FI90353C - En plasmid för expression av human-mangansuperoxiddismutase i bakterier och ett förfarande för framställning och utvinning av enzymatiskt aktiv human-mangansuperoxiddismutase - Google Patents

Claims (21)

1. Plasmid for expression i en låmplig prokaryotisk vård-cell av en human-mangansuperoxiddismutasanalog uppvisande den enzymatiska aktiviteten av naturligt upptrådande human-mangansuperoxiddismutas, k&nnetecknad av att analogen inne-fattar två eller fyra icke-kovalent bundna polypeptider, som var och en innefattar 199 aminosyror, varvid varje polypep-tidsekvens uppvisar i sin N-terminal metionin omedelbart intill lysin, som kodas av nukleotider 115-117 i fig. l, och fortsåtter till lysin, som kodas av nukleotider 706-708 i fig 1, som utgdr polypeptidens COOH-terminal, och att plas-miden innefattar ett DNA, som kodar en sådan polypeptid, och låmpliga reglerelement anordnade i plasmiden så att expression av polypeptiden och bildning av human-mangansuperoxid-dismutasanalogen i vårdcellen uppnås.

2. Plasmid enligt patentkravet 1, k&nnetecknad av att den år pMSE-4 deponerad i Escherichia coli -stam A4255 under ATCC-nummer 53250.

3. Plasmid enligt patentkravet 1, k&nnetecknad av att den år pMSARB4.

4. Prokaryotisk vårdcell, k&nnetecknad av att plasmiden enligt patentkravet 1 år inford dåri.

5. Vårdcell enligt patentkravet 4, k&nnetecknad av att den år en cell av Escherichia coli -stam A4255 innehållande en plasmid betecknad pMSE-4 som år deponerad under ATCC-nummer 53250.

6. Vårdcell enligt patentkravet 4, k&nnetecknad av att den år en Escherichia coli -cell innehållande en plasmid betecknad pMSARB4.

7. Fdrfarande for framstållning av human-mangansuperoxiddi smut asanal og, k&nnetecknat av att det odlas ett vårdplas-midsystem enligt patentkravet 4 under sådana betingelser att 41 90353 human-mangansuperoxiddismutasanalogen bildas och så bildad analog utvinnes.

8. Forfarande for framstållning av en enzymatiskt aktiv rekombinant human-mangansuperoxiddismutas med en DNA-sekvens enligt figur 1 innehållande nukleotider 115-708 uppvisande våsentligen samma aminosyrasekvens som och den biologiska aktiviteten av naturligt upptrådande human-mangansuperoxiddismutas eller dess analog eller mutant, kånnetecknat av att en kultur av bakterieceller odlas i ett produktionsmedium kompletterat med en icke-tillvåxtinhiberande mångd av Mn++, sådan att koncentrationen av Mn++ i mediet år hogre ån 2 ppm under bakteriecellernas tillvåxt, vilka bakterieceller inne-håller en plasmid, som innehåller ett DNA som kodar analogen av human-mangansuperoxiddismutas och vilka celler kan ut-trycka detta DNA som kodar analogen av human-mangansuperoxiddismutas, varvid odling genomfores under betingelser sådana att DNA uttryckes och analogen av human-mangansuperoxiddismutas bildas i bakteriecellerna, varefter den sålunda bildade enzymatiskt aktiva analogen eller mutanten utvinnes.

9. F5rfarande enligt patentkravet 8, kånnetecknat av att bakteriecellerna utgores av Escherichia coli -celler.

10. Forfarande enligt patentkravet 8, kånnetecknat av att plasmiden innehåller DNA, som kodar en human-mangansuper-oxiddismutasanalog, vilken analog innefattar två eller fyra icke-kovalent bundna identiska polypeptider, som var och en innefattar 199 aminosyror, varvid varje polypeptidsekvens uppvisar i sin N-terminal metionin omedelbart intill lysin, som kodas av nukleotider 115-117 i fig. 1, och fortsåtter till lysin, som kodas av nukleotider 706-708 i fig 1, som utgor polypeptidens COOH-terminal.

11. Forfarande enligt patentkravet 10, kånnetecknat av att plasmiden år pMSE-4 som år deponerad i Escherichia coli -stam A4255 under ATCC-nummer 53250. 42 90 353

12. Fdrfarande enligt patentkravet 10, kånnetecknat av att plasmiden år pMSARB4.

13. F5rfarande enligt patentkravet 8, kånnetecknat av att Mn++-koncentrationen år 50-1500 ppm.

14. Forfarande enligt patentkravet 9, kånnetecknat av att Escherichia coli -cellerna utgåres av celler av Escherichia coli -stam A4255, innehållande en plasmid pMSE-4 och de-ponerad under ATCC-nummer 53250.

15. Forfarande enligt patentkravet 9, kånnetecknat av att Escherichia coli -cellerna utgores av celler av Escherichia coli -stam A4255, innehållande en plasmid pMSARB4.

16. Forfarande for katalysering av foljande reaktion: 202' + 2H+ -► H202 + 02 kånnetecknat av att reagenser bringas i kontakt med human-mangansuperoxiddismutasen eller dess analog expresserats med plasmiden enligt patentkravet 1 under låmpliga betingelser.

17. Forfarande for minskning av skador på celler in vitro orsakade av superoxidradikaler, kånnetecknat av att reduktion av superoxidradikaler katalyseras enligt patentkravet 16.

18. Forfarande for ffirlångning av overlevnadsperioden for uttagna, isolerade organ, kånnetecknat av att man tillsåtter till perfusionsmediet en effektiv mångd av human-mangansu-peroxiddismutas med plasmiden enligt patentkravet 1.

19. Forfarande for utvinning av rekombinant human-mangansuper oxiddi smutas innefattande DNA-sekvens enligt figur 1 innehållande nukleotider 115-708, eller en analog eller mutant dårav från bakterieceller, som innehåller human-mangansuper- 43 90353 oxiddismutas eller en analog eller mutant dårav, kånneteck-nat av (a) behandling av bakteriecellerna for utvinning av en proteinfraktion innehållande proteinerna ingående i cellerna inklusive human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav; och (b) behandling av proteinfraktionen for utvinning av human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav.

20. Forfarande enligt patentkravet 19, kånnetecknat av (a) behandling av cellerna for separation av Idsliga proteiner och cellvåggssdnderfall; (b) utvinning av de Idsliga proteinerna; (c) behandling av de Idsliga proteinerna som utvunnits sålunda for separation av en fraktion av de Idsliga proteinerna innehållande human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav; (d) utvinning av fraktionen av Idsliga proteiner innehållande human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav; och (e) behandling av fraktionen av Idsliga proteiner innehållande human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav fdr separat utvinning av human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav.

21. Fdrfarande enligt patentkravet 19, kånnetecknat av (a) isolering av bakteriecellerna från odlingsmediet; (b) uppslamning av de isolerade bakteriecellerna i en låmp-lig losning uppvisande ett pH-vårde av 7,0 - 8,0; (c) språngning av de uppslammade bakteriecellerna; (d) centrifugering av de språngda bakteriecellerna; (e) upphettning av erhållen supernatant under en period va-rierande från 30 till 120 minuter vid en temperatur varie-rande från 55°C till 65°C; (f) kylning av den upphettade supernatanten till lagre temperatur ån 10°C; (g) avlågsnande av eventuell fållning från den kylda supernatanten; 90353 44 (h) dialys av den kylda supernatanten mot en låmplig buffert ; (i) eluering av kvarhållet material på en anjonbytarkroma-tografikolonn med en låmplig buffrad låsning; (j) tillvaratagande och ihopslagning av fraktioner av elue-rat material innehållande human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav; (k) dialys av de sammanslagna fraktionerna mot 40 mM kaliumacetat , pH 5,5; (l) eluering av de dialyserade sammanslagna fraktionerna genom en katjonbytarkromatografikolonn med en linjår gradient av 40 - 200 mM kaliumacetat, pH 5,5; och (m) tillvaratagande och ihopslagning av fraktioner av elua-tet innehållande human-mangansuperoxiddismutas eller analogen eller mutanten dårav.