JPS6112289A - アルフア−1−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 - Google Patents
アルフア−1−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発Info
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- JPS6112289A JPS6112289A JP60051553A JP5155385A JPS6112289A JP S6112289 A JPS6112289 A JP S6112289A JP 60051553 A JP60051553 A JP 60051553A JP 5155385 A JP5155385 A JP 5155385A JP S6112289 A JPS6112289 A JP S6112289A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は突然変異誘発遺伝子の作製および微生物中に於
けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は突
然変異誘発ヒトアルファ− 1−抗1〜リプンン遺伝子
の作製およびアルファ−1−抗1リプシンの部位特異性
突然異性体の表現に関する。 アJpファーI−抗トリプシン(以下ATと略称する)
はプロテアーゼ阻害剤であり、その主な機能は広スペク
トルプロテアーゼであるエラスターゼを阻害することで
ある。咄乳頻の肺組織はエラスターゼに特に侵されやす
いので、ATの欠乏または不活性化は肺組織および弾性
の)置火およびそれに続く気腫を生ずる可能性がある。 AT活性の(置火または減少はタバコの煙を含む環境1
15染物質によるΔ′Fの酸化の結果であり得る。ガデ
ク、ジェームスE、 (Gadek、 James E
、)およびR,D、クリスタル(R,Il、Cryst
;]Il、 ”アルファ−1−抗トリプシン欠1員(八
Ipha−1−八ntiLrypsin Defic
iency) ” 、ザ・メタポリ4−り−ニベ
:シス・オーツl二(4ユ之±テア F≧’Y x ’
17−7::(ユhe Metabolic Ba5i
s of−(Stanbury、 J、B、)ら編、マ
グロ−・ヒル、ニューヨーク (1988)pp、14
50−1467およびキャロル(Carrol l)
ら、玉ニチ+ −(Nature)−2381,32
9−334(1982)参照。 オウエン(Owen)ら(New Eng、J、Med
、、 309 :G 94−698.1983)は、
患者かアミノ酸位置358に於けるメチオニンの代わり
にアルギニンを置換したアルファ−1−抗トリプシンの
突然変異体形を生成する条件を記載している。遺伝子配
列中の単点突然変異(ATC−=AGG)の結果として
、アルファ−1−抗1−リプシンはエラスターゼ阻害剤
としてのその正常な機能からトロンヒン阻害剤の機能へ
変化した。この機能変化は野生型へ]゛とアンチトロン
ビン■との間の構造の30%相同から生じる(キャロル
(Carrol I) ら、同上をも参照のこと)。 これらの発見は、ATの変化形か例えば播種血管向凝固
の治療に於けるような血液凝固防止に用いるために臨床
的に重要となり得ることを示す。 蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安
定性の増強をもたらし得る野生型ヒト八Tの変化形を作
製することは望ましいことである。Δ′1″るこ於ける
遺伝的欠損にかかっている患者に投j5するための、か
かる患者よ免疫学的により相容性である野牛型ATの変
化形を作製することも望ましい・二とである・う。増加
したアンチトロンヒン活性を有するATの変化形を作製
することも望ましい、二とてあく〉・う。 従って、本発明の1つの目的は野生型ヒト八′「の部位
特異性突然変異誘発の作製方法を提供することである。 本発明のも・う1つの目的は突然変異体形八Tのための
116号づけをする構造遺伝子からなる表現ヘクターを
提供することである。 本発明のもう1つの目的は部位特異性突然変異誘発△1
′蛋白質を提供することである。 本発明は部位特異性突然変異誘発ATのための構造遺伝
子のための暗号づけをする1本鎖および2本鎖閉環状D
NAの生成方法を提供する。特に、本発明は (a+ 野生型A′Fのための構造遺伝子の暗号配列
またはその相補物からなる環状1本鎖cDNA分子を作
製する工程と、 ib)かかる】本鎖1) N Aに、(1)かかる1本
鎖DNAのセグメン1〜に相補的であることと野生型Δ
Tの位置358に於けるアミノ酸に対応するコドンに於
て1つまたは2つ以上の誤対合を含めかつ該誤対合がア
ラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラ
ニンまたはアルキニンまたはリジンのためのコドンの1
つからなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレオチ
ドと(2+M13のだめの万能プライマーのようなプラ
イマーとをアニーリングさせる工程と、tel 該オ
リゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的に延長する工
程と、 (d) 延長されたオリゴヌクレオチドとプライマー
との末端を一緒に結合してギャップつき環状2本鎖DN
A分子を生成させる工程と、 (ρ) 該2本鎖ギャップ付き環状1.) N A分子
を大腸菌、(!1−49119−中へトランスフェクシ
ョンしてヒト×7+ ′R−八Tへための構造遺伝子を
含む閉環状1つNA分子を4ト威させかつプラークハイ
ブリダイゼーシヨンのためのプローブとしての突然変異
体オリゴヌクレオチドでスクリーニング後、突然変異体
1) N八を分離する工程とからなるヒト×3′8−八
T(ごごでXはアラニンまたはバリンまたはグリシンま
たはフェニルアラニンまた6、tアルギニンまたはリジ
ンである)のための構造遺伝子のための暗号づLJをす
る1本鎖または2本鎖閉環状DNAの生成方法を提供す
る。 同様の方法によって、Δ1゛のZ一対立遺伝子としても
知られているヒトLys”2− A Tの構造遺伝子か
らなる閉環状DNA分子を作製することができる。本発
明の方法は342と358の両方の位置ならひに他の位
置に於て突然変異誘発されたΔ′1゛の作製にも利用す
ることができる。 本発明しJ突然変異誘発A i”のための構造遺伝子か
らなるl) N A構造物およびクローニングへフタ−
および突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的に
純粋な部位特異性突然変異誘発ATをも提供する。 第1図について説明すると、この図には野生型へTの優
勢形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示しである。位
置356−360に於けるアミノ酸からなるATの活性
部位はメチオニン残基を含む。位置358に於ける残基
はタバコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されると
き酸化を受けやすい。かかる酸化はATの生物学的活性
を減少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘
発により、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニ
ンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニン
またはアルギニンまたはリジンで置換して、より安定な
ATの形を生成させることができる。 さらに、遺伝的AT欠損の1つはZ一対立遺伝子変異体
として知られている異常形の生成である。 第1図について言うと、この突然変異はアミノ酸位置3
42に於けるグルタミン酸のリジンによる置換によって
示される。Z一対立遺伝子変異体に対して同型接合性の
個人は、明らかに肝臓に於ける処理妨害のために正常レ
ベルの約15%のATを4゛成する。このことは肝臓中
にATの未熟形の7W積を生し、これに対応して血脩の
該阻害剤レベルが減少する。この状態をもつ個人の80
%までは慢性の肺A′りよび(または)肝臓疾患で死に
至ると考えられている。Z一対立遺伝子変異体蛋白質自
体は野生型蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性を有するこ
とは注目す、べきである。かかる個人のA′1゛レヘル
は野生型へTの静脈内投与によって増強することができ
る〔ガデク(Gadek) ら、乏土二丈11581
165 (+981)参照〕。しかし7、野生型蛋白
質はごれらの患者にとって異種であるので、成人かの7
7個人は野生型蛋白質にアレルー1−一になるとjjJ
l待され得る。かくして、本発明はある種のΔ′丁゛欠
損患者に於て非免疫原となり得るZ一対立遺伝子変異体
の生成方法を提供する。 抗トロンビン活性を有することが示されているArg3
59− A ’rは血液凝固阻止に有用でもあり得る。 天然産アンチトロンビン■は、通常、体内で血液凝固を
調節する働きがある。アンチトロンビン■は播種血管内
擬固の治療のため〔ガスチー(Gassner) ら
、典、但ユn、 W−ochenschr、 91
:51−53.1979iおよびヘルグレン(Ile
l Igren) 、 M、他、Gynecol、 0
bste旦−1nves t。 16107−118.1983)、および他の症状の治
療に於てヘパリンの代替物として〔バーンハート(Be
rnhard t) 、 W、およびノハコハーハlノ
)(Novakova−Banet)、A、、Ric、
Cl1n、 Lab、 1 3 :61−
66.1983)用いられて来た。 特に、本発明は野生型ヒトAT遺伝子のcDNへまたは
その相補物からなる1本鎖DNA鋳型の作製に関する。 突然変異させようとするコドンに於て1個または2個以
七の誤対合を含む直線状オリゴヌクレオチ1゛プライマ
ーを、突然変異誘発部位の5′側にアニーリングする第
2プライマーと一緒に鋳型ヘアニーリングさせる。好ま
しい第2プライマーはT−1ノ販されておりかつM13
ヘクター中のラフp、 (1;4q) Z遺伝子ヘ
ハ・イブリダイセーションJるMI3の万能ブライマー
である〔メノシンク(Messing)+Met−jB
、 in IE−n、z7mo↓q6.y −J−0−
1ノ20−77.1.983)。該オリゴヌクレオチド
を延長しかつ末端に於て粘合させて2本鎖キヤツプつき
環状IJ N Aを得る。この2本鎖1) N Aを用
いて宿j7微生物人腸1■L轄、−Ho−1−jΣをト
ランスフェクションし、突然変異体および野生型DNA
分子の混合物を含む、集団をもたらす。突然変異体DN
Aオリ二lヌクL/オチドをブし7−フ゛とし−こ用い
るブラークハイフリダイセーションによって突然変異体
11N八分−rを4g択する。このl) N Aをシー
ケンシング(sequenced)変化したコドンの存
在を証明した後、適当な表現−・ツク−中へクローニン
グすることができる、突然変異誘発AT蛋白質は、細菌
または酵母あるいは他の前核類または真正核類中で表現
さ口ることができる。 本明細書中で使用する”DNA構造物”、゛ヘククー”
、°゛プラスミド゛いう用語は、ヒトの介在によって変
性されているDNA分子あるいはかく変性されている分
子のクローンであるDNA分子であって、そうでなけれ
ば天然には存在しない方法で結合さ−Uかつ配列させた
DNAのセグメントを含むDNA分子を構成する。本明
細書中で使用する゛表現ヘクター”という用語は、宿主
生物中・\形質転換させるときそれ自体の複製を保証す
る遺伝情報と宿主生物中で表現されるべき少なくとも」
つの遺伝子ならびに転写の開始、翻訳の開始、プロモー
ター領域およびある場合には読み終り領域のための部位
のような、表現が起こるために必要となり得る他の制御
機能を含むDNA構造物である。゛′表現″という用語
は、通常の用途に於ては、宿主生物中に存在する遺伝子
によって暗号づりされる蛋白質生成物がある生物によっ
て合成される条件を意味すると定義される。“ギャップ
つき”という用語は、実質的に2本鎖であるか1本鎖頭
域を含むDNA分子を意味する。 災夏札喋可几 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。 ′□M
I 3 宿−i−株、万能プライマーおよびヘクター
は−< テスダ・り勺−チ・ラボラI・リーズ(Bet
hesda1ンescarcl+ Labora)、o
ries)から得た。制限エンドヌクレフアーゼは、ヘ
デスダ・リサーチ・ラボラドリース(13eLheSd
a l1esei+rch Laboratories
)、二、1゜−・インクラント・ハイオラブズ(Nei
y EnglandBioL、Ih5)、ヘーリンガー
・マンハイJ1、・ハイオケミカルズ(11oehri
nBer Mannhcim Biochemical
s)から得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌
細胞の形質転換、DNAポリメラーゼI 〔フレナラ(
Klenow)断片)を用いるDNA断片の平滑化(1
旧+ting)方法、T4DNΔリガーゼを用いる1)
N A断片の接合方法を含む一般的クローニング方法
はマニ゛アテイス(Maniatis)らが記載してい
る〔天火キー2・ユラニでツター二丑Zグ」色坪皐小猛
C−jonjn6) : ア−’z、−夫う」ドーリ−
ニー1−]]5−?−?J!/ (n、、−i、a1
7o、−r;1−t、−p、r、y−Ma、r++1Q
)、コールド・スプリング・バーバー・ラホラl−リ
ー(Cold SpringHarborl、ahor
atory )、1982)。 −・般的な部位特異性突然変異誘発方法は、シラー、マ
ークJ、(Zoller、Mark J、)および1.
スミス(M、Sm1th)著、” M 13誘導ヘクタ
ー中へクローニングされたDNA断片のオリゴヌクレオ
チド指示突然変異誘発(01igonucleoLid
e DirccledMutagenesis of
DNA Fragments C1oned
In1.o M13Derived Vector
s)″、マーユアル・シラー・アドールト・スプリング
・バーバー・ラホラトリ=(Ccld Spring
Harher Laboratory) 、1983に
記載されている。 野生型AT中の配列から1つ以上の塩基変化を含むオリ
ゴヌクレオチドは、ビューケージ<Beaucage)
およびカルケージ(Caruthers) 、? )’
z 21” 丑Z二に久−3(Tetrahed−ro
n Letters)22 : +859−1862.
1981およびマソテウチ(Ma tteoch)およ
びカル−勺−ズ(Caru thers)、J、Am、
Chem、Soc、 103 : 3138 (198
1)に一般的に記載されている亜燐酸トリエステル法に
より、マノテウヂ(M;]t teuch)およびカル
ーザース(Caruthers) 、テトラヘドロン・
レターズ4−Tq−1,4−!]−hq、d−ron−
Ls1↓二(sし!二s) 2 1 : 7
] 9 − 7 2 2(1980)に記載されて
いるようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド・ハイオシステムス・モデル
38o−A I) !”jA合成装置のような機械によ
って、オリゴヌクレオチドを合成することができる。合
成されたオリゴヌクレオチドは、変性用ゲル七でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製することがで
きる。オリゴヌクレオチドは、5′一端に於て、くカン
マ)32 P−ΔT’Pおよびポリヌクレオヂトキナー
セによって燐酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の
検定はマクザl、(Maxam)およびギルバート(G
Nbert)法、メソド・イン・工−ンーglイーE
r’J!−二−(、Mejユhods−i四]いlym
oJo5z) 、 6 5・、57. (] 98
0)で行うことができる。 野生型アルファ−1−抗トリプシン遺伝−−−一−乙か
支秦本−↓一本掩pJ−Δ−9罫ZJ−−−ヒトA T
の優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、DNAハイ
ブリダイゼーションプローブとして 々配列を用いる常
法〔クラチ(Kurachi) ら、Proc、
Nat、 八cad、 Sci、 USA+
7□づ6□、 6820 −830 (1980)
;およびチャンドラ(Chandra)ら、Bi−oc
ham、 側遼ユys、 Res、 Com−+ 10
3.751−758 (1981))によってヒト肝
臓cDNAライブラリーから単離することができる。A
T遺伝子は1446bpPstl 断片として単離さ
れ、Pst ] 消化プラスミドpuc 13
Cビエイラ(Vieira)ら、ジーン(Gen旬、よ
度、259−268(19’82)記載の方法で作製、
但し1acZ遺伝子に於ける開始に於て第2図に示す多
重制限部位を含む〕中へ挿入されてAT遺伝子の3′側
のポリリンカー中にBam I−I 1部位を含む組換
型プラスミドptlcα1を与える。プラスミド pU
cα1ばRam H]で消化されてAT配列を得る。 1320bpBam H1断片を次にM13mplO
中に結合し〔メソシング(lIIessing、メソド
ニ堕7−A!ブイJロジー(Methods jn E
nzymologi)101420−77 (1983
))、得られた組換型ファージを用いて大腸菌(fi=
cqli−) K l 2(、JM]03)をトラン
スフェクションする。AT遺伝子を含む1本鎖閉環状D
Nへをへ次にシラー(Zoller)およびスミス(S
mith)の方法(上掲)で単離する。 野η型AT中の配列から1つ以」−の塩基−変イ15剣
イ
けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は突
然変異誘発ヒトアルファ− 1−抗1〜リプンン遺伝子
の作製およびアルファ−1−抗1リプシンの部位特異性
突然異性体の表現に関する。 アJpファーI−抗トリプシン(以下ATと略称する)
はプロテアーゼ阻害剤であり、その主な機能は広スペク
トルプロテアーゼであるエラスターゼを阻害することで
ある。咄乳頻の肺組織はエラスターゼに特に侵されやす
いので、ATの欠乏または不活性化は肺組織および弾性
の)置火およびそれに続く気腫を生ずる可能性がある。 AT活性の(置火または減少はタバコの煙を含む環境1
15染物質によるΔ′Fの酸化の結果であり得る。ガデ
ク、ジェームスE、 (Gadek、 James E
、)およびR,D、クリスタル(R,Il、Cryst
;]Il、 ”アルファ−1−抗トリプシン欠1員(八
Ipha−1−八ntiLrypsin Defic
iency) ” 、ザ・メタポリ4−り−ニベ
:シス・オーツl二(4ユ之±テア F≧’Y x ’
17−7::(ユhe Metabolic Ba5i
s of−(Stanbury、 J、B、)ら編、マ
グロ−・ヒル、ニューヨーク (1988)pp、14
50−1467およびキャロル(Carrol l)
ら、玉ニチ+ −(Nature)−2381,32
9−334(1982)参照。 オウエン(Owen)ら(New Eng、J、Med
、、 309 :G 94−698.1983)は、
患者かアミノ酸位置358に於けるメチオニンの代わり
にアルギニンを置換したアルファ−1−抗トリプシンの
突然変異体形を生成する条件を記載している。遺伝子配
列中の単点突然変異(ATC−=AGG)の結果として
、アルファ−1−抗1−リプシンはエラスターゼ阻害剤
としてのその正常な機能からトロンヒン阻害剤の機能へ
変化した。この機能変化は野生型へ]゛とアンチトロン
ビン■との間の構造の30%相同から生じる(キャロル
(Carrol I) ら、同上をも参照のこと)。 これらの発見は、ATの変化形か例えば播種血管向凝固
の治療に於けるような血液凝固防止に用いるために臨床
的に重要となり得ることを示す。 蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安
定性の増強をもたらし得る野生型ヒト八Tの変化形を作
製することは望ましいことである。Δ′1″るこ於ける
遺伝的欠損にかかっている患者に投j5するための、か
かる患者よ免疫学的により相容性である野牛型ATの変
化形を作製することも望ましい・二とである・う。増加
したアンチトロンヒン活性を有するATの変化形を作製
することも望ましい、二とてあく〉・う。 従って、本発明の1つの目的は野生型ヒト八′「の部位
特異性突然変異誘発の作製方法を提供することである。 本発明のも・う1つの目的は突然変異体形八Tのための
116号づけをする構造遺伝子からなる表現ヘクターを
提供することである。 本発明のもう1つの目的は部位特異性突然変異誘発△1
′蛋白質を提供することである。 本発明は部位特異性突然変異誘発ATのための構造遺伝
子のための暗号づけをする1本鎖および2本鎖閉環状D
NAの生成方法を提供する。特に、本発明は (a+ 野生型A′Fのための構造遺伝子の暗号配列
またはその相補物からなる環状1本鎖cDNA分子を作
製する工程と、 ib)かかる】本鎖1) N Aに、(1)かかる1本
鎖DNAのセグメン1〜に相補的であることと野生型Δ
Tの位置358に於けるアミノ酸に対応するコドンに於
て1つまたは2つ以上の誤対合を含めかつ該誤対合がア
ラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラ
ニンまたはアルキニンまたはリジンのためのコドンの1
つからなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレオチ
ドと(2+M13のだめの万能プライマーのようなプラ
イマーとをアニーリングさせる工程と、tel 該オ
リゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的に延長する工
程と、 (d) 延長されたオリゴヌクレオチドとプライマー
との末端を一緒に結合してギャップつき環状2本鎖DN
A分子を生成させる工程と、 (ρ) 該2本鎖ギャップ付き環状1.) N A分子
を大腸菌、(!1−49119−中へトランスフェクシ
ョンしてヒト×7+ ′R−八Tへための構造遺伝子を
含む閉環状1つNA分子を4ト威させかつプラークハイ
ブリダイゼーシヨンのためのプローブとしての突然変異
体オリゴヌクレオチドでスクリーニング後、突然変異体
1) N八を分離する工程とからなるヒト×3′8−八
T(ごごでXはアラニンまたはバリンまたはグリシンま
たはフェニルアラニンまた6、tアルギニンまたはリジ
ンである)のための構造遺伝子のための暗号づLJをす
る1本鎖または2本鎖閉環状DNAの生成方法を提供す
る。 同様の方法によって、Δ1゛のZ一対立遺伝子としても
知られているヒトLys”2− A Tの構造遺伝子か
らなる閉環状DNA分子を作製することができる。本発
明の方法は342と358の両方の位置ならひに他の位
置に於て突然変異誘発されたΔ′1゛の作製にも利用す
ることができる。 本発明しJ突然変異誘発A i”のための構造遺伝子か
らなるl) N A構造物およびクローニングへフタ−
および突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的に
純粋な部位特異性突然変異誘発ATをも提供する。 第1図について説明すると、この図には野生型へTの優
勢形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示しである。位
置356−360に於けるアミノ酸からなるATの活性
部位はメチオニン残基を含む。位置358に於ける残基
はタバコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されると
き酸化を受けやすい。かかる酸化はATの生物学的活性
を減少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘
発により、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニ
ンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニン
またはアルギニンまたはリジンで置換して、より安定な
ATの形を生成させることができる。 さらに、遺伝的AT欠損の1つはZ一対立遺伝子変異体
として知られている異常形の生成である。 第1図について言うと、この突然変異はアミノ酸位置3
42に於けるグルタミン酸のリジンによる置換によって
示される。Z一対立遺伝子変異体に対して同型接合性の
個人は、明らかに肝臓に於ける処理妨害のために正常レ
ベルの約15%のATを4゛成する。このことは肝臓中
にATの未熟形の7W積を生し、これに対応して血脩の
該阻害剤レベルが減少する。この状態をもつ個人の80
%までは慢性の肺A′りよび(または)肝臓疾患で死に
至ると考えられている。Z一対立遺伝子変異体蛋白質自
体は野生型蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性を有するこ
とは注目す、べきである。かかる個人のA′1゛レヘル
は野生型へTの静脈内投与によって増強することができ
る〔ガデク(Gadek) ら、乏土二丈11581
165 (+981)参照〕。しかし7、野生型蛋白
質はごれらの患者にとって異種であるので、成人かの7
7個人は野生型蛋白質にアレルー1−一になるとjjJ
l待され得る。かくして、本発明はある種のΔ′丁゛欠
損患者に於て非免疫原となり得るZ一対立遺伝子変異体
の生成方法を提供する。 抗トロンビン活性を有することが示されているArg3
59− A ’rは血液凝固阻止に有用でもあり得る。 天然産アンチトロンビン■は、通常、体内で血液凝固を
調節する働きがある。アンチトロンビン■は播種血管内
擬固の治療のため〔ガスチー(Gassner) ら
、典、但ユn、 W−ochenschr、 91
:51−53.1979iおよびヘルグレン(Ile
l Igren) 、 M、他、Gynecol、 0
bste旦−1nves t。 16107−118.1983)、および他の症状の治
療に於てヘパリンの代替物として〔バーンハート(Be
rnhard t) 、 W、およびノハコハーハlノ
)(Novakova−Banet)、A、、Ric、
Cl1n、 Lab、 1 3 :61−
66.1983)用いられて来た。 特に、本発明は野生型ヒトAT遺伝子のcDNへまたは
その相補物からなる1本鎖DNA鋳型の作製に関する。 突然変異させようとするコドンに於て1個または2個以
七の誤対合を含む直線状オリゴヌクレオチ1゛プライマ
ーを、突然変異誘発部位の5′側にアニーリングする第
2プライマーと一緒に鋳型ヘアニーリングさせる。好ま
しい第2プライマーはT−1ノ販されておりかつM13
ヘクター中のラフp、 (1;4q) Z遺伝子ヘ
ハ・イブリダイセーションJるMI3の万能ブライマー
である〔メノシンク(Messing)+Met−jB
、 in IE−n、z7mo↓q6.y −J−0−
1ノ20−77.1.983)。該オリゴヌクレオチド
を延長しかつ末端に於て粘合させて2本鎖キヤツプつき
環状IJ N Aを得る。この2本鎖1) N Aを用
いて宿j7微生物人腸1■L轄、−Ho−1−jΣをト
ランスフェクションし、突然変異体および野生型DNA
分子の混合物を含む、集団をもたらす。突然変異体DN
Aオリ二lヌクL/オチドをブし7−フ゛とし−こ用い
るブラークハイフリダイセーションによって突然変異体
11N八分−rを4g択する。このl) N Aをシー
ケンシング(sequenced)変化したコドンの存
在を証明した後、適当な表現−・ツク−中へクローニン
グすることができる、突然変異誘発AT蛋白質は、細菌
または酵母あるいは他の前核類または真正核類中で表現
さ口ることができる。 本明細書中で使用する”DNA構造物”、゛ヘククー”
、°゛プラスミド゛いう用語は、ヒトの介在によって変
性されているDNA分子あるいはかく変性されている分
子のクローンであるDNA分子であって、そうでなけれ
ば天然には存在しない方法で結合さ−Uかつ配列させた
DNAのセグメントを含むDNA分子を構成する。本明
細書中で使用する゛表現ヘクター”という用語は、宿主
生物中・\形質転換させるときそれ自体の複製を保証す
る遺伝情報と宿主生物中で表現されるべき少なくとも」
つの遺伝子ならびに転写の開始、翻訳の開始、プロモー
ター領域およびある場合には読み終り領域のための部位
のような、表現が起こるために必要となり得る他の制御
機能を含むDNA構造物である。゛′表現″という用語
は、通常の用途に於ては、宿主生物中に存在する遺伝子
によって暗号づりされる蛋白質生成物がある生物によっ
て合成される条件を意味すると定義される。“ギャップ
つき”という用語は、実質的に2本鎖であるか1本鎖頭
域を含むDNA分子を意味する。 災夏札喋可几 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。 ′□M
I 3 宿−i−株、万能プライマーおよびヘクター
は−< テスダ・り勺−チ・ラボラI・リーズ(Bet
hesda1ンescarcl+ Labora)、o
ries)から得た。制限エンドヌクレフアーゼは、ヘ
デスダ・リサーチ・ラボラドリース(13eLheSd
a l1esei+rch Laboratories
)、二、1゜−・インクラント・ハイオラブズ(Nei
y EnglandBioL、Ih5)、ヘーリンガー
・マンハイJ1、・ハイオケミカルズ(11oehri
nBer Mannhcim Biochemical
s)から得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌
細胞の形質転換、DNAポリメラーゼI 〔フレナラ(
Klenow)断片)を用いるDNA断片の平滑化(1
旧+ting)方法、T4DNΔリガーゼを用いる1)
N A断片の接合方法を含む一般的クローニング方法
はマニ゛アテイス(Maniatis)らが記載してい
る〔天火キー2・ユラニでツター二丑Zグ」色坪皐小猛
C−jonjn6) : ア−’z、−夫う」ドーリ−
ニー1−]]5−?−?J!/ (n、、−i、a1
7o、−r;1−t、−p、r、y−Ma、r++1Q
)、コールド・スプリング・バーバー・ラホラl−リ
ー(Cold SpringHarborl、ahor
atory )、1982)。 −・般的な部位特異性突然変異誘発方法は、シラー、マ
ークJ、(Zoller、Mark J、)および1.
スミス(M、Sm1th)著、” M 13誘導ヘクタ
ー中へクローニングされたDNA断片のオリゴヌクレオ
チド指示突然変異誘発(01igonucleoLid
e DirccledMutagenesis of
DNA Fragments C1oned
In1.o M13Derived Vector
s)″、マーユアル・シラー・アドールト・スプリング
・バーバー・ラホラトリ=(Ccld Spring
Harher Laboratory) 、1983に
記載されている。 野生型AT中の配列から1つ以上の塩基変化を含むオリ
ゴヌクレオチドは、ビューケージ<Beaucage)
およびカルケージ(Caruthers) 、? )’
z 21” 丑Z二に久−3(Tetrahed−ro
n Letters)22 : +859−1862.
1981およびマソテウチ(Ma tteoch)およ
びカル−勺−ズ(Caru thers)、J、Am、
Chem、Soc、 103 : 3138 (198
1)に一般的に記載されている亜燐酸トリエステル法に
より、マノテウヂ(M;]t teuch)およびカル
ーザース(Caruthers) 、テトラヘドロン・
レターズ4−Tq−1,4−!]−hq、d−ron−
Ls1↓二(sし!二s) 2 1 : 7
] 9 − 7 2 2(1980)に記載されて
いるようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド・ハイオシステムス・モデル
38o−A I) !”jA合成装置のような機械によ
って、オリゴヌクレオチドを合成することができる。合
成されたオリゴヌクレオチドは、変性用ゲル七でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製することがで
きる。オリゴヌクレオチドは、5′一端に於て、くカン
マ)32 P−ΔT’Pおよびポリヌクレオヂトキナー
セによって燐酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の
検定はマクザl、(Maxam)およびギルバート(G
Nbert)法、メソド・イン・工−ンーglイーE
r’J!−二−(、Mejユhods−i四]いlym
oJo5z) 、 6 5・、57. (] 98
0)で行うことができる。 野生型アルファ−1−抗トリプシン遺伝−−−一−乙か
支秦本−↓一本掩pJ−Δ−9罫ZJ−−−ヒトA T
の優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、DNAハイ
ブリダイゼーションプローブとして 々配列を用いる常
法〔クラチ(Kurachi) ら、Proc、
Nat、 八cad、 Sci、 USA+
7□づ6□、 6820 −830 (1980)
;およびチャンドラ(Chandra)ら、Bi−oc
ham、 側遼ユys、 Res、 Com−+ 10
3.751−758 (1981))によってヒト肝
臓cDNAライブラリーから単離することができる。A
T遺伝子は1446bpPstl 断片として単離さ
れ、Pst ] 消化プラスミドpuc 13
Cビエイラ(Vieira)ら、ジーン(Gen旬、よ
度、259−268(19’82)記載の方法で作製、
但し1acZ遺伝子に於ける開始に於て第2図に示す多
重制限部位を含む〕中へ挿入されてAT遺伝子の3′側
のポリリンカー中にBam I−I 1部位を含む組換
型プラスミドptlcα1を与える。プラスミド pU
cα1ばRam H]で消化されてAT配列を得る。 1320bpBam H1断片を次にM13mplO
中に結合し〔メソシング(lIIessing、メソド
ニ堕7−A!ブイJロジー(Methods jn E
nzymologi)101420−77 (1983
))、得られた組換型ファージを用いて大腸菌(fi=
cqli−) K l 2(、JM]03)をトラン
スフェクションする。AT遺伝子を含む1本鎖閉環状D
Nへをへ次にシラー(Zoller)およびスミス(S
mith)の方法(上掲)で単離する。 野η型AT中の配列から1つ以」−の塩基−変イ15剣
イ
【ノし゛ノ―−リーーフー呂−子(Kイ二す」メ不1
D−1W−−下記第1表に示すオリゴヌクレオチドを通
常の亜燐酸トリエステル法またはアプライド・ハイオシ
ステJ・ス・モデル380〜八合成装置で合成し7た後
、変1」用ポリアクリルアミドケル」二で精製すること
ができる。このオリゴヌクレオチドは、アミノ酸358
のコドンのための適当な誤対合が存在する以外は第1図
に示す野生型ヒト八Tのアミノ酸356−3GOのため
の暗号づけをする。 il−一−−1表 メチオニン(野生型) −ATACCCATGT(
:TATCアラニン へTACCCG
CGTCT/ITcハ リ ン
へTACCCGTGTCTATCグリ
シン ATACCCGGGTCTATC
フェニルアラニン へTACCCTTCTCT
ATCアルギニン へT/
IcccAGATcTATcATACCCAGGTCT
ATCCCCリ ジン
へTACCCへへGTCTATC」−記のもの
よりも長いオリゴヌクレオチドを使用できることは言う
までもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第1表中に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが15−21ヌクレオチドの範囲でありかつ少
なくともヌクレオチド1184−1198を含むことか
好ましい。 もう1つのオリゴヌクレオチ1−は第2表に示すように
U7で作製され、AT配列中のアミノ酸342のための
コドンの周りにほぼ中心を置く配列に対応する。第2表
のオリゴヌクレオチドはアミノ酸342のためのコドン
に於ける誤対合を含み、それによってリジンのコドンが
含まれてZ一対立遺伝子変異体を生しる。 上記、Lりも長いオリゴヌクレオチドが利用できること
ば君フまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第2
表に示したものの代わりに他の突然変異体コ1−ンを用
いることができることも言うまでもない。オリゴヌクレ
オチド−は、長さが15〜21ヌクレオチドでありかつ
ヌクレオチド1135〜1149を含むことが好ましい
。 一丈丈ダんムに1天−し勿龜長省劣グ胎金−にに至りた
オリゴヌクレオチドのおのおのを、M13の万能プライ
マーのような第2プライマーと一緒に野生型AT遺伝子
を含む1本鎖組換型M13ファージDNAとアニーリン
グさせる。典型的な操作に於ては、20pmolの燐酸
化Z一対立遺伝子オリゴヌクレオヂトと20pmolの
M13プライマーとをΔTcDNAを含む組換型M13
ファージ] pmolと混合し、アニーリングさせた。 このオリゴヌクレオチドを、次にDNAポリメラーゼI
Cフレナラ(Klenow)フラグメント〕を用いて
延長し、合成鎮の末端をT4DNAリガーゼを用いて接
合さセた。得られたDNA分子はAT暗号領域にわたっ
て明らかに二本鎖でありかつM13ヘクター領域にわた
って部分的に1本鎖である。 これらのギャップ付きDNA環をコンピテント大腸菌(
E、coli) K 12 (J M 101 )中へ
トランスフェクションして細菌DNA修復系によってギ
ャップを埋めて活性ファージを作ることができる。 突然変異体骨Yの集団は、ファージDNAをニド1′J
セルI」−スフイルターに結合さセて32pでラヘルし
た突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでプローブするプ
ラーク・リフト(plaque−1ift) ハイブリ
ダイセージコン法〔シラー(Zol Ier)ら、L掲
〕によって野生型から識別される。本操作の背後にある
原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが野41−
型クローンとよりも安定な複式を突然変異体クローンと
形成する(野生型クローンとのハイブリダイゼーション
は誤対合を生ずる)ということである。低温に於けるハ
・イブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけがプ
ローブとハイフリソFを形成するまで洗浄温度を上げる
。典型的には、23°Cの温度でハイブリダイゼーショ
ンを行った後、23゛C137°C150゛C155°
Cで逐次洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを
行うことができる。突然変異体ファージを次に単離し、
再度プレートにまき、サンガー(Sanger)ら(、
■6+□□−−□ −poV、−1jjOj、、 −! 、、4−u、、
: 161、]、983)およびり゛ンガー(SanB
er)ら、XPy碧ユNat、 Acad、 Sci、
−」Σ酊、ニー↓: 54.63.1977)のシ
ブオキ(dideoxy)法を用いるシーケンシング(
Sequencing)によって突然変異の存在を証明
することができる。 細菌表現ベクター中への配列に於ける −−」然−弯」(化や堅]し一ニングーー突然変異体A
T暗号w4域は、複製型のBam H1およびPst
1による消化によって閉環状DNAから取除くことがで
きる。突然変異体AT遺伝子を含む断片を、Bam H
1およびI’st 1消化ヘクタ−Ml 3T八Cまた
はMI3mplO中へ挿入することができる。ファージ
M13mplOばP−Lバイオケミカルス(P −r−
Biochemicals)またはヘテスダ・リザーチ
・ラホラトリーズ (BethesdeResearc
h Laboratories)から市販されている。 得られた構造物は、上述のように大腸菌(旦ユcoli
)K]2 (JM103)を形質転換させるために用い
ることができる。 ファージM]3mplOをEco RIおよびRam
Illで消化してM13TACを作製する。得られた付
着末端に、P−Lバイオケミカルス(P−LBiocl
+emicals)から購入した、下記構造を有しAΔ
TTCΔTGG、AC G T A CCT CCi’ A Gかつ5個の主燐
酸塩が欠損している合成りNAアダプターを結合させて
構造物mplo八を生成させる。かくして、構造物mp
lOAはAT遺伝子のための開始コドンと第1アミノ酸
(Glu)コドンとを、1ゴえるΔ’「c cへGを含
む配列についてのHc、。 1ン1およびRam T(]制限部位を含む。mplo
のもとのV、c、o Rlと!1.]m H1との間の
領域のためのアダプターの置換はランクオペロン解読フ
レームを破壊し、得られた1ランスフエクタントは白色
プラークを!ブ、える。 ヘククーmplOAをAva IIで消化し、付着末端
をDNAポリメラーゼのフレナラ(Klenow)フラ
グメントを用いて埋める。この後でEco RIで消化
しかつS1ヌクレアーゼを用いて付着末端を除去する。 得られた平滑末端断片がmplOBである。 t’r p−ランクプロモーターからなるDNA断片を
市販プラスミドpDR540(P−Lハイオヶミカルズ
(P −L Biochemjcals> )から取り
出す。 このプラスミドpDR540をH4nd II+で切断
し、付着端をフレナラ(Klenow)ポリメラーゼで
埋める。 配列CCTCGAGGを有するリンカ−をこの平滑末端
に結合し、過剰のリンカ−をXholによる消化によっ
て除去する。得られたpDR540Xとして知られてい
る構造物4;j:pDR540のHi n d m部位
の代わりにXho 1部位を含む。Xho 1およびB
amJ−IIによるρDR540Xの消化およびそれに
続くフレナラ(Klenoiy)フラグメントを用いる
末端の平滑化によってtrp 〜ランクプロモーター(
TAC)とシャインーダルガーノ(Shine−Dal
garno)配列とを含む断片を得る。trp−ラック
プロモーターを含む上記断片をmr+10B断片中に挿
入してハイブリッドファージmplOcを生成する。n
+910Bの平滑化AνaUをTAC含有断片の平滑化
Xho Iへ結合することによって結合部にXho 1
部位を再生する。TAC断片の平滑化Bam H1部位
のmpl。 Bの平滑化Eco RI末端への結合によってこの結合
部にNco 1部位(CCATGG)を生しる。断片の
正しい指向は、青色プラークの生成によってスクリーニ
ングすることができる。ファージmplOcは、もとの
Bam H1部位中へのAT遺伝その挿入を容易にする
ために除去されねばならないATG開始コドンのに流に
位置する第2 Bam H1を含む。 この異質のRam H1部位を除去するため、mpl。 CをRam Hi Lこよる2回の消化にか&Jる。第
1の部分的消化の後で、フレナラ (Klenow)ポ
リメラーゼによって付着末端を埋め、Xho Tで消化
し、アガロースゲル上ご精製する。正しい断片ばNc、
。 】制限部位を含む断片として確認される。mplOCの
第2のBan H,1消化は完了まで行い、付着末端を
フレナラ(Klenow)ポリメラーゼを用いて埋め、
(! −12P−dNTP ’ sを用いてBa131
エキソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュ
アリングの監視を容易にする。Ba1.31エキソヌク
レアーゼにより標識末端から5塩基対を除去し、それに
よっ”ζBam H1部位を除去する。プロモーターを
含む配列をXI+o Iで除去し、ゲル精製する011
11110とp[lR540誘導断片とを一緒に結合し
、大腸菌(E、coli) K 12 (JM 103
) (メソランク、J、 (Messj+B;、J、
)ら1981ヌクレイノ久二LスU二叉明、 (Nuc
leic Acjds Red、) 9 : 309
、P−1,ハイオケミカルズ(P −L Bioch
emicals)から市販〕中へクローニングし、Nc
o +感受性および青色プラークの生成でスクリーニン
グする。 得られたヘクターはM13’FΔCである。 酢隼もζ於−婁る表現ヘクク〕q之−豆二三2ノー酵母
中に於けるクローニングおよび表現のために、Bam
H1断片のような変異体配列を含む旧3フプージの複製
型から変異体A′F配列を単離し、Bam H1消化プ
ラスミドHATd中へ挿入することができる。プラスミ
ドHA T 4は、下記の方法で作られたものである。 プラスミドpJDB 248〔ヘノグズ(Beggs
) 、ネニ丈?(Nature) 275 :104−
10’9、] 978)をFミcoRIで部分的に消化
し、pMB 9配列を除去した。プラスミドpBR32
2(ポリバー(Bolivar) ら、2二2−(G
ene) 2 : 95 113、I 977)をEc
o R1で開裂し、pMB 9配列の代わりに直線状p
JD8248へ接合さ(た。得られたプラスミド−ばC
1/1として知られている。プラスミドpTPlc
10 (アルハ(Alber)およびカワサキ(Ka
wasaki)、J、Mol。 岨L」肪虹 」づ419−434.1982’lから、
部分的BI!l II消化、再結合、Kpn Tによ
る消化によって酵l:TPIプロモーターを除去した。 得られた直線状プラスミド約50μgを5単位の1ia
131で、30°Cに於て5分間処理した。このDNA
を、次GこD N AポリメラーゼI(フレナラ(Kl
enow)フラグメント〕で処理して分子の末端を平滑
化した。次に、旧nd ■リンカーを添加した。 ’rPI暗号領域の位置」−4に於てl1ind II
Iリンカ−を含むプラスミドが同定された。このプラス
ミドを1lind mで切断し、BaL31で数秒間消
化し、DNAポリメラーゼ■ 〔フレナラ(Kleno
w)フラグメント〕て5[Fン骨化した。次に、Eco
RIリンカ−(GGAATTCC)を添加し、このD
NAをBglllおよびEco TマIで消化し、Te
)lプロモーターからなる断片を単離した。この断片を
、l1gInおよびEco RTで直線状にしであるY
Rp 7 ’ Cステインチコム(SL3nchco
mb)ら8.木ニーチー1y (Nature)28
2 : 39−43.1979)中へ挿入した。 TE32と呼ばれる1つのかかるプラスミドは、TPI
配列中のおよそ−14の位置にEcoRIリンカ−を含
んでいた。TE32をEco RIおよびBam H]
で切断し、下記配列 へATTCATGGAG G T A CCT CCTへG を有するリンカ−の10倍過剰と結合させた。得られた
プラスミドをBam Hlで切断し、再結合させてプラ
スミド’TEA32を生成させた。次に、 。 T” Eへ32から、約900塩基対のBgl H−B
amH1断片としてTPIプロモーター断片を除去し、
C1/】のBam H1部位中へ挿入した。プラスミド
’pUcα1を次にXba Iで開裂し プラスミドp
TPJc]、o(アルハ(Alber)およびカワサキ
(Kawasaki)、L掲〕から得られた、700塩
基対Xl〕a l −Eco RI断片のような酵母T
P+44丁暗号をへT配列の下流に挿入した。次に、U
co R1部位にEco RI −Bam H1合成り
NAアダプターを(=j加した。得られたプラスミドを
Bam H1で消化してAT暗号配列と′rP[終了暗
号とからなる1’J 2100塩基対の断片を遊離させ
た。ごの断片をCI/1とTPIプロモーターとからな
るプラスミI・のRam 81部位中へ挿入した。得ら
れたプラスミドをI−iΔT4と名イ」けた。ここに得
た表現ヘククーを酵母株の形質転換に用いて突然変異誘
発蛋白質を表現させた。好ましい酵母株宿主はGKlo
o、ATCCNo、20669およびS、セレ与−ンヱ
舌、 、(、S、−qqrevisiae)株E2−7
B−Δ”r c c 陽20689である。 また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ヘククー、
例えばyEp 13 Cブローチ(Broach)ら
、ン了イ(堕呼)−8:121:133.1979)、
yRp 7 (ストルール(Struhl)ら、Pr
9c、 Nat。 知神、−領j、 usz ユj2 : 1035−−
1’039、】979)、CI/1 (上記)、およ
び2μまたはΔ■< S配列を含む他のプラスミドおよ
びそれらの誘導体中へ挿入することもできる。 別法−ζは、該AT突然変異体配列を宿主の染色体中へ
組込むことによって表現を得ることができる。この場合
には、AT配列を、適正な方向づけで、適当な転写プロ
モーターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。 酵母中に於ける突然変異体AT遺伝子の表現のための好
ましいヘククーはC1/1誘1pFATPQT〔第3図
; pFATPOTで形質転換されたΣ工丸乞旦2グエ
(S、Cerevisjae)株E18が受入れlt、
20699でATCCに寄託されている。pFATPO
Tはこの形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって人手
でできる〕である。ヘククーpFATPOTはamp”
、 UE[12およびC1/1の2μ領域からなり、表
現単位ばS9セレビシアエ(S、Cerevisiae
)三炭糖燐酸イソメラーゼ(Tl+)プロモーター、p
UCα1からの野生型AT配列、およびS、セレビシア
エ 見。 Cerevisiae) T P I転写終了暗号;お
よび’y 7’ ”jソカロミセス・ボンへ(Schi
zosaccharomycespombe)三炭糖燐
酸イソメラーゼ(POTI)遺伝子からなる。三炭糖燐
酸インメラーゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質転
換させるときは、プラスミト−ヒのPOTI遺伝子が宿
主細胞の欠損を補い、冨んだ培地上での成長中、高いコ
ピー数でプラスミ1−を保つことができる。 第3図について説明する。p[Icα1をRam H1
で開裂し、Δ′F配列からなる約1400bp 断片
をケル精製した。この断片を、次にBam H1消化M
13mp1.0 (複製型)と適当な方向づりで結
合さ・口て第1表のオリゴヌクレオチドを有する1本鎖
ファージのハイブリタイセーションを可能にし7だ。次
に、Δ′1゛配列を上記のよ・うにして突然変異誘発し
て配列暗号づけVa1358−A Tを生成させた。 次に、複製型D N AのILan+ j−11および
Xba Iによる消化によってMl、3=、ククーから
突然変異誘発配列を除フベした。この突然変異体AT配
列を、Bamtl IおよびXba Iによる消化によ
って直線状乙こしであるpQC13中へ挿入した。得ら
れた組換型プラスミド”をptlZc37と名付けた。 再び第31mについて説明する。Va13S’ −A
Tのだめの酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。 plJZc37から、Bam HIおよびXba Iに
よる消化によりて突然変異体AT配列を精製した。 pFATPOTから、Bam HIおよびBgl Iに
よる消化によって、TPIプロモーターとamp’遺伝
子の上流部分とからなる断片を除去し、ケル精製した。 3゛つの断片を一諸に結合し一大腸菌 (E、col
1)R17I (ATCC31343)の形質転換に
用いた。形質転換体をアンピシリン耐性でスクリーニン
グした。得られたプラスミドをpFATPOT 37と
名イて1りた。 一ミュ火ヤーe ’y ? I (S、Cerevis
iae)株E18 〔アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(American Type Cu1
Lure Cod]ection)に寄託、受入れ番号
隘20743)をpFATPOT 37で形質転換し、
培地■ (グルコース6%、酵母エキス2%、硫酸アン
モニウム0.5%)中で定常期まで1晩中成長させ、測
定標準としてヒトα−1抗トリプシン〔シグマ・ケミカ
ル社(Sigma Chemical Co、))およ
びpFATPOTで形質転換した酵母中で生成したM(
!t358− A Tを用い、下記のようにしてエラス
ターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性の生成を測定
した。測定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、カラ
スビーズで細胞を摩砕して作製した。 −酵−71,1,−、l!Lr’ニー )j%L+−4
郁IW’ −A T (7)表現性g3!iR−Δ′F
のための酵母表現ベクターを、pFATr’OT 37
について記載したようにして作製した。但し突然変異誘
発段階に於てオリゴヌクレオチドΔT A CCCA
G G T CTA T CCCCを用いた。最終表現
・ベクターをpFATPOT 136と名付リ ノこ、
Sp−、tlzi>7I(S、Cereyisi
ae)株 E18をρF A ’I″POT 136で
形質転換し、下記のようQこし−ご成長さ一已、測定し
た。結果を第3表に示すつ王−グスタニ束肚吉泄淀 pl+8.8の0.2 M +−リス中に1μg/lt
Rの豚膵Ilrλエシスターゼ〔シグマ(Si5ma)
)を含む溶液1、 Q p ?をΔ′[゛含有試料2
00μlに力(Iえた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて全容
1 m eとし7、混合物を4°Cにh企て15分間イ
ンキユヘートした。次に、pl+8.8のO,/I M
l−リス中に10+ng/mRのエラスチンーオルセ
インを含む溶液1mlを加え、混合物を、15分間隔で
混合しながら37℃に於て60分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のA39Gを測定した。 ヒトATならびに」二記のようにして作製したMet3
50− A T、Val”” −A T 、Δrg15
8−A Tについての測定結果を第3表中に示す。 シップシン阻害砺1生 A′F含有試料50plに、2.5mM1l(J!中に
6μg / m 、eのトリプシン〔生膵臓から、シグ
マ(Sig+na) )を含む/g?(1,40pnを
添加し、pH8,2の0.4 M +−リノイ0.02
M CaC7+ 2で容積を500μlに調節し、室
温で10分間インキユヘートした。燐酸塩緩衝食塩水中
10■/mllのアゾコル(^zocoll) (カ
ルハイオケム(C,11biochem) :lを含む
溶液1rnf2を添加し、混合物を、10分期間隔で混
合しなから37°Cに於て30分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のAS20を測定した。 ヒ) A Tならびに上記のようにして作製したMet
”” −A T、Val”ll−AT’、八r g 3
S 8−八Tについての測定結果を第3表に示す。 第一−−−−3−、−表 ヒトΔN’ 200 .166 .030
400 .372 .071+0
.482 .1721 .502
.242 0.1 、/160 .219M e H
″S ′1−八T 200 .
207 .045(酵母) ’10
0 .344 .06010 .4
99 .1991 .498 .2
35 0.1 .497 .240VaR”−八T
200 .175
.120(酵母) 1.00 .2
02 .16810 .494 .
1671 .487 .166 0.1.477 .194 八rg’3 S a−八T 200
.480 .027(酵母)
100 .488 .01910
.499 .1241 .46
3 .1660.1 .471
.191本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵
母細胞の抽出物から免疫吸着によって精製することがで
きる。免疫吸着カラムは、アルファ−1−抗トリプシン
に対する親和性精製抗体を、キュアトレカザス(Cua
trecasas)便、 Biol、 Chem、
245 :3059.1970)の方法に従ってCN
Br1性化セフアロースに共有結合させることによって
調製することができる。破壊した細胞を、0.5MのN
aC7!を含むpl+7.2の燐酸塩緩衝食塩水3容で
抽出し、抽出液をカラムに適用し、カラムを3MNa5
CNでン容出した。 本発明の部位特異性突然変異誘発AT蛋白質は、遺伝的
22−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損な
らびにATの不十分なレヘルまたは患者が野生型へTと
抗原反応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用
であり得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻
害性肺疾患や成人呼吸困姉症候群のような肺嚢の進行性
消化に関する他の肺疾患を治療することができる。ヘビ
ースモーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫
も治療することができる。嚢胞性線維症や関節炎のよう
な必ずしも肺に関係のない疾患をも治療することかでき
る。アルファ−1−抗トリプシンの総説についてはガデ
ク(Gadek) (J二掲)を参照されたい。 ATの突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸35
8に於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異から
なる蛋白質は、例えば播種血管向凝固の治療に於て血液
凝固防止のために用いることができる。 本発明の蛋白質は、通常の製剤用担体と混合することが
できる。好ましくは、本発明の蛋白質は、静脈内または
吸入によって投与することができる。 有効投与量は、症状の重度および患者の体重によって異
なるか、本発明の蛋白質を0.5−10.0g/週の範
の投与量で静脈内投与することが多くの場合有効である
。投与方法が吸入の場合には、上記よりも低い投与量で
有効であり得る。部位特異性突然変異誘発ATが消化管
中ての早期分解を防くためにカプセルまたは被覆担体内
で保護されるならば経口投与も有効であり得る。 本発明の特別な好ましい実施態様につし・で説明したが
、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろう
。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべきも
のである。
D−1W−−下記第1表に示すオリゴヌクレオチドを通
常の亜燐酸トリエステル法またはアプライド・ハイオシ
ステJ・ス・モデル380〜八合成装置で合成し7た後
、変1」用ポリアクリルアミドケル」二で精製すること
ができる。このオリゴヌクレオチドは、アミノ酸358
のコドンのための適当な誤対合が存在する以外は第1図
に示す野生型ヒト八Tのアミノ酸356−3GOのため
の暗号づけをする。 il−一−−1表 メチオニン(野生型) −ATACCCATGT(
:TATCアラニン へTACCCG
CGTCT/ITcハ リ ン
へTACCCGTGTCTATCグリ
シン ATACCCGGGTCTATC
フェニルアラニン へTACCCTTCTCT
ATCアルギニン へT/
IcccAGATcTATcATACCCAGGTCT
ATCCCCリ ジン
へTACCCへへGTCTATC」−記のもの
よりも長いオリゴヌクレオチドを使用できることは言う
までもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第1表中に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが15−21ヌクレオチドの範囲でありかつ少
なくともヌクレオチド1184−1198を含むことか
好ましい。 もう1つのオリゴヌクレオチ1−は第2表に示すように
U7で作製され、AT配列中のアミノ酸342のための
コドンの周りにほぼ中心を置く配列に対応する。第2表
のオリゴヌクレオチドはアミノ酸342のためのコドン
に於ける誤対合を含み、それによってリジンのコドンが
含まれてZ一対立遺伝子変異体を生しる。 上記、Lりも長いオリゴヌクレオチドが利用できること
ば君フまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第2
表に示したものの代わりに他の突然変異体コ1−ンを用
いることができることも言うまでもない。オリゴヌクレ
オチド−は、長さが15〜21ヌクレオチドでありかつ
ヌクレオチド1135〜1149を含むことが好ましい
。 一丈丈ダんムに1天−し勿龜長省劣グ胎金−にに至りた
オリゴヌクレオチドのおのおのを、M13の万能プライ
マーのような第2プライマーと一緒に野生型AT遺伝子
を含む1本鎖組換型M13ファージDNAとアニーリン
グさせる。典型的な操作に於ては、20pmolの燐酸
化Z一対立遺伝子オリゴヌクレオヂトと20pmolの
M13プライマーとをΔTcDNAを含む組換型M13
ファージ] pmolと混合し、アニーリングさせた。 このオリゴヌクレオチドを、次にDNAポリメラーゼI
Cフレナラ(Klenow)フラグメント〕を用いて
延長し、合成鎮の末端をT4DNAリガーゼを用いて接
合さセた。得られたDNA分子はAT暗号領域にわたっ
て明らかに二本鎖でありかつM13ヘクター領域にわた
って部分的に1本鎖である。 これらのギャップ付きDNA環をコンピテント大腸菌(
E、coli) K 12 (J M 101 )中へ
トランスフェクションして細菌DNA修復系によってギ
ャップを埋めて活性ファージを作ることができる。 突然変異体骨Yの集団は、ファージDNAをニド1′J
セルI」−スフイルターに結合さセて32pでラヘルし
た突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでプローブするプ
ラーク・リフト(plaque−1ift) ハイブリ
ダイセージコン法〔シラー(Zol Ier)ら、L掲
〕によって野生型から識別される。本操作の背後にある
原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが野41−
型クローンとよりも安定な複式を突然変異体クローンと
形成する(野生型クローンとのハイブリダイゼーション
は誤対合を生ずる)ということである。低温に於けるハ
・イブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけがプ
ローブとハイフリソFを形成するまで洗浄温度を上げる
。典型的には、23°Cの温度でハイブリダイゼーショ
ンを行った後、23゛C137°C150゛C155°
Cで逐次洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを
行うことができる。突然変異体ファージを次に単離し、
再度プレートにまき、サンガー(Sanger)ら(、
■6+□□−−□ −poV、−1jjOj、、 −! 、、4−u、、
: 161、]、983)およびり゛ンガー(SanB
er)ら、XPy碧ユNat、 Acad、 Sci、
−」Σ酊、ニー↓: 54.63.1977)のシ
ブオキ(dideoxy)法を用いるシーケンシング(
Sequencing)によって突然変異の存在を証明
することができる。 細菌表現ベクター中への配列に於ける −−」然−弯」(化や堅]し一ニングーー突然変異体A
T暗号w4域は、複製型のBam H1およびPst
1による消化によって閉環状DNAから取除くことがで
きる。突然変異体AT遺伝子を含む断片を、Bam H
1およびI’st 1消化ヘクタ−Ml 3T八Cまた
はMI3mplO中へ挿入することができる。ファージ
M13mplOばP−Lバイオケミカルス(P −r−
Biochemicals)またはヘテスダ・リザーチ
・ラホラトリーズ (BethesdeResearc
h Laboratories)から市販されている。 得られた構造物は、上述のように大腸菌(旦ユcoli
)K]2 (JM103)を形質転換させるために用い
ることができる。 ファージM]3mplOをEco RIおよびRam
Illで消化してM13TACを作製する。得られた付
着末端に、P−Lバイオケミカルス(P−LBiocl
+emicals)から購入した、下記構造を有しAΔ
TTCΔTGG、AC G T A CCT CCi’ A Gかつ5個の主燐
酸塩が欠損している合成りNAアダプターを結合させて
構造物mplo八を生成させる。かくして、構造物mp
lOAはAT遺伝子のための開始コドンと第1アミノ酸
(Glu)コドンとを、1ゴえるΔ’「c cへGを含
む配列についてのHc、。 1ン1およびRam T(]制限部位を含む。mplo
のもとのV、c、o Rlと!1.]m H1との間の
領域のためのアダプターの置換はランクオペロン解読フ
レームを破壊し、得られた1ランスフエクタントは白色
プラークを!ブ、える。 ヘククーmplOAをAva IIで消化し、付着末端
をDNAポリメラーゼのフレナラ(Klenow)フラ
グメントを用いて埋める。この後でEco RIで消化
しかつS1ヌクレアーゼを用いて付着末端を除去する。 得られた平滑末端断片がmplOBである。 t’r p−ランクプロモーターからなるDNA断片を
市販プラスミドpDR540(P−Lハイオヶミカルズ
(P −L Biochemjcals> )から取り
出す。 このプラスミドpDR540をH4nd II+で切断
し、付着端をフレナラ(Klenow)ポリメラーゼで
埋める。 配列CCTCGAGGを有するリンカ−をこの平滑末端
に結合し、過剰のリンカ−をXholによる消化によっ
て除去する。得られたpDR540Xとして知られてい
る構造物4;j:pDR540のHi n d m部位
の代わりにXho 1部位を含む。Xho 1およびB
amJ−IIによるρDR540Xの消化およびそれに
続くフレナラ(Klenoiy)フラグメントを用いる
末端の平滑化によってtrp 〜ランクプロモーター(
TAC)とシャインーダルガーノ(Shine−Dal
garno)配列とを含む断片を得る。trp−ラック
プロモーターを含む上記断片をmr+10B断片中に挿
入してハイブリッドファージmplOcを生成する。n
+910Bの平滑化AνaUをTAC含有断片の平滑化
Xho Iへ結合することによって結合部にXho 1
部位を再生する。TAC断片の平滑化Bam H1部位
のmpl。 Bの平滑化Eco RI末端への結合によってこの結合
部にNco 1部位(CCATGG)を生しる。断片の
正しい指向は、青色プラークの生成によってスクリーニ
ングすることができる。ファージmplOcは、もとの
Bam H1部位中へのAT遺伝その挿入を容易にする
ために除去されねばならないATG開始コドンのに流に
位置する第2 Bam H1を含む。 この異質のRam H1部位を除去するため、mpl。 CをRam Hi Lこよる2回の消化にか&Jる。第
1の部分的消化の後で、フレナラ (Klenow)ポ
リメラーゼによって付着末端を埋め、Xho Tで消化
し、アガロースゲル上ご精製する。正しい断片ばNc、
。 】制限部位を含む断片として確認される。mplOCの
第2のBan H,1消化は完了まで行い、付着末端を
フレナラ(Klenow)ポリメラーゼを用いて埋め、
(! −12P−dNTP ’ sを用いてBa131
エキソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュ
アリングの監視を容易にする。Ba1.31エキソヌク
レアーゼにより標識末端から5塩基対を除去し、それに
よっ”ζBam H1部位を除去する。プロモーターを
含む配列をXI+o Iで除去し、ゲル精製する011
11110とp[lR540誘導断片とを一緒に結合し
、大腸菌(E、coli) K 12 (JM 103
) (メソランク、J、 (Messj+B;、J、
)ら1981ヌクレイノ久二LスU二叉明、 (Nuc
leic Acjds Red、) 9 : 309
、P−1,ハイオケミカルズ(P −L Bioch
emicals)から市販〕中へクローニングし、Nc
o +感受性および青色プラークの生成でスクリーニン
グする。 得られたヘクターはM13’FΔCである。 酢隼もζ於−婁る表現ヘクク〕q之−豆二三2ノー酵母
中に於けるクローニングおよび表現のために、Bam
H1断片のような変異体配列を含む旧3フプージの複製
型から変異体A′F配列を単離し、Bam H1消化プ
ラスミドHATd中へ挿入することができる。プラスミ
ドHA T 4は、下記の方法で作られたものである。 プラスミドpJDB 248〔ヘノグズ(Beggs
) 、ネニ丈?(Nature) 275 :104−
10’9、] 978)をFミcoRIで部分的に消化
し、pMB 9配列を除去した。プラスミドpBR32
2(ポリバー(Bolivar) ら、2二2−(G
ene) 2 : 95 113、I 977)をEc
o R1で開裂し、pMB 9配列の代わりに直線状p
JD8248へ接合さ(た。得られたプラスミド−ばC
1/1として知られている。プラスミドpTPlc
10 (アルハ(Alber)およびカワサキ(Ka
wasaki)、J、Mol。 岨L」肪虹 」づ419−434.1982’lから、
部分的BI!l II消化、再結合、Kpn Tによ
る消化によって酵l:TPIプロモーターを除去した。 得られた直線状プラスミド約50μgを5単位の1ia
131で、30°Cに於て5分間処理した。このDNA
を、次GこD N AポリメラーゼI(フレナラ(Kl
enow)フラグメント〕で処理して分子の末端を平滑
化した。次に、旧nd ■リンカーを添加した。 ’rPI暗号領域の位置」−4に於てl1ind II
Iリンカ−を含むプラスミドが同定された。このプラス
ミドを1lind mで切断し、BaL31で数秒間消
化し、DNAポリメラーゼ■ 〔フレナラ(Kleno
w)フラグメント〕て5[Fン骨化した。次に、Eco
RIリンカ−(GGAATTCC)を添加し、このD
NAをBglllおよびEco TマIで消化し、Te
)lプロモーターからなる断片を単離した。この断片を
、l1gInおよびEco RTで直線状にしであるY
Rp 7 ’ Cステインチコム(SL3nchco
mb)ら8.木ニーチー1y (Nature)28
2 : 39−43.1979)中へ挿入した。 TE32と呼ばれる1つのかかるプラスミドは、TPI
配列中のおよそ−14の位置にEcoRIリンカ−を含
んでいた。TE32をEco RIおよびBam H]
で切断し、下記配列 へATTCATGGAG G T A CCT CCTへG を有するリンカ−の10倍過剰と結合させた。得られた
プラスミドをBam Hlで切断し、再結合させてプラ
スミド’TEA32を生成させた。次に、 。 T” Eへ32から、約900塩基対のBgl H−B
amH1断片としてTPIプロモーター断片を除去し、
C1/】のBam H1部位中へ挿入した。プラスミド
’pUcα1を次にXba Iで開裂し プラスミドp
TPJc]、o(アルハ(Alber)およびカワサキ
(Kawasaki)、L掲〕から得られた、700塩
基対Xl〕a l −Eco RI断片のような酵母T
P+44丁暗号をへT配列の下流に挿入した。次に、U
co R1部位にEco RI −Bam H1合成り
NAアダプターを(=j加した。得られたプラスミドを
Bam H1で消化してAT暗号配列と′rP[終了暗
号とからなる1’J 2100塩基対の断片を遊離させ
た。ごの断片をCI/1とTPIプロモーターとからな
るプラスミI・のRam 81部位中へ挿入した。得ら
れたプラスミドをI−iΔT4と名イ」けた。ここに得
た表現ヘククーを酵母株の形質転換に用いて突然変異誘
発蛋白質を表現させた。好ましい酵母株宿主はGKlo
o、ATCCNo、20669およびS、セレ与−ンヱ
舌、 、(、S、−qqrevisiae)株E2−7
B−Δ”r c c 陽20689である。 また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ヘククー、
例えばyEp 13 Cブローチ(Broach)ら
、ン了イ(堕呼)−8:121:133.1979)、
yRp 7 (ストルール(Struhl)ら、Pr
9c、 Nat。 知神、−領j、 usz ユj2 : 1035−−
1’039、】979)、CI/1 (上記)、およ
び2μまたはΔ■< S配列を含む他のプラスミドおよ
びそれらの誘導体中へ挿入することもできる。 別法−ζは、該AT突然変異体配列を宿主の染色体中へ
組込むことによって表現を得ることができる。この場合
には、AT配列を、適正な方向づけで、適当な転写プロ
モーターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。 酵母中に於ける突然変異体AT遺伝子の表現のための好
ましいヘククーはC1/1誘1pFATPQT〔第3図
; pFATPOTで形質転換されたΣ工丸乞旦2グエ
(S、Cerevisjae)株E18が受入れlt、
20699でATCCに寄託されている。pFATPO
Tはこの形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって人手
でできる〕である。ヘククーpFATPOTはamp”
、 UE[12およびC1/1の2μ領域からなり、表
現単位ばS9セレビシアエ(S、Cerevisiae
)三炭糖燐酸イソメラーゼ(Tl+)プロモーター、p
UCα1からの野生型AT配列、およびS、セレビシア
エ 見。 Cerevisiae) T P I転写終了暗号;お
よび’y 7’ ”jソカロミセス・ボンへ(Schi
zosaccharomycespombe)三炭糖燐
酸イソメラーゼ(POTI)遺伝子からなる。三炭糖燐
酸インメラーゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質転
換させるときは、プラスミト−ヒのPOTI遺伝子が宿
主細胞の欠損を補い、冨んだ培地上での成長中、高いコ
ピー数でプラスミ1−を保つことができる。 第3図について説明する。p[Icα1をRam H1
で開裂し、Δ′F配列からなる約1400bp 断片
をケル精製した。この断片を、次にBam H1消化M
13mp1.0 (複製型)と適当な方向づりで結
合さ・口て第1表のオリゴヌクレオチドを有する1本鎖
ファージのハイブリタイセーションを可能にし7だ。次
に、Δ′1゛配列を上記のよ・うにして突然変異誘発し
て配列暗号づけVa1358−A Tを生成させた。 次に、複製型D N AのILan+ j−11および
Xba Iによる消化によってMl、3=、ククーから
突然変異誘発配列を除フベした。この突然変異体AT配
列を、Bamtl IおよびXba Iによる消化によ
って直線状乙こしであるpQC13中へ挿入した。得ら
れた組換型プラスミド”をptlZc37と名付けた。 再び第31mについて説明する。Va13S’ −A
Tのだめの酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。 plJZc37から、Bam HIおよびXba Iに
よる消化によりて突然変異体AT配列を精製した。 pFATPOTから、Bam HIおよびBgl Iに
よる消化によって、TPIプロモーターとamp’遺伝
子の上流部分とからなる断片を除去し、ケル精製した。 3゛つの断片を一諸に結合し一大腸菌 (E、col
1)R17I (ATCC31343)の形質転換に
用いた。形質転換体をアンピシリン耐性でスクリーニン
グした。得られたプラスミドをpFATPOT 37と
名イて1りた。 一ミュ火ヤーe ’y ? I (S、Cerevis
iae)株E18 〔アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(American Type Cu1
Lure Cod]ection)に寄託、受入れ番号
隘20743)をpFATPOT 37で形質転換し、
培地■ (グルコース6%、酵母エキス2%、硫酸アン
モニウム0.5%)中で定常期まで1晩中成長させ、測
定標準としてヒトα−1抗トリプシン〔シグマ・ケミカ
ル社(Sigma Chemical Co、))およ
びpFATPOTで形質転換した酵母中で生成したM(
!t358− A Tを用い、下記のようにしてエラス
ターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性の生成を測定
した。測定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、カラ
スビーズで細胞を摩砕して作製した。 −酵−71,1,−、l!Lr’ニー )j%L+−4
郁IW’ −A T (7)表現性g3!iR−Δ′F
のための酵母表現ベクターを、pFATr’OT 37
について記載したようにして作製した。但し突然変異誘
発段階に於てオリゴヌクレオチドΔT A CCCA
G G T CTA T CCCCを用いた。最終表現
・ベクターをpFATPOT 136と名付リ ノこ、
Sp−、tlzi>7I(S、Cereyisi
ae)株 E18をρF A ’I″POT 136で
形質転換し、下記のようQこし−ご成長さ一已、測定し
た。結果を第3表に示すつ王−グスタニ束肚吉泄淀 pl+8.8の0.2 M +−リス中に1μg/lt
Rの豚膵Ilrλエシスターゼ〔シグマ(Si5ma)
)を含む溶液1、 Q p ?をΔ′[゛含有試料2
00μlに力(Iえた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて全容
1 m eとし7、混合物を4°Cにh企て15分間イ
ンキユヘートした。次に、pl+8.8のO,/I M
l−リス中に10+ng/mRのエラスチンーオルセ
インを含む溶液1mlを加え、混合物を、15分間隔で
混合しながら37℃に於て60分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のA39Gを測定した。 ヒトATならびに」二記のようにして作製したMet3
50− A T、Val”” −A T 、Δrg15
8−A Tについての測定結果を第3表中に示す。 シップシン阻害砺1生 A′F含有試料50plに、2.5mM1l(J!中に
6μg / m 、eのトリプシン〔生膵臓から、シグ
マ(Sig+na) )を含む/g?(1,40pnを
添加し、pH8,2の0.4 M +−リノイ0.02
M CaC7+ 2で容積を500μlに調節し、室
温で10分間インキユヘートした。燐酸塩緩衝食塩水中
10■/mllのアゾコル(^zocoll) (カ
ルハイオケム(C,11biochem) :lを含む
溶液1rnf2を添加し、混合物を、10分期間隔で混
合しなから37°Cに於て30分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のAS20を測定した。 ヒ) A Tならびに上記のようにして作製したMet
”” −A T、Val”ll−AT’、八r g 3
S 8−八Tについての測定結果を第3表に示す。 第一−−−−3−、−表 ヒトΔN’ 200 .166 .030
400 .372 .071+0
.482 .1721 .502
.242 0.1 、/160 .219M e H
″S ′1−八T 200 .
207 .045(酵母) ’10
0 .344 .06010 .4
99 .1991 .498 .2
35 0.1 .497 .240VaR”−八T
200 .175
.120(酵母) 1.00 .2
02 .16810 .494 .
1671 .487 .166 0.1.477 .194 八rg’3 S a−八T 200
.480 .027(酵母)
100 .488 .01910
.499 .1241 .46
3 .1660.1 .471
.191本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵
母細胞の抽出物から免疫吸着によって精製することがで
きる。免疫吸着カラムは、アルファ−1−抗トリプシン
に対する親和性精製抗体を、キュアトレカザス(Cua
trecasas)便、 Biol、 Chem、
245 :3059.1970)の方法に従ってCN
Br1性化セフアロースに共有結合させることによって
調製することができる。破壊した細胞を、0.5MのN
aC7!を含むpl+7.2の燐酸塩緩衝食塩水3容で
抽出し、抽出液をカラムに適用し、カラムを3MNa5
CNでン容出した。 本発明の部位特異性突然変異誘発AT蛋白質は、遺伝的
22−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損な
らびにATの不十分なレヘルまたは患者が野生型へTと
抗原反応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用
であり得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻
害性肺疾患や成人呼吸困姉症候群のような肺嚢の進行性
消化に関する他の肺疾患を治療することができる。ヘビ
ースモーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫
も治療することができる。嚢胞性線維症や関節炎のよう
な必ずしも肺に関係のない疾患をも治療することかでき
る。アルファ−1−抗トリプシンの総説についてはガデ
ク(Gadek) (J二掲)を参照されたい。 ATの突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸35
8に於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異から
なる蛋白質は、例えば播種血管向凝固の治療に於て血液
凝固防止のために用いることができる。 本発明の蛋白質は、通常の製剤用担体と混合することが
できる。好ましくは、本発明の蛋白質は、静脈内または
吸入によって投与することができる。 有効投与量は、症状の重度および患者の体重によって異
なるか、本発明の蛋白質を0.5−10.0g/週の範
の投与量で静脈内投与することが多くの場合有効である
。投与方法が吸入の場合には、上記よりも低い投与量で
有効であり得る。部位特異性突然変異誘発ATが消化管
中ての早期分解を防くためにカプセルまたは被覆担体内
で保護されるならば経口投与も有効であり得る。 本発明の特別な好ましい実施態様につし・で説明したが
、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろう
。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべきも
のである。
第1A図および第1B図は、ヒトアルファ−1−抗トリ
プシンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのI)
NAおよびアミノ酸配列であり、第2図はラックZ遺伝
子の開始に於ける多重制限部位からなるpUc13のD
NA配列であり、第3図は突然変異体Val”B−AT
配列を含むヘクターpFATPOT 37の作製のため
のスキー1、である。
プシンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのI)
NAおよびアミノ酸配列であり、第2図はラックZ遺伝
子の開始に於ける多重制限部位からなるpUc13のD
NA配列であり、第3図は突然変異体Val”B−AT
配列を含むヘクターpFATPOT 37の作製のため
のスキー1、である。
Claims (18)
- (1)少なくとも1個の突然変異コドンを含む構造遺伝
子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−1−抗トリ
プシンの突然変異体のための暗号づけをしているDNA
構造物。 - (2)該突然変異コドンが哺乳類のアルファ−1−抗ト
リプシンの位置358に於てアミノ酸置換をもたらすコ
ドン358である特許請求の範囲第(1)項記載のDN
A構造物。 - (3)該突然変異コドンが哺乳類のアルファ−1−抗ト
リプシンの位置342に於てグルタミン酸のリジンによ
る置換をもたらすコドン342である特許請求の範囲第
(1)項記載のDNA構造物。 - (4)位置358に於てアラニンをもたらす特許請求の
範囲第(2)項記載のDNA構造物。 - (5)位置358に於てバリンをもたらす特許請求の範
囲第(2)項記載のDNA構造物。 - (6)位置358に於てグリシンをもたらす特許請求の
範囲第(2)項記載のDNA構造物。 - (7)位置358に於てフェニルアラニンをもたらす特
許請求の範囲第(2)項記載のDNA構造物。 - (8)位置358に於てアルギニンをもたらす特許請求
の範囲第(2)項記載のDNA構造物。 - (9)位置358に於てリジンをもたらす特許請求の範
囲第(2)項記載のDNA構造物。 - (10)少なくとも1個の突然変異コドンを含む構造遺
伝子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−1−抗ト
リプシンの突然変異体形のための暗号づけをしているD
NA構造物によって宿主微生物を形質転換させる工程で
あって、該構造物が該宿主微生物中で複製能力がある形
質転換工程からなる哺乳類のアルファ−1−抗トリプシ
ンの突然変異体形の表現方法。 - (11)該突然変異コドンがコドン358でありかつ該
突然変異体形がArg^3^5^8−アルファ−1−抗
トリプシンである特許請求の範囲第(10)項記載の方
法。 - (12)哺乳類類のアルファ−1−抗トリプシンの突然
変異体アミノ酸配列からなる実質的に純粋な蛋白質。 - (13)哺乳類のアルファ−1−抗トリプシンの優勢形
に対して上昇したアンチトロンビン活性を特徴とする特
許請求の範囲第(11)項記載の方法によって生成され
る実質的に純粋な蛋白質。 - (14)X^3^5^8−アルファ−1−抗トリプシン
(ここでXはアラニンまたはバリンまたはグリシンまた
はフェニルアラニンまたはアルギニンまたはリジンであ
る)のためのヒト構造遺伝子のために暗号づけする閉環
状DNA分子の生成方法であって、 A)野生型ヒトアルファ−1−抗トリプシンのための構
造遺伝子の暗号配列または相補物からなる環状1本鎖c
DNAを作製する工程と、B)該1本鎖cDNAに(1
)該1本鎖DNAのセグメントに相補的であることと該
野生型アルファ−1−抗トリプシンの位置358に於け
るアミノ酸に対応するコドン誤対合を含みかつ該誤対合
がアラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニル
アラニンまたはアルギニンまたはリジンのためのコドン
からなることを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと
(2)プライマーとをアニーリングさせる工程と、C)
該オリゴヌクレオチドとプライマーとを延長する工程と
、 D)該延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーとの
末端を結合してギャップつき環状2本鎖DNA分子を生
成させる工程と、 E)該ギャップつき環状2本鎖DNAを宿主微生物中へ
トランスフェクションしてヒトX^3^5^8−アルフ
ァ−1−抗トリプシンのための暗号づけをする該構造遺
伝子からなる該閉環状 DNA分子を生成させる工程と からなる閉環状DNA分子の生成方法。 - (15)A)野生型ヒトアルファ−1−抗トリプシンの
ための構造遺伝子の暗号配列または相補物からなる環状
1本鎖cDNA分子を作製する工程と、 B)該1本鎖DNAを、(1)該1本鎖DNAのセグメ
ントに相補的であることと該野生型アルファ−1−抗ト
リプシンの位置342に於けるアミノ酸に対応するコド
ン誤対合を含みかつ該誤対合がリジンのためのコドンか
らなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと
(2)プライマーとにアニーリングさせる工程と、 C)該オリゴヌクレオチドとプライマーとを延長させる
工程と、 D)該延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーとの
末端を結合させてギャップつき環状2本鎖DNA分子を
生成させる工程と、 E)該2本鎖ギャップつき環状DNAを宿主微生物中へ
トランスフェクションしてヒトZ−対立遺伝子アルファ
−1−抗トリプシン変異体のための暗号づけをする該遺
伝子からなる閉環状DNA分子を生成させる工程と からなるヒトZ−対立遺伝子アルファ−1−抗トリプシ
ン変異体のための構造遺伝子のための暗号づけをする閉
環状DNAの生成方法。 - (16)X^3^5^8−アルファ−1−抗トリプシン
(ここでXはアニリンまたはバリンまたはグリシンまた
はフェニルアラニンまたはアルギニンまたはリジンであ
る)のアミノ酸配列からなる実質的に純粋な蛋白質。 - (17)ヒトリジン^3^4^2−1−アルファ−1−
抗トリプシンのアミノ酸配列からなる実質的に純粋な蛋
白質。 - (18)特許請求の範囲第(12)項または第(13)
項または第(16)項または第(17)項のいずれか1
項に記載の実質的にグリコシル化されていない蛋白質。
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