JPS6112289A - アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 - Google Patents
アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は突然変異誘発遺伝子の作製および微生物中に於
けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は突
然変異誘発ヒトアルファ− １−抗１〜リプンン遺伝子
の作製およびアルファ−１−抗１リプシンの部位特異性
突然異性体の表現に関する。 アＪｐファーＩ−抗トリプシン（以下ＡＴと略称する）
はプロテアーゼ阻害剤であり、その主な機能は広スペク
トルプロテアーゼであるエラスターゼを阻害することで
ある。咄乳頻の肺組織はエラスターゼに特に侵されやす
いので、ＡＴの欠乏または不活性化は肺組織および弾性
の）置火およびそれに続く気腫を生ずる可能性がある。 ＡＴ活性の（置火または減少はタバコの煙を含む環境１
１５染物質によるΔ′Ｆの酸化の結果であり得る。ガデ
ク、ジェームスＥ、 （Ｇａｄｅｋ、 Ｊａｍｅｓ Ｅ
、）およびＲ，Ｄ、クリスタル（Ｒ，Ｉｌ、Ｃｒｙｓｔ
；］Ｉｌ、 ”アルファ−１−抗トリプシン欠１員（八
Ｉｐｈａ−１−八ｎｔｉＬｒｙｐｓｉｎ Ｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ） ” 、ザ・メタポリ４−り−ニベ
：シス・オーツｌ二（４ユ之±テア Ｆ≧’Ｙ ｘ ’
１７−７：：（ユｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａ５ｉ
ｓ ｏｆ−（Ｓｔａｎｂｕｒｙ、 Ｊ、Ｂ、）ら編、マ
グロ−・ヒル、ニューヨーク （１９８８）ｐｐ、１４
５０−１４６７およびキャロル（Ｃａｒｒｏｌ ｌ）
ら、玉ニチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）−２３８１，３２
９−３３４（１９８２）参照。 オウエン（Ｏｗｅｎ）ら（Ｎｅｗ Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ
、、 ３０９ ：Ｇ ９４−６９８．１９８３）は、
患者かアミノ酸位置３５８に於けるメチオニンの代わり
にアルギニンを置換したアルファ−１−抗トリプシンの
突然変異体形を生成する条件を記載している。遺伝子配
列中の単点突然変異（ＡＴＣ−＝ＡＧＧ）の結果として
、アルファ−１−抗１−リプシンはエラスターゼ阻害剤
としてのその正常な機能からトロンヒン阻害剤の機能へ
変化した。この機能変化は野生型へ］゛とアンチトロン
ビン■との間の構造の３０％相同から生じる（キャロル
（Ｃａｒｒｏｌ Ｉ） ら、同上をも参照のこと）。 これらの発見は、ＡＴの変化形か例えば播種血管向凝固
の治療に於けるような血液凝固防止に用いるために臨床
的に重要となり得ることを示す。 蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安
定性の増強をもたらし得る野生型ヒト八Ｔの変化形を作
製することは望ましいことである。Δ′１″るこ於ける
遺伝的欠損にかかっている患者に投ｊ５するための、か
かる患者よ免疫学的により相容性である野牛型ＡＴの変
化形を作製することも望ましい・二とである・う。増加
したアンチトロンヒン活性を有するＡＴの変化形を作製
することも望ましい、二とてあく〉・う。 従って、本発明の１つの目的は野生型ヒト八′「の部位
特異性突然変異誘発の作製方法を提供することである。 本発明のも・う１つの目的は突然変異体形八Ｔのための
１１６号づけをする構造遺伝子からなる表現ヘクターを
提供することである。 本発明のもう１つの目的は部位特異性突然変異誘発△１
′蛋白質を提供することである。 本発明は部位特異性突然変異誘発ＡＴのための構造遺伝
子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉環状Ｄ
ＮＡの生成方法を提供する。特に、本発明は （ａ＋ 野生型Ａ′Ｆのための構造遺伝子の暗号配列
またはその相補物からなる環状１本鎖ｃＤＮＡ分子を作
製する工程と、 ｉｂ）かかる】本鎖１） Ｎ Ａに、（１）かかる１本
鎖ＤＮＡのセグメン１〜に相補的であることと野生型Δ
Ｔの位置３５８に於けるアミノ酸に対応するコドンに於
て１つまたは２つ以上の誤対合を含めかつ該誤対合がア
ラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラ
ニンまたはアルキニンまたはリジンのためのコドンの１
つからなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレオチ
ドと（２＋Ｍ１３のだめの万能プライマーのようなプラ
イマーとをアニーリングさせる工程と、ｔｅｌ 該オ
リゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的に延長する工
程と、 （ｄ） 延長されたオリゴヌクレオチドとプライマー
との末端を一緒に結合してギャップつき環状２本鎖ＤＮ
Ａ分子を生成させる工程と、 （ρ） 該２本鎖ギャップ付き環状１．） Ｎ Ａ分子
を大腸菌、（！１−４９１１９−中へトランスフェクシ
ョンしてヒト×７＋ ′Ｒ−八Ｔへための構造遺伝子を
含む閉環状１つＮＡ分子を４ト威させかつプラークハイ
ブリダイゼーシヨンのためのプローブとしての突然変異
体オリゴヌクレオチドでスクリーニング後、突然変異体
１） Ｎ八を分離する工程とからなるヒト×３′８−八
Ｔ（ごごでＸはアラニンまたはバリンまたはグリシンま
たはフェニルアラニンまた６、ｔアルギニンまたはリジ
ンである）のための構造遺伝子のための暗号づＬＪをす
る１本鎖または２本鎖閉環状ＤＮＡの生成方法を提供す
る。 同様の方法によって、Δ１゛のＺ一対立遺伝子としても
知られているヒトＬｙｓ”２− Ａ Ｔの構造遺伝子か
らなる閉環状ＤＮＡ分子を作製することができる。本発
明の方法は３４２と３５８の両方の位置ならひに他の位
置に於て突然変異誘発されたΔ′１゛の作製にも利用す
ることができる。 本発明しＪ突然変異誘発Ａ ｉ”のための構造遺伝子か
らなるｌ） Ｎ Ａ構造物およびクローニングへフタ−
および突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的に
純粋な部位特異性突然変異誘発ＡＴをも提供する。 第１図について説明すると、この図には野生型へＴの優
勢形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示しである。位
置３５６−３６０に於けるアミノ酸からなるＡＴの活性
部位はメチオニン残基を含む。位置３５８に於ける残基
はタバコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されると
き酸化を受けやすい。かかる酸化はＡＴの生物学的活性
を減少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘
発により、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニ
ンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニン
またはアルギニンまたはリジンで置換して、より安定な
ＡＴの形を生成させることができる。 さらに、遺伝的ＡＴ欠損の１つはＺ一対立遺伝子変異体
として知られている異常形の生成である。 第１図について言うと、この突然変異はアミノ酸位置３
４２に於けるグルタミン酸のリジンによる置換によって
示される。Ｚ一対立遺伝子変異体に対して同型接合性の
個人は、明らかに肝臓に於ける処理妨害のために正常レ
ベルの約１５％のＡＴを４゛成する。このことは肝臓中
にＡＴの未熟形の７Ｗ積を生し、これに対応して血脩の
該阻害剤レベルが減少する。この状態をもつ個人の８０
％までは慢性の肺Ａ′りよび（または）肝臓疾患で死に
至ると考えられている。Ｚ一対立遺伝子変異体蛋白質自
体は野生型蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性を有するこ
とは注目す、べきである。かかる個人のＡ′１゛レヘル
は野生型へＴの静脈内投与によって増強することができ
る〔ガデク（Ｇａｄｅｋ） ら、乏土二丈１１５８１
１６５ （＋９８１）参照〕。しかし７、野生型蛋白
質はごれらの患者にとって異種であるので、成人かの７
７個人は野生型蛋白質にアレルー１−一になるとｊｊＪ
ｌ待され得る。かくして、本発明はある種のΔ′丁゛欠
損患者に於て非免疫原となり得るＺ一対立遺伝子変異体
の生成方法を提供する。 抗トロンビン活性を有することが示されているＡｒｇ３
５９− Ａ ’ｒは血液凝固阻止に有用でもあり得る。 天然産アンチトロンビン■は、通常、体内で血液凝固を
調節する働きがある。アンチトロンビン■は播種血管内
擬固の治療のため〔ガスチー（Ｇａｓｓｎｅｒ） ら
、典、但ユｎ、 Ｗ−ｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、 ９１
：５１−５３．１９７９ｉおよびヘルグレン（Ｉｌｅ
ｌ Ｉｇｒｅｎ） 、 Ｍ、他、Ｇｙｎｅｃｏｌ、 ０
ｂｓｔｅ旦−１ｎｖｅｓ ｔ。 １６１０７−１１８．１９８３）、および他の症状の治
療に於てヘパリンの代替物として〔バーンハート（Ｂｅ
ｒｎｈａｒｄ ｔ） 、 Ｗ、およびノハコハーハｌノ
）（Ｎｏｖａｋｏｖａ−Ｂａｎｅｔ）、Ａ、、Ｒｉｃ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｌａｂ、 １ ３ ：６１−
６６．１９８３）用いられて来た。 特に、本発明は野生型ヒトＡＴ遺伝子のｃＤＮへまたは
その相補物からなる１本鎖ＤＮＡ鋳型の作製に関する。 突然変異させようとするコドンに於て１個または２個以
七の誤対合を含む直線状オリゴヌクレオチ１゛プライマ
ーを、突然変異誘発部位の５′側にアニーリングする第
２プライマーと一緒に鋳型ヘアニーリングさせる。好ま
しい第２プライマーはＴ−１ノ販されておりかつＭ１３
ヘクター中のラフｐ、 （１；４ｑ） Ｚ遺伝子ヘ
ハ・イブリダイセーションＪるＭＩ３の万能ブライマー
である〔メノシンク（Ｍｅｓｓｉｎｇ）＋Ｍｅｔ−ｊＢ
、 ｉｎ ＩＥ−ｎ、ｚ７ｍｏ↓ｑ６．ｙ −Ｊ−０−
１ノ２０−７７．１．９８３）。該オリゴヌクレオチド
を延長しかつ末端に於て粘合させて２本鎖キヤツプつき
環状ＩＪ Ｎ Ａを得る。この２本鎖１） Ｎ Ａを用
いて宿ｊ７微生物人腸１■Ｌ轄、−Ｈｏ−１−ｊΣをト
ランスフェクションし、突然変異体および野生型ＤＮＡ
分子の混合物を含む、集団をもたらす。突然変異体ＤＮ
Ａオリ二ｌヌクＬ／オチドをブし７−フ゛とし−こ用い
るブラークハイフリダイセーションによって突然変異体
１１Ｎ八分−ｒを４ｇ択する。このｌ） Ｎ Ａをシー
ケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）変化したコドンの存
在を証明した後、適当な表現−・ツク−中へクローニン
グすることができる、突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、細菌
または酵母あるいは他の前核類または真正核類中で表現
さ口ることができる。 本明細書中で使用する”ＤＮＡ構造物”、゛ヘククー”
、°゛プラスミド゛いう用語は、ヒトの介在によって変
性されているＤＮＡ分子あるいはかく変性されている分
子のクローンであるＤＮＡ分子であって、そうでなけれ
ば天然には存在しない方法で結合さ−Ｕかつ配列させた
ＤＮＡのセグメントを含むＤＮＡ分子を構成する。本明
細書中で使用する゛表現ヘクター”という用語は、宿主
生物中・＼形質転換させるときそれ自体の複製を保証す
る遺伝情報と宿主生物中で表現されるべき少なくとも」
つの遺伝子ならびに転写の開始、翻訳の開始、プロモー
ター領域およびある場合には読み終り領域のための部位
のような、表現が起こるために必要となり得る他の制御
機能を含むＤＮＡ構造物である。゛′表現″という用語
は、通常の用途に於ては、宿主生物中に存在する遺伝子
によって暗号づりされる蛋白質生成物がある生物によっ
て合成される条件を意味すると定義される。“ギャップ
つき”という用語は、実質的に２本鎖であるか１本鎖頭
域を含むＤＮＡ分子を意味する。 災夏札喋可几 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。 ′□Ｍ
Ｉ ３ 宿−ｉ−株、万能プライマーおよびヘクター
は−＜ テスダ・り勺−チ・ラボラＩ・リーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ１ンｅｓｃａｒｃｌ＋ Ｌａｂｏｒａ）、ｏ
ｒｉｅｓ）から得た。制限エンドヌクレフアーゼは、ヘ
デスダ・リサーチ・ラボラドリース（１３ｅＬｈｅＳｄ
ａ ｌ１ｅｓｅｉ＋ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）、二、１゜−・インクラント・ハイオラブズ（Ｎｅｉ
ｙ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬ、Ｉｈ５）、ヘーリンガー
・マンハイＪ１、・ハイオケミカルズ（１１ｏｅｈｒｉ
ｎＢｅｒ Ｍａｎｎｈｃｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌
細胞の形質転換、ＤＮＡポリメラーゼＩ 〔フレナラ（
Ｋｌｅｎｏｗ）断片）を用いるＤＮＡ断片の平滑化（１
旧＋ｔｉｎｇ）方法、Ｔ４ＤＮΔリガーゼを用いる１）
Ｎ Ａ断片の接合方法を含む一般的クローニング方法
はマニ゛アテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らが記載してい
る〔天火キー２・ユラニでツター二丑Ｚグ」色坪皐小猛
Ｃ−ｊｏｎｊｎ６） ： ア−’ｚ、−夫う」ドーリ−
ニー１−］］５−？−？Ｊ！／ （ｎ、、−ｉ、ａ１
７ｏ、−ｒ；１−ｔ、−ｐ、ｒ、ｙ−Ｍａ、ｒ＋＋１Ｑ
）、コールド・スプリング・バーバー・ラホラｌ−リ
ー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｌ、ａｈｏｒ
ａｔｏｒｙ ）、１９８２）。 −・般的な部位特異性突然変異誘発方法は、シラー、マ
ークＪ、（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍａｒｋ Ｊ、）および１．
スミス（Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ）著、” Ｍ １３誘導ヘクタ
ー中へクローニングされたＤＮＡ断片のオリゴヌクレオ
チド指示突然変異誘発（０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄ
ｅ ＤｉｒｃｃｌｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ
ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｃ１ｏｎｅｄ
Ｉｎ１．ｏ Ｍ１３Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ）″、マーユアル・シラー・アドールト・スプリング
・バーバー・ラホラトリ＝（Ｃｃｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｈｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 、１９８３に
記載されている。 野生型ＡＴ中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリ
ゴヌクレオチドは、ビューケージ＜Ｂｅａｕｃａｇｅ）
およびカルケージ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ） 、？ ）’
ｚ ２１” 丑Ｚ二に久−３（Ｔｅｔｒａｈｅｄ−ｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２ ： ＋８５９−１８６２．
１９８１およびマソテウチ（Ｍａ ｔｔｅｏｃｈ）およ
びカル−勺−ズ（Ｃａｒｕ ｔｈｅｒｓ）、Ｊ、Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、 １０３ ： ３１３８ （１９８
１）に一般的に記載されている亜燐酸トリエステル法に
より、マノテウヂ（Ｍ；］ｔ ｔｅｕｃｈ）およびカル
ーザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ） 、テトラヘドロン・
レターズ４−Ｔｑ−１，４−！］−ｈｑ、ｄ−ｒｏｎ−
Ｌｓ１↓二（ｓし！二ｓ） ２ １ ： ７
］ ９ − ７ ２ ２（１９８０）に記載されて
いるようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド・ハイオシステムス・モデル
３８ｏ−Ａ Ｉ） ！”ｊＡ合成装置のような機械によ
って、オリゴヌクレオチドを合成することができる。合
成されたオリゴヌクレオチドは、変性用ゲル七でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製することがで
きる。オリゴヌクレオチドは、５′一端に於て、くカン
マ）３２ Ｐ−ΔＴ’Ｐおよびポリヌクレオヂトキナー
セによって燐酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の
検定はマクザｌ、（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇ
Ｎｂｅｒｔ）法、メソド・イン・工−ンーｇｌイーＥ
ｒ’Ｊ！−二−（、Ｍｅｊユｈｏｄｓ−ｉ四］いｌｙｍ
ｏＪｏ５ｚ） 、 ６ ５・、５７． （］ ９８
０）で行うことができる。 野生型アルファ−１−抗トリプシン遺伝−−−一−乙か
支秦本−↓一本掩ｐＪ−Δ−９罫ＺＪ−−−ヒトＡ Ｔ
の優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションプローブとして 々配列を用いる常
法〔クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ） ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ＋
７□づ６□、 ６８２０ −８３０ （１９８０）
；およびチャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ）ら、Ｂｉ−ｏｃ
ｈａｍ、 側遼ユｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍ−＋ １０
３．７５１−７５８ （１９８１））によってヒト肝
臓ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。Ａ
Ｔ遺伝子は１４４６ｂｐＰｓｔｌ 断片として単離さ
れ、Ｐｓｔ ］ 消化プラスミドｐｕｃ １３
Ｃビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら、ジーン（Ｇｅｎ旬、よ
度、２５９−２６８（１９’８２）記載の方法で作製、
但し１ａｃＺ遺伝子に於ける開始に於て第２図に示す多
重制限部位を含む〕中へ挿入されてＡＴ遺伝子の３′側
のポリリンカー中にＢａｍ Ｉ−Ｉ １部位を含む組換
型プラスミドｐｔｌｃα１を与える。プラスミド ｐＵ
ｃα１ばＲａｍ Ｈ］で消化されてＡＴ配列を得る。 １３２０ｂｐＢａｍ Ｈ１断片を次にＭ１３ｍｐｌＯ
中に結合し〔メソシング（ｌＩＩｅｓｓｉｎｇ、メソド
ニ堕７−Ａ！ブイＪロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｊｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｉ）１０１４２０−７７ （１９８３
））、得られた組換型ファージを用いて大腸菌（ｆｉ＝
ｃｑｌｉ−） Ｋ ｌ ２（、ＪＭ］０３）をトラン
スフェクションする。ＡＴ遺伝子を含む１本鎖閉環状Ｄ
Ｎへをへ次にシラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓ
ｍｉｔｈ）の方法（上掲）で単離する。 野η型ＡＴ中の配列から１つ以」−の塩基−変イ１５剣
イ
けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は突
然変異誘発ヒトアルファ− １−抗１〜リプンン遺伝子
の作製およびアルファ−１−抗１リプシンの部位特異性
突然異性体の表現に関する。 アＪｐファーＩ−抗トリプシン（以下ＡＴと略称する）
はプロテアーゼ阻害剤であり、その主な機能は広スペク
トルプロテアーゼであるエラスターゼを阻害することで
ある。咄乳頻の肺組織はエラスターゼに特に侵されやす
いので、ＡＴの欠乏または不活性化は肺組織および弾性
の）置火およびそれに続く気腫を生ずる可能性がある。 ＡＴ活性の（置火または減少はタバコの煙を含む環境１
１５染物質によるΔ′Ｆの酸化の結果であり得る。ガデ
ク、ジェームスＥ、 （Ｇａｄｅｋ、 Ｊａｍｅｓ Ｅ
、）およびＲ，Ｄ、クリスタル（Ｒ，Ｉｌ、Ｃｒｙｓｔ
；］Ｉｌ、 ”アルファ−１−抗トリプシン欠１員（八
Ｉｐｈａ−１−八ｎｔｉＬｒｙｐｓｉｎ Ｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ） ” 、ザ・メタポリ４−り−ニベ
：シス・オーツｌ二（４ユ之±テア Ｆ≧’Ｙ ｘ ’
１７−７：：（ユｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａ５ｉ
ｓ ｏｆ−（Ｓｔａｎｂｕｒｙ、 Ｊ、Ｂ、）ら編、マ
グロ−・ヒル、ニューヨーク （１９８８）ｐｐ、１４
５０−１４６７およびキャロル（Ｃａｒｒｏｌ ｌ）
ら、玉ニチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）−２３８１，３２
９−３３４（１９８２）参照。 オウエン（Ｏｗｅｎ）ら（Ｎｅｗ Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ
、、 ３０９ ：Ｇ ９４−６９８．１９８３）は、
患者かアミノ酸位置３５８に於けるメチオニンの代わり
にアルギニンを置換したアルファ−１−抗トリプシンの
突然変異体形を生成する条件を記載している。遺伝子配
列中の単点突然変異（ＡＴＣ−＝ＡＧＧ）の結果として
、アルファ−１−抗１−リプシンはエラスターゼ阻害剤
としてのその正常な機能からトロンヒン阻害剤の機能へ
変化した。この機能変化は野生型へ］゛とアンチトロン
ビン■との間の構造の３０％相同から生じる（キャロル
（Ｃａｒｒｏｌ Ｉ） ら、同上をも参照のこと）。 これらの発見は、ＡＴの変化形か例えば播種血管向凝固
の治療に於けるような血液凝固防止に用いるために臨床
的に重要となり得ることを示す。 蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安
定性の増強をもたらし得る野生型ヒト八Ｔの変化形を作
製することは望ましいことである。Δ′１″るこ於ける
遺伝的欠損にかかっている患者に投ｊ５するための、か
かる患者よ免疫学的により相容性である野牛型ＡＴの変
化形を作製することも望ましい・二とである・う。増加
したアンチトロンヒン活性を有するＡＴの変化形を作製
することも望ましい、二とてあく〉・う。 従って、本発明の１つの目的は野生型ヒト八′「の部位
特異性突然変異誘発の作製方法を提供することである。 本発明のも・う１つの目的は突然変異体形八Ｔのための
１１６号づけをする構造遺伝子からなる表現ヘクターを
提供することである。 本発明のもう１つの目的は部位特異性突然変異誘発△１
′蛋白質を提供することである。 本発明は部位特異性突然変異誘発ＡＴのための構造遺伝
子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉環状Ｄ
ＮＡの生成方法を提供する。特に、本発明は （ａ＋ 野生型Ａ′Ｆのための構造遺伝子の暗号配列
またはその相補物からなる環状１本鎖ｃＤＮＡ分子を作
製する工程と、 ｉｂ）かかる】本鎖１） Ｎ Ａに、（１）かかる１本
鎖ＤＮＡのセグメン１〜に相補的であることと野生型Δ
Ｔの位置３５８に於けるアミノ酸に対応するコドンに於
て１つまたは２つ以上の誤対合を含めかつ該誤対合がア
ラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラ
ニンまたはアルキニンまたはリジンのためのコドンの１
つからなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレオチ
ドと（２＋Ｍ１３のだめの万能プライマーのようなプラ
イマーとをアニーリングさせる工程と、ｔｅｌ 該オ
リゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的に延長する工
程と、 （ｄ） 延長されたオリゴヌクレオチドとプライマー
との末端を一緒に結合してギャップつき環状２本鎖ＤＮ
Ａ分子を生成させる工程と、 （ρ） 該２本鎖ギャップ付き環状１．） Ｎ Ａ分子
を大腸菌、（！１−４９１１９−中へトランスフェクシ
ョンしてヒト×７＋ ′Ｒ−八Ｔへための構造遺伝子を
含む閉環状１つＮＡ分子を４ト威させかつプラークハイ
ブリダイゼーシヨンのためのプローブとしての突然変異
体オリゴヌクレオチドでスクリーニング後、突然変異体
１） Ｎ八を分離する工程とからなるヒト×３′８−八
Ｔ（ごごでＸはアラニンまたはバリンまたはグリシンま
たはフェニルアラニンまた６、ｔアルギニンまたはリジ
ンである）のための構造遺伝子のための暗号づＬＪをす
る１本鎖または２本鎖閉環状ＤＮＡの生成方法を提供す
る。 同様の方法によって、Δ１゛のＺ一対立遺伝子としても
知られているヒトＬｙｓ”２− Ａ Ｔの構造遺伝子か
らなる閉環状ＤＮＡ分子を作製することができる。本発
明の方法は３４２と３５８の両方の位置ならひに他の位
置に於て突然変異誘発されたΔ′１゛の作製にも利用す
ることができる。 本発明しＪ突然変異誘発Ａ ｉ”のための構造遺伝子か
らなるｌ） Ｎ Ａ構造物およびクローニングへフタ−
および突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的に
純粋な部位特異性突然変異誘発ＡＴをも提供する。 第１図について説明すると、この図には野生型へＴの優
勢形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示しである。位
置３５６−３６０に於けるアミノ酸からなるＡＴの活性
部位はメチオニン残基を含む。位置３５８に於ける残基
はタバコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されると
き酸化を受けやすい。かかる酸化はＡＴの生物学的活性
を減少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘
発により、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニ
ンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニン
またはアルギニンまたはリジンで置換して、より安定な
ＡＴの形を生成させることができる。 さらに、遺伝的ＡＴ欠損の１つはＺ一対立遺伝子変異体
として知られている異常形の生成である。 第１図について言うと、この突然変異はアミノ酸位置３
４２に於けるグルタミン酸のリジンによる置換によって
示される。Ｚ一対立遺伝子変異体に対して同型接合性の
個人は、明らかに肝臓に於ける処理妨害のために正常レ
ベルの約１５％のＡＴを４゛成する。このことは肝臓中
にＡＴの未熟形の７Ｗ積を生し、これに対応して血脩の
該阻害剤レベルが減少する。この状態をもつ個人の８０
％までは慢性の肺Ａ′りよび（または）肝臓疾患で死に
至ると考えられている。Ｚ一対立遺伝子変異体蛋白質自
体は野生型蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性を有するこ
とは注目す、べきである。かかる個人のＡ′１゛レヘル
は野生型へＴの静脈内投与によって増強することができ
る〔ガデク（Ｇａｄｅｋ） ら、乏土二丈１１５８１
１６５ （＋９８１）参照〕。しかし７、野生型蛋白
質はごれらの患者にとって異種であるので、成人かの７
７個人は野生型蛋白質にアレルー１−一になるとｊｊＪ
ｌ待され得る。かくして、本発明はある種のΔ′丁゛欠
損患者に於て非免疫原となり得るＺ一対立遺伝子変異体
の生成方法を提供する。 抗トロンビン活性を有することが示されているＡｒｇ３
５９− Ａ ’ｒは血液凝固阻止に有用でもあり得る。 天然産アンチトロンビン■は、通常、体内で血液凝固を
調節する働きがある。アンチトロンビン■は播種血管内
擬固の治療のため〔ガスチー（Ｇａｓｓｎｅｒ） ら
、典、但ユｎ、 Ｗ−ｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、 ９１
：５１−５３．１９７９ｉおよびヘルグレン（Ｉｌｅ
ｌ Ｉｇｒｅｎ） 、 Ｍ、他、Ｇｙｎｅｃｏｌ、 ０
ｂｓｔｅ旦−１ｎｖｅｓ ｔ。 １６１０７−１１８．１９８３）、および他の症状の治
療に於てヘパリンの代替物として〔バーンハート（Ｂｅ
ｒｎｈａｒｄ ｔ） 、 Ｗ、およびノハコハーハｌノ
）（Ｎｏｖａｋｏｖａ−Ｂａｎｅｔ）、Ａ、、Ｒｉｃ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｌａｂ、 １ ３ ：６１−
６６．１９８３）用いられて来た。 特に、本発明は野生型ヒトＡＴ遺伝子のｃＤＮへまたは
その相補物からなる１本鎖ＤＮＡ鋳型の作製に関する。 突然変異させようとするコドンに於て１個または２個以
七の誤対合を含む直線状オリゴヌクレオチ１゛プライマ
ーを、突然変異誘発部位の５′側にアニーリングする第
２プライマーと一緒に鋳型ヘアニーリングさせる。好ま
しい第２プライマーはＴ−１ノ販されておりかつＭ１３
ヘクター中のラフｐ、 （１；４ｑ） Ｚ遺伝子ヘ
ハ・イブリダイセーションＪるＭＩ３の万能ブライマー
である〔メノシンク（Ｍｅｓｓｉｎｇ）＋Ｍｅｔ−ｊＢ
、 ｉｎ ＩＥ−ｎ、ｚ７ｍｏ↓ｑ６．ｙ −Ｊ−０−
１ノ２０−７７．１．９８３）。該オリゴヌクレオチド
を延長しかつ末端に於て粘合させて２本鎖キヤツプつき
環状ＩＪ Ｎ Ａを得る。この２本鎖１） Ｎ Ａを用
いて宿ｊ７微生物人腸１■Ｌ轄、−Ｈｏ−１−ｊΣをト
ランスフェクションし、突然変異体および野生型ＤＮＡ
分子の混合物を含む、集団をもたらす。突然変異体ＤＮ
Ａオリ二ｌヌクＬ／オチドをブし７−フ゛とし−こ用い
るブラークハイフリダイセーションによって突然変異体
１１Ｎ八分−ｒを４ｇ択する。このｌ） Ｎ Ａをシー
ケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）変化したコドンの存
在を証明した後、適当な表現−・ツク−中へクローニン
グすることができる、突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、細菌
または酵母あるいは他の前核類または真正核類中で表現
さ口ることができる。 本明細書中で使用する”ＤＮＡ構造物”、゛ヘククー”
、°゛プラスミド゛いう用語は、ヒトの介在によって変
性されているＤＮＡ分子あるいはかく変性されている分
子のクローンであるＤＮＡ分子であって、そうでなけれ
ば天然には存在しない方法で結合さ−Ｕかつ配列させた
ＤＮＡのセグメントを含むＤＮＡ分子を構成する。本明
細書中で使用する゛表現ヘクター”という用語は、宿主
生物中・＼形質転換させるときそれ自体の複製を保証す
る遺伝情報と宿主生物中で表現されるべき少なくとも」
つの遺伝子ならびに転写の開始、翻訳の開始、プロモー
ター領域およびある場合には読み終り領域のための部位
のような、表現が起こるために必要となり得る他の制御
機能を含むＤＮＡ構造物である。゛′表現″という用語
は、通常の用途に於ては、宿主生物中に存在する遺伝子
によって暗号づりされる蛋白質生成物がある生物によっ
て合成される条件を意味すると定義される。“ギャップ
つき”という用語は、実質的に２本鎖であるか１本鎖頭
域を含むＤＮＡ分子を意味する。 災夏札喋可几 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。 ′□Ｍ
Ｉ ３ 宿−ｉ−株、万能プライマーおよびヘクター
は−＜ テスダ・り勺−チ・ラボラＩ・リーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ１ンｅｓｃａｒｃｌ＋ Ｌａｂｏｒａ）、ｏ
ｒｉｅｓ）から得た。制限エンドヌクレフアーゼは、ヘ
デスダ・リサーチ・ラボラドリース（１３ｅＬｈｅＳｄ
ａ ｌ１ｅｓｅｉ＋ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）、二、１゜−・インクラント・ハイオラブズ（Ｎｅｉ
ｙ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬ、Ｉｈ５）、ヘーリンガー
・マンハイＪ１、・ハイオケミカルズ（１１ｏｅｈｒｉ
ｎＢｅｒ Ｍａｎｎｈｃｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌
細胞の形質転換、ＤＮＡポリメラーゼＩ 〔フレナラ（
Ｋｌｅｎｏｗ）断片）を用いるＤＮＡ断片の平滑化（１
旧＋ｔｉｎｇ）方法、Ｔ４ＤＮΔリガーゼを用いる１）
Ｎ Ａ断片の接合方法を含む一般的クローニング方法
はマニ゛アテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らが記載してい
る〔天火キー２・ユラニでツター二丑Ｚグ」色坪皐小猛
Ｃ−ｊｏｎｊｎ６） ： ア−’ｚ、−夫う」ドーリ−
ニー１−］］５−？−？Ｊ！／ （ｎ、、−ｉ、ａ１
７ｏ、−ｒ；１−ｔ、−ｐ、ｒ、ｙ−Ｍａ、ｒ＋＋１Ｑ
）、コールド・スプリング・バーバー・ラホラｌ−リ
ー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｌ、ａｈｏｒ
ａｔｏｒｙ ）、１９８２）。 −・般的な部位特異性突然変異誘発方法は、シラー、マ
ークＪ、（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍａｒｋ Ｊ、）および１．
スミス（Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ）著、” Ｍ １３誘導ヘクタ
ー中へクローニングされたＤＮＡ断片のオリゴヌクレオ
チド指示突然変異誘発（０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄ
ｅ ＤｉｒｃｃｌｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ
ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｃ１ｏｎｅｄ
Ｉｎ１．ｏ Ｍ１３Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ）″、マーユアル・シラー・アドールト・スプリング
・バーバー・ラホラトリ＝（Ｃｃｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｈｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 、１９８３に
記載されている。 野生型ＡＴ中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリ
ゴヌクレオチドは、ビューケージ＜Ｂｅａｕｃａｇｅ）
およびカルケージ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ） 、？ ）’
ｚ ２１” 丑Ｚ二に久−３（Ｔｅｔｒａｈｅｄ−ｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２ ： ＋８５９−１８６２．
１９８１およびマソテウチ（Ｍａ ｔｔｅｏｃｈ）およ
びカル−勺−ズ（Ｃａｒｕ ｔｈｅｒｓ）、Ｊ、Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、 １０３ ： ３１３８ （１９８
１）に一般的に記載されている亜燐酸トリエステル法に
より、マノテウヂ（Ｍ；］ｔ ｔｅｕｃｈ）およびカル
ーザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ） 、テトラヘドロン・
レターズ４−Ｔｑ−１，４−！］−ｈｑ、ｄ−ｒｏｎ−
Ｌｓ１↓二（ｓし！二ｓ） ２ １ ： ７
］ ９ − ７ ２ ２（１９８０）に記載されて
いるようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド・ハイオシステムス・モデル
３８ｏ−Ａ Ｉ） ！”ｊＡ合成装置のような機械によ
って、オリゴヌクレオチドを合成することができる。合
成されたオリゴヌクレオチドは、変性用ゲル七でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製することがで
きる。オリゴヌクレオチドは、５′一端に於て、くカン
マ）３２ Ｐ−ΔＴ’Ｐおよびポリヌクレオヂトキナー
セによって燐酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の
検定はマクザｌ、（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇ
Ｎｂｅｒｔ）法、メソド・イン・工−ンーｇｌイーＥ
ｒ’Ｊ！−二−（、Ｍｅｊユｈｏｄｓ−ｉ四］いｌｙｍ
ｏＪｏ５ｚ） 、 ６ ５・、５７． （］ ９８
０）で行うことができる。 野生型アルファ−１−抗トリプシン遺伝−−−一−乙か
支秦本−↓一本掩ｐＪ−Δ−９罫ＺＪ−−−ヒトＡ Ｔ
の優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションプローブとして 々配列を用いる常
法〔クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ） ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ＋
７□づ６□、 ６８２０ −８３０ （１９８０）
；およびチャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ）ら、Ｂｉ−ｏｃ
ｈａｍ、 側遼ユｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍ−＋ １０
３．７５１−７５８ （１９８１））によってヒト肝
臓ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。Ａ
Ｔ遺伝子は１４４６ｂｐＰｓｔｌ 断片として単離さ
れ、Ｐｓｔ ］ 消化プラスミドｐｕｃ １３
Ｃビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら、ジーン（Ｇｅｎ旬、よ
度、２５９−２６８（１９’８２）記載の方法で作製、
但し１ａｃＺ遺伝子に於ける開始に於て第２図に示す多
重制限部位を含む〕中へ挿入されてＡＴ遺伝子の３′側
のポリリンカー中にＢａｍ Ｉ−Ｉ １部位を含む組換
型プラスミドｐｔｌｃα１を与える。プラスミド ｐＵ
ｃα１ばＲａｍ Ｈ］で消化されてＡＴ配列を得る。 １３２０ｂｐＢａｍ Ｈ１断片を次にＭ１３ｍｐｌＯ
中に結合し〔メソシング（ｌＩＩｅｓｓｉｎｇ、メソド
ニ堕７−Ａ！ブイＪロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｊｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｉ）１０１４２０−７７ （１９８３
））、得られた組換型ファージを用いて大腸菌（ｆｉ＝
ｃｑｌｉ−） Ｋ ｌ ２（、ＪＭ］０３）をトラン
スフェクションする。ＡＴ遺伝子を含む１本鎖閉環状Ｄ
Ｎへをへ次にシラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓ
ｍｉｔｈ）の方法（上掲）で単離する。 野η型ＡＴ中の配列から１つ以」−の塩基−変イ１５剣
イ
【ノし゛ノ―−リーーフー呂−子（Ｋイ二す」メ不１
Ｄ−１Ｗ−−下記第１表に示すオリゴヌクレオチドを通
常の亜燐酸トリエステル法またはアプライド・ハイオシ
ステＪ・ス・モデル３８０〜八合成装置で合成し７た後
、変１」用ポリアクリルアミドケル」二で精製すること
ができる。このオリゴヌクレオチドは、アミノ酸３５８
のコドンのための適当な誤対合が存在する以外は第１図
に示す野生型ヒト八Ｔのアミノ酸３５６−３ＧＯのため
の暗号づけをする。 ｉｌ−一−−１表 メチオニン（野生型） −ＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴ（
：ＴＡＴＣアラニン へＴＡＣＣＣＧ
ＣＧＴＣＴ／ＩＴｃハ リ ン
へＴＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＣグリ
シン ＡＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＴＣ
フェニルアラニン へＴＡＣＣＣＴＴＣＴＣＴ
ＡＴＣアルギニン へＴ／
ＩｃｃｃＡＧＡＴｃＴＡＴｃＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴ
ＡＴＣＣＣＣリ ジン
へＴＡＣＣＣへへＧＴＣＴＡＴＣ」−記のもの
よりも長いオリゴヌクレオチドを使用できることは言う
までもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第１表中に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが１５−２１ヌクレオチドの範囲でありかつ少
なくともヌクレオチド１１８４−１１９８を含むことか
好ましい。 もう１つのオリゴヌクレオチ１−は第２表に示すように
Ｕ７で作製され、ＡＴ配列中のアミノ酸３４２のための
コドンの周りにほぼ中心を置く配列に対応する。第２表
のオリゴヌクレオチドはアミノ酸３４２のためのコドン
に於ける誤対合を含み、それによってリジンのコドンが
含まれてＺ一対立遺伝子変異体を生しる。 上記、Ｌりも長いオリゴヌクレオチドが利用できること
ば君フまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第２
表に示したものの代わりに他の突然変異体コ１−ンを用
いることができることも言うまでもない。オリゴヌクレ
オチド−は、長さが１５〜２１ヌクレオチドでありかつ
ヌクレオチド１１３５〜１１４９を含むことが好ましい
。 一丈丈ダんムに１天−し勿龜長省劣グ胎金−にに至りた
オリゴヌクレオチドのおのおのを、Ｍ１３の万能プライ
マーのような第２プライマーと一緒に野生型ＡＴ遺伝子
を含む１本鎖組換型Ｍ１３ファージＤＮＡとアニーリン
グさせる。典型的な操作に於ては、２０ｐｍｏｌの燐酸
化Ｚ一対立遺伝子オリゴヌクレオヂトと２０ｐｍｏｌの
Ｍ１３プライマーとをΔＴｃＤＮＡを含む組換型Ｍ１３
ファージ］ ｐｍｏｌと混合し、アニーリングさせた。 このオリゴヌクレオチドを、次にＤＮＡポリメラーゼＩ
Ｃフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕を用いて
延長し、合成鎮の末端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接
合さセた。得られたＤＮＡ分子はＡＴ暗号領域にわたっ
て明らかに二本鎖でありかつＭ１３ヘクター領域にわた
って部分的に１本鎖である。 これらのギャップ付きＤＮＡ環をコンピテント大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ １２ （Ｊ Ｍ １０１ ）中へ
トランスフェクションして細菌ＤＮＡ修復系によってギ
ャップを埋めて活性ファージを作ることができる。 突然変異体骨Ｙの集団は、ファージＤＮＡをニド１′Ｊ
セルＩ」−スフイルターに結合さセて３２ｐでラヘルし
た突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでプローブするプ
ラーク・リフト（ｐｌａｑｕｅ−１ｉｆｔ） ハイブリ
ダイセージコン法〔シラー（Ｚｏｌ Ｉｅｒ）ら、Ｌ掲
〕によって野生型から識別される。本操作の背後にある
原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが野４１−
型クローンとよりも安定な複式を突然変異体クローンと
形成する（野生型クローンとのハイブリダイゼーション
は誤対合を生ずる）ということである。低温に於けるハ
・イブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけがプ
ローブとハイフリソＦを形成するまで洗浄温度を上げる
。典型的には、２３°Ｃの温度でハイブリダイゼーショ
ンを行った後、２３゛Ｃ１３７°Ｃ１５０゛Ｃ１５５°
Ｃで逐次洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを
行うことができる。突然変異体ファージを次に単離し、
再度プレートにまき、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（、
■６＋□□−−□ −ｐｏＶ、−１ｊｊＯｊ、、 −！ 、、４−ｕ、、
： １６１、］、９８３）およびり゛ンガー（ＳａｎＢ
ｅｒ）ら、ＸＰｙ碧ユＮａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
−」Σ酊、ニー↓： ５４．６３．１９７７）のシ
ブオキ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いるシーケンシング（
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって突然変異の存在を証明
することができる。 細菌表現ベクター中への配列に於ける −−」然−弯」（化や堅］し一ニングーー突然変異体Ａ
Ｔ暗号ｗ４域は、複製型のＢａｍ Ｈ１およびＰｓｔ
１による消化によって閉環状ＤＮＡから取除くことがで
きる。突然変異体ＡＴ遺伝子を含む断片を、Ｂａｍ Ｈ
１およびＩ’ｓｔ １消化ヘクタ−Ｍｌ ３Ｔ八Ｃまた
はＭＩ３ｍｐｌＯ中へ挿入することができる。ファージ
Ｍ１３ｍｐｌＯばＰ−Ｌバイオケミカルス（Ｐ −ｒ−
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはヘテスダ・リザーチ
・ラホラトリーズ （ＢｅｔｈｅｓｄｅＲｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている。 得られた構造物は、上述のように大腸菌（旦ユｃｏｌｉ
）Ｋ］２ （ＪＭ１０３）を形質転換させるために用い
ることができる。 ファージＭ］３ｍｐｌＯをＥｃｏ ＲＩおよびＲａｍ
Ｉｌｌで消化してＭ１３ＴＡＣを作製する。得られた付
着末端に、Ｐ−Ｌバイオケミカルス（Ｐ−ＬＢｉｏｃｌ
＋ｅｍｉｃａｌｓ）から購入した、下記構造を有しＡΔ
ＴＴＣΔＴＧＧ、ＡＣ Ｇ Ｔ Ａ ＣＣＴ ＣＣｉ’ Ａ Ｇかつ５個の主燐
酸塩が欠損している合成りＮＡアダプターを結合させて
構造物ｍｐｌｏ八を生成させる。かくして、構造物ｍｐ
ｌＯＡはＡＴ遺伝子のための開始コドンと第１アミノ酸
（Ｇｌｕ）コドンとを、１ゴえるΔ’「ｃ ｃへＧを含
む配列についてのＨｃ、。 １ン１およびＲａｍ Ｔ（］制限部位を含む。ｍｐｌｏ
のもとのＶ、ｃ、ｏ Ｒｌと！１．］ｍ Ｈ１との間の
領域のためのアダプターの置換はランクオペロン解読フ
レームを破壊し、得られた１ランスフエクタントは白色
プラークを！ブ、える。 ヘククーｍｐｌＯＡをＡｖａ ＩＩで消化し、付着末端
をＤＮＡポリメラーゼのフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラ
グメントを用いて埋める。この後でＥｃｏ ＲＩで消化
しかつＳ１ヌクレアーゼを用いて付着末端を除去する。 得られた平滑末端断片がｍｐｌＯＢである。 ｔ’ｒ ｐ−ランクプロモーターからなるＤＮＡ断片を
市販プラスミドｐＤＲ５４０（Ｐ−Ｌハイオヶミカルズ
（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌｓ＞ ）から取り
出す。 このプラスミドｐＤＲ５４０をＨ４ｎｄ ＩＩ＋で切断
し、付着端をフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで
埋める。 配列ＣＣＴＣＧＡＧＧを有するリンカ−をこの平滑末端
に結合し、過剰のリンカ−をＸｈｏｌによる消化によっ
て除去する。得られたｐＤＲ５４０Ｘとして知られてい
る構造物４；ｊ：ｐＤＲ５４０のＨｉ ｎ ｄ ｍ部位
の代わりにＸｈｏ １部位を含む。Ｘｈｏ １およびＢ
ａｍＪ−ＩＩによるρＤＲ５４０Ｘの消化およびそれに
続くフレナラ（Ｋｌｅｎｏｉｙ）フラグメントを用いる
末端の平滑化によってｔｒｐ 〜ランクプロモーター（
ＴＡＣ）とシャインーダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ）配列とを含む断片を得る。ｔｒｐ−ラック
プロモーターを含む上記断片をｍｒ＋１０Ｂ断片中に挿
入してハイブリッドファージｍｐｌＯｃを生成する。ｎ
＋９１０Ｂの平滑化ＡνａＵをＴＡＣ含有断片の平滑化
Ｘｈｏ Ｉへ結合することによって結合部にＸｈｏ １
部位を再生する。ＴＡＣ断片の平滑化Ｂａｍ Ｈ１部位
のｍｐｌ。 Ｂの平滑化Ｅｃｏ ＲＩ末端への結合によってこの結合
部にＮｃｏ １部位（ＣＣＡＴＧＧ）を生しる。断片の
正しい指向は、青色プラークの生成によってスクリーニ
ングすることができる。ファージｍｐｌＯｃは、もとの
Ｂａｍ Ｈ１部位中へのＡＴ遺伝その挿入を容易にする
ために除去されねばならないＡＴＧ開始コドンのに流に
位置する第２ Ｂａｍ Ｈ１を含む。 この異質のＲａｍ Ｈ１部位を除去するため、ｍｐｌ。 ＣをＲａｍ Ｈｉ Ｌこよる２回の消化にか＆Ｊる。第
１の部分的消化の後で、フレナラ （Ｋｌｅｎｏｗ）ポ
リメラーゼによって付着末端を埋め、Ｘｈｏ Ｔで消化
し、アガロースゲル上ご精製する。正しい断片ばＮｃ、
。 】制限部位を含む断片として確認される。ｍｐｌＯＣの
第２のＢａｎ Ｈ，１消化は完了まで行い、付着末端を
フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼを用いて埋め、
（！ −１２Ｐ−ｄＮＴＰ ’ ｓを用いてＢａ１３１
エキソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュ
アリングの監視を容易にする。Ｂａ１．３１エキソヌク
レアーゼにより標識末端から５塩基対を除去し、それに
よっ”ζＢａｍ Ｈ１部位を除去する。プロモーターを
含む配列をＸＩ＋ｏ Ｉで除去し、ゲル精製する０１１
１１１１０とｐ［ｌＲ５４０誘導断片とを一緒に結合し
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ １２ （ＪＭ １０３
） （メソランク、Ｊ、 （Ｍｅｓｓｊ＋Ｂ；、Ｊ、
）ら１９８１ヌクレイノ久二ＬスＵ二叉明、 （Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｊｄｓ Ｒｅｄ、） ９ ： ３０９
、Ｐ−１，ハイオケミカルズ（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）から市販〕中へクローニングし、Ｎｃ
ｏ ＋感受性および青色プラークの生成でスクリーニン
グする。 得られたヘクターはＭ１３’ＦΔＣである。 酢隼もζ於−婁る表現ヘクク〕ｑ之−豆二三２ノー酵母
中に於けるクローニングおよび表現のために、Ｂａｍ
Ｈ１断片のような変異体配列を含む旧３フプージの複製
型から変異体Ａ′Ｆ配列を単離し、Ｂａｍ Ｈ１消化プ
ラスミドＨＡＴｄ中へ挿入することができる。プラスミ
ドＨＡ Ｔ ４は、下記の方法で作られたものである。 プラスミドｐＪＤＢ ２４８〔ヘノグズ（Ｂｅｇｇｓ
） 、ネニ丈？（Ｎａｔｕｒｅ） ２７５ ：１０４−
１０’９、］ ９７８）をＦミｃｏＲＩで部分的に消化
し、ｐＭＢ ９配列を除去した。プラスミドｐＢＲ３２
２（ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ） ら、２二２−（Ｇ
ｅｎｅ） ２ ： ９５ １１３、Ｉ ９７７）をＥｃ
ｏ Ｒ１で開裂し、ｐＭＢ ９配列の代わりに直線状ｐ
ＪＤ８２４８へ接合さ（た。得られたプラスミド−ばＣ
１／１として知られている。プラスミドｐＴＰｌｃ
１０ （アルハ（Ａｌｂｅｒ）およびカワサキ（Ｋａ
ｗａｓａｋｉ）、Ｊ、Ｍｏｌ。 岨Ｌ」肪虹 」づ４１９−４３４．１９８２’ｌから、
部分的ＢＩ！ｌ ＩＩ消化、再結合、Ｋｐｎ Ｔによ
る消化によって酵ｌ：ＴＰＩプロモーターを除去した。 得られた直線状プラスミド約５０μｇを５単位の１ｉａ
１３１で、３０°Ｃに於て５分間処理した。このＤＮＡ
を、次ＧこＤ Ｎ ＡポリメラーゼＩ（フレナラ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）フラグメント〕で処理して分子の末端を平滑
化した。次に、旧ｎｄ ■リンカーを添加した。 ’ｒＰＩ暗号領域の位置」−４に於てｌ１ｉｎｄ ＩＩ
Ｉリンカ−を含むプラスミドが同定された。このプラス
ミドを１ｌｉｎｄ ｍで切断し、ＢａＬ３１で数秒間消
化し、ＤＮＡポリメラーゼ■ 〔フレナラ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント〕て５［Ｆン骨化した。次に、Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を添加し、このＤ
ＮＡをＢｇｌｌｌおよびＥｃｏ ＴマＩで消化し、Ｔｅ
）ｌプロモーターからなる断片を単離した。この断片を
、ｌ１ｇＩｎおよびＥｃｏ ＲＴで直線状にしであるＹ
Ｒｐ ７ ’ Ｃステインチコム（ＳＬ３ｎｃｈｃｏ
ｍｂ）ら８．木ニーチー１ｙ （Ｎａｔｕｒｅ）２８
２ ： ３９−４３．１９７９）中へ挿入した。 ＴＥ３２と呼ばれる１つのかかるプラスミドは、ＴＰＩ
配列中のおよそ−１４の位置にＥｃｏＲＩリンカ−を含
んでいた。ＴＥ３２をＥｃｏ ＲＩおよびＢａｍ Ｈ］
で切断し、下記配列 へＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧ Ｇ Ｔ Ａ ＣＣＴ ＣＣＴへＧ を有するリンカ−の１０倍過剰と結合させた。得られた
プラスミドをＢａｍ Ｈｌで切断し、再結合させてプラ
スミド’ＴＥＡ３２を生成させた。次に、 。 Ｔ” Ｅへ３２から、約９００塩基対のＢｇｌ Ｈ−Ｂ
ａｍＨ１断片としてＴＰＩプロモーター断片を除去し、
Ｃ１／】のＢａｍ Ｈ１部位中へ挿入した。プラスミド
’ｐＵｃα１を次にＸｂａ Ｉで開裂し プラスミドｐ
ＴＰＪｃ］、ｏ（アルハ（Ａｌｂｅｒ）およびカワサキ
（Ｋａｗａｓａｋｉ）、Ｌ掲〕から得られた、７００塩
基対Ｘｌ〕ａ ｌ −Ｅｃｏ ＲＩ断片のような酵母Ｔ
Ｐ＋４４丁暗号をへＴ配列の下流に挿入した。次に、Ｕ
ｃｏ Ｒ１部位にＥｃｏ ＲＩ −Ｂａｍ Ｈ１合成り
ＮＡアダプターを（＝ｊ加した。得られたプラスミドを
Ｂａｍ Ｈ１で消化してＡＴ暗号配列と′ｒＰ［終了暗
号とからなる１’Ｊ ２１００塩基対の断片を遊離させ
た。ごの断片をＣＩ／１とＴＰＩプロモーターとからな
るプラスミＩ・のＲａｍ ８１部位中へ挿入した。得ら
れたプラスミドをＩ−ｉΔＴ４と名イ」けた。ここに得
た表現ヘククーを酵母株の形質転換に用いて突然変異誘
発蛋白質を表現させた。好ましい酵母株宿主はＧＫｌｏ
ｏ、ＡＴＣＣＮｏ、２０６６９およびＳ、セレ与−ンヱ
舌、 、（、Ｓ、−ｑｑｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ２−７
Ｂ−Δ”ｒ ｃ ｃ 陽２０６８９である。 また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ヘククー、
例えばｙＥｐ １３ Ｃブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら
、ン了イ（堕呼）−８：１２１：１３３．１９７９）、
ｙＲｐ ７ （ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、Ｐｒ
９ｃ、 Ｎａｔ。 知神、−領ｊ、 ｕｓｚ ユｊ２ ： １０３５−−
１’０３９、】９７９）、ＣＩ／１ （上記）、およ
び２μまたはΔ■＜ Ｓ配列を含む他のプラスミドおよ
びそれらの誘導体中へ挿入することもできる。 別法−ζは、該ＡＴ突然変異体配列を宿主の染色体中へ
組込むことによって表現を得ることができる。この場合
には、ＡＴ配列を、適正な方向づけで、適当な転写プロ
モーターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。 酵母中に於ける突然変異体ＡＴ遺伝子の表現のための好
ましいヘククーはＣ１／１誘１ｐＦＡＴＰＱＴ〔第３図
； ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換されたΣ工丸乞旦２グエ
（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ）株Ｅ１８が受入れｌｔ、
２０６９９でＡＴＣＣに寄託されている。ｐＦＡＴＰＯ
Ｔはこの形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって人手
でできる〕である。ヘククーｐＦＡＴＰＯＴはａｍｐ”
、 ＵＥ［１２およびＣ１／１の２μ領域からなり、表
現単位ばＳ９セレビシアエ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）三炭糖燐酸イソメラーゼ（Ｔｌ＋）プロモーター、ｐ
ＵＣα１からの野生型ＡＴ配列、およびＳ、セレビシア
エ 見。 Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｔ Ｐ Ｉ転写終了暗号；お
よび’ｙ ７’ ”ｊソカロミセス・ボンへ（Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）三炭糖燐
酸イソメラーゼ（ＰＯＴＩ）遺伝子からなる。三炭糖燐
酸インメラーゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質転
換させるときは、プラスミト−ヒのＰＯＴＩ遺伝子が宿
主細胞の欠損を補い、冨んだ培地上での成長中、高いコ
ピー数でプラスミ１−を保つことができる。 第３図について説明する。ｐ［Ｉｃα１をＲａｍ Ｈ１
で開裂し、Δ′Ｆ配列からなる約１４００ｂｐ 断片
をケル精製した。この断片を、次にＢａｍ Ｈ１消化Ｍ
１３ｍｐ１．０ （複製型）と適当な方向づりで結
合さ・口て第１表のオリゴヌクレオチドを有する１本鎖
ファージのハイブリタイセーションを可能にし７だ。次
に、Δ′１゛配列を上記のよ・うにして突然変異誘発し
て配列暗号づけＶａ１３５８−Ａ Ｔを生成させた。 次に、複製型Ｄ Ｎ ＡのＩＬａｎ＋ ｊ−１１および
Ｘｂａ Ｉによる消化によってＭｌ、３＝、ククーから
突然変異誘発配列を除フベした。この突然変異体ＡＴ配
列を、Ｂａｍｔｌ ＩおよびＸｂａ Ｉによる消化によ
って直線状乙こしであるｐＱＣ１３中へ挿入した。得ら
れた組換型プラスミド”をｐｔｌＺｃ３７と名付けた。 再び第３１ｍについて説明する。Ｖａ１３Ｓ’ −Ａ
Ｔのだめの酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。 ｐｌＪＺｃ３７から、Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉに
よる消化によりて突然変異体ＡＴ配列を精製した。 ｐＦＡＴＰＯＴから、Ｂａｍ ＨＩおよびＢｇｌ Ｉに
よる消化によって、ＴＰＩプロモーターとａｍｐ’遺伝
子の上流部分とからなる断片を除去し、ケル精製した。 ３゛つの断片を一諸に結合し一大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌ
１）Ｒ１７Ｉ （ＡＴＣＣ３１３４３）の形質転換に
用いた。形質転換体をアンピシリン耐性でスクリーニン
グした。得られたプラスミドをｐＦＡＴＰＯＴ ３７と
名イて１りた。 一ミュ火ヤーｅ ’ｙ ？ Ｉ （Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）株Ｅ１８ 〔アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１
Ｌｕｒｅ Ｃｏｄ］ｅｃｔｉｏｎ）に寄託、受入れ番号
隘２０７４３）をｐＦＡＴＰＯＴ ３７で形質転換し、
培地■ （グルコース６％、酵母エキス２％、硫酸アン
モニウム０．５％）中で定常期まで１晩中成長させ、測
定標準としてヒトα−１抗トリプシン〔シグマ・ケミカ
ル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、））およ
びｐＦＡＴＰＯＴで形質転換した酵母中で生成したＭ（
！ｔ３５８− Ａ Ｔを用い、下記のようにしてエラス
ターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性の生成を測定
した。測定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、カラ
スビーズで細胞を摩砕して作製した。 −酵−７１，１，−、ｌ！Ｌｒ’ニー ）ｊ％Ｌ＋−４
郁ＩＷ’ −Ａ Ｔ （７）表現性ｇ３！ｉＲ−Δ′Ｆ
のための酵母表現ベクターを、ｐＦＡＴｒ’ＯＴ ３７
について記載したようにして作製した。但し突然変異誘
発段階に於てオリゴヌクレオチドΔＴ Ａ ＣＣＣＡ
Ｇ Ｇ Ｔ ＣＴＡ Ｔ ＣＣＣＣを用いた。最終表現
・ベクターをｐＦＡＴＰＯＴ １３６と名付リ ノこ、
Ｓｐ−、ｔｌｚｉ＞７Ｉ（Ｓ、Ｃｅｒｅｙｉｓｉ
ａｅ）株 Ｅ１８をρＦ Ａ ’Ｉ″ＰＯＴ １３６で
形質転換し、下記のようＱこし−ご成長さ一已、測定し
た。結果を第３表に示すつ王−グスタニ束肚吉泄淀 ｐｌ＋８．８の０．２ Ｍ ＋−リス中に１μｇ／ｌｔ
Ｒの豚膵Ｉｌｒλエシスターゼ〔シグマ（Ｓｉ５ｍａ）
）を含む溶液１、 Ｑ ｐ ？をΔ′［゛含有試料２
００μｌに力（Ｉえた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて全容
１ ｍ ｅとし７、混合物を４°Ｃにｈ企て１５分間イ
ンキユヘートした。次に、ｐｌ＋８．８のＯ，／Ｉ Ｍ
ｌ−リス中に１０＋ｎｇ／ｍＲのエラスチンーオルセ
インを含む溶液１ｍｌを加え、混合物を、１５分間隔で
混合しながら３７℃に於て６０分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のＡ３９Ｇを測定した。 ヒトＡＴならびに」二記のようにして作製したＭｅｔ３
５０− Ａ Ｔ、Ｖａｌ”” −Ａ Ｔ 、Δｒｇ１５
８−Ａ Ｔについての測定結果を第３表中に示す。 シップシン阻害砺１生 Ａ′Ｆ含有試料５０ｐｌに、２．５ｍＭ１ｌ（Ｊ！中に
６μｇ ／ ｍ 、ｅのトリプシン〔生膵臓から、シグ
マ（Ｓｉｇ＋ｎａ） ）を含む／ｇ？（１，４０ｐｎを
添加し、ｐＨ８，２の０．４ Ｍ ＋−リノイ０．０２
Ｍ ＣａＣ７＋ ２で容積を５００μｌに調節し、室
温で１０分間インキユヘートした。燐酸塩緩衝食塩水中
１０■／ｍｌｌのアゾコル（＾ｚｏｃｏｌｌ） （カ
ルハイオケム（Ｃ，１１ｂｉｏｃｈｅｍ） ：ｌを含む
溶液１ｒｎｆ２を添加し、混合物を、１０分期間隔で混
合しなから３７°Ｃに於て３０分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のＡＳ２０を測定した。 ヒ） Ａ Ｔならびに上記のようにして作製したＭｅｔ
”” −Ａ Ｔ、Ｖａｌ”ｌｌ−ＡＴ’、八ｒ ｇ ３
Ｓ ８−八Ｔについての測定結果を第３表に示す。 第一−−−−３−、−表 ヒトΔＮ’ ２００ ．１６６ ．０３０
４００ ．３７２ ．０７１＋０
．４８２ ．１７２１ ．５０２
．２４２ ０．１ 、／１６０ ．２１９Ｍ ｅ Ｈ
″Ｓ ′１−八Ｔ ２００ ．
２０７ ．０４５（酵母） ’１０
０ ．３４４ ．０６０１０ ．４
９９ ．１９９１ ．４９８ ．２
３５ ０．１ ．４９７ ．２４０ＶａＲ”−八Ｔ
２００ ．１７５
．１２０（酵母） １．００ ．２
０２ ．１６８１０ ．４９４ ．
１６７１ ．４８７ ．１６６ ０．１．４７７ ．１９４ 八ｒｇ’３ Ｓ ａ−八Ｔ ２００
．４８０ ．０２７（酵母）
１００ ．４８８ ．０１９１０
．４９９ ．１２４１ ．４６
３ ．１６６０．１ ．４７１
．１９１本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵
母細胞の抽出物から免疫吸着によって精製することがで
きる。免疫吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシン
に対する親和性精製抗体を、キュアトレカザス（Ｃｕａ
ｔｒｅｃａｓａｓ）便、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
２４５ ：３０５９．１９７０）の方法に従ってＣＮ
Ｂｒ１性化セフアロースに共有結合させることによって
調製することができる。破壊した細胞を、０．５ＭのＮ
ａＣ７！を含むｐｌ＋７．２の燐酸塩緩衝食塩水３容で
抽出し、抽出液をカラムに適用し、カラムを３ＭＮａ５
ＣＮでン容出した。 本発明の部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、遺伝的
２２−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損な
らびにＡＴの不十分なレヘルまたは患者が野生型へＴと
抗原反応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用
であり得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻
害性肺疾患や成人呼吸困姉症候群のような肺嚢の進行性
消化に関する他の肺疾患を治療することができる。ヘビ
ースモーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫
も治療することができる。嚢胞性線維症や関節炎のよう
な必ずしも肺に関係のない疾患をも治療することかでき
る。アルファ−１−抗トリプシンの総説についてはガデ
ク（Ｇａｄｅｋ） （Ｊ二掲）を参照されたい。 ＡＴの突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸３５
８に於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異から
なる蛋白質は、例えば播種血管向凝固の治療に於て血液
凝固防止のために用いることができる。 本発明の蛋白質は、通常の製剤用担体と混合することが
できる。好ましくは、本発明の蛋白質は、静脈内または
吸入によって投与することができる。 有効投与量は、症状の重度および患者の体重によって異
なるか、本発明の蛋白質を０．５−１０．０ｇ／週の範
の投与量で静脈内投与することが多くの場合有効である
。投与方法が吸入の場合には、上記よりも低い投与量で
有効であり得る。部位特異性突然変異誘発ＡＴが消化管
中ての早期分解を防くためにカプセルまたは被覆担体内
で保護されるならば経口投与も有効であり得る。 本発明の特別な好ましい実施態様につし・で説明したが
、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろう
。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべきも
のである。
Ｄ−１Ｗ−−下記第１表に示すオリゴヌクレオチドを通
常の亜燐酸トリエステル法またはアプライド・ハイオシ
ステＪ・ス・モデル３８０〜八合成装置で合成し７た後
、変１」用ポリアクリルアミドケル」二で精製すること
ができる。このオリゴヌクレオチドは、アミノ酸３５８
のコドンのための適当な誤対合が存在する以外は第１図
に示す野生型ヒト八Ｔのアミノ酸３５６−３ＧＯのため
の暗号づけをする。 ｉｌ−一−−１表 メチオニン（野生型） −ＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴ（
：ＴＡＴＣアラニン へＴＡＣＣＣＧ
ＣＧＴＣＴ／ＩＴｃハ リ ン
へＴＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＣグリ
シン ＡＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＴＣ
フェニルアラニン へＴＡＣＣＣＴＴＣＴＣＴ
ＡＴＣアルギニン へＴ／
ＩｃｃｃＡＧＡＴｃＴＡＴｃＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴ
ＡＴＣＣＣＣリ ジン
へＴＡＣＣＣへへＧＴＣＴＡＴＣ」−記のもの
よりも長いオリゴヌクレオチドを使用できることは言う
までもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第１表中に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが１５−２１ヌクレオチドの範囲でありかつ少
なくともヌクレオチド１１８４−１１９８を含むことか
好ましい。 もう１つのオリゴヌクレオチ１−は第２表に示すように
Ｕ７で作製され、ＡＴ配列中のアミノ酸３４２のための
コドンの周りにほぼ中心を置く配列に対応する。第２表
のオリゴヌクレオチドはアミノ酸３４２のためのコドン
に於ける誤対合を含み、それによってリジンのコドンが
含まれてＺ一対立遺伝子変異体を生しる。 上記、Ｌりも長いオリゴヌクレオチドが利用できること
ば君フまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第２
表に示したものの代わりに他の突然変異体コ１−ンを用
いることができることも言うまでもない。オリゴヌクレ
オチド−は、長さが１５〜２１ヌクレオチドでありかつ
ヌクレオチド１１３５〜１１４９を含むことが好ましい
。 一丈丈ダんムに１天−し勿龜長省劣グ胎金−にに至りた
オリゴヌクレオチドのおのおのを、Ｍ１３の万能プライ
マーのような第２プライマーと一緒に野生型ＡＴ遺伝子
を含む１本鎖組換型Ｍ１３ファージＤＮＡとアニーリン
グさせる。典型的な操作に於ては、２０ｐｍｏｌの燐酸
化Ｚ一対立遺伝子オリゴヌクレオヂトと２０ｐｍｏｌの
Ｍ１３プライマーとをΔＴｃＤＮＡを含む組換型Ｍ１３
ファージ］ ｐｍｏｌと混合し、アニーリングさせた。 このオリゴヌクレオチドを、次にＤＮＡポリメラーゼＩ
Ｃフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕を用いて
延長し、合成鎮の末端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接
合さセた。得られたＤＮＡ分子はＡＴ暗号領域にわたっ
て明らかに二本鎖でありかつＭ１３ヘクター領域にわた
って部分的に１本鎖である。 これらのギャップ付きＤＮＡ環をコンピテント大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ １２ （Ｊ Ｍ １０１ ）中へ
トランスフェクションして細菌ＤＮＡ修復系によってギ
ャップを埋めて活性ファージを作ることができる。 突然変異体骨Ｙの集団は、ファージＤＮＡをニド１′Ｊ
セルＩ」−スフイルターに結合さセて３２ｐでラヘルし
た突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでプローブするプ
ラーク・リフト（ｐｌａｑｕｅ−１ｉｆｔ） ハイブリ
ダイセージコン法〔シラー（Ｚｏｌ Ｉｅｒ）ら、Ｌ掲
〕によって野生型から識別される。本操作の背後にある
原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが野４１−
型クローンとよりも安定な複式を突然変異体クローンと
形成する（野生型クローンとのハイブリダイゼーション
は誤対合を生ずる）ということである。低温に於けるハ
・イブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけがプ
ローブとハイフリソＦを形成するまで洗浄温度を上げる
。典型的には、２３°Ｃの温度でハイブリダイゼーショ
ンを行った後、２３゛Ｃ１３７°Ｃ１５０゛Ｃ１５５°
Ｃで逐次洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを
行うことができる。突然変異体ファージを次に単離し、
再度プレートにまき、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（、
■６＋□□−−□ −ｐｏＶ、−１ｊｊＯｊ、、 −！ 、、４−ｕ、、
： １６１、］、９８３）およびり゛ンガー（ＳａｎＢ
ｅｒ）ら、ＸＰｙ碧ユＮａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
−」Σ酊、ニー↓： ５４．６３．１９７７）のシ
ブオキ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いるシーケンシング（
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって突然変異の存在を証明
することができる。 細菌表現ベクター中への配列に於ける −−」然−弯」（化や堅］し一ニングーー突然変異体Ａ
Ｔ暗号ｗ４域は、複製型のＢａｍ Ｈ１およびＰｓｔ
１による消化によって閉環状ＤＮＡから取除くことがで
きる。突然変異体ＡＴ遺伝子を含む断片を、Ｂａｍ Ｈ
１およびＩ’ｓｔ １消化ヘクタ−Ｍｌ ３Ｔ八Ｃまた
はＭＩ３ｍｐｌＯ中へ挿入することができる。ファージ
Ｍ１３ｍｐｌＯばＰ−Ｌバイオケミカルス（Ｐ −ｒ−
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはヘテスダ・リザーチ
・ラホラトリーズ （ＢｅｔｈｅｓｄｅＲｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている。 得られた構造物は、上述のように大腸菌（旦ユｃｏｌｉ
）Ｋ］２ （ＪＭ１０３）を形質転換させるために用い
ることができる。 ファージＭ］３ｍｐｌＯをＥｃｏ ＲＩおよびＲａｍ
Ｉｌｌで消化してＭ１３ＴＡＣを作製する。得られた付
着末端に、Ｐ−Ｌバイオケミカルス（Ｐ−ＬＢｉｏｃｌ
＋ｅｍｉｃａｌｓ）から購入した、下記構造を有しＡΔ
ＴＴＣΔＴＧＧ、ＡＣ Ｇ Ｔ Ａ ＣＣＴ ＣＣｉ’ Ａ Ｇかつ５個の主燐
酸塩が欠損している合成りＮＡアダプターを結合させて
構造物ｍｐｌｏ八を生成させる。かくして、構造物ｍｐ
ｌＯＡはＡＴ遺伝子のための開始コドンと第１アミノ酸
（Ｇｌｕ）コドンとを、１ゴえるΔ’「ｃ ｃへＧを含
む配列についてのＨｃ、。 １ン１およびＲａｍ Ｔ（］制限部位を含む。ｍｐｌｏ
のもとのＶ、ｃ、ｏ Ｒｌと！１．］ｍ Ｈ１との間の
領域のためのアダプターの置換はランクオペロン解読フ
レームを破壊し、得られた１ランスフエクタントは白色
プラークを！ブ、える。 ヘククーｍｐｌＯＡをＡｖａ ＩＩで消化し、付着末端
をＤＮＡポリメラーゼのフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラ
グメントを用いて埋める。この後でＥｃｏ ＲＩで消化
しかつＳ１ヌクレアーゼを用いて付着末端を除去する。 得られた平滑末端断片がｍｐｌＯＢである。 ｔ’ｒ ｐ−ランクプロモーターからなるＤＮＡ断片を
市販プラスミドｐＤＲ５４０（Ｐ−Ｌハイオヶミカルズ
（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌｓ＞ ）から取り
出す。 このプラスミドｐＤＲ５４０をＨ４ｎｄ ＩＩ＋で切断
し、付着端をフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで
埋める。 配列ＣＣＴＣＧＡＧＧを有するリンカ−をこの平滑末端
に結合し、過剰のリンカ−をＸｈｏｌによる消化によっ
て除去する。得られたｐＤＲ５４０Ｘとして知られてい
る構造物４；ｊ：ｐＤＲ５４０のＨｉ ｎ ｄ ｍ部位
の代わりにＸｈｏ １部位を含む。Ｘｈｏ １およびＢ
ａｍＪ−ＩＩによるρＤＲ５４０Ｘの消化およびそれに
続くフレナラ（Ｋｌｅｎｏｉｙ）フラグメントを用いる
末端の平滑化によってｔｒｐ 〜ランクプロモーター（
ＴＡＣ）とシャインーダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ）配列とを含む断片を得る。ｔｒｐ−ラック
プロモーターを含む上記断片をｍｒ＋１０Ｂ断片中に挿
入してハイブリッドファージｍｐｌＯｃを生成する。ｎ
＋９１０Ｂの平滑化ＡνａＵをＴＡＣ含有断片の平滑化
Ｘｈｏ Ｉへ結合することによって結合部にＸｈｏ １
部位を再生する。ＴＡＣ断片の平滑化Ｂａｍ Ｈ１部位
のｍｐｌ。 Ｂの平滑化Ｅｃｏ ＲＩ末端への結合によってこの結合
部にＮｃｏ １部位（ＣＣＡＴＧＧ）を生しる。断片の
正しい指向は、青色プラークの生成によってスクリーニ
ングすることができる。ファージｍｐｌＯｃは、もとの
Ｂａｍ Ｈ１部位中へのＡＴ遺伝その挿入を容易にする
ために除去されねばならないＡＴＧ開始コドンのに流に
位置する第２ Ｂａｍ Ｈ１を含む。 この異質のＲａｍ Ｈ１部位を除去するため、ｍｐｌ。 ＣをＲａｍ Ｈｉ Ｌこよる２回の消化にか＆Ｊる。第
１の部分的消化の後で、フレナラ （Ｋｌｅｎｏｗ）ポ
リメラーゼによって付着末端を埋め、Ｘｈｏ Ｔで消化
し、アガロースゲル上ご精製する。正しい断片ばＮｃ、
。 】制限部位を含む断片として確認される。ｍｐｌＯＣの
第２のＢａｎ Ｈ，１消化は完了まで行い、付着末端を
フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼを用いて埋め、
（！ −１２Ｐ−ｄＮＴＰ ’ ｓを用いてＢａ１３１
エキソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュ
アリングの監視を容易にする。Ｂａ１．３１エキソヌク
レアーゼにより標識末端から５塩基対を除去し、それに
よっ”ζＢａｍ Ｈ１部位を除去する。プロモーターを
含む配列をＸＩ＋ｏ Ｉで除去し、ゲル精製する０１１
１１１１０とｐ［ｌＲ５４０誘導断片とを一緒に結合し
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ １２ （ＪＭ １０３
） （メソランク、Ｊ、 （Ｍｅｓｓｊ＋Ｂ；、Ｊ、
）ら１９８１ヌクレイノ久二ＬスＵ二叉明、 （Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｊｄｓ Ｒｅｄ、） ９ ： ３０９
、Ｐ−１，ハイオケミカルズ（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）から市販〕中へクローニングし、Ｎｃ
ｏ ＋感受性および青色プラークの生成でスクリーニン
グする。 得られたヘクターはＭ１３’ＦΔＣである。 酢隼もζ於−婁る表現ヘクク〕ｑ之−豆二三２ノー酵母
中に於けるクローニングおよび表現のために、Ｂａｍ
Ｈ１断片のような変異体配列を含む旧３フプージの複製
型から変異体Ａ′Ｆ配列を単離し、Ｂａｍ Ｈ１消化プ
ラスミドＨＡＴｄ中へ挿入することができる。プラスミ
ドＨＡ Ｔ ４は、下記の方法で作られたものである。 プラスミドｐＪＤＢ ２４８〔ヘノグズ（Ｂｅｇｇｓ
） 、ネニ丈？（Ｎａｔｕｒｅ） ２７５ ：１０４−
１０’９、］ ９７８）をＦミｃｏＲＩで部分的に消化
し、ｐＭＢ ９配列を除去した。プラスミドｐＢＲ３２
２（ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ） ら、２二２−（Ｇ
ｅｎｅ） ２ ： ９５ １１３、Ｉ ９７７）をＥｃ
ｏ Ｒ１で開裂し、ｐＭＢ ９配列の代わりに直線状ｐ
ＪＤ８２４８へ接合さ（た。得られたプラスミド−ばＣ
１／１として知られている。プラスミドｐＴＰｌｃ
１０ （アルハ（Ａｌｂｅｒ）およびカワサキ（Ｋａ
ｗａｓａｋｉ）、Ｊ、Ｍｏｌ。 岨Ｌ」肪虹 」づ４１９−４３４．１９８２’ｌから、
部分的ＢＩ！ｌ ＩＩ消化、再結合、Ｋｐｎ Ｔによ
る消化によって酵ｌ：ＴＰＩプロモーターを除去した。 得られた直線状プラスミド約５０μｇを５単位の１ｉａ
１３１で、３０°Ｃに於て５分間処理した。このＤＮＡ
を、次ＧこＤ Ｎ ＡポリメラーゼＩ（フレナラ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）フラグメント〕で処理して分子の末端を平滑
化した。次に、旧ｎｄ ■リンカーを添加した。 ’ｒＰＩ暗号領域の位置」−４に於てｌ１ｉｎｄ ＩＩ
Ｉリンカ−を含むプラスミドが同定された。このプラス
ミドを１ｌｉｎｄ ｍで切断し、ＢａＬ３１で数秒間消
化し、ＤＮＡポリメラーゼ■ 〔フレナラ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント〕て５［Ｆン骨化した。次に、Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を添加し、このＤ
ＮＡをＢｇｌｌｌおよびＥｃｏ ＴマＩで消化し、Ｔｅ
）ｌプロモーターからなる断片を単離した。この断片を
、ｌ１ｇＩｎおよびＥｃｏ ＲＴで直線状にしであるＹ
Ｒｐ ７ ’ Ｃステインチコム（ＳＬ３ｎｃｈｃｏ
ｍｂ）ら８．木ニーチー１ｙ （Ｎａｔｕｒｅ）２８
２ ： ３９−４３．１９７９）中へ挿入した。 ＴＥ３２と呼ばれる１つのかかるプラスミドは、ＴＰＩ
配列中のおよそ−１４の位置にＥｃｏＲＩリンカ−を含
んでいた。ＴＥ３２をＥｃｏ ＲＩおよびＢａｍ Ｈ］
で切断し、下記配列 へＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧ Ｇ Ｔ Ａ ＣＣＴ ＣＣＴへＧ を有するリンカ−の１０倍過剰と結合させた。得られた
プラスミドをＢａｍ Ｈｌで切断し、再結合させてプラ
スミド’ＴＥＡ３２を生成させた。次に、 。 Ｔ” Ｅへ３２から、約９００塩基対のＢｇｌ Ｈ−Ｂ
ａｍＨ１断片としてＴＰＩプロモーター断片を除去し、
Ｃ１／】のＢａｍ Ｈ１部位中へ挿入した。プラスミド
’ｐＵｃα１を次にＸｂａ Ｉで開裂し プラスミドｐ
ＴＰＪｃ］、ｏ（アルハ（Ａｌｂｅｒ）およびカワサキ
（Ｋａｗａｓａｋｉ）、Ｌ掲〕から得られた、７００塩
基対Ｘｌ〕ａ ｌ −Ｅｃｏ ＲＩ断片のような酵母Ｔ
Ｐ＋４４丁暗号をへＴ配列の下流に挿入した。次に、Ｕ
ｃｏ Ｒ１部位にＥｃｏ ＲＩ −Ｂａｍ Ｈ１合成り
ＮＡアダプターを（＝ｊ加した。得られたプラスミドを
Ｂａｍ Ｈ１で消化してＡＴ暗号配列と′ｒＰ［終了暗
号とからなる１’Ｊ ２１００塩基対の断片を遊離させ
た。ごの断片をＣＩ／１とＴＰＩプロモーターとからな
るプラスミＩ・のＲａｍ ８１部位中へ挿入した。得ら
れたプラスミドをＩ−ｉΔＴ４と名イ」けた。ここに得
た表現ヘククーを酵母株の形質転換に用いて突然変異誘
発蛋白質を表現させた。好ましい酵母株宿主はＧＫｌｏ
ｏ、ＡＴＣＣＮｏ、２０６６９およびＳ、セレ与−ンヱ
舌、 、（、Ｓ、−ｑｑｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ２−７
Ｂ−Δ”ｒ ｃ ｃ 陽２０６８９である。 また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ヘククー、
例えばｙＥｐ １３ Ｃブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら
、ン了イ（堕呼）−８：１２１：１３３．１９７９）、
ｙＲｐ ７ （ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、Ｐｒ
９ｃ、 Ｎａｔ。 知神、−領ｊ、 ｕｓｚ ユｊ２ ： １０３５−−
１’０３９、】９７９）、ＣＩ／１ （上記）、およ
び２μまたはΔ■＜ Ｓ配列を含む他のプラスミドおよ
びそれらの誘導体中へ挿入することもできる。 別法−ζは、該ＡＴ突然変異体配列を宿主の染色体中へ
組込むことによって表現を得ることができる。この場合
には、ＡＴ配列を、適正な方向づけで、適当な転写プロ
モーターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。 酵母中に於ける突然変異体ＡＴ遺伝子の表現のための好
ましいヘククーはＣ１／１誘１ｐＦＡＴＰＱＴ〔第３図
； ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換されたΣ工丸乞旦２グエ
（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ）株Ｅ１８が受入れｌｔ、
２０６９９でＡＴＣＣに寄託されている。ｐＦＡＴＰＯ
Ｔはこの形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって人手
でできる〕である。ヘククーｐＦＡＴＰＯＴはａｍｐ”
、 ＵＥ［１２およびＣ１／１の２μ領域からなり、表
現単位ばＳ９セレビシアエ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）三炭糖燐酸イソメラーゼ（Ｔｌ＋）プロモーター、ｐ
ＵＣα１からの野生型ＡＴ配列、およびＳ、セレビシア
エ 見。 Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｔ Ｐ Ｉ転写終了暗号；お
よび’ｙ ７’ ”ｊソカロミセス・ボンへ（Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）三炭糖燐
酸イソメラーゼ（ＰＯＴＩ）遺伝子からなる。三炭糖燐
酸インメラーゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質転
換させるときは、プラスミト−ヒのＰＯＴＩ遺伝子が宿
主細胞の欠損を補い、冨んだ培地上での成長中、高いコ
ピー数でプラスミ１−を保つことができる。 第３図について説明する。ｐ［Ｉｃα１をＲａｍ Ｈ１
で開裂し、Δ′Ｆ配列からなる約１４００ｂｐ 断片
をケル精製した。この断片を、次にＢａｍ Ｈ１消化Ｍ
１３ｍｐ１．０ （複製型）と適当な方向づりで結
合さ・口て第１表のオリゴヌクレオチドを有する１本鎖
ファージのハイブリタイセーションを可能にし７だ。次
に、Δ′１゛配列を上記のよ・うにして突然変異誘発し
て配列暗号づけＶａ１３５８−Ａ Ｔを生成させた。 次に、複製型Ｄ Ｎ ＡのＩＬａｎ＋ ｊ−１１および
Ｘｂａ Ｉによる消化によってＭｌ、３＝、ククーから
突然変異誘発配列を除フベした。この突然変異体ＡＴ配
列を、Ｂａｍｔｌ ＩおよびＸｂａ Ｉによる消化によ
って直線状乙こしであるｐＱＣ１３中へ挿入した。得ら
れた組換型プラスミド”をｐｔｌＺｃ３７と名付けた。 再び第３１ｍについて説明する。Ｖａ１３Ｓ’ −Ａ
Ｔのだめの酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。 ｐｌＪＺｃ３７から、Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉに
よる消化によりて突然変異体ＡＴ配列を精製した。 ｐＦＡＴＰＯＴから、Ｂａｍ ＨＩおよびＢｇｌ Ｉに
よる消化によって、ＴＰＩプロモーターとａｍｐ’遺伝
子の上流部分とからなる断片を除去し、ケル精製した。 ３゛つの断片を一諸に結合し一大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌ
１）Ｒ１７Ｉ （ＡＴＣＣ３１３４３）の形質転換に
用いた。形質転換体をアンピシリン耐性でスクリーニン
グした。得られたプラスミドをｐＦＡＴＰＯＴ ３７と
名イて１りた。 一ミュ火ヤーｅ ’ｙ ？ Ｉ （Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）株Ｅ１８ 〔アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１
Ｌｕｒｅ Ｃｏｄ］ｅｃｔｉｏｎ）に寄託、受入れ番号
隘２０７４３）をｐＦＡＴＰＯＴ ３７で形質転換し、
培地■ （グルコース６％、酵母エキス２％、硫酸アン
モニウム０．５％）中で定常期まで１晩中成長させ、測
定標準としてヒトα−１抗トリプシン〔シグマ・ケミカ
ル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、））およ
びｐＦＡＴＰＯＴで形質転換した酵母中で生成したＭ（
！ｔ３５８− Ａ Ｔを用い、下記のようにしてエラス
ターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性の生成を測定
した。測定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、カラ
スビーズで細胞を摩砕して作製した。 −酵−７１，１，−、ｌ！Ｌｒ’ニー ）ｊ％Ｌ＋−４
郁ＩＷ’ −Ａ Ｔ （７）表現性ｇ３！ｉＲ−Δ′Ｆ
のための酵母表現ベクターを、ｐＦＡＴｒ’ＯＴ ３７
について記載したようにして作製した。但し突然変異誘
発段階に於てオリゴヌクレオチドΔＴ Ａ ＣＣＣＡ
Ｇ Ｇ Ｔ ＣＴＡ Ｔ ＣＣＣＣを用いた。最終表現
・ベクターをｐＦＡＴＰＯＴ １３６と名付リ ノこ、
Ｓｐ−、ｔｌｚｉ＞７Ｉ（Ｓ、Ｃｅｒｅｙｉｓｉ
ａｅ）株 Ｅ１８をρＦ Ａ ’Ｉ″ＰＯＴ １３６で
形質転換し、下記のようＱこし−ご成長さ一已、測定し
た。結果を第３表に示すつ王−グスタニ束肚吉泄淀 ｐｌ＋８．８の０．２ Ｍ ＋−リス中に１μｇ／ｌｔ
Ｒの豚膵Ｉｌｒλエシスターゼ〔シグマ（Ｓｉ５ｍａ）
）を含む溶液１、 Ｑ ｐ ？をΔ′［゛含有試料２
００μｌに力（Ｉえた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて全容
１ ｍ ｅとし７、混合物を４°Ｃにｈ企て１５分間イ
ンキユヘートした。次に、ｐｌ＋８．８のＯ，／Ｉ Ｍ
ｌ−リス中に１０＋ｎｇ／ｍＲのエラスチンーオルセ
インを含む溶液１ｍｌを加え、混合物を、１５分間隔で
混合しながら３７℃に於て６０分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のＡ３９Ｇを測定した。 ヒトＡＴならびに」二記のようにして作製したＭｅｔ３
５０− Ａ Ｔ、Ｖａｌ”” −Ａ Ｔ 、Δｒｇ１５
８−Ａ Ｔについての測定結果を第３表中に示す。 シップシン阻害砺１生 Ａ′Ｆ含有試料５０ｐｌに、２．５ｍＭ１ｌ（Ｊ！中に
６μｇ ／ ｍ 、ｅのトリプシン〔生膵臓から、シグ
マ（Ｓｉｇ＋ｎａ） ）を含む／ｇ？（１，４０ｐｎを
添加し、ｐＨ８，２の０．４ Ｍ ＋−リノイ０．０２
Ｍ ＣａＣ７＋ ２で容積を５００μｌに調節し、室
温で１０分間インキユヘートした。燐酸塩緩衝食塩水中
１０■／ｍｌｌのアゾコル（＾ｚｏｃｏｌｌ） （カ
ルハイオケム（Ｃ，１１ｂｉｏｃｈｅｍ） ：ｌを含む
溶液１ｒｎｆ２を添加し、混合物を、１０分期間隔で混
合しなから３７°Ｃに於て３０分間インキユヘートした
。混合物を遠心分離し、上澄液のＡＳ２０を測定した。 ヒ） Ａ Ｔならびに上記のようにして作製したＭｅｔ
”” −Ａ Ｔ、Ｖａｌ”ｌｌ−ＡＴ’、八ｒ ｇ ３
Ｓ ８−八Ｔについての測定結果を第３表に示す。 第一−−−−３−、−表 ヒトΔＮ’ ２００ ．１６６ ．０３０
４００ ．３７２ ．０７１＋０
．４８２ ．１７２１ ．５０２
．２４２ ０．１ 、／１６０ ．２１９Ｍ ｅ Ｈ
″Ｓ ′１−八Ｔ ２００ ．
２０７ ．０４５（酵母） ’１０
０ ．３４４ ．０６０１０ ．４
９９ ．１９９１ ．４９８ ．２
３５ ０．１ ．４９７ ．２４０ＶａＲ”−八Ｔ
２００ ．１７５
．１２０（酵母） １．００ ．２
０２ ．１６８１０ ．４９４ ．
１６７１ ．４８７ ．１６６ ０．１．４７７ ．１９４ 八ｒｇ’３ Ｓ ａ−八Ｔ ２００
．４８０ ．０２７（酵母）
１００ ．４８８ ．０１９１０
．４９９ ．１２４１ ．４６
３ ．１６６０．１ ．４７１
．１９１本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵
母細胞の抽出物から免疫吸着によって精製することがで
きる。免疫吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシン
に対する親和性精製抗体を、キュアトレカザス（Ｃｕａ
ｔｒｅｃａｓａｓ）便、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
２４５ ：３０５９．１９７０）の方法に従ってＣＮ
Ｂｒ１性化セフアロースに共有結合させることによって
調製することができる。破壊した細胞を、０．５ＭのＮ
ａＣ７！を含むｐｌ＋７．２の燐酸塩緩衝食塩水３容で
抽出し、抽出液をカラムに適用し、カラムを３ＭＮａ５
ＣＮでン容出した。 本発明の部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、遺伝的
２２−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損な
らびにＡＴの不十分なレヘルまたは患者が野生型へＴと
抗原反応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用
であり得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻
害性肺疾患や成人呼吸困姉症候群のような肺嚢の進行性
消化に関する他の肺疾患を治療することができる。ヘビ
ースモーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫
も治療することができる。嚢胞性線維症や関節炎のよう
な必ずしも肺に関係のない疾患をも治療することかでき
る。アルファ−１−抗トリプシンの総説についてはガデ
ク（Ｇａｄｅｋ） （Ｊ二掲）を参照されたい。 ＡＴの突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸３５
８に於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異から
なる蛋白質は、例えば播種血管向凝固の治療に於て血液
凝固防止のために用いることができる。 本発明の蛋白質は、通常の製剤用担体と混合することが
できる。好ましくは、本発明の蛋白質は、静脈内または
吸入によって投与することができる。 有効投与量は、症状の重度および患者の体重によって異
なるか、本発明の蛋白質を０．５−１０．０ｇ／週の範
の投与量で静脈内投与することが多くの場合有効である
。投与方法が吸入の場合には、上記よりも低い投与量で
有効であり得る。部位特異性突然変異誘発ＡＴが消化管
中ての早期分解を防くためにカプセルまたは被覆担体内
で保護されるならば経口投与も有効であり得る。 本発明の特別な好ましい実施態様につし・で説明したが
、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろう
。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべきも
のである。
第１Ａ図および第１Ｂ図は、ヒトアルファ−１−抗トリ
プシンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのＩ）
ＮＡおよびアミノ酸配列であり、第２図はラックＺ遺伝
子の開始に於ける多重制限部位からなるｐＵｃ１３のＤ
ＮＡ配列であり、第３図は突然変異体Ｖａｌ”Ｂ−ＡＴ
配列を含むヘクターｐＦＡＴＰＯＴ ３７の作製のため
のスキー１、である。
プシンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのＩ）
ＮＡおよびアミノ酸配列であり、第２図はラックＺ遺伝
子の開始に於ける多重制限部位からなるｐＵｃ１３のＤ
ＮＡ配列であり、第３図は突然変異体Ｖａｌ”Ｂ−ＡＴ
配列を含むヘクターｐＦＡＴＰＯＴ ３７の作製のため
のスキー１、である。
Claims (18)
- （１）少なくとも１個の突然変異コドンを含む構造遺伝
子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−１−抗トリ
プシンの突然変異体のための暗号づけをしているＤＮＡ
構造物。 - （２）該突然変異コドンが哺乳類のアルファ−１−抗ト
リプシンの位置３５８に於てアミノ酸置換をもたらすコ
ドン３５８である特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮ
Ａ構造物。 - （３）該突然変異コドンが哺乳類のアルファ−１−抗ト
リプシンの位置３４２に於てグルタミン酸のリジンによ
る置換をもたらすコドン３４２である特許請求の範囲第
（１）項記載のＤＮＡ構造物。 - （４）位置３５８に於てアラニンをもたらす特許請求の
範囲第（２）項記載のＤＮＡ構造物。 - （５）位置３５８に於てバリンをもたらす特許請求の範
囲第（２）項記載のＤＮＡ構造物。 - （６）位置３５８に於てグリシンをもたらす特許請求の
範囲第（２）項記載のＤＮＡ構造物。 - （７）位置３５８に於てフェニルアラニンをもたらす特
許請求の範囲第（２）項記載のＤＮＡ構造物。 - （８）位置３５８に於てアルギニンをもたらす特許請求
の範囲第（２）項記載のＤＮＡ構造物。 - （９）位置３５８に於てリジンをもたらす特許請求の範
囲第（２）項記載のＤＮＡ構造物。 - （１０）少なくとも１個の突然変異コドンを含む構造遺
伝子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−１−抗ト
リプシンの突然変異体形のための暗号づけをしているＤ
ＮＡ構造物によって宿主微生物を形質転換させる工程で
あって、該構造物が該宿主微生物中で複製能力がある形
質転換工程からなる哺乳類のアルファ−１−抗トリプシ
ンの突然変異体形の表現方法。 - （１１）該突然変異コドンがコドン３５８でありかつ該
突然変異体形がＡｒｇ＾３＾５＾８−アルファ−１−抗
トリプシンである特許請求の範囲第（１０）項記載の方
法。 - （１２）哺乳類類のアルファ−１−抗トリプシンの突然
変異体アミノ酸配列からなる実質的に純粋な蛋白質。 - （１３）哺乳類のアルファ−１−抗トリプシンの優勢形
に対して上昇したアンチトロンビン活性を特徴とする特
許請求の範囲第（１１）項記載の方法によって生成され
る実質的に純粋な蛋白質。 - （１４）Ｘ＾３＾５＾８−アルファ−１−抗トリプシン
（ここでＸはアラニンまたはバリンまたはグリシンまた
はフェニルアラニンまたはアルギニンまたはリジンであ
る）のためのヒト構造遺伝子のために暗号づけする閉環
状ＤＮＡ分子の生成方法であって、 Ａ）野生型ヒトアルファ−１−抗トリプシンのための構
造遺伝子の暗号配列または相補物からなる環状１本鎖ｃ
ＤＮＡを作製する工程と、Ｂ）該１本鎖ｃＤＮＡに（１
）該１本鎖ＤＮＡのセグメントに相補的であることと該
野生型アルファ−１−抗トリプシンの位置３５８に於け
るアミノ酸に対応するコドン誤対合を含みかつ該誤対合
がアラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニル
アラニンまたはアルギニンまたはリジンのためのコドン
からなることを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと
（２）プライマーとをアニーリングさせる工程と、Ｃ）
該オリゴヌクレオチドとプライマーとを延長する工程と
、 Ｄ）該延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーとの
末端を結合してギャップつき環状２本鎖ＤＮＡ分子を生
成させる工程と、 Ｅ）該ギャップつき環状２本鎖ＤＮＡを宿主微生物中へ
トランスフェクションしてヒトＸ＾３＾５＾８−アルフ
ァ−１−抗トリプシンのための暗号づけをする該構造遺
伝子からなる該閉環状 ＤＮＡ分子を生成させる工程と からなる閉環状ＤＮＡ分子の生成方法。 - （１５）Ａ）野生型ヒトアルファ−１−抗トリプシンの
ための構造遺伝子の暗号配列または相補物からなる環状
１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製する工程と、 Ｂ）該１本鎖ＤＮＡを、（１）該１本鎖ＤＮＡのセグメ
ントに相補的であることと該野生型アルファ−１−抗ト
リプシンの位置３４２に於けるアミノ酸に対応するコド
ン誤対合を含みかつ該誤対合がリジンのためのコドンか
らなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと
（２）プライマーとにアニーリングさせる工程と、 Ｃ）該オリゴヌクレオチドとプライマーとを延長させる
工程と、 Ｄ）該延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーとの
末端を結合させてギャップつき環状２本鎖ＤＮＡ分子を
生成させる工程と、 Ｅ）該２本鎖ギャップつき環状ＤＮＡを宿主微生物中へ
トランスフェクションしてヒトＺ−対立遺伝子アルファ
−１−抗トリプシン変異体のための暗号づけをする該遺
伝子からなる閉環状ＤＮＡ分子を生成させる工程と からなるヒトＺ−対立遺伝子アルファ−１−抗トリプシ
ン変異体のための構造遺伝子のための暗号づけをする閉
環状ＤＮＡの生成方法。 - （１６）Ｘ＾３＾５＾８−アルファ−１−抗トリプシン
（ここでＸはアニリンまたはバリンまたはグリシンまた
はフェニルアラニンまたはアルギニンまたはリジンであ
る）のアミノ酸配列からなる実質的に純粋な蛋白質。 - （１７）ヒトリジン＾３＾４＾２−１−アルファ−１−
抗トリプシンのアミノ酸配列からなる実質的に純粋な蛋
白質。 - （１８）特許請求の範囲第（１２）項または第（１３）
項または第（１６）項または第（１７）項のいずれか１
項に記載の実質的にグリコシル化されていない蛋白質。
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|---|---|---|---|
| US58941084A | 1984-03-14 | 1984-03-14 | |
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| US06/709,382 US4711848A (en) | 1984-03-14 | 1985-03-07 | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
| US709382 | 1985-03-07 |
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| JP5115129A Expired - Fee Related JP2750257B2 (ja) | 1984-03-14 | 1993-04-06 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
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| JP5115129A Expired - Fee Related JP2750257B2 (ja) | 1984-03-14 | 1993-04-06 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
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| AU (1) | AU593766B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341219C (ja) |
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