PT93217A - Meio de cultura de tecidos contendo arginil-a-o-insulina - Google Patents

Description

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Durante alguns anos a arto do crescimento de células de mamíferos em cultura de tecido esteve no coração de um grande número de campos de pesquisa das ciências biológicas. Tais células são feitas crescer em cultura de tecido como fontes de produtos bioquímicos e para estudos de base em processos bioquímicos e bio-tecnológicas. As células de mamíferos crescendo em cultura de tecido são vitais à grande maioria dos avanços recentes em biologia molecular.

Desta forma a pesquisa nos processos de cultura de tecido ê actualmente, de grande importância e numerosas pesquisas estão a ser efectuadas sobre as condições de cultura de tecido e os mecanismos que se processam em células de cultura de tecido.

Este invento integra-se na arte da bioquímica e particularmente na arte da cultura de tecido.

Este invento fornece um método para o crescimento, num meio de cultura de tecido sem soro, de células de marrfiferos adequados ao crescimento em cultura de tecido e que respondem positivamente à presença de insulina no meio de cultura de tecido, em que o meio de cultura de tecido contem de cerca de 0,1 a cerca de 10.000 na-nogramas de insulina arginil-A-0- por mililitro. 0 invento também fornece um meio de cultura sem soro adaptado ao crescimento de células de mamíferos em cultura de tecido, contendo de cerca de 0,1 a cerca de 10.000 nanogramas de insulina arginil-A-0 por mililitro. -3-

Este invento caracteriza-se pela utilização de insulina arginil-A-0 {insulina AAO) como agente para melhorar o crescimento nos meios de cultura de tecido para o crescimento de células de mamíferos. A insu-lina-AAO ê um sub-produto da preparação de insulina humana (Hl) a partir da pro-insulina humana. 0 processo foi publicado com algum detalhe e começa com a pro-insulina humana, ligada covalentemente ao condutor destacável de se-queficia que é sintetizado por micro-organismos geneticamente modificados para este fim. Frank, B.H., e Chance, R.E. (1983), Munch. Med. Wschr; 125 (supl. 1) 14-20. Frank, B. H., e Chance, R.E. (1985) Symposium "Quo Vadis", Sanofi, Maio 29-30, Toubuse-Labege, France, pp 138-146. Frank B. H., Petre, J.M. Zimmerman, R.E., e Burk, P.J. (1981) em Peptides:Syntesis-Structure-Function, Procedings of the Seventh American Peptide Symposium. D.H. Rick e E. Gross eds., Pierce Chemical Co., Rockfond, 111., pp. 729-738. A pro-insulina é separada com tripsina e carboxipeptidase B, de preferência na presença de iões metálicos com exposto por European Patent Publication 0264250 (U.S. Patent Aplication 06/917939).

Como hoje se sabe, a insulina humana é formada por 30 amino-ácidos de cadeia B ligados a 21 amino-ácidos de cadeia A por meio de partes bissulfure-to que ligamas císteinas nas posições A-7 e B-7 e as císteinas das posições A-20 e B-19. A pro-insulina humana ê uma proteína contendo 86 amino-ácidos em que a glici-na na posição A-1 da Hl está ligada à teonina na posição B-30 por meio de um peptídeo de ligação interna, uma cadeia de 35 amino-ácidos. 0 peptídeo de ligação é retirado por separação no processo que converte a pro-insulina humana em Hl. 0 processo de separação não ê, evidentemente, totalmente eficiente e surgem alguns sub- Ϊ t

-produtos da separação imperfeita. Um desses sub-produtos ê a insulina arginil-A-O, que difere da Hl por possuir um grupo arginil extra, ligado na posição A-1, o extremo ami-na, da insulina humana. Este sub-produto pode ser separado da Hl por cromatografia de permuta catiónica, como se mostra abaixo na preparação 1.

Curiosamente a insulina AAD ê menos potente no que se refere aos efeitos de redução de glucose no sangue de coelhos, in vivo. No ensaio em coelhos, a insulina AAO apresenta tem uma eficiência de 75% da própria Hl, mole por mole. Contudo, a "insulina AAO ê, pelo menos tão eficiente como a insulina para estimular o crescimento de células de mamíferos em cultura de tecido.

Quando os biólogos e os bioquímicos iniciaram o processo de crescimento de células de mamíferos em cultura de tecido era convencional que o crescimento se realizasse num meio de cultura de tecido com soro animal em concentrações de 5-10%. 0 soro fornecia nu trientes valiosos às células e foram realizados muitas experiências importantes nessas culturas. 0 desejo de experiências mais rigorosas, contudo, levou ao crescimento de células de cultura de tecido em meios bem definidos,em que todos os constituintes são entidades químicas purificadas e rigorosamente caracterizadas. Uma das substâncias que deveria ou deve ser adicionada aos meios definidos para o crescimento adequado de muitas células ê a insulina.

Por exemplo, na literatura têm sido descritos os seguintes tipos de células como responsáveis positivamente à adição de insulina aos meios de cultura de tecido. 9Β86ΖΓ63*

Carcinoma da pituitária de ratazana

Carcinoma cervical humano

Carcinoma de rim de cão

Neuroblastoma de ratazana

Melanoma de rato

Glicoma de ratazana

Carcinoma de mama humana

Ovário de ratazana

Carcinoma embrional de rato

Testículos de rato

Carcinoma de colon humano

Embrião de ratazana Balb/c

Mioblasto de ratazana

Carcinoma epidérmico de pulmão humano

Rim de hamster

Fibroblasto humano

Carcinoma epidermóide humano

Tiróide de ratazana

Embrião de rato -6-

Linfoma de rato Adipócito de ovelha A insulina ê, nitidamente, um factor comum, desejável ou necessário em meios de cultura de células de mamíferos. A aplicação deste invento ê desejável na cultura, de todas as células de mamíferos que sejam estimulados pela insulina nos meios de cultura. Deste modo, a natureza ou a fonte de células a utilizar não constitui uma limitação do presente invento.

Do mesmo modo o meio de cultura de tecido não ê um factor limitativo. Os meios de cultura sem soro têm sido extensivamente estudados e alvo de publicações há 30 anos ou mais. Como fonte de informação sobre os meios de cultura, para conveniência do leitor, sugerem--se as seguintes publicações que aqui se incluem por referência.

Jayne e Blackman, Culture Media for Propagation of Manualian Cells, Viruses and Other Bio-logicals, Advances in Biotechnological Processes, 5, 1-30, A.R. Liss, Ine (1985).

Hans and Mekeehan, Methods Enzy- mol. 58, 44-93 (1979).

The Grouth Requirement of Verte-brate Cells In Vitro, Waymouth, Han and Chapple, Eds., Cambridge University Press (1981).

Methods for Serum-Free Culture of Cells of the Endocrine System, Barnes, Sirbasku and Sato, -7-

Eds., A.R. Liss, Inc. (1966).

Em geral os meios de cultura sem soro para células de mamíferos são constituídos por numerosos ingredientes incluindo amino-ácido essênciais como argi-nina, cisteína, histidina, metionina e equivalentes; por amino-ácidos não essenciais como alanina, asparagina, gli-cina e afins; e derivados de amino-âcidos como a glutaniona, a hidroxiprolina, a pustrecina e afins. Habitualmente também contem vitaminas como o ácido fólico, o biotino, a ni-cotinamida, o ácido pentatênico, a piridoxina, a riboflavi-na e a vitamina B12. Empregam-se carbo-hidratos como glucose e piruvato, assim como, com frequência, cferivados de ácido nucleíco como adenina, hipoxantina e timidina.

Tais meios de cultura contêm uma fonte de lípidos como colina e i-inositol e iões inorgânicos incluindo cálcio, magnésio, sódio, fosfato e afins. Traços de elementos inorgânicos como o cobalto, ferro, selênio e o zinco estão frequentemente incluídos. Os meios de cultura são muitas vezes tamponizados para manter o pH desejado, muitas vezes com o ião bicarbonato ou o gás dióxido de carbono. 0 artigo de Ham e Mckerhan anteriormente citado é uma boa fonte de fórmulas de meios que têm sido testados com utilização com sucesso e que são familiares na arte. Uma descrição ainda mais detalhadas de meios de cultura pode ser encontrada no TCA Manual, publicado pela Tissue Culture Association, 12111 Park Lawn Drive, Rockville, MD. 20852.

Como se explicou anteriormente, a insulina AAO encontra-se como sub-produto da preparação da pro-insulina humana Hl, e ê, deste modo, fâcilmente obtida para aplicação no presente invento por simples separação a partir do produto Hl impuro. A Preparação seguinte ilustra um procedimento cromatográfico útil para essa separação e um passo de cristalização para a purificação da in- -8-

sulina AAO. PREPARAÇAO 1

Cromatografia

Dissolveu-se uma mistura contendo insulina AAO e Hl em 32 ml de um tampão contendo ureia 7M, acetato de sódio 0,05M e cloreto de sódio 0,1M a pH3,8. Encheu-se uma coluna cromatogrãfica; 1x15 cm, com resina TRISACRYL sulfopropilo, fabricada para Reactifs IBF, uma divisa de Rhone-Poulene, sob a forma de partículas de 40-80 micron. A solução de insulina AAO foi colocada na coluna e eluída com 9 volumes da coluna de uma solução tampão gradiente com a composição anteriormente descrita, com excepção do facto da solução de cloreto de sódio subir a 0,2M. 0 fluxo foi de 1ml/minuto. 0 efluente da coluna foi controlada por absorção atómica a 280 nm. Verificou-se que a insulina saiu em primeiro lugar e que prãticamente foi toda eluida nos primeiros 70 ml após o inicio da eluição por gradiente. Em seguida saiu a insulina AAO e foi recolhida no efluente entre 72-105 ml para se obter a fracção rica em insulina AAO com muito pouca contaminação de Hl.

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Cristalização

Com hidróxido de sódio 10¾ ajus-tou-se para 8,0 o pH de 840 ml de solução com o produto insulina AAO, contendo 2,32 g de insulina AAO. A solução foi concentrada a 260 ml a 4°C utilizando uma membrana de separação com peso molecular 3000, a 4°C. A solução concentrada foi então diafiltrada com 280 ml de âgua desionizada. A solução foi diluída a uma concentração de 2 g de proteína por litro e adicionaram-se 16,2 ml de ácido acético glacial e 850 ml de âgua desionizada para tornar a solução 0,25M em ácido acético. Aqueceu-se em seguida a 23°C e adicionaram-se 0,93 ml de uma solução aquosa de cloreto de zinco a 20¾. 0 pH foi ajustado a 6,0 com hidróxido de amónio con centrado e a mistura foi agitada a 23°C durante quatro horas. Arrefeceu-se então a 4°C e a mistura foi incubada a essa temperatura durante 16 horas, sem agitação. Em seguida decantou-se o sobrenadante e a pasta espessa cristalina que ficou foi centrifugada. Os cristais foram lavados duas vezes com âgua purificada e em seguida duas vezes com eta-nol absoluto, utilizando 23 ml para cada lavagem. Os cristais foram secos sob vácuo à temperatura ambiente para obter 2,11 g de insulina AAO prãticamente pura.

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EXEMPLO 1 A insulina AAO foi utilizada no crescimento de células de ovário de hamster Chineses num meio sem soro que se revelara eficiente para o crescimento dessas células. 0 meio ê formado por três partes de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DME) e uma parte (em volu-

O me) de meio F12, com a adição 10” M de selénio, 50 uM de etanolamina, 20 mM de ácido hidroxi-eti1-piperazina etanos-sulfônico e 1 ug/ml de transferrina humana. Adicionaram-se as quantidades de insulina AAO referidas na tabela que adiante se apresenta a diversas quantidades do meio. 0 crescimento das células foi efectuado em pratos de 12 compartimentos Corning que foram sujeitos a um tratamento prévio com laminina, uma proteína que promove a ligação e a disseminação da célula nos locais de cultura. Cada situação foi levada a cabo em duplicado.

Cada ponto de cultura cheio do meio foi inoculado com 25.000 células no dia 0 da experiência, e foram contadas com um contador Colter no sexto dia. Nesta experiência utilizaram-se quatro lotes diferentes de insulina AAO, que se adicionou ao meio de cultura como solução em ácido clorídrico 0,1N, estão expressas em nanograma por mililitro, em todos os casos.

Nas experiências de controlo, sem a adição de insulina ou insulina AAO ao meio de cultura, o número de células foi de 10.000 a 200.000 células por compartimento. As mesmas células, feitas crescer no mesmo meio contendo Hl ou insulina de carne de vaca, em vez de insulina AAO, cresceram tão bem como nas experiências descritas aqui -11-

Concentração de Número de células, (x1000) insulina AAO Lote A Lote B Lote C Lote D 0,25 380 280 270 330 1 370 360 330 270 2,5 480 420 420 380 10 540 550 540 470 25 600 600 530 510 100 670 640 580 580

As experiências anteriores mostram a eficiência da insulina AAO para estimular o crescimento de células que forem possíveis à presença de insulina na cultura de tecido. De facto o número médio de células por compartimento nesses testes, aumentou para valores desde 240000 a 610000, dependendo da concentração de insulina AAO.

Claims (1)

1. -12--

   REIVINDICAÇÕES 1â. - Meio de cultura, caracte-rizado por ser constituído por um tecido sem soro adaptado ao crescimento de células de mamíferos, contendo de cerca de 0,1 a cerca de 10.000 nanogramas de arginil-A-0-insulina por mililitro. 2â. - Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração da argini1-A-O-insulina ser de cerca de 1 a cerca de 1.000 nanogramas por mililitro. 3ã. - Meio de cultura de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a concentração da arginil-A-0 insulina ser de cerca de 1 a cerca de 100 nanogramas por mililitro. 4â. - Método para o crescimento, num meio de cultura de tecidos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser empregado para o crescimento de células de mamíferos adequados ao crescimento em cultura de tecidos e que reqpondem positivamente à presença de insulina em meio de cultura de tecidos. 5â. - Método para o crescimento, num meio de cultura de tecidos de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser empregado para o crescimento de células de mamíferos adequados ao crescimento em cultura de tecidos e que respondem positivamente à presença de insulina no meio de cultura de tecidos. -13- 6â. - Método p-ara o crescimento, num meio de cultura de tecidos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado para ser empregado para o crescimento de células de mamíferos adequados ao crescimento em cultura de tecidos e que respondem positivamente à presença de insulina no meio de cultura de tecidos. Lisboa, 21 de Fevereiro de 1990

   J. PEREIRA DA CRUZ Âgsnts Gflfâsi tís PfGptóâde industrial RUA VICTOn CORDSN, 10-A, 1/ 1200 LISBOA