로 접종시킨 후, 37℃에서 16시간 동안 배양한다. 균주의 성장을 시험하고, 그 결과는 표 5에 나타낸다.

[표 5 박테리아 성장에 있어 소듐 L-글루타메이트의 효과]

[시험예 2]

25g/ℓ의 글루코오즈 및 4g/ℓ의 소듐 L-글루타메이트를 TSM-3 배지에 가함으로써 제조된 배지 2.5ℓ를 5ℓ들이 병 발효기에 채운다. 표 6에 기재된 금속염을 가한다. 생성된 배지를 인체 백혈구 IFN-αA의 구조적 유전자가 삽입된 플라스미드를 운반하는 에스케리키아 콜리 294(ATCC 31446)/pLe IF A trp 25의 종 배양액 50㎖로 접종시키고, 1000rpm의 속도로 교반 및 2.5ℓ/분의 유속으로 통기시키면서 37℃에서 배양한다. 배양하는 동안, 박테리아의 성장에 따라 온도를 37℃에서 33℃, 29℃ 및 25℃로 단계적으로 하강시킨다. 배양동안 글루코오즈 농도가 1％ 이하가 될 때 새로운 2.5％ 량의 글루코오즈를 가한다. 배양은 27시간동안 계속한다. 배양 기간을 통해 암모니아수에 의해 pH를 6.8로 유지시킨다. 박테리아 성장 및 인체 백혈구 인터페론 αA의 수율을 시험하고, 표 6에 기재된 결과를 수득한다.

[표 6 박테리아 성장 및 IFN 생성에 있어 미량 금속염의 효과]

주 : * 박테리아 혼탁도를 클레트-스머슨 칼로리 메타로 측정하고, 철, 구리 및 아연 이온을 가했을 때의 생장도를 100으로 하여 상대적인 성장도를 구한다.

** IFN의 축적을 항비루스 활성에 의해 측정하고, 철, 구리 및 아연 이온을 가했을 때의 수율을 100으로 하여 상대치를 구한다.

[시험예 3]

200㎖ 삼각 플라스크에 표 7에 기재된 L-브로스 배지 또는 상술한 SS-1 배지 50㎖를 채운다. 5㎎/ℓ의 테트라시클린 히드로클로라이드를 가하고, 인체 백혈구 IFN-αA의 구조적 유전자가 삽입된 플라스미드를 운반하는 에스케리키아 콜리 294(ATCC 31446/pLe IF A trp 25로 배지를 접종한 후, 37℃에서 12시간 또는 16시간동안 배양한다.

[표 7 종 배양 배지(L-브로스)]

그리고, 상술한 TSM-3 배지에, 25g/ℓ의 글루코오즈, 4g/ℓ의 소듐 L-글루타메이트, 27㎎/ℓ의 FeCl₃·6H₂O, 8㎎/ℓ의 CuSO₄·5H₂O, 8㎎/ℓ의 ZnSO₄·7H₂O, 70㎖/ℓ의 타아민 히드로클로라이드 및 5㎎/ℓ의 테트라시클린 히드로클로라이드를 가한다. 생성된 배지 2.5ℓ를 5ℓ들이 병 발효기에 채운다. 상기의 종배양액으로 접종하고, 시험예 2와 같은 조건하에 배양을 수행한 후, 박테리아 성장 및 인체 백혈구 IFN의 수율을 시험한다. 수득된 결과는 표 8에 나타낸다.

[표 8 IFN 생성에 있어 종배양액의 효과]

주: * 클레트-스머슨 칼로리메터를 사용하여 박테리아 혼탁도를 측정하고, L-브로스 배지를 사용하여 18시간 동안 배양하는 경우의 성장도를 100으로 하여 상대적인 성장치를 구한다.

** 항비루스 활성에 의해 IFN의 축적을 측정하고, L-브로스배지를 사용하여 18시간 동안 배양하는 경우의 성장도를 100으로 하여 상대치를 구한다.

표 8에서 명백한 바와 같이, 합성 배지(SS-1종 배지)에서 제조된 종배양액을 사용하면 영양배지(L-브로스배지)에서 제조된 종배양액을 사용하는 것에 비해 발효시 박테리아의 성장이 증가하면 IFN 생성도 증가된다.

[시험예 4]

200㎖ 삼각 플라스크에 50㎖의 SS-1 종배지를 채운다. 5㎎/ℓ의 테트라시클린히드로클로라이드를 가하고, 인체백혈구 IFN-αA의 구조적 유전자가 삽입된 플라스미드를 운반하는 에스케리키아 콜리 294(ATCC 31446)/pLe IF A trp 25으로 배지를 접종시킨다. 37℃에서 16시간 동안 배양을 수행한다. 그리고, TSM-3 배지에 4g/ℓ의 소듐 L-글루타메이트, 27㎎/ℓ의 염화제2철, 8㎎/ℓ의 황산구리, 8㎎/ℓ의 황산아연, 70㎎/ℓ의 티 아민 히드로클로라이드 및 5㎎/ℓ의 테트라시클린 히드로 클로라이드를 가한다. 5ℓ들이 병 발효기에 2.5ℓ의 생성 배지를 채운다. 표 9에 기재된 방법으로 글루코오즈를 가한다. 상기 종 배양액으로 접종시키고, 2.5ℓ/분의 통기 속도, 1000rpm의 교반속도 및 37℃의 온도에서 배양을 시작한다. 박테리아의 성장에 따라, 배양온도를 37℃에서 33℃, 29℃ 및 25℃로 단계적으로 하강시키고, 용해된 산소 농도를 포화산소 농도의 pH는 암모니아수에 의해 6.8로 조절한다. 배양은 27시간 동안 계속한다. 박테리아 성장 및 인체백혈구 IFN-αA의 수율을 검사한다. 수득된 결과는 표 9에 나타낸다.

[표 9 글루코오즈 농도의 효과]

주: * 클레트-스머슨 칼로리메터에 의해 박테리아 혼탁도를 측정하고, 실시번호 4-1의 성장을 100으로 하여 상대치를 구한다.

** 항비루스 활성에 의해 IFN의 축적을 측정하고, 실시번호 4-1의 생산성을 100으로 하여 상대치를 구한다.

표 9로부터, 실시번호 4-1, 4-2 및 4-3의 조건하에 박테리아 성장 및 IFN-αA 생성이 현저히 증가한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 1]

M-9 배지에 25g/ℓ의 글루코오즈, 5g/ℓ의 카스아미노산(Difco, USA), 70㎎/ℓ의 비타민 B₁히드로클로라이드 및 5㎎/ℓ의 테트라시클린 히드로클로라이드를 가함으로써 제조된 배지(영양배지)(1) 또는 M-9 배지에 25㎎/ℓ의 글루코오즈, 4g/ℓ의 소듐 L-글루타메이트, 27㎎/ℓ의 FeCl₃·6H₂O, 8㎎/ℓ의 CuSO₄·5H₂O, 8㎎/ℓ의 ZnSO₄·7H₂O, 70㎎/ℓ의 비타민 B1 히드로클로라이드, 5㎎/ℓ의 테트라시클린 히드로클로라이드, 50㎎/ℓ의 L-프롤린 및 50㎎/ℓ의 L-류신을 가함으로써 제조된 배지(합성배지)(2) 2.5ℓ를 5ℓ들이 병 발효기에 채우고, 인체 백혈구 IFN-αA의 구조적 유전자가 삽입된 플라스미드를 운반하는 에스케리키아 콜리 294(ATCC 31446)/pLe IF A tre 25로 접종 시킨다(유럽 특허출원공고 제43,980호). 2.5ℓ/분의 통기속도, 1000rpm의 교반속도 및 37℃의 온도에서 배양을 시작한다. 배양 동안, 0D 3000 KU에서 33℃, 0D 5000 KU에서 29℃ 및 0D 7000 KU에서 25℃로 온도를 하강시킨다. 이 방법으로 배양을 48시간 동안 계속한다. 배양동안, 용해된 산소 농도는 5％ 이상이 되도록 유지한다. 배양하는 동안, 글루코오즈 농도가 1％ 이하로 저하되면, 25g/ℓ의 양으로 글루코오즈를 가한다. 수득된 결과는 표 10에 나타낸다.

[표 10]

주 : * 항비루스 활성에 의해 IFN의 축적을 측정하고, 영양배지를 사용했을 때의 생산성을 100으로 하여 상대치를 구한다.

상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 합성배지(2)에 본 발명에 따른 각종 화합물을 가하면 IFN의 생산성이 현저히 증가한다.

합성배지(2)의 배양 브로스 2ℓ를 원심 분리하여 세포를 수거한다. 10％ 슈크로오즈, 0.2M NaCl, 10mM 에틸렌-디아민테트라아세테이트(EDTA), 10mM 스퍼미딘, 2mM 페닐 메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 및 0.2㎎/㎖ 리소짐을 함유한 50mM 트리스-HCl(pH 7.6) 100㎖에 세포를 현탁시킨다. 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 교반하고, 37℃에서 5분간 유지시킨 후, 0℃에서 40초간 소니케이터(알텍스, USA)에 처리한다. 가수분해물을 11,300×g에서 1시간 동안 원심 분리하여 95㎖의 상층액을 수득한다.

이 상층액(95㎖)을 1mM EDTA 및 0.15M NaCl(TEN)을 함유한 20mM 트리스-HCl(pH 7.6)으로 300㎖로 희석하고, 희석된 용액을 항 IFN-αA 항체 컬럼(20㎖)에 넣는다.

컬럼을 TEN으로 잘 세척한 후, 0.1％ 트윈 20(Wako Pure Chemical Industries, Japan)를 함유한 0.2M 아세트산으로 용출을 수행한다. 활성분획을 합하여, pH 4.5로 조절하고, CM 셀룰로오즈 컬럼에 흡착시킨다. 컬럼을 잘 세척하고, 0.15M NaCl을 함유한 0.025M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.0)으로 용출을 수행한다. 다시 활성 분획을 합하고 동결 건조시켜 320㎎의 인체 백혈구 IFN-αA 분말을 수득한다.

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하면 이 생성물의 분자량은 19,000±1,000으로 나타난다. 최종적으로 수득된 인체 백혈구 IFN 단백질의 비활성은 2×10⁸U/㎎이다. 다른 물리-화학적 특성, 아미노산 조성 및 펩티드지도에 있어서, 이 생성물은 공지의 방법으로 제조된 재조합 인체 백혈구 IFN과 아주 동일하다.

[실시예 2]

TSM-3 배지에 25g/ℓ의 글루코오즈, 20g/ℓ의 이스크 추출물 및 5㎎/ℓ의 테트라시클린 히드로 클로라이드를 가함으로써 제조된 배지(영양 배지)(1) 또는 TSM-3 배지에 25g/ℓ의 글루코오즈, 4g/ℓ의 소듐 L-글루타메이트, 27㎎/ℓ의 FeCl₃·6H₂O, 8㎎/ℓ의 CuSO₄·5H₂O, 8㎎/ℓ의 ZnSO₄·7H₂O, 70㎎/ℓ의 티아민 히드로 클로라이드 및 5㎎/ℓ의 테트라 시클린 히드로 클로라이드를 가함으로써 제조된 배지(합성배지)(2) 2.5ℓ를 5ℓ들이 발효기에 넣고, 인체 면역 IFN의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 플라스미드를 운반하는 에스케리키아 콜리 294(IFO 14171)/pHIT·trp 2101[일본국 특허출원 제176090/1983호(일본국 특허출원공개 제186995/1984호, 유럽 특허출원공고 제110,044호)]로 접종시킨다. 배양은 2.5ℓ/분의 통기 속도, 1000rpm의 교반속도 및 37℃의 온도에서 시작한다. 배양하는 동안, OD가 2000클레트단위일 때 33℃, OD가 4000클레트 단위일 때 29℃ 및 OD가 6000클레트 단위일 때 25℃로 온도를 하강시킨다. 이 방법으로, 배양을 26시간동안 계속한다. 배양 배지의 pH는 암모니아수에 의해 pH 6.8로 유지시킨다. 배양도중, 배지의 글루코오즈 농도가 1％ 이하로 될 때마다 25g/ℓ의 글루코오즈를 가한다. 결과로, 영양배지(1)에서 TFN-γ의 생산성이 100일 때, 합성배지(2)에서의 생산성은 550이다.

상기에서 수득된 합성배지 배양액 2.4ℓ를 원심분리하여 박테리아 세포를 수거하고, 10％ 슈크로오즈, 10mM EDTA, 10mM 스퍼미딘, 2mM PMSF 및 0.2㎎/㎖ 리소짐을 함유한 50mM 트리스-HCl(pH 7.6) 120㎖에 현탁시킨다. 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 교반하고, 37℃에서 5분간 유지한 후, 초음파 처리(알텍스, USA)한다. 가수분해물을 11,300×g에서 1시간 동안 원심분리하여 115㎖의 상층액을 수득한다.

상층액(115㎖)를 TEN에 의해 360㎖로 희석하고, 희석 용액을 항-IFN-γ 항체 컬럼(25㎖)[cf. 일본국 특허출원 제176091/1983호(유럽 특허출원공고 제103,898호)의 실시예 12 및 13]에 넣는다. 컬럼을 TEN으로 잘 세척한 후, 1M NaCl 및 0.1％ 트윈 20을 함유한 20mM 트리스-HCl(pH 7.0)으로 더 세척한 후, 2M 구아니딘 히드로 클로라이드(시그마, USA)를 함유한 트리스-HCl(pH 7.0)으로 용출시킨다. 수득된 활성 분획(100㎖)을 0.115％ Na₂HPO₄, 0.02％ KH₂PO₄, 0.8％ NaCl 및 0.02％ KCl을 함유한 완충액에 4℃에서 18시간 동안 투석시킨다.

이 방법으로 최종적으로 수득된 인체 면역 IFN 단백질은 47㎎이며, 2×10⁷U/㎎의 항 비루스 활성을 갖는다.

수득된 시료를 SDS-폴리아크릴 아미드 전기 영동하여 측정된 분자량은 18,000±1,000이다. 다른 물리-화학적 특성, 아미노산 조성 및 펩티드 지도에 있어서, 이 시료는 공지의 배지에서 제조된 재조합 인체면역 IFN과 거의 같다.

Claims

인터페론의 구조적 유전자가 삽입된 형질 발현 벡타를 운반하는 미생물을 L-글루탐산 및 철이온원이 함유된 합성 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 인터페론을 회수함을 특징으로 하는 인터페론의 제조방법.
제1항에 있어서, 배지에 아연이온원이 더 함유된 방법.
제1항에 있어서, 배지에 구리이온원이 더 함유된 방법.
제2항에 있어서, 배지에 구리이온원이 더 함유된 방법.
제1항에 있어서, 인터페론의 구조적 유전자가 인체 백혈구 인터페론의 구조적 유전자인 방법.
제1항에 있어서, 인터페론의 구조적 유전자가 인체 면역 인터페론의 구조적 유전자인 방법.
제1항에 있어서, 배지에 약 0.1∼10g/ℓ 농도의 L-글루탐산 및 약 10^-5∼10^-3몰/ℓ 농도의 철이온이 함유된 방법.
제2항에 있어서, 배지에 약 10^-5∼10^-3몰/ℓ 농도의 아연 이온원이 함유된 방법.
제3항에 있어서, 배지에 약 10^-5∼10^-3몰/ℓ 농도의 구리 이온원이 함유된 방법.
제4항에 있어서, 배지에 약 10^-5∼10^-3몰/ℓ 농도의 구리 이온원이 함유된 방법.
제1항에 있어서, 배지의 탄소원 농도를 약 0.1∼5％로 유지시키면서 배양을 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 배지의 산소 농도를 용해된 산소 포화 농도의 약 5％ 이상에서 유지시키면서 배양을 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 37℃±5℃의 온도에서 배양을 시작하여 세포가 성장함에 따라 온도를 단계적으로 또는 선상으로 하강시켜 최종적으로 23℃±5℃가 되도록 배양을 수행하는 방법.