JPH10113193A - アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 - Google Patents
アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発Info
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- JPH10113193A JPH10113193A JP9275648A JP27564897A JPH10113193A JP H10113193 A JPH10113193 A JP H10113193A JP 9275648 A JP9275648 A JP 9275648A JP 27564897 A JP27564897 A JP 27564897A JP H10113193 A JPH10113193 A JP H10113193A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】アルファ−１−抗トリプシンの位置３５８のア
ミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されている突
然変異体及びそれを含む医薬組成物を提供すること。 【解決手段】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体；それを産生する細胞；それを含有する
遺伝的抗トリプシン欠損症、肺気腫及び／又は肺嚢の進
行性消化に関連する他の肺疾患、嚢胞性線維症、又は関
節炎の処置のための医薬組成物。
ミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されている突
然変異体及びそれを含む医薬組成物を提供すること。 【解決手段】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体；それを産生する細胞；それを含有する
遺伝的抗トリプシン欠損症、肺気腫及び／又は肺嚢の進
行性消化に関連する他の肺疾患、嚢胞性線維症、又は関
節炎の処置のための医薬組成物。
Description
【０００１】本発明は突然変異誘発遺伝子の作製および
微生物中に於けるその構造蛋白質の表現に関する。特
に、本発明は突然変異誘発ヒトアルファ−１−抗トリプ
シン遺伝子の作製およびアルファ−１−抗トリプシンの
部位特異性突然異性体の表現に関する。アルファ−１−
抗トリプシン（以下ＡＴと略称する）はプロテァーゼ阻
害剤であり、その主な機能は広スペクトルプロテアーゼ
であるエラスターゼを阻害することである。哺乳類の肺
組織はエラスターゼに特に侵されやすいので、ＡＴの欠
乏または不活性化は肺組織および弾性の損失およびそれ
に続く気腫を生ずる可能性がある。ＡＴ活性の損失また
は減少はタバコの煙を含む環境汚染物質によるＡＴの酸
化の結果であり得る。ガデク、ジェームズ E.(Gadek,Ja
mes E.) およびR.D.クリスタル(R.D.Crystal),“アルフ
ァ−１−抗トリプシン欠損(Alpha−１−Antitrypsin De
ficiency) ”、ザ・メタボリック・ベーシス・オブ・イ
ンヘライテッド・ディジーズ(The Metabolic Basis of
Inherited Disease), スタンバリー、J.B.(Stanbury,J.
B.) ら編、マグロー・ヒル、ニューョーク（１９８８）
pp.１４５０−１４６７およびキャロル(Carroll) ら、
ネーチャー(Nature)２９８８、３２９−３３４（１９８
２）参照。
微生物中に於けるその構造蛋白質の表現に関する。特
に、本発明は突然変異誘発ヒトアルファ−１−抗トリプ
シン遺伝子の作製およびアルファ−１−抗トリプシンの
部位特異性突然異性体の表現に関する。アルファ−１−
抗トリプシン（以下ＡＴと略称する）はプロテァーゼ阻
害剤であり、その主な機能は広スペクトルプロテアーゼ
であるエラスターゼを阻害することである。哺乳類の肺
組織はエラスターゼに特に侵されやすいので、ＡＴの欠
乏または不活性化は肺組織および弾性の損失およびそれ
に続く気腫を生ずる可能性がある。ＡＴ活性の損失また
は減少はタバコの煙を含む環境汚染物質によるＡＴの酸
化の結果であり得る。ガデク、ジェームズ E.(Gadek,Ja
mes E.) およびR.D.クリスタル(R.D.Crystal),“アルフ
ァ−１−抗トリプシン欠損(Alpha−１−Antitrypsin De
ficiency) ”、ザ・メタボリック・ベーシス・オブ・イ
ンヘライテッド・ディジーズ(The Metabolic Basis of
Inherited Disease), スタンバリー、J.B.(Stanbury,J.
B.) ら編、マグロー・ヒル、ニューョーク（１９８８）
pp.１４５０−１４６７およびキャロル(Carroll) ら、
ネーチャー(Nature)２９８８、３２９−３３４（１９８
２）参照。
【０００２】オウエン(Owen)ら(New Eng.J.Med. ３０
９： ６９４−６９８、１９８３）は、患者がアミノ酸
位置３５８に於けるメチオニンの代わりにアルギニンを
置換したアルファ−１−抗トリプシンの突然変異体形を
生成する条件を記載している。遺伝子配列中の単点突然
変異（ＡＴＧ→ＡＧＧ）の結果として、アルファ−１−
抗トリプシンはエラスターゼ阻害剤としてのその正常な
機能からトロンビン阻害剤の機能へ変化した。この機能
変化は野生型ＡＴとアンチトロンビンIII との間の構造
の３０％相同から生じる。（キャロル(Carroll) ら、同
上をも参照のこと）。これらの発見は、ＡＴの変化形が
例えば播種血管内凝固の治療に於けるような血液凝固防
止に用いるために臨床的に重要となり得ることを示す。
蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安
定性の増強をもたらし得る野生型ヒトＡＴの変化形を作
製することは望ましいことである。ＡＴに於ける遺伝的
欠損にかかっている患者に投与するための、かかる患者
と免疫学的により相容性である野生型ＡＴの変化形を作
製することも望ましいことであろう。増加したアンチト
ロンビン活性を有するＡＴの変化形を作製することも望
ましいことであろう。
９： ６９４−６９８、１９８３）は、患者がアミノ酸
位置３５８に於けるメチオニンの代わりにアルギニンを
置換したアルファ−１−抗トリプシンの突然変異体形を
生成する条件を記載している。遺伝子配列中の単点突然
変異（ＡＴＧ→ＡＧＧ）の結果として、アルファ−１−
抗トリプシンはエラスターゼ阻害剤としてのその正常な
機能からトロンビン阻害剤の機能へ変化した。この機能
変化は野生型ＡＴとアンチトロンビンIII との間の構造
の３０％相同から生じる。（キャロル(Carroll) ら、同
上をも参照のこと）。これらの発見は、ＡＴの変化形が
例えば播種血管内凝固の治療に於けるような血液凝固防
止に用いるために臨床的に重要となり得ることを示す。
蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安
定性の増強をもたらし得る野生型ヒトＡＴの変化形を作
製することは望ましいことである。ＡＴに於ける遺伝的
欠損にかかっている患者に投与するための、かかる患者
と免疫学的により相容性である野生型ＡＴの変化形を作
製することも望ましいことであろう。増加したアンチト
ロンビン活性を有するＡＴの変化形を作製することも望
ましいことであろう。
【０００３】従って、本発明の１つの目的は野生型ヒト
ＡＴの部位特異性突然変異誘発の作製方法を提供するこ
とである。本発明のもう１つの目的は突然変異誘発ＡＴ
のための暗号づけをする構造遺伝子からなる表現ベクタ
ーを提供することである。本発明のもう１つの目的は部
位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質を提供することであ
る。本発明は部位特異性突然変異誘発ＡＴのための構造
遺伝子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉環
状ＤＮＡの生成方法を提供する。特に、本発明は(a) 野
生型ＡＴのための構造遺伝子の暗号配列またはその相補
物からなる環状１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製する工程と、
(b) かかる１本鎖ＤＮＡに、(1) かかる１本鎖ＤＮＡの
セグメント相補的であることと野生型ＡＴの位置３５８
に於けるアミノ酸に対応するコドンに於て１つまたは２
つ以上の誤対合を含みかつ該誤対合がアラニンまたはバ
リンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアル
ギニンまたはリジンのためのコドンの１つからなること
とを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと(2) Ｍ１３
のための万能プライマーのようなプライマーとをアニー
リングさせる工程と、(c) 該オリゴヌクレオチドとプラ
イマーとを酵素的に延長する工程と、(d) 延長されたオ
リゴヌクレオチドとプライマーとの末端を一緒に結合し
てギャップつき環状２本鎖ＤＮＡ分子を生成させる工程
と、(e) 該２本鎖ギャップ付き環状ＤＮＡ分子を大腸菌
(E.coli)中へトランスフェクションしてヒトＸ358 −Ａ
Ｔのための構造遺伝子を含む閉環状ＤＮＡ分子を生成さ
せかつプラークハイブリダイゼーションのためのプロー
ブとしての突然変異体オリゴヌクレオチドでスクリーニ
ング後、突然変異体ＤＮＡを分離する工程とからなるヒ
トＸ358 −ＡＴ（ここでＸはアラニンまたはバリンまた
はグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギニンま
たはリジンである）のための構造遺伝子のための暗号づ
けをする１本鎖または２本鎖閉環状ＤＮＡの生成方法を
提供する。
ＡＴの部位特異性突然変異誘発の作製方法を提供するこ
とである。本発明のもう１つの目的は突然変異誘発ＡＴ
のための暗号づけをする構造遺伝子からなる表現ベクタ
ーを提供することである。本発明のもう１つの目的は部
位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質を提供することであ
る。本発明は部位特異性突然変異誘発ＡＴのための構造
遺伝子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉環
状ＤＮＡの生成方法を提供する。特に、本発明は(a) 野
生型ＡＴのための構造遺伝子の暗号配列またはその相補
物からなる環状１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製する工程と、
(b) かかる１本鎖ＤＮＡに、(1) かかる１本鎖ＤＮＡの
セグメント相補的であることと野生型ＡＴの位置３５８
に於けるアミノ酸に対応するコドンに於て１つまたは２
つ以上の誤対合を含みかつ該誤対合がアラニンまたはバ
リンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアル
ギニンまたはリジンのためのコドンの１つからなること
とを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと(2) Ｍ１３
のための万能プライマーのようなプライマーとをアニー
リングさせる工程と、(c) 該オリゴヌクレオチドとプラ
イマーとを酵素的に延長する工程と、(d) 延長されたオ
リゴヌクレオチドとプライマーとの末端を一緒に結合し
てギャップつき環状２本鎖ＤＮＡ分子を生成させる工程
と、(e) 該２本鎖ギャップ付き環状ＤＮＡ分子を大腸菌
(E.coli)中へトランスフェクションしてヒトＸ358 −Ａ
Ｔのための構造遺伝子を含む閉環状ＤＮＡ分子を生成さ
せかつプラークハイブリダイゼーションのためのプロー
ブとしての突然変異体オリゴヌクレオチドでスクリーニ
ング後、突然変異体ＤＮＡを分離する工程とからなるヒ
トＸ358 −ＡＴ（ここでＸはアラニンまたはバリンまた
はグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギニンま
たはリジンである）のための構造遺伝子のための暗号づ
けをする１本鎖または２本鎖閉環状ＤＮＡの生成方法を
提供する。
【０００４】同様の方法によって、ＡＴのＺ−対立遺伝
子としても知られているヒトLys342−ＡＴの構造遺伝子
からなる閉環状ＤＮＡ分子を作製することができる。本
発明の方法は３４２と３５８の両方の位置ならびに他の
位置に於て突然変異誘発されたＡＴの作製にも利用する
ことができる。本発明は突然変異誘発ＡＴのための構造
遺伝子からなるＤＮＡ構造物およびクローニングベクタ
ーおよび突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的
に純粋な部位特異性突然変異誘発ＡＴをも提供する。図
１について説明すると、この図には野生型ＡＴの優勢形
の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示してある。位置３
５６−３６０に於けるアミノ酸からなるＡＴの活性部位
はメチオニン残基を含む。位置３５８に於ける残基はタ
バコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されるとき酸
化を受けやすい。かかる酸化はＡＴの生物学的活性を減
少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘発に
より、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニンま
たはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまた
はアルギニンまたはリジンで置換して、より安定なＡＴ
の形を生成させることができる。
子としても知られているヒトLys342−ＡＴの構造遺伝子
からなる閉環状ＤＮＡ分子を作製することができる。本
発明の方法は３４２と３５８の両方の位置ならびに他の
位置に於て突然変異誘発されたＡＴの作製にも利用する
ことができる。本発明は突然変異誘発ＡＴのための構造
遺伝子からなるＤＮＡ構造物およびクローニングベクタ
ーおよび突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的
に純粋な部位特異性突然変異誘発ＡＴをも提供する。図
１について説明すると、この図には野生型ＡＴの優勢形
の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示してある。位置３
５６−３６０に於けるアミノ酸からなるＡＴの活性部位
はメチオニン残基を含む。位置３５８に於ける残基はタ
バコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されるとき酸
化を受けやすい。かかる酸化はＡＴの生物学的活性を減
少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘発に
より、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニンま
たはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまた
はアルギニンまたはリジンで置換して、より安定なＡＴ
の形を生成させることができる。
【０００５】さらに、遺伝的ＡＴ欠損の１つはＺ−対立
遺伝子変異体として知られている異常形の生成である。
図１について言うと、この突然変異はアミノ酸位置３４
２に於けるグルタミン酸のリジンによる置換によって示
される。Ｚ−対立遺伝子変異体に対して同型接合性の個
人は、明らかに肝臓に於ける処理妨害のために正常レベ
ルの約１５％のＡＴを生成する。このことは肝臓中にＡ
Ｔの未熟形の蓄積を生じ、これに対応して血漿の該阻害
剤レベルが減少する。この状態をもつ個人の８０％まで
は慢性の肺および（または）肝臓疾患で死に至ると考え
られている。Ｚ−対立遺伝子変異体蛋白質自体は野生型
蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性を有することは注目す
べきである。かかる個人のＡＴレベルは野生型ＡＴの静
脈内投与によって増強することができる〔ガデク(Gade
k) ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーション(Journal of Clinical Investigation ６
８，１１５８−１１６５（１９８１）参照〕。しかし、
野生型蛋白質はこれらの患者にとって異種であるので、
幾人かのＺＺ個人は野生型蛋白質にアレルギーになると
期待され得る。かくして、本発明はある種のＡＴ欠損患
者に於て非免疫原となり得るＺ−対立遺伝子変異体の生
成方法を提供する。
遺伝子変異体として知られている異常形の生成である。
図１について言うと、この突然変異はアミノ酸位置３４
２に於けるグルタミン酸のリジンによる置換によって示
される。Ｚ−対立遺伝子変異体に対して同型接合性の個
人は、明らかに肝臓に於ける処理妨害のために正常レベ
ルの約１５％のＡＴを生成する。このことは肝臓中にＡ
Ｔの未熟形の蓄積を生じ、これに対応して血漿の該阻害
剤レベルが減少する。この状態をもつ個人の８０％まで
は慢性の肺および（または）肝臓疾患で死に至ると考え
られている。Ｚ−対立遺伝子変異体蛋白質自体は野生型
蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性を有することは注目す
べきである。かかる個人のＡＴレベルは野生型ＡＴの静
脈内投与によって増強することができる〔ガデク(Gade
k) ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーション(Journal of Clinical Investigation ６
８，１１５８−１１６５（１９８１）参照〕。しかし、
野生型蛋白質はこれらの患者にとって異種であるので、
幾人かのＺＺ個人は野生型蛋白質にアレルギーになると
期待され得る。かくして、本発明はある種のＡＴ欠損患
者に於て非免疫原となり得るＺ−対立遺伝子変異体の生
成方法を提供する。
【０００６】抗トロンビン活性を有することが示されて
いるArg358−ＡＴは血液凝固阻止に有用でもあり得る。
天然産アンチトロンビンIII は、通常、体内で血液凝固
を調節する働きがある。アンチトロンビンIII は播種血
管内凝固の治療のため〔ガスナー(Gassner) ら、Wien.
Klin. Wochenschr. ９１：５１−５３、１９７９；およ
びヘルグレン(Hellgren),M. 他、Gynecol. Obstet. I
nvest.１６：１０７−１１８、１９８３〕、および他の
症状の治療に於てヘパリンの代替物として〔バーンハー
ト(Bernhardt),W.およびノバコバ- バネット(Novakova-
Banet),A.,Ric.Clin. Lab. １３：６１−６６、１９８
３〕用いられて来た。特に、本発明は野生型ヒトＡＴ遺
伝子のｃＤＮＡまたはその相補物からなる１本鎖ＤＮＡ
鋳型の作製に関する。突然変異させようとするコドンに
於て１個または２個以上の誤対合を含む直線状オリゴヌ
クレオチドプライマーを、突然変異誘発部位の５′側に
アニーリングする第２プライマーと一緒に鋳型ヘアニー
リングさせる。好ましい第２プライマーは市販されてお
りかつＭ１３ベクター中のラック (lac) Ｚ遺伝子へハ
イブリダイゼーションするＭ１３の万能プライマーであ
る〔メッシング(Messing),Meth. in Enzymology １０
１：２０−７７、１９８３〕。該オリゴヌクレオチドを
延長しかつ末端に於て結合させて２本鎖ギャップつき環
状ＤＮＡを得る。この２本鎖ＤＮＡを用いて宿主微生物
大腸菌(E.coli)をトランスフェクションし、突然変異体
および野生型ＤＮＡ分子の混合物を含む集団をもたら
す。突然変異体ＤＮＡオリゴヌクレオチドをプローブと
して用いるプラークハイブリダイゼーションによって突
然変異体ＤＮＡ分子を選択する。このＤＮＡをシーケン
シング(sequenced) し、変化したコドンの存在を証明し
た後、適当な表現ベクター中へクローニングすることが
できる。突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、細菌または酵母あ
るいは他の原核類または真正核類中で表現させることが
できる。
いるArg358−ＡＴは血液凝固阻止に有用でもあり得る。
天然産アンチトロンビンIII は、通常、体内で血液凝固
を調節する働きがある。アンチトロンビンIII は播種血
管内凝固の治療のため〔ガスナー(Gassner) ら、Wien.
Klin. Wochenschr. ９１：５１−５３、１９７９；およ
びヘルグレン(Hellgren),M. 他、Gynecol. Obstet. I
nvest.１６：１０７−１１８、１９８３〕、および他の
症状の治療に於てヘパリンの代替物として〔バーンハー
ト(Bernhardt),W.およびノバコバ- バネット(Novakova-
Banet),A.,Ric.Clin. Lab. １３：６１−６６、１９８
３〕用いられて来た。特に、本発明は野生型ヒトＡＴ遺
伝子のｃＤＮＡまたはその相補物からなる１本鎖ＤＮＡ
鋳型の作製に関する。突然変異させようとするコドンに
於て１個または２個以上の誤対合を含む直線状オリゴヌ
クレオチドプライマーを、突然変異誘発部位の５′側に
アニーリングする第２プライマーと一緒に鋳型ヘアニー
リングさせる。好ましい第２プライマーは市販されてお
りかつＭ１３ベクター中のラック (lac) Ｚ遺伝子へハ
イブリダイゼーションするＭ１３の万能プライマーであ
る〔メッシング(Messing),Meth. in Enzymology １０
１：２０−７７、１９８３〕。該オリゴヌクレオチドを
延長しかつ末端に於て結合させて２本鎖ギャップつき環
状ＤＮＡを得る。この２本鎖ＤＮＡを用いて宿主微生物
大腸菌(E.coli)をトランスフェクションし、突然変異体
および野生型ＤＮＡ分子の混合物を含む集団をもたら
す。突然変異体ＤＮＡオリゴヌクレオチドをプローブと
して用いるプラークハイブリダイゼーションによって突
然変異体ＤＮＡ分子を選択する。このＤＮＡをシーケン
シング(sequenced) し、変化したコドンの存在を証明し
た後、適当な表現ベクター中へクローニングすることが
できる。突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、細菌または酵母あ
るいは他の原核類または真正核類中で表現させることが
できる。
【０００７】本明細書中で使用する“ＤＮＡ構造物”、
“ベクター”、“プラスミド”という用語は、ヒトの介
在によって変性されているＤＮＡ分子あるいはかく変性
されている分子のクローンであるＤＮＡ分子であって、
そうでなければ天然には存在しない方法で結合させかつ
配列させたＤＮＡのセグメントを含むＤＮＡ分子を構成
する。本明細書中で使用する“表現ベクター”という用
語は、宿主生物中へ形質転換させるときそれ自体の複製
を保証する遺伝情報と宿主生物中で表現されるべき少な
くとも１つの遺伝子ならびに転写の開始、翻訳の開始、
プロモーター領域およびある場合には読み終り領域のた
めの部位のような、表現が起こるために必要となり得る
他の制御機能を含むＤＮＡ構造物である。“表現”とい
う用語は、通常の用途に於ては、宿主生物中に存在する
遺伝子によって暗号づけされる蛋白質生成物がある生物
によって合成される条件を意味すると定義される。“ギ
ャップつき”という用語は、実質的に２本鎖であるが１
本鎖領域を含むＤＮＡ分子を意味する。
“ベクター”、“プラスミド”という用語は、ヒトの介
在によって変性されているＤＮＡ分子あるいはかく変性
されている分子のクローンであるＤＮＡ分子であって、
そうでなければ天然には存在しない方法で結合させかつ
配列させたＤＮＡのセグメントを含むＤＮＡ分子を構成
する。本明細書中で使用する“表現ベクター”という用
語は、宿主生物中へ形質転換させるときそれ自体の複製
を保証する遺伝情報と宿主生物中で表現されるべき少な
くとも１つの遺伝子ならびに転写の開始、翻訳の開始、
プロモーター領域およびある場合には読み終り領域のた
めの部位のような、表現が起こるために必要となり得る
他の制御機能を含むＤＮＡ構造物である。“表現”とい
う用語は、通常の用途に於ては、宿主生物中に存在する
遺伝子によって暗号づけされる蛋白質生成物がある生物
によって合成される条件を意味すると定義される。“ギ
ャップつき”という用語は、実質的に２本鎖であるが１
本鎖領域を含むＤＮＡ分子を意味する。
【０００８】物質および方法 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。Ｍ１３宿
主株、万能プライマーおよびベクターはベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratori
es) から得た。制限エンドヌクレファーゼは、ベテスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories) 、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ne
w England BioLobs)、ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals) か
ら得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌細胞の
形質転換、ＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレナウ(Klenow)断
片）を用いるＤＮＡ断片の平滑化(blunting)方法、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いるＤＮＡ断片の接合方法を含む一
般的クローニング方法はマニアテイス（Maniatis）らが
記載している〔モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A. Labor
atory Manual) 、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、１９８
２〕。
主株、万能プライマーおよびベクターはベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratori
es) から得た。制限エンドヌクレファーゼは、ベテスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories) 、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ne
w England BioLobs)、ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals) か
ら得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌細胞の
形質転換、ＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレナウ(Klenow)断
片）を用いるＤＮＡ断片の平滑化(blunting)方法、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いるＤＮＡ断片の接合方法を含む一
般的クローニング方法はマニアテイス（Maniatis）らが
記載している〔モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A. Labor
atory Manual) 、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、１９８
２〕。
【０００９】一般的な部位特異性突然変異誘発方法は、
ゾラー、マークJ.(Zoller,Mark J.)およびM.スミス(M.
Smith)著、“Ｍ１３誘導ベクター中ヘクローニングされ
たＤＮＡ断片のオリゴヌクレオチド指示突然変異誘発
（Oligonuclestide Directed Mutagenesis of DNA Frag
ments Cloned Into M13 Derived Vectors)”、マニュア
・フォー・アドバンスト・テクニックス・イン・モレキ
ュラー・クローニング・コース（Manual for Advenced
Techniquse in Molecular Cloning Course) 、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harber Laboratory)、１９８３年に記載されている。野
生型ＡＴ中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリゴ
ヌクレオチドは、ビューケージ（Beaucage) およびカル
サーズ（Caruthers)、テトラヘドロン・レターズ(Tetra
bedron Letters) ２２：１８５９−１８６２、１９８１
およびマッテウチ（Matteucci)およびカルーサーズ(Car
uthers) 、J.Am.Chem.Soc.１０３：３１３８（１９８
１）に一般的に記載されている亜燐酸トリエステル法に
より、マッテウチ（Matteucci)およびカルーサーズ（Ca
ruthers)、テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Let
ters) ２１：７１９−７２２（１９８０）に記載されて
いるようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド・バイオシステムズ・モデル
３８０−ＡＤＮＡ合成装置のような機械によって、オリ
ゴヌクレオチドを合成することができる。合成されたオ
リゴヌクレオチドは、変性用ゲル上でのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製することができる。オリ
ゴヌクレオチドは、５′−端に於て、（ガンマ）32Ｐ−
ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化
され得る。オリゴヌクレオチド配列の検定はマクサム(M
axam）およびギルバート（Gilbert)法、メソド・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 、６５：５
７（１９８０）で行うことができる。
ゾラー、マークJ.(Zoller,Mark J.)およびM.スミス(M.
Smith)著、“Ｍ１３誘導ベクター中ヘクローニングされ
たＤＮＡ断片のオリゴヌクレオチド指示突然変異誘発
（Oligonuclestide Directed Mutagenesis of DNA Frag
ments Cloned Into M13 Derived Vectors)”、マニュア
・フォー・アドバンスト・テクニックス・イン・モレキ
ュラー・クローニング・コース（Manual for Advenced
Techniquse in Molecular Cloning Course) 、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harber Laboratory)、１９８３年に記載されている。野
生型ＡＴ中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリゴ
ヌクレオチドは、ビューケージ（Beaucage) およびカル
サーズ（Caruthers)、テトラヘドロン・レターズ(Tetra
bedron Letters) ２２：１８５９−１８６２、１９８１
およびマッテウチ（Matteucci)およびカルーサーズ(Car
uthers) 、J.Am.Chem.Soc.１０３：３１３８（１９８
１）に一般的に記載されている亜燐酸トリエステル法に
より、マッテウチ（Matteucci)およびカルーサーズ（Ca
ruthers)、テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Let
ters) ２１：７１９−７２２（１９８０）に記載されて
いるようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド・バイオシステムズ・モデル
３８０−ＡＤＮＡ合成装置のような機械によって、オリ
ゴヌクレオチドを合成することができる。合成されたオ
リゴヌクレオチドは、変性用ゲル上でのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製することができる。オリ
ゴヌクレオチドは、５′−端に於て、（ガンマ）32Ｐ−
ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化
され得る。オリゴヌクレオチド配列の検定はマクサム(M
axam）およびギルバート（Gilbert)法、メソド・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 、６５：５
７（１９８０）で行うことができる。
【００１０】野生型アルファ−１−抗トリプシン遺伝子
からなる１本鎖ＤＮＡの作製 ヒトＡＴの優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、Ｄ
ＮＡハイブリダイゼージョンプローブとしてバブーン配
列を用いる常法〔クラチ(Kurachi）ら、Proc.Nat. Aca
d. Sci. USA,７８、６８２０−８３０（１９８０）：お
よびチャンドラ（Chandra)ら、Biocham. Biophys. Res.
Com.,１０３、７５１−７５８（１９８１）〕によって
ヒト肝臓 cDNA ライブラリーから単離することができ
る。ＡＴ遺伝子は１４４６bp Pst 1 断片として単離さ
れ、Pst 1 消化プラスミドpUC １３〔ビエイラ(Vieira)
ら、ジーン(Gene)、１９、２５９−２６８（１９８２）
記載の方法で作製、但しlac Ｚ遺伝子に於ける開始に於
て図３に示す多重制限部位を含む〕中へ挿入されてＡＴ
遺伝子の３′側のポリリンカー中にBam Ｈ１部位を含む
組換型プラスミドpUC α1 を与える。プラスミドpUC α
1 はBam Ｈ１で消化されてＡＴ配列を得る。１３２０bp
Bam Ｈ１断片を次にＭ１３mp１０中に結合し〔メッシ
ング(Messing、メソド・イン・エンザイモロジー(Metho
ds in Enzymology）１０１：２０−７７（１９８
３）〕、得られた組換型ファージを用いて大腸菌（E.co
li) Ｋ１２（ＪＭ１０３）をトランスフェクションす
る。ＡＴ遺伝子を含む１本鎖閉環状ＤＮＡを、次にゾラ
ー（Zoller) およびスミス(Smith) の方法（上掲）で単
離する。
からなる１本鎖ＤＮＡの作製 ヒトＡＴの優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、Ｄ
ＮＡハイブリダイゼージョンプローブとしてバブーン配
列を用いる常法〔クラチ(Kurachi）ら、Proc.Nat. Aca
d. Sci. USA,７８、６８２０−８３０（１９８０）：お
よびチャンドラ（Chandra)ら、Biocham. Biophys. Res.
Com.,１０３、７５１−７５８（１９８１）〕によって
ヒト肝臓 cDNA ライブラリーから単離することができ
る。ＡＴ遺伝子は１４４６bp Pst 1 断片として単離さ
れ、Pst 1 消化プラスミドpUC １３〔ビエイラ(Vieira)
ら、ジーン(Gene)、１９、２５９−２６８（１９８２）
記載の方法で作製、但しlac Ｚ遺伝子に於ける開始に於
て図３に示す多重制限部位を含む〕中へ挿入されてＡＴ
遺伝子の３′側のポリリンカー中にBam Ｈ１部位を含む
組換型プラスミドpUC α1 を与える。プラスミドpUC α
1 はBam Ｈ１で消化されてＡＴ配列を得る。１３２０bp
Bam Ｈ１断片を次にＭ１３mp１０中に結合し〔メッシ
ング(Messing、メソド・イン・エンザイモロジー(Metho
ds in Enzymology）１０１：２０−７７（１９８
３）〕、得られた組換型ファージを用いて大腸菌（E.co
li) Ｋ１２（ＪＭ１０３）をトランスフェクションす
る。ＡＴ遺伝子を含む１本鎖閉環状ＤＮＡを、次にゾラ
ー（Zoller) およびスミス(Smith) の方法（上掲）で単
離する。
【００１１】野生型ＡＴ中の配列から１つ以上の塩基変
化を含むオリゴヌクレオチドの作製 下記表１に示すオリゴヌクレオチドを通常の亜燐酸トリ
エステル法またはアプライド・バイオシステムズ・モデ
ル３８０−Ａ合成装置で合成した後、変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製することができる。このオリゴヌ
クレオチドは、アミノ酸３５８のコドンのための適当な
誤対合が存在する以外は図１に示す野生型ヒトＡＴのア
ミノ酸３５６−３６０のための暗号づけをする。
化を含むオリゴヌクレオチドの作製 下記表１に示すオリゴヌクレオチドを通常の亜燐酸トリ
エステル法またはアプライド・バイオシステムズ・モデ
ル３８０−Ａ合成装置で合成した後、変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製することができる。このオリゴヌ
クレオチドは、アミノ酸３５８のコドンのための適当な
誤対合が存在する以外は図１に示す野生型ヒトＡＴのア
ミノ酸３５６−３６０のための暗号づけをする。
【００１２】
【表１】 表１ 活性部位突然変異誘発 アミノ酸３５８ ヌクレオチド１１８４−１１９８のための オリゴヌクレオチド メチオニン（野生型） ATACCC ATGTCTATC アラニン ATACCC GCGTCTATC バリン ATACCC GTGTCTATC グリシン ATACCC GGGTCTATC フェニルアラニン ATACCC TTCTCTATC アルギニン ATACCC AGATCTATC ATACCC AGGTCTATCCCC リジン ATACCC AAGTCTATC 上記のものよりも長いオリゴヌクレオチドを使用できる
ことは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、
表１中に示したものの代わりに他の突然変異体コドンを
用いることができることも言うまでもない。オリゴヌク
レオチドは、長さが１５−２１ヌクレオチドの範囲であ
りかつ少なくともヌクレオチド１１８４−１１９８を含
むことが好ましい。
ことは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、
表１中に示したものの代わりに他の突然変異体コドンを
用いることができることも言うまでもない。オリゴヌク
レオチドは、長さが１５−２１ヌクレオチドの範囲であ
りかつ少なくともヌクレオチド１１８４−１１９８を含
むことが好ましい。
【００１３】もう１つのオリゴヌクレオチドは第２表に
示すようにして作製され、ＡＴ配列中のアミノ酸３４２
のためのコドンの周りにほぼ中心を置く配列に対応す
る。表２のオリゴヌクレオチドはアミノ酸３４２のため
のコドンに於ける誤対合を含み、それによってリジンの
コドンが含まれているＺ−対立遺伝子変異体を生じる。
示すようにして作製され、ＡＴ配列中のアミノ酸３４２
のためのコドンの周りにほぼ中心を置く配列に対応す
る。表２のオリゴヌクレオチドはアミノ酸３４２のため
のコドンに於ける誤対合を含み、それによってリジンの
コドンが含まれているＺ−対立遺伝子変異体を生じる。
【００１４】
【表２】 表２ Ｚ−対立遺伝子変異体部位突然変異誘発 ヌクレオチド１１３５−１１４９アミノ酸３４２突然変異 のためのオリゴヌクレオチド リジン CATCGACAAGAAAGG 上記よりも長いオリゴヌクレオチドが利用できることは
言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、表２に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが１５−２１ヌクレオチドでありかつヌクレオ
チド１１３５−１１４９を含むことが好ましい。
言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、表２に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが１５−２１ヌクレオチドでありかつヌクレオ
チド１１３５−１１４９を含むことが好ましい。
【００１５】オリゴヌクレオチドの延長および結合 上に挙げたオリゴヌクレオチドのおのおのを、Ｍ１３の
万能プライマーのような第２プライマーと一緒に野生型
ＡＴ遺伝子を含む１本鎖組換型Ｍ１３ファージＤＮＡと
アニーリングさせる。典型的な操作に於ては、２０pmol
の燐酸化Ｚ−対立遺伝子オリゴヌクレオチドと２０pmol
のＭ１３プライマーとをＡＴｃＤＮＡを含む組換型Ｍ１
３ファージ１pmolと混合し、アニーリングさせた。この
オリゴヌクレオチドを、次にＤＮＡポリメラーゼＩ〔ク
レナウ(Klenow)フグラメント〕を用いて延長し、合成鎖
の末端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接合させた。得ら
れたＤＮＡ分子はＡＴ暗号領域にわたって明らかに二本
鎖でありかつＭ１３ベクター領域にわたって部分的に１
本鎖である。これらのギャップ付きＤＮＡ環をコンピテ
ント大腸菌（E.coli) Ｋ１２（ＪＭ１０１）中へトラン
スフェクションして細菌ＤＮＡ修復系によってギャップ
を埋めて活性ファージを作ることができる。突然変異体
分子の集団は、ファージＤＮＡをニトロセルロースフィ
ルターに結合させて32Ｐでラベルした突然変異誘発性オ
リゴヌクレオチドでプローブするプラーク・リフト（pl
aque-lift)ハイブリダイゼーション法〔ゾラ−(Zoller)
ら、上掲〕によって野生型から識別される。本操作の背
後にある原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが
野生型クローンとよりも安定な二重鎖を突然変異体クロ
ーンと形成する（野生型クローンとのハイブリダイゼー
ションは誤対合を生ずる）ということである。低温に於
けるハイブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけ
がプローブとハイブリッドを形成するまで洗浄温度を上
げる。典型的には、２３℃の温度でハイブリダイゼーシ
ョンを行った後、２３℃、３７℃、５０℃、５５℃で逐
次洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを行うこ
とができる。突然変異体ファージを次に単離し、再度プ
レートにまき、サンガー(Sanger)ら、 (J. Mol. Biol.
１４３：１６１、１９８３）およびサンガー(Sanger)
ら、（Proc. Nat. Acad. Sci. USA., ７４：５４６３、
１９７７）のジデオキシ（dideoxy)法を用いるシーケン
シング（Sequencing) によって突然変異の存在を証明す
ることができる。
万能プライマーのような第２プライマーと一緒に野生型
ＡＴ遺伝子を含む１本鎖組換型Ｍ１３ファージＤＮＡと
アニーリングさせる。典型的な操作に於ては、２０pmol
の燐酸化Ｚ−対立遺伝子オリゴヌクレオチドと２０pmol
のＭ１３プライマーとをＡＴｃＤＮＡを含む組換型Ｍ１
３ファージ１pmolと混合し、アニーリングさせた。この
オリゴヌクレオチドを、次にＤＮＡポリメラーゼＩ〔ク
レナウ(Klenow)フグラメント〕を用いて延長し、合成鎖
の末端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接合させた。得ら
れたＤＮＡ分子はＡＴ暗号領域にわたって明らかに二本
鎖でありかつＭ１３ベクター領域にわたって部分的に１
本鎖である。これらのギャップ付きＤＮＡ環をコンピテ
ント大腸菌（E.coli) Ｋ１２（ＪＭ１０１）中へトラン
スフェクションして細菌ＤＮＡ修復系によってギャップ
を埋めて活性ファージを作ることができる。突然変異体
分子の集団は、ファージＤＮＡをニトロセルロースフィ
ルターに結合させて32Ｐでラベルした突然変異誘発性オ
リゴヌクレオチドでプローブするプラーク・リフト（pl
aque-lift)ハイブリダイゼーション法〔ゾラ−(Zoller)
ら、上掲〕によって野生型から識別される。本操作の背
後にある原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが
野生型クローンとよりも安定な二重鎖を突然変異体クロ
ーンと形成する（野生型クローンとのハイブリダイゼー
ションは誤対合を生ずる）ということである。低温に於
けるハイブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけ
がプローブとハイブリッドを形成するまで洗浄温度を上
げる。典型的には、２３℃の温度でハイブリダイゼーシ
ョンを行った後、２３℃、３７℃、５０℃、５５℃で逐
次洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを行うこ
とができる。突然変異体ファージを次に単離し、再度プ
レートにまき、サンガー(Sanger)ら、 (J. Mol. Biol.
１４３：１６１、１９８３）およびサンガー(Sanger)
ら、（Proc. Nat. Acad. Sci. USA., ７４：５４６３、
１９７７）のジデオキシ（dideoxy)法を用いるシーケン
シング（Sequencing) によって突然変異の存在を証明す
ることができる。
【００１６】細菌表現ベクター中への配列に於ける突然
変異体のクローニング 突然変異体ＡＴ暗号領域は、複製型のBam Ｈ１およびPs
t １による消化によって閉環状ＤＮＡから取除くことが
できる。突然変異体ＡＴ遺伝子を含む断片を、Bam Ｈ１
およびPst １消化ベクターＭ１３ＴＡＣまたはＭ１３mp
１０中へ挿入することができる。ファージＭ１３ mp １
０はＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−ＬBiochemicals）ま
たはベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesde R
esearch Laboratories）から市販されている。得られた
構造物は、上述のように大腸菌（E.coli) Ｋ１２（ＪＭ
１０３）を形質転換させるために用いることができる。
ファージＭ１３mp１０をEco ＲＩおよびBam Ｈ１で消化
してＭ１３ＴＡＣを作製する。得られた付着末端に、Ｐ
−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals)から購
入した、下記構造を有し、かつ５個の主燐酸塩が欠損し
ている合成ＤＮＡアダプターを結合させて構造物mp１０
Ａを生成させる。
変異体のクローニング 突然変異体ＡＴ暗号領域は、複製型のBam Ｈ１およびPs
t １による消化によって閉環状ＤＮＡから取除くことが
できる。突然変異体ＡＴ遺伝子を含む断片を、Bam Ｈ１
およびPst １消化ベクターＭ１３ＴＡＣまたはＭ１３mp
１０中へ挿入することができる。ファージＭ１３ mp １
０はＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−ＬBiochemicals）ま
たはベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesde R
esearch Laboratories）から市販されている。得られた
構造物は、上述のように大腸菌（E.coli) Ｋ１２（ＪＭ
１０３）を形質転換させるために用いることができる。
ファージＭ１３mp１０をEco ＲＩおよびBam Ｈ１で消化
してＭ１３ＴＡＣを作製する。得られた付着末端に、Ｐ
−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals)から購
入した、下記構造を有し、かつ５個の主燐酸塩が欠損し
ている合成ＤＮＡアダプターを結合させて構造物mp１０
Ａを生成させる。
【００１７】 かくして、構造物mp１０ＡはＡＴ遺伝子のための開始コ
ドンと第１アミノ酸（Glu)コドンとを与えるＡＴＧＧＡ
Ｇを含む配列についてのEco ＲＩおよびBam Ｈ１制限部
位を含む。mp１０のもとのEco ＲＩとBam Ｈ１との間の
領域のためのアダプターの置換はラックオペロン解読フ
レームを破壊し、得られたトランスフェクタントは白色
プラークを与える。ベクターmp１０ＡをAva IIで消化
し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼのクレナウ(Klenow)
フラグメントを用いて埋める。この後でEco ＲＩで消化
しかつＳ１ヌクレアーゼを用いて付着末端を除去する。
得られた平滑末端断片がmp１０Ｂである。
ドンと第１アミノ酸（Glu)コドンとを与えるＡＴＧＧＡ
Ｇを含む配列についてのEco ＲＩおよびBam Ｈ１制限部
位を含む。mp１０のもとのEco ＲＩとBam Ｈ１との間の
領域のためのアダプターの置換はラックオペロン解読フ
レームを破壊し、得られたトランスフェクタントは白色
プラークを与える。ベクターmp１０ＡをAva IIで消化
し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼのクレナウ(Klenow)
フラグメントを用いて埋める。この後でEco ＲＩで消化
しかつＳ１ヌクレアーゼを用いて付着末端を除去する。
得られた平滑末端断片がmp１０Ｂである。
【００１８】trp −ラックプロモーターからなるＤＮＡ
断片を市販プラスミドpDR ５４０〔Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals) 〕から取り出す。このプ
ラスミドpDR ５４０をHind IIIで切断し、付着端をクレ
ナウ(Klenow)ポリメラーゼで埋める。配列ＣＣＴＣＧＡ
ＧＧを有するリンカーをこの平滑末端に結合し、過剰の
リンカーをXho Ｉによる消化によって除去する。得られ
たpDR ５４０Ｘとして知られている構造物はpDR ５４０
のHind III部位の代わりにXho Ｉ部位を含む。Xho Ｉ部
位およびBam Ｈ１によるpDR ５４０Ｘの消化およびそれ
に続くクレナウ(Klenow)フラグメントを用いる末端の平
滑化によってtrp −ラックプロモーター（ＴＡＣ）とシ
ャイン−ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列とを含む断片
を得る。trp −ラックプロモーターを含む上記断片をmp
１０Ｂ断片中に挿入してハイブリッドファージmp１０Ｃ
を生成する。mp１０Ｂの平滑化Ava IIをＴＡＣ含有断片
の平滑化Xho Ｉへ結合することによって結合部にXho Ｉ
部位を再生する。ＴＡＣ断片の平滑化Bam Ｈ１部位のmp
１０Ｂの平滑化Eco ＲＩ末端への結合によってこの結合
部にNco Ｉ部位（CCATGG）を生じる。断片の正しい指向
は、青色プラークの生成によってスクリーニングするこ
とができる。ファージmp１０Ｃは、もとのBam Ｈ１部位
中へのＡＴ遺伝子の挿入を容易にするために除去されね
ばならないＡＴＧ開始コドンの上流に位置する第２Bam
Ｈ１を含む。この異質のBam Ｈ１部位を除去するため、
mp１０ＣをBam Ｈ１による２回の消化にかける。第１の
部分的消化の後で、クレナウ(Klenow)ポリメラーゼによ
って付着末端を埋め、Xho Ｉで消化し、アガロースゲル
上で精製する。正しい断片はNco Ｉ制限部位を含む断片
として確認される。mp１０Ｃの第２のBam Ｈ１消化は完
了まで行い、付着末端をクレナウ(Klenow)ポリメラーゼ
を用いて埋め、α−32Ｐ−dNTP′s を用いてBal３１エ
キソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュア
リングの監視を容易にする。Bal ３１エキソヌクレアー
ゼにより標識末端から５塩基対を除去し、それによって
Bam Ｈ１部位を除去する。プロモーターを含む配列をXh
o Ｉで除去し、ゲル精製する。mp１０とpDR ５４０誘導
断片とを一緒に結合し、大腸菌（E.coli) Ｋ１２（ＪＭ
１０３）〔メッシング、J.(Messing,J.)ら１９８１ヌク
レイック・アシド・Res.(Nucleic Acids Res.)９：３０
９、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals）
から市販〕中へクローニングし、Nco I 感受性および青
色プラークの生成でスクリーニングする。得られたベク
ターはＭ１３ＴＡＣである。
断片を市販プラスミドpDR ５４０〔Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals) 〕から取り出す。このプ
ラスミドpDR ５４０をHind IIIで切断し、付着端をクレ
ナウ(Klenow)ポリメラーゼで埋める。配列ＣＣＴＣＧＡ
ＧＧを有するリンカーをこの平滑末端に結合し、過剰の
リンカーをXho Ｉによる消化によって除去する。得られ
たpDR ５４０Ｘとして知られている構造物はpDR ５４０
のHind III部位の代わりにXho Ｉ部位を含む。Xho Ｉ部
位およびBam Ｈ１によるpDR ５４０Ｘの消化およびそれ
に続くクレナウ(Klenow)フラグメントを用いる末端の平
滑化によってtrp −ラックプロモーター（ＴＡＣ）とシ
ャイン−ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列とを含む断片
を得る。trp −ラックプロモーターを含む上記断片をmp
１０Ｂ断片中に挿入してハイブリッドファージmp１０Ｃ
を生成する。mp１０Ｂの平滑化Ava IIをＴＡＣ含有断片
の平滑化Xho Ｉへ結合することによって結合部にXho Ｉ
部位を再生する。ＴＡＣ断片の平滑化Bam Ｈ１部位のmp
１０Ｂの平滑化Eco ＲＩ末端への結合によってこの結合
部にNco Ｉ部位（CCATGG）を生じる。断片の正しい指向
は、青色プラークの生成によってスクリーニングするこ
とができる。ファージmp１０Ｃは、もとのBam Ｈ１部位
中へのＡＴ遺伝子の挿入を容易にするために除去されね
ばならないＡＴＧ開始コドンの上流に位置する第２Bam
Ｈ１を含む。この異質のBam Ｈ１部位を除去するため、
mp１０ＣをBam Ｈ１による２回の消化にかける。第１の
部分的消化の後で、クレナウ(Klenow)ポリメラーゼによ
って付着末端を埋め、Xho Ｉで消化し、アガロースゲル
上で精製する。正しい断片はNco Ｉ制限部位を含む断片
として確認される。mp１０Ｃの第２のBam Ｈ１消化は完
了まで行い、付着末端をクレナウ(Klenow)ポリメラーゼ
を用いて埋め、α−32Ｐ−dNTP′s を用いてBal３１エ
キソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュア
リングの監視を容易にする。Bal ３１エキソヌクレアー
ゼにより標識末端から５塩基対を除去し、それによって
Bam Ｈ１部位を除去する。プロモーターを含む配列をXh
o Ｉで除去し、ゲル精製する。mp１０とpDR ５４０誘導
断片とを一緒に結合し、大腸菌（E.coli) Ｋ１２（ＪＭ
１０３）〔メッシング、J.(Messing,J.)ら１９８１ヌク
レイック・アシド・Res.(Nucleic Acids Res.)９：３０
９、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals）
から市販〕中へクローニングし、Nco I 感受性および青
色プラークの生成でスクリーニングする。得られたベク
ターはＭ１３ＴＡＣである。
【００１９】酵母中に於ける表現ベクターのクローニン
グ 酵母中に於けるクローニングおよび表現のために、Bam
Ｈ１断片のような変異体配列を含むＭ１３ファージの複
製型から変異体ＡＴ配列を単離し、Bam Ｈ１消化プラス
ミドＨＡＴ４中へ挿入することができる。プラスミドＨ
ＡＴ４は、下記の方法で作られたものである。プラスミ
ドpJDB ２４８〔ベッグズ(Beggs) 、ネーチャー(Natur
e)２７５：１０４−１０９、１９７８）をEco ＲＩで部
分的に消化し、pMB ９配列を除去した。プラスミドpBR
３２２〔ボリバー（Bolivar)ら、ジーン(Gene)２：９５
−１１３、１９７７〕をEco ＲＩで開裂し、pMB ９配列
の代わりに直線状pJDB248 へ接合させた。得られたプラ
スミドはＣ１／１として知られている。プラスミドpTPI
C １０〔アルバー（Alber)およびカワサキ(Kawasaki)、
J.Mol.App. Genet １：４１９−４３４、１９８２〕か
ら、部分的Bgl II消化、再結合、Kpn I による消化によ
って酵母ＴＰＩプロモーターを除去した。得られた直線
状プラスミド約５０μｇを５単位のBal ３１で、３０℃
に於て５分間処理した。このＤＮＡを、次にＤＮＡポリ
メラーゼＩ〔クレナウ（Klenow) フラグメント] で処理
して分子の末端を平滑化した。次に、Hind IIIリンカー
を添加した。ＴＰＩ暗号領域の位置＋４に於てHind III
リンカーを含むプラスミドが同定された。このプラスミ
ドをHind IIIで切断し、Bal ３１で数秒間消化し、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klenow) フラグメント]
で平滑化した。次に、Eco ＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣ）を添加し、このＤＮＡをBgl IIおよびEcoＲＩで
消化し、ＴＰＩプロモーターからなる断片を単離した。
この断片を、BglIIおよびEco ＲＩで直線状にしてあるY
Rp ７’〔スティンチコム（Stinchcomb)ら、ネーチャー
(Nature)２８２：３９−４３、１９７９〕中に挿入し
た。ＴＥ３２と呼ばれる１つのかかるプラスミドは、Ｔ
ＰＩ配列中のおよそ−１４の位置にEcoＲＩリンカーを
含んでいた。ＴＥ３２をEco ＲＩおよびBam Ｈ１で切断
し、下記配列を有するリンカーの１０倍過剰と結合させ
た。
グ 酵母中に於けるクローニングおよび表現のために、Bam
Ｈ１断片のような変異体配列を含むＭ１３ファージの複
製型から変異体ＡＴ配列を単離し、Bam Ｈ１消化プラス
ミドＨＡＴ４中へ挿入することができる。プラスミドＨ
ＡＴ４は、下記の方法で作られたものである。プラスミ
ドpJDB ２４８〔ベッグズ(Beggs) 、ネーチャー(Natur
e)２７５：１０４−１０９、１９７８）をEco ＲＩで部
分的に消化し、pMB ９配列を除去した。プラスミドpBR
３２２〔ボリバー（Bolivar)ら、ジーン(Gene)２：９５
−１１３、１９７７〕をEco ＲＩで開裂し、pMB ９配列
の代わりに直線状pJDB248 へ接合させた。得られたプラ
スミドはＣ１／１として知られている。プラスミドpTPI
C １０〔アルバー（Alber)およびカワサキ(Kawasaki)、
J.Mol.App. Genet １：４１９−４３４、１９８２〕か
ら、部分的Bgl II消化、再結合、Kpn I による消化によ
って酵母ＴＰＩプロモーターを除去した。得られた直線
状プラスミド約５０μｇを５単位のBal ３１で、３０℃
に於て５分間処理した。このＤＮＡを、次にＤＮＡポリ
メラーゼＩ〔クレナウ（Klenow) フラグメント] で処理
して分子の末端を平滑化した。次に、Hind IIIリンカー
を添加した。ＴＰＩ暗号領域の位置＋４に於てHind III
リンカーを含むプラスミドが同定された。このプラスミ
ドをHind IIIで切断し、Bal ３１で数秒間消化し、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klenow) フラグメント]
で平滑化した。次に、Eco ＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣ）を添加し、このＤＮＡをBgl IIおよびEcoＲＩで
消化し、ＴＰＩプロモーターからなる断片を単離した。
この断片を、BglIIおよびEco ＲＩで直線状にしてあるY
Rp ７’〔スティンチコム（Stinchcomb)ら、ネーチャー
(Nature)２８２：３９−４３、１９７９〕中に挿入し
た。ＴＥ３２と呼ばれる１つのかかるプラスミドは、Ｔ
ＰＩ配列中のおよそ−１４の位置にEcoＲＩリンカーを
含んでいた。ＴＥ３２をEco ＲＩおよびBam Ｈ１で切断
し、下記配列を有するリンカーの１０倍過剰と結合させ
た。
【００２０】 得られたプラスミドをBam Ｈ１で切断し、再結合させて
プラスミドＴＥＡ３２を生成させた。次に、ＴＥＡ３２
から、約９００塩基対のBal II−Bam Ｈ１断片としてＴ
ＰＩプロモーター断片を除去し、Ｃ１／１のBam Ｈ１部
位中へ挿入した。プラスミドpUC α 1を次にXba I で開
裂し、プラスミド pＴＰＩＣ１０〔アルバー（Alber)お
よびカワサキ(Kawasaki)、上掲〕から得られた、７００
塩基対Xba I −Eco ＲＩ断片のような酵母ＴＰＩ終了暗
号をＡＴ配列の下流に挿入した。次に、Eco RI部位にEc
o ＲＩ−Bam Ｈ１合成ＤＮＡアダプターを付加した。得
られたプラスミドをBam Ｈ１で消化してＡＴ暗号配列と
ＴＰＩ終了暗号とからなる約２１００塩基対の断片を遊
離させた。この断片をＣ１／１とＴＰＩプロモーターと
からなるプラスミドのBam Ｈ１部位中へ挿入した。得ら
れたプラスミドをＨＡＴ４と名付けた。ここに得た表現
ベクターを酵母株の形質転換に用いて突然変異誘発蛋白
質を表現させた。好ましい酵母株宿主はＧＫ１００、Ａ
ＴＣＣNo２０６６９およびＳ．セレビシアエ（S.Cerevi
siae) 株Ｅ２−７Ｂ、ＡＴＣＣ No.２０６８９である。
プラスミドＴＥＡ３２を生成させた。次に、ＴＥＡ３２
から、約９００塩基対のBal II−Bam Ｈ１断片としてＴ
ＰＩプロモーター断片を除去し、Ｃ１／１のBam Ｈ１部
位中へ挿入した。プラスミドpUC α 1を次にXba I で開
裂し、プラスミド pＴＰＩＣ１０〔アルバー（Alber)お
よびカワサキ(Kawasaki)、上掲〕から得られた、７００
塩基対Xba I −Eco ＲＩ断片のような酵母ＴＰＩ終了暗
号をＡＴ配列の下流に挿入した。次に、Eco RI部位にEc
o ＲＩ−Bam Ｈ１合成ＤＮＡアダプターを付加した。得
られたプラスミドをBam Ｈ１で消化してＡＴ暗号配列と
ＴＰＩ終了暗号とからなる約２１００塩基対の断片を遊
離させた。この断片をＣ１／１とＴＰＩプロモーターと
からなるプラスミドのBam Ｈ１部位中へ挿入した。得ら
れたプラスミドをＨＡＴ４と名付けた。ここに得た表現
ベクターを酵母株の形質転換に用いて突然変異誘発蛋白
質を表現させた。好ましい酵母株宿主はＧＫ１００、Ａ
ＴＣＣNo２０６６９およびＳ．セレビシアエ（S.Cerevi
siae) 株Ｅ２−７Ｂ、ＡＴＣＣ No.２０６８９である。
【００２１】また、この突然変異体配列は、他の酵母表
現ベクター、例えばYEp １３〔ブローチ（Broach) ら、
ジーン(Gene)８：１２１：１３３、１９７９〕、YRp ７
〔ストルール(Struhl)ら、Proc.Nat. Acad． Sci. USA
７６：１０３５−１０３９、１９７９〕、Ｃ１／１
（上記）、および２μまたはＡＲＳ配列を含む他のプラ
スミドおよびそれらの誘導体中へ挿入することもでき
る。別法では、該ＡＴ突然変異体配列を宿主の染色体中
へ組込むことによって表現を得ることができる。この場
合には、ＡＴ配列を、適正な方向づけで、適当な転写プ
ロモーターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。
現ベクター、例えばYEp １３〔ブローチ（Broach) ら、
ジーン(Gene)８：１２１：１３３、１９７９〕、YRp ７
〔ストルール(Struhl)ら、Proc.Nat. Acad． Sci. USA
７６：１０３５−１０３９、１９７９〕、Ｃ１／１
（上記）、および２μまたはＡＲＳ配列を含む他のプラ
スミドおよびそれらの誘導体中へ挿入することもでき
る。別法では、該ＡＴ突然変異体配列を宿主の染色体中
へ組込むことによって表現を得ることができる。この場
合には、ＡＴ配列を、適正な方向づけで、適当な転写プ
ロモーターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。
【００２２】酵母中に於けるＸ358 −ＡＴの表現 酵母中に於けるVal358−ＡＴの表現 酵母中に於ける突然変異体ＡＴ遺伝子の表現のための好
ましいベクターはＣ１／１誘導pFATPOT 〔図４；pFATPO
T で形質転換されたＳ．セレビシアエ(S.Cerevisiae)株
Ｅ１８が受入れNo.20699でＡＴＣＣに寄託されている。
pFATPOT はこの形質転換体の溶菌細胞からの抽出によっ
て入手できる〕である。ベクターpFATPOT は ampr 、LE
U2およびＣ１／１の２μ領域からなり、表現単位はＳ．
セレビシアエ(S.Cerevisiae)三炭糖燐酸イソメラーゼ
（ＴＰＩ）プロモーター、pUC α１からの野生型ＡＴ配
列、およびＳ．セレビシアエ（S.Cerevisiae) ＴＰＩ転
写終了暗号；およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schiz
osaccharomyces pombe) 三炭糖燐酸イソメラーゼ（ＰＯ
Ｔ１）遺伝子からなる。三炭糖燐酸イソメラーゼ産生の
欠損している酵母宿主中へ形質転換させるときは、プラ
スミド上のＰＯＴ１遺伝子が宿主細胞の欠損を補い、富
んだ培地上での成長中、高いコピー数でプラスミドを保
つことができる。
ましいベクターはＣ１／１誘導pFATPOT 〔図４；pFATPO
T で形質転換されたＳ．セレビシアエ(S.Cerevisiae)株
Ｅ１８が受入れNo.20699でＡＴＣＣに寄託されている。
pFATPOT はこの形質転換体の溶菌細胞からの抽出によっ
て入手できる〕である。ベクターpFATPOT は ampr 、LE
U2およびＣ１／１の２μ領域からなり、表現単位はＳ．
セレビシアエ(S.Cerevisiae)三炭糖燐酸イソメラーゼ
（ＴＰＩ）プロモーター、pUC α１からの野生型ＡＴ配
列、およびＳ．セレビシアエ（S.Cerevisiae) ＴＰＩ転
写終了暗号；およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schiz
osaccharomyces pombe) 三炭糖燐酸イソメラーゼ（ＰＯ
Ｔ１）遺伝子からなる。三炭糖燐酸イソメラーゼ産生の
欠損している酵母宿主中へ形質転換させるときは、プラ
スミド上のＰＯＴ１遺伝子が宿主細胞の欠損を補い、富
んだ培地上での成長中、高いコピー数でプラスミドを保
つことができる。
【００２３】図４について説明する。pUC α１をBam Ｈ
Ｉで開裂し、ＡＴ配列からなる約１４００bp 断片をゲ
ル精製した。この断片を、次にBam Ｈ１消化Ｍ１３mp１
０（複製型）と適当な方向づけで結合させて表１のオリ
ゴヌクレオチドを有する１本鎖ファージのハイブリダイ
ゼーションを可能にした。次に、ＡＴ配列を上記のよう
にして突然変異誘発して配列暗号づけVal358−ＡＴを生
成させた。次に、複製型ＤＮＡのBam ＨＩおよびXba Ｉ
による消化によってＭ１３ベクターから突然変異誘発配
列を除去した。この突然変異体ＡＴ配列を、Bam ＨＩお
よびXba I による消化によって直線状にしてあるpUC １
３中へ挿入した。得られた組換型プラスミドをpUZC３７
と名付けた。再び図４について説明する。Val358−ＡＴ
のための酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。pU
ZC３７から、Bam ＨＩおよびXba I による消化によって
突然変異体ＡＴ配列を精製した。pFATPOT から、Bam Ｈ
Ｉおよび Bal Iによる消化によって、ＴＰＩプロモータ
ーと ampr 遺伝子の上流部分とからなる断片を除去し、
ゲル精製した。３つの断片を一緒に結合し、大腸菌
(E.coli)ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３）の形質転換に用
いた。形質転換体をアンピシリン耐性でスクリーニング
した。得られたプラスミドをpFATPOT ３７と名付けた。
Ｓ．セレビシアエ(S.Cerevisiae)株Ｅ１８〔アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type C
ulture Collection)に寄託、受入れ番号No. ２０７４
３〕をpFATPOT ３７で形質転換し、培地Ｉ（グルコース
６％、酵母エキス２％、硫酸アンモニウム0.5 ％）中で
定常期まで１晩中成長させ、測定標準としてヒトα−１
抗トリプシン〔シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical C
o.)〕およびpFATPOT で形質転換した酵母中で生成したM
et358−ＡＴを用い、下記のようにしてエラスターゼ阻
害活性およびトリプシン阻害活性の生成を測定した。測
定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、ガラスビーズ
で細胞を摩砕して作製した。
Ｉで開裂し、ＡＴ配列からなる約１４００bp 断片をゲ
ル精製した。この断片を、次にBam Ｈ１消化Ｍ１３mp１
０（複製型）と適当な方向づけで結合させて表１のオリ
ゴヌクレオチドを有する１本鎖ファージのハイブリダイ
ゼーションを可能にした。次に、ＡＴ配列を上記のよう
にして突然変異誘発して配列暗号づけVal358−ＡＴを生
成させた。次に、複製型ＤＮＡのBam ＨＩおよびXba Ｉ
による消化によってＭ１３ベクターから突然変異誘発配
列を除去した。この突然変異体ＡＴ配列を、Bam ＨＩお
よびXba I による消化によって直線状にしてあるpUC １
３中へ挿入した。得られた組換型プラスミドをpUZC３７
と名付けた。再び図４について説明する。Val358−ＡＴ
のための酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。pU
ZC３７から、Bam ＨＩおよびXba I による消化によって
突然変異体ＡＴ配列を精製した。pFATPOT から、Bam Ｈ
Ｉおよび Bal Iによる消化によって、ＴＰＩプロモータ
ーと ampr 遺伝子の上流部分とからなる断片を除去し、
ゲル精製した。３つの断片を一緒に結合し、大腸菌
(E.coli)ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３）の形質転換に用
いた。形質転換体をアンピシリン耐性でスクリーニング
した。得られたプラスミドをpFATPOT ３７と名付けた。
Ｓ．セレビシアエ(S.Cerevisiae)株Ｅ１８〔アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type C
ulture Collection)に寄託、受入れ番号No. ２０７４
３〕をpFATPOT ３７で形質転換し、培地Ｉ（グルコース
６％、酵母エキス２％、硫酸アンモニウム0.5 ％）中で
定常期まで１晩中成長させ、測定標準としてヒトα−１
抗トリプシン〔シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical C
o.)〕およびpFATPOT で形質転換した酵母中で生成したM
et358−ＡＴを用い、下記のようにしてエラスターゼ阻
害活性およびトリプシン阻害活性の生成を測定した。測
定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、ガラスビーズ
で細胞を摩砕して作製した。
【００２４】酵母中に於けるArg358−ＡＴの表現 Arg358−ＡＴのための酵母表現ベクターを、pFATPOT ３
７について記載したようにして作製した。但し突然変異
誘発段階に於てオリゴヌクレオチドＡＴＡＣＣＣＡＧＧ
ＴＣＴＡＴＣＣＣＣを用いた。最終表現ベクターをpFAT
POT １３６と名付けた。Ｓ．セレビシアエ(S.Cerevisia
e)株Ｅ１８をpFATPOT １３６で形質転換し、下記のよう
にして成長させ、測定した。結果を表３に示す。
７について記載したようにして作製した。但し突然変異
誘発段階に於てオリゴヌクレオチドＡＴＡＣＣＣＡＧＧ
ＴＣＴＡＴＣＣＣＣを用いた。最終表現ベクターをpFAT
POT １３６と名付けた。Ｓ．セレビシアエ(S.Cerevisia
e)株Ｅ１８をpFATPOT １３６で形質転換し、下記のよう
にして成長させ、測定した。結果を表３に示す。
【００２５】エラスターゼ阻害測定 pH8.8 の0.2 Ｍトリス中に１μｇ／μｌの豚膵臓エラス
ターゼ〔シグマ(Sigma) 〕を含む溶液１０μｌをＡＴ含
有試料２００μｌに加えた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて
全容１ｍｌとし、混合物を４℃に於て１５分間インキュ
ベートした。次に、pH8.8 の0.4 Ｍトリス中に１０mg／
ｍｌのエラスチン−オルセインを含む溶液１ｍｌを加
え、混合物を、１５分間隔で混合しながら３７℃に於て
６０分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上
澄液のＡ590 を測定した。ヒトＡＴならびに上記のよう
にして作製したMet358−ＡＴ、Val358−ＡＴ、Arg358−
ＡＴについての測定結果を表３中に示す。
ターゼ〔シグマ(Sigma) 〕を含む溶液１０μｌをＡＴ含
有試料２００μｌに加えた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて
全容１ｍｌとし、混合物を４℃に於て１５分間インキュ
ベートした。次に、pH8.8 の0.4 Ｍトリス中に１０mg／
ｍｌのエラスチン−オルセインを含む溶液１ｍｌを加
え、混合物を、１５分間隔で混合しながら３７℃に於て
６０分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上
澄液のＡ590 を測定した。ヒトＡＴならびに上記のよう
にして作製したMet358−ＡＴ、Val358−ＡＴ、Arg358−
ＡＴについての測定結果を表３中に示す。
【００２６】トリプシン阻害活性 ＡＴ含有試料５０μｌに、2.5 ｍＭ HCl中に６μｇ／ｍ
ｌのトリプシン〔牛膵臓から、シグマ(Sigma) 〕を含む
溶液４０μｌを添加し、pH8.2 の0.１Ｍトリス、0.０２
Ｍ CaCl2で容積を500 μｌに調節し、室温で１０分間イ
ンキュベートした。燐酸塩緩衝食塩水中１０mg／ｍｌの
アゾコル(Azocoll) 〔カルバイオケム(Calbiochem)〕を
含む溶液１ｍｌを添加し、混合物を、１０分間隔で混合
しながら３７℃に於て３０分間インキュベートした。混
合物を遠心分離し、上澄液のA520を測定した。ヒトＡＴ
ならびに上記のようにして作製したMet358−ＡＴ、Val
358−ＡＴ、Arg358−ＡＴについての測定結果を表３に
示す。
ｌのトリプシン〔牛膵臓から、シグマ(Sigma) 〕を含む
溶液４０μｌを添加し、pH8.2 の0.１Ｍトリス、0.０２
Ｍ CaCl2で容積を500 μｌに調節し、室温で１０分間イ
ンキュベートした。燐酸塩緩衝食塩水中１０mg／ｍｌの
アゾコル(Azocoll) 〔カルバイオケム(Calbiochem)〕を
含む溶液１ｍｌを添加し、混合物を、１０分間隔で混合
しながら３７℃に於て３０分間インキュベートした。混
合物を遠心分離し、上澄液のA520を測定した。ヒトＡＴ
ならびに上記のようにして作製したMet358−ＡＴ、Val
358−ＡＴ、Arg358−ＡＴについての測定結果を表３に
示す。
【００２７】
【表３】 表３ 濃 度 エラスターゼ阻害 トリプシン阻害 （μｇ／ｍｌ） （Ａ590 ） （Ａ520 ） ヒトＡＴ ２００ .１６６ .０３０ １００ .３７２ .０７１ １０ .４８２ .１７２ １ .５０２ .２４２ ０.1 .４６０ .２１９ Met358-AT ２００ .２０７ .０４５ （酵母） １００ .３４４ .０６０ １０ .４９９ .１９９ １ .４９８ .２３５ ０.1 .４９７ .２４０ Val358-AT ２００ .１７５ .１２０ （酵母） １００ .２０２ .１６８ １０ .４９４ .１６７ １ .４８７ .１６６ ０.1 .４７７ .１９４ Arg358-AT ２００ .４８０ .０２７ （酵母） １００ .４８８ .０１９ １０ .４９９ .１２４ １ .４６３ .１６６ ０.1 .４７１ .１９１ 対 照 (AT なし) -- .５００ .１３８ ヒトＡＴ 200 μg/ml トリプシンなし -- -- .０３２ 本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵母細胞の抽
出物から免疫吸着によって精製することができる。免疫
吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシンに対する親
和性精製抗体を、キュアトレカサス(Cuatrecasas)(J. B
iol. Chem.２４５：３０５９、１９７０）の方法に従っ
てCNBr活性化セファロースに共有結合させることによっ
て調製することができる。破壊した細胞を、0.5 ＭのNa
Clを含むpH7.2 の燐酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出
液をカラムに適用し、カラムを３Ｍ NaSCNで溶出した。
出物から免疫吸着によって精製することができる。免疫
吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシンに対する親
和性精製抗体を、キュアトレカサス(Cuatrecasas)(J. B
iol. Chem.２４５：３０５９、１９７０）の方法に従っ
てCNBr活性化セファロースに共有結合させることによっ
て調製することができる。破壊した細胞を、0.5 ＭのNa
Clを含むpH7.2 の燐酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出
液をカラムに適用し、カラムを３Ｍ NaSCNで溶出した。
【００２８】本発明の部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白
質は、遺伝的ＺＺ−個体に見られるような遺伝的抗トリ
プシン欠損ならびにＡＴの不十分なレベルまたは患者が
野生型ＡＴと抗原反応を示す状態に関する他の疾病状態
の治療に有用であり得る。かくして、気腫のような症状
および慢性阻害性肺疾患や成人呼吸困難症候群のような
肺嚢の進行性消化に関する他の肺疾患を治療することが
できる。ヘビースモーキングから来る気腫のような遺伝
的でない気腫も治療することができる。嚢胞性線維症や
関節炎のような必ずしも肺に関係のない疾患をも治療す
ることができる。アルファ−１−抗トリプシンの総説に
ついてはガデク(Gadek) （上掲）を参照されたい。ＡＴ
の突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸３５８に
於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異からなる
蛋白質は、例えば播種血管内凝固の治療に於て血液凝固
防止のために用いることができる。
質は、遺伝的ＺＺ−個体に見られるような遺伝的抗トリ
プシン欠損ならびにＡＴの不十分なレベルまたは患者が
野生型ＡＴと抗原反応を示す状態に関する他の疾病状態
の治療に有用であり得る。かくして、気腫のような症状
および慢性阻害性肺疾患や成人呼吸困難症候群のような
肺嚢の進行性消化に関する他の肺疾患を治療することが
できる。ヘビースモーキングから来る気腫のような遺伝
的でない気腫も治療することができる。嚢胞性線維症や
関節炎のような必ずしも肺に関係のない疾患をも治療す
ることができる。アルファ−１−抗トリプシンの総説に
ついてはガデク(Gadek) （上掲）を参照されたい。ＡＴ
の突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸３５８に
於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異からなる
蛋白質は、例えば播種血管内凝固の治療に於て血液凝固
防止のために用いることができる。
【００２９】本発明の蛋白質は、通常の製剤用担体と混
合することができる。好ましくは、本発明の蛋白質は、
静脈内または吸入によって投与することができる。有効
投与量は、症状の重度および患者の体重によって異なる
が、本発明の蛋白質を0.５−10.0ｇ/ 週の範の投与量で
静脈内投与することが多くの場合有効である。投与方法
が吸入の場合には、上記よりも低い投与量で有効であり
得る。部位特異性突然変異誘発ＡＴが消化管中での早期
分解を防ぐためにカプセルまたは被覆担体内で保護され
るならば経口投与も有効であり得る。本発明の特別な好
ましい実施態様について説明したが、他の変化や他の実
施態様は当業者には明らかであろう。かかる変化や実施
態様は本発明の範囲内に入るべきものである。
合することができる。好ましくは、本発明の蛋白質は、
静脈内または吸入によって投与することができる。有効
投与量は、症状の重度および患者の体重によって異なる
が、本発明の蛋白質を0.５−10.0ｇ/ 週の範の投与量で
静脈内投与することが多くの場合有効である。投与方法
が吸入の場合には、上記よりも低い投与量で有効であり
得る。部位特異性突然変異誘発ＡＴが消化管中での早期
分解を防ぐためにカプセルまたは被覆担体内で保護され
るならば経口投与も有効であり得る。本発明の特別な好
ましい実施態様について説明したが、他の変化や他の実
施態様は当業者には明らかであろう。かかる変化や実施
態様は本発明の範囲内に入るべきものである。
【図１】ヒトアルファ−１−抗トリプシンの優勢形の構
造遺伝子および蛋白質のためのＤＮＡおよびアミノ酸配
列である。
造遺伝子および蛋白質のためのＤＮＡおよびアミノ酸配
列である。
【図２】ヒトアルファ−１−抗トリプシンの優勢形の構
造遺伝子および蛋白質のためのＤＮＡおよびアミノ酸配
列である。
造遺伝子および蛋白質のためのＤＮＡおよびアミノ酸配
列である。
【図３】ラックＺ遺伝子の開始に於ける多重制限部位か
らなるpUC １３のＤＮＡ配列である。
らなるpUC １３のＤＮＡ配列である。
【図４】突然変異体Val358−ＡＴ配列を含むベクターpF
ATPOT ３７の作製のためのスキームである。
ATPOT ３７の作製のためのスキームである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＳ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 グレン ヒトシ カワサキ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト シックスティーンス アベニュー 1547
Claims (6)
- 【請求項１】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体。 - 【請求項２】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体を産生する細胞。 - 【請求項３】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体を含有することを特徴とする遺伝的抗ト
リプシン欠損症の処置のための医薬組成物。 - 【請求項４】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体を含有することを特徴とする肺気腫及び
／又は肺嚢の進行性消化に関連する他の肺疾患の処置の
ための医薬組成物。 - 【請求項５】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体を含有することを特徴とする嚢胞性線維
症の処置のための医薬組成物。 - 【請求項６】 アルファ−１−抗トリプシンの位置３５
８のアミノ酸が、バリンまたはアルギニンに置換されて
いる突然変異体を含有することを特徴とする関節炎の処
置のための医薬組成物。
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