SU1830080A3 - Бессыворотомная питательная среда для культуры ткани - Google Patents
Бессыворотомная питательная среда для культуры ткани Download PDFInfo
- Publication number
- SU1830080A3 SU1830080A3 SU904743208A SU4743208A SU1830080A3 SU 1830080 A3 SU1830080 A3 SU 1830080A3 SU 904743208 A SU904743208 A SU 904743208A SU 4743208 A SU4743208 A SU 4743208A SU 1830080 A3 SU1830080 A3 SU 1830080A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- insulin
- tissue culture
- aao
- cells
- party
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0056—Xeno-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Изобретение относится к области биохимии. в частности к области Культуры ткани.
Настоящее изобретение охватывает способ выращивания клеток млекопитающих животных в не содержащей сыворотки среде культуры ткани, в котором клетки способны к росту в культуре ткани и имеют положительную реакцию на присутствие инсулина в среде культуры тканй, где среда культуры ткани содержит примерно от 0.1 до 10000 нанограммов аргинил-А-О-инсулина на миллилитр.
Настоящее изобретение охватывает также не содержащую сыворотки среду для разведения пригодную для роста клеток млекопитающих в культуре ткани, которая содержит примерно от 0.1 до 10000 нанограммов аргинил-А-О-инсулина на миллилитр.
Отличительной особенностью данного изобретения является использование аргинил-А-О-инсулина (ААО-инсулйна) как агента улучшения роста клеток млекопитающих в среде культуры ткани. ААО-инсулин является побочным продуктом процесса получения человеческого инсулина (HI) из человеческого проинсулина. Данный процесс опубликован в имеющейся литературе более подробно, и в качестве исходного продукта используется человеческий проинсулин, ковалентно связанный с расщепляемой главной последовательностью, которая синтезируется посредством микроорганизмов, генетически модифицированных для данной цели. Проинсулин расщепляется трипсином и карбоксипептидазой В. предпочтительно в присутствии металлических ионов.
Как уже сейчас хорошо известно, человеческий инсулин состоит из 30-аминокислотной цели В, связанной с 21-аминокислотной цепью А посредством дисульфидных мостиков, которые связывают цистеины в положении А-7 и В-7, и цистеины в положении А-20 и В-19. Человеческий проинсулин является белком, содержащим 86 аминокислот, в котором
1830080 АЗ глицин в положении А-1 человеческого инсулина (HI) связан стреонином в положении В-30 посредством внутреннего связывающего пептида, 35-аминокислотной цепи. Этот связывающий пептид удаляется путем расщепления в процессе, в ходе которого человеческий проинсулин превращается в Hl.
Этот процесс расщепления безусловно не является идеально эффективным, и в результате неполного расщепления образуются некоторые побочные продукты. Одним таким побочным продуктом является аргинил-А-О-инсулин, который отличается от HI тем, что имеет одну нижнюю аргинильную группу, присоединенную в положении А-1 к концевой аминогруппе, человеческого инсулина. Этот побочный продукт может быть отделен от HI путем катинообменной хроматографии, как показано ниже в Приготовлении препарата 1. Интересен тот факт, что ААО-инсулин является менее эффективным, чем HI в отношении эффектов снижения глюкозы в крови в условиях ин виво” у кроликов. При проведении испытания на кроликах определено, что ААО-инсулин проявляется 75% эффективности, моль на моль, от самого HI. Однако, ААО-инсулин имеет, по меньшей мере, такую же эффективность, как и инсулин в стимулировании роста клеток в культуре ткани. При первых работах биологов и биохимиков по выращиванию клеток млекопитающих в культуре ткани было принято выращивать их в среде культуры ткани, содержащей кислотную сыворотку в пределах концентрации от 5 до 10%. Сыворотка служила в качестве ценного питательного сырья для клеток, и многие очень важные эксперименты проводились в таких культурах. Однако желание в более точных экспериментах привело к выращиванию клеток культуры ткани в специфической среде, в которой все составляющие компоненты очищены и имеют точные характерные для них химические названия. Одним из таких веществ, которое может или должно вводиться в специфическую среду для желаемого роста многих клеток, является инсулин.
Так например, в литературе описаны следующие типы клеток, как положительно реагирующих н'а ввод инсулина в среду культуры ткани.
Карцинома гипофиза крысы
Человеческая цервикальная карцинома Карцинома собачьей почки
Крысиная нейробластома
Мышиная меланома
Крысиная глиома
Карцинома человеческой молочной железы
Яичник крысы
Эмбриональная мышиная карцинома
Мышиные семенники
Карцинома человеческой толстой кишки Мышиные эмбрионы Balb/c Крысиный миобласт
Эпидермоидная карцинома человеческого легкого Почка хомяка
Человеческий фибробласт Человеческая эпидермоидная карцинома
Крысиная щитовидная железа Мышиный эмбрион Мышиная лимфома Овечий адиноцит
Инсулин является общим необходимым или желательным фактором в среде для выращивания клеток млекопитающих. Использование настоящего изобретения желательно в культурах всех клеток млекопитающих. которые стимулируются инсулином в среде разведения культуры. Так, природа или источник клеток, которые должны использоваться, не является ограничивающим фактором при осуществлении данного изобретения. Среда культуры ткани также не является ограничивающим фактором. Ранее уже была тщательно изучена не содержащая сыворотки среда культуры ткани. и в литературе были опубликованы данные работы на 30 лет или более. Для информации можно привести нижеследующие источники, которые приводятся здесь как ссылочный материал.
Обычно не содержащая сыворотки питательная среда выращивания клеток млекопитающих приготавливается из многочисленных ингредиентов, включающих основные аминокислоты, такие как аргинин, цистеин, гистидин, метионин и другие; неосновные аминокислоты, такие как аланин, аспарагин, глицин, и другие; и аминокислотные производные, такие как глютатион. оксипролин, путросцин и другие. Обычно они содержат такие витамины, такие как фолиевая кислота, биотин, никотинамид, пантотеновая кислота, пиридоксин, рибофлавин и витамин В12. Часто используются углеводы, такие как глюкоза и пируват, а также производные нуклеиновой кислоты, такие как аденин, гипоксантин и тимидин. Такая питательная среда выращивания содержит источник липидов, например холин и и-инозитол, и неорганические ионы, включая ионы кальция, магния, натрия, фосфата и другие. Часто она включает неорганические элементы в следовых количествах, на
1830G80 пример кобальт, железо, селен, цинк. Часто питательная среда выращивания приготавливается в форме буферного раствора для поддержания желаемого значения pH, часто с использованием бикарбонатного иона или газообразной двуокиси углерода. Как разъяснялось выше, ААО-инсулин является побочным продуктом процесса получения HI из человеческого проинсулина, и согласно этому он легко получается для использования в настоящем изобретении путем простого извлечения из продукта загрязненного HI.
Нижеследующий раздел Приготовление препарата 1 иллюстрирует процедуру хроматографического разделения, используемую для этого извлечения, и этап кристаллизации с целью очистки ААО-инсулина.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТА 1 ХРОМАТОГРАФИЯ
Смесь, содержащая ААО-инсулин и HI. растворяется в 32 мл буферного раствора, с концентрацией 7 моль мочевины. 0,05 моль ацетата натрия и 0,1 моль хлорида натрия, величина pH 3,8. Хроматографическая колонка размерами 1x15 см наполняется сульфопропиловой ТРИЗАКРИЛ смолой, изготавливаемой фирмой Reactib IBF, отделением Rhone-Poulenc с размером частиц 40-80 мкм. Раствор ААО-инсулина вводится в колонку и элюируется градиентным буфером (в количестве, составляющим 9-кратный обьем колонки) того же состава, что описан выше, с той разницей, что концентрация хлорида натрия в нем увеличена до 0,2 моль. Скорость прохождения в колонке составляет 1 мл/мин. Поток продукта, выходящего из колонки, контролируется по спектру поглощения при 280 нм. Инсулин выходит из колонки первым, он практически весь элюируется в первых 70 мл после начала градиентного элюирования. Затем выходит ААО-инсулин. который собирается в выходящей фракции 72-105 мл для получения фракции, обогащенной ААО-инсулином с очень небольшой примесью HI.
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ
Величину pH раствора ААО-инсулинового продукта в количестве 840 мл (с содержанием 2.32 г ААО-инсулина) доводят до 8,0 посредством 10%-ного гидрата окиси натрия. Раствор концентрируется до объема 260 мл при 4°С с использованием отсасывающей мембраны молекулярной массой 3000. Концентрированный раствор затем диафильтруется с использованием 280 мл деионизированной воды. Раствор разбавляется до концентрации 2 г белка на 1 л. В него добавляют 16.2 мл ледяной уксусной кисло ты и 850 мл деионизированной воды, так чтобы концентрация уксусной кислоты данного раствора составляет 0,25 моль. Затем он нагревается до 23°С, в него вводится 0,93 мл 20%-ного водного раствора хлорида цинка. Величина pH доводится до 6,0 посредством концентрированного раствора гидрата окиси аммония.( Смесь перемешивается в течение 4 ч при 23°С. Затем она охлаждается до 4°С, а смесь инкубируется при указанной температуре в течение 16 ч без перемешивания. Затем поверхностный слой декантируется, а оставшийся густой кристаллический шлам центрифугируется. Кристаллы промываются двукратно очищенной водой, затем двукратно абсолютным этанолом, используемым в количестве 23 мл на каждую промывку. Кристаллы высушиваются в вакууме при комнатной температуре. и в результате получается 2,11 г практически чистого ААО-инсулина.
Пример. Используется ААО-инсулин для роста клеток яичника Китайского хомяка в не содержащей сыворотки среде, которая, как было показано, эффективна для роста таких клеток. Эта среда состоит из трех частей модифицированной Dulbecco среди Eagle (ДМЕ)и одной части (по объему) соеды Г12, с введенными в нее селеном (10 8 моль) этаноламином (50 мкмоль), оксиэтилпиперазинэтансульфокислотой (20 ммоль) и человеческим трансферрином (1 мкг/мл). Количества ААО-инсулина. которые указаны в нижеследующей таблице, вводятся в различных пропорциях от количества среды. Клетки выращиваются в 12-ячеистых чашках Конинга, которые предварительно обрабатываются ламинином, белком, который способствует прилипанию · клеток и распределению их в ячейках разведения культуры. Эксперимент для каждого условия осуществляется двукратно. Каждая ячейка с питательной средой разведения инокулируется 25000 клетками на 0-й день эксперимента, и подсчет осуществляется на 6-ой день с помощью счетчика Колтера. В данных экспериментах используются четыре различных партии ААО-инсулина. Концентрации ААО-инсулина, вводимого в питательную среду разведения в виде раствора в 0,1 н. соляной кислоте, выражаются в нанограммах на миллилитр во всех случаях. В контрольных экспериментах без ввода инсулина или ААО-инсулина в среду разведения, число клеток составляет от 10000 до 200000 на ячейку. Те же клетки в той же среде, содержащей HI или коровий инсулин вместо ААО-инсулина, растут так же, как и в описанных здесь экспериментах.
Ί
Приведенные выше экспериментальные данные показывают эффективность ААО-инсулина в стимулирований роста клеток, которые реагируют на инсулин в культуре ткани, Среднее число клеток на ячейку в 5 этих испытаниях увеличивается от 240000 до 610000 в зависимости от концентрации ААО-инсулина;
Claims (1)
- Формула изобретенияБессывороточная питательная среда для культуры ткани, содержащая основную среду и стимулятор роста клеток, отличающаяся тем. что в качестве стимулятора роста она содержит аргинил А-0 инсулин в концентрации 0.25-100 нг на 1 мл.
Концентрация ААО-инсулина, нанограмм/мл Число клеток (х 1000) Партия А Партия В Партия С Партия 0,25 380 280 270 330 1 370 360 330 270 2.5 480 420 420 380 10 540 550 540 470 25 600 ' 600 530 510 100 670 640 580 580 Составитель И, Тарасова Редактор Техред М.Моргентал Корректор Г. Кос Заказ 2490 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31588789A | 1989-02-27 | 1989-02-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1830080A3 true SU1830080A3 (ru) | 1993-07-23 |
Family
ID=23226497
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904743208A SU1830080A3 (ru) | 1989-02-27 | 1990-02-26 | Бессыворотомная питательная среда для культуры ткани |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0390327A3 (ru) |
JP (1) | JPH02261376A (ru) |
CN (1) | CN1045125A (ru) |
AU (1) | AU620499B2 (ru) |
CA (1) | CA2010424A1 (ru) |
HU (1) | HUT53671A (ru) |
IE (1) | IE900685L (ru) |
IL (1) | IL93463A0 (ru) |
NZ (1) | NZ232641A (ru) |
PT (1) | PT93217A (ru) |
SU (1) | SU1830080A3 (ru) |
ZA (1) | ZA901280B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MD3569G2 (ru) * | 2007-07-13 | 2008-11-30 | Национальный Научно-Практический Центр Превентивной Медицины Министерства Здравоохранения Республики Молдова | Среда для культивирования человеческих и животных клеток |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9022545D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
IL102929A (en) * | 1992-08-24 | 1996-11-14 | Interpharm Lab Ltd | Serum-free medium for mammalian cells |
WO2001051624A2 (en) * | 2000-01-12 | 2001-07-19 | Eli Lilly And Company | Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
USRE30985E (en) * | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
AU4254489A (en) * | 1989-10-03 | 1991-04-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of induction and activation of cytotoxic t cells |
-
1990
- 1990-02-20 IL IL93463A patent/IL93463A0/xx unknown
- 1990-02-20 CA CA 2010424 patent/CA2010424A1/en not_active Abandoned
- 1990-02-20 ZA ZA901280A patent/ZA901280B/xx unknown
- 1990-02-21 PT PT93217A patent/PT93217A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-02-22 NZ NZ23264190A patent/NZ232641A/xx unknown
- 1990-02-22 EP EP19900301902 patent/EP0390327A3/en not_active Withdrawn
- 1990-02-22 JP JP2044292A patent/JPH02261376A/ja active Pending
- 1990-02-23 AU AU50154/90A patent/AU620499B2/en not_active Ceased
- 1990-02-26 SU SU904743208A patent/SU1830080A3/ru active
- 1990-02-26 IE IE900685A patent/IE900685L/xx unknown
- 1990-02-26 HU HU901046A patent/HUT53671A/hu unknown
- 1990-02-26 CN CN90100961A patent/CN1045125A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MD3569G2 (ru) * | 2007-07-13 | 2008-11-30 | Национальный Научно-Практический Центр Превентивной Медицины Министерства Здравоохранения Республики Молдова | Среда для культивирования человеческих и животных клеток |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0390327A3 (en) | 1990-11-14 |
IE900685L (en) | 1990-08-27 |
HU901046D0 (en) | 1990-05-28 |
CA2010424A1 (en) | 1990-08-27 |
AU620499B2 (en) | 1992-02-20 |
EP0390327A2 (en) | 1990-10-03 |
JPH02261376A (ja) | 1990-10-24 |
CN1045125A (zh) | 1990-09-05 |
HUT53671A (en) | 1990-11-28 |
AU5015490A (en) | 1990-08-30 |
IL93463A0 (en) | 1990-11-29 |
ZA901280B (en) | 1991-10-30 |
PT93217A (pt) | 1990-08-31 |
NZ232641A (en) | 1991-08-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4443546A (en) | Process and composition for propagating mammalian cells | |
US4959351A (en) | Crystal suspensions of insulin derivatives, processes for their preparation and their use | |
US4876242A (en) | Human insulin-like growth factor analoges with reduced binding to serum carrier proteins and their production in yeast | |
EP0216832B1 (en) | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives | |
US4440860A (en) | Stimulating cell growth | |
FI66751B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt insulinpreparatmed laongtidsverkan | |
Mosier | Primary in vitro antibody responses by purified murine B lymphocytes in serum-free defined medium. | |
KR920006868B1 (ko) | 인터페론의 제조방법 | |
JPS61212598A (ja) | インシユリン化合物 | |
DeLuca et al. | Altered glycoprotein synthesis in mouse epidermal cells treated with retinyl acetate in vitro | |
Carpenter et al. | Epidermal growth factors | |
CA2583027A1 (en) | Serum-free cell culture medium for mammalian cells | |
RU2073686C1 (ru) | Способ получения стабильных соматотропинов, стабильные соматотропины и композиция стабильного соматотропина | |
Nilausen | Role of fatty acids in growth‐promoting effect of serum albumin on hamster cells in vitro | |
Patel et al. | Concentration of free amino acids in primary cultures of neurones and astrocytes | |
Spencer | Synthesis by cultured hepatocytes of somatomedin and its binding protein | |
Scher et al. | Dissociation of cell division stimulating capacity for Balb/c-3T3 from the insulin-like activity in human serum | |
JPH04503154A (ja) | 変型ヒト成長ホルモン | |
US4621053A (en) | Process for the production of human peptide hormones | |
SU1830080A3 (ru) | Бессыворотомная питательная среда для культуры ткани | |
JPH03501856A (ja) | 新規なソマトトロピン | |
EP0310887B1 (en) | Vasoconstrictor peptide | |
EP0591605B1 (en) | Method for suppressing coloring of human serum albumin | |
Vasiliev et al. | The 30 S ribosomal subparticle retains its main morphological features after removal of half the proteins | |
US4452893A (en) | Cell growth medium supplement |