JP2539781B2 - アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 - Google Patents
アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は突然変異誘発遺伝子の作製および微生物中に
於けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は
突然変異誘発ヒトアルファ−１−抗トリプシン遺伝子の
作製およびアルファ−１−抗トリプシンの部位特異性突
然異性体の表現に関する。
於けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は
突然変異誘発ヒトアルファ−１−抗トリプシン遺伝子の
作製およびアルファ−１−抗トリプシンの部位特異性突
然異性体の表現に関する。
アルファ−１−抗トリプシン（以下ATと略称する）は
プロテァーゼ阻害剤であり、その主な機能は広スペクト
ルプロテァーゼであるエラスターゼを阻害することであ
る。哺乳類の肺組織はエラスターゼに特に侵されやすい
ので、ATの欠乏または不活性化は肺組織および弾性の損
失およびそれに続く気腫を生ずる可能性がある。AT活性
の損失または減少はタバコの煙を含む環境汚染物質によ
るATの酸化の結果であり得る。ガデク、ジェームズ E.
（Gadek,James E.）およびR.D.クリスタル（R.D.Crysta
l），“アルファ−１−抗トリプシン欠損（Alpha−１−
Antitrypsin Deficiency）”、ザ・メタボリック・ベー
シス・オブ・インヘライテッド・ディジーズ（The Meta
bolic Basis of Inherited Disease），スタンバリー、
J.B.（Stanbury,J.B.）ら編、マグロー・ヒル、ニュー
ョーク（1988）pp.1450−1467およびキャロル（Carrol
l）ら、ネーチャー（Nature）2988、329−334（1982）
参照。
プロテァーゼ阻害剤であり、その主な機能は広スペクト
ルプロテァーゼであるエラスターゼを阻害することであ
る。哺乳類の肺組織はエラスターゼに特に侵されやすい
ので、ATの欠乏または不活性化は肺組織および弾性の損
失およびそれに続く気腫を生ずる可能性がある。AT活性
の損失または減少はタバコの煙を含む環境汚染物質によ
るATの酸化の結果であり得る。ガデク、ジェームズ E.
（Gadek,James E.）およびR.D.クリスタル（R.D.Crysta
l），“アルファ−１−抗トリプシン欠損（Alpha−１−
Antitrypsin Deficiency）”、ザ・メタボリック・ベー
シス・オブ・インヘライテッド・ディジーズ（The Meta
bolic Basis of Inherited Disease），スタンバリー、
J.B.（Stanbury,J.B.）ら編、マグロー・ヒル、ニュー
ョーク（1988）pp.1450−1467およびキャロル（Carrol
l）ら、ネーチャー（Nature）2988、329−334（1982）
参照。
オウエン（Owen）ら（New Eng.J.Med.309:694−698、
1983）は、患者がアミノ酸位置358に於けるメチオニン
の代わりにアルギニンを置換したアルファ−１−抗トリ
プシンの突然変異体形を生成する条件を記載している。
遺伝子配列中の単点突然変異（ATG→AGG）の結果とし
て、アルファ−１−抗トリプシンはエラスターゼ阻害剤
としてのその正常な機能からトロンビン阻害剤の機能へ
変化した。この機能変化は野生型ATとアンチトロンビン
IIIとの間の構造の30％相同から生じる（キャロル（Car
roll）ら、同上をも参照のこと）。これらの発見は、AT
の変化形が例えば播種血管内凝固の治療に於けるような
血液凝固防止に用いるために臨床的に重要となり得るこ
とを示す。
1983）は、患者がアミノ酸位置358に於けるメチオニン
の代わりにアルギニンを置換したアルファ−１−抗トリ
プシンの突然変異体形を生成する条件を記載している。
遺伝子配列中の単点突然変異（ATG→AGG）の結果とし
て、アルファ−１−抗トリプシンはエラスターゼ阻害剤
としてのその正常な機能からトロンビン阻害剤の機能へ
変化した。この機能変化は野生型ATとアンチトロンビン
IIIとの間の構造の30％相同から生じる（キャロル（Car
roll）ら、同上をも参照のこと）。これらの発見は、AT
の変化形が例えば播種血管内凝固の治療に於けるような
血液凝固防止に用いるために臨床的に重要となり得るこ
とを示す。
蛋白質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような
安定性の増強をもたらし得る野生型ヒトATの変化形を作
製することは望ましいことである。ATに於ける遺伝的欠
損にかかっている患者に投与するための、かかる患者と
免疫学的により相容性である野生型ATの変化形を作製す
ることも望ましいことであろう。増加したアンチトロン
ビン活性を有するATの変化形を作製することも望ましい
ことであろう。
安定性の増強をもたらし得る野生型ヒトATの変化形を作
製することは望ましいことである。ATに於ける遺伝的欠
損にかかっている患者に投与するための、かかる患者と
免疫学的により相容性である野生型ATの変化形を作製す
ることも望ましいことであろう。増加したアンチトロン
ビン活性を有するATの変化形を作製することも望ましい
ことであろう。
従って、本発明の１つの目的は野生型ヒトATの部位特
異性突然変異誘発の作製方法を提供することである。
異性突然変異誘発の作製方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は突然変異誘発ATのための暗
号づけをする構造遺伝子からなる表現ベクターを提供す
ることである。
号づけをする構造遺伝子からなる表現ベクターを提供す
ることである。
本発明のもう１つの目的は部位特異性突然変異誘発AT
蛋白質を提供することである。
蛋白質を提供することである。
本発明は部位特異性突然変異誘発ATのための構造遺伝
子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉環状DN
Aの生成方法を提供する。特に、本発明は （ａ） 野生型ATのための構造遺伝子の暗号配列または
その相補物からなる環状１本鎖cDNA分子を作製する工程
と、 （ｂ） かかる１本鎖DNAに、（１）かかる１本鎖DNAの
セグメントに相補的であることと野生型ATの位置358に
於けるアミノ酸に対応するコドンに於て１つまたは２つ
以上の誤対合を含みかつ該誤対合がアラニンまたはバリ
ンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギ
ニンまたはリジンのためのコドンの１つからなることと
を特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと（２）M13の
ための万能プライマーのようなプライマーとをアニーリ
ングさせる工程と、 （ｃ） 該オリゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的
に延長する工程と、 （ｄ） 延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーと
の末端を一緒に結合してギャップつき環状２本鎖DNA分
子を生成させる工程と、 （ｅ） 該２本鎖ギャップ付き環状DNA分子を大腸菌
（E.coli）中へトランスフェクションしてヒトX358−AT
のための構造遺伝子を含む閉環状DNA分子を生成させか
つプラークハイブリダイゼーションのためのプローブと
しての突然変異体オリゴヌクレオチドでスクリーニング
後、突然変異体DNAを分離する工程と からなるヒトX358−AT（ここでＸはアラニンまたはバリ
ンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギ
ニンまたはリジンである）のための構造遺伝子のための
暗号づけをする１本鎖または２本鎖閉環状DNAの生成方
法を提供する。
子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉環状DN
Aの生成方法を提供する。特に、本発明は （ａ） 野生型ATのための構造遺伝子の暗号配列または
その相補物からなる環状１本鎖cDNA分子を作製する工程
と、 （ｂ） かかる１本鎖DNAに、（１）かかる１本鎖DNAの
セグメントに相補的であることと野生型ATの位置358に
於けるアミノ酸に対応するコドンに於て１つまたは２つ
以上の誤対合を含みかつ該誤対合がアラニンまたはバリ
ンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギ
ニンまたはリジンのためのコドンの１つからなることと
を特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと（２）M13の
ための万能プライマーのようなプライマーとをアニーリ
ングさせる工程と、 （ｃ） 該オリゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的
に延長する工程と、 （ｄ） 延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーと
の末端を一緒に結合してギャップつき環状２本鎖DNA分
子を生成させる工程と、 （ｅ） 該２本鎖ギャップ付き環状DNA分子を大腸菌
（E.coli）中へトランスフェクションしてヒトX358−AT
のための構造遺伝子を含む閉環状DNA分子を生成させか
つプラークハイブリダイゼーションのためのプローブと
しての突然変異体オリゴヌクレオチドでスクリーニング
後、突然変異体DNAを分離する工程と からなるヒトX358−AT（ここでＸはアラニンまたはバリ
ンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギ
ニンまたはリジンである）のための構造遺伝子のための
暗号づけをする１本鎖または２本鎖閉環状DNAの生成方
法を提供する。
同様の方法によって、ATのＺ−対立遺伝子としても知
られているヒトLys342−ATの構造遺伝子からなる閉環状
DNA分子を作製することができる。本発明の方法は342と
358の両方の位置ならびに他の位置に於て突然変異誘発
されたATの作製にも利用することができる。
られているヒトLys342−ATの構造遺伝子からなる閉環状
DNA分子を作製することができる。本発明の方法は342と
358の両方の位置ならびに他の位置に於て突然変異誘発
されたATの作製にも利用することができる。
本発明は突然変異誘発ATのための構造遺伝子からなる
DNA構造物およびクローニングベクターおよび突然変異
誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的に純粋な部位特異
性突然変異誘発ATをも提供する。
DNA構造物およびクローニングベクターおよび突然変異
誘発蛋白質の表現方法ならびに実質的に純粋な部位特異
性突然変異誘発ATをも提供する。
第１図について説明すると、この図には野生型ATの優
勢形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示してある。位
置356−360に於けるアミノ酸からなるATの活性部位はメ
チオニン残基を含む。位置358に於ける残基はタバコの
煙または他の酸化性汚染物質に暴露されるとき酸化を受
けやすい。かかる酸化はATの生物学的活性を減少させる
可能性があるので、部位特異性突然変異誘発により、該
位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニンまたはバリ
ンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギ
ニンまたはリジンで置換して、より安定なATの形を生成
させることができる。
勢形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示してある。位
置356−360に於けるアミノ酸からなるATの活性部位はメ
チオニン残基を含む。位置358に於ける残基はタバコの
煙または他の酸化性汚染物質に暴露されるとき酸化を受
けやすい。かかる酸化はATの生物学的活性を減少させる
可能性があるので、部位特異性突然変異誘発により、該
位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニンまたはバリ
ンまたはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギ
ニンまたはリジンで置換して、より安定なATの形を生成
させることができる。
さらに、遺伝的AT欠損の１つはＺ−対立遺伝子変異体
として知られている異常形の生成である。第１図につい
て言うと、この突然変異はアミノ酸位置342に於けるグ
ルタミン酸のリジンによる置換によって示される。Ｚ−
対立遺伝子変異体に対して同型接合性の個人は、明らか
に肝臓に於ける処理妨害のために正常レベルの約15％の
ATを生成する。このことは肝臓中にATの未熟形の蓄積を
生じ、これに対応して血漿の該阻害剤レベルが減少す
る。この状態をもつ個人の80％までは慢性の肺および
（または）肝臓疾患で死に至ると考えられている。Ｚ−
対立遺伝子変異体蛋白質自体は野生型蛋白質と同じ抗エ
ラスターゼ活性を有することは注目すべきである。かか
る個人のATレベルは野生型ATの静脈内投与によって増強
することができる〔ガデク（Gadek）ら、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal
of Clinical Investigation 68,1158−1165（1981）参
照〕。しかし、野生型蛋白質はこれらの患者にとって異
種であるので、幾人かのZZ個人は野生型蛋白質にアレル
ギーになると期待され得る。かくして、本発明はある種
のAT欠損患者に於て非免疫原となり得るＺ−対立遺伝子
変異体の生成方法を提供する。
として知られている異常形の生成である。第１図につい
て言うと、この突然変異はアミノ酸位置342に於けるグ
ルタミン酸のリジンによる置換によって示される。Ｚ−
対立遺伝子変異体に対して同型接合性の個人は、明らか
に肝臓に於ける処理妨害のために正常レベルの約15％の
ATを生成する。このことは肝臓中にATの未熟形の蓄積を
生じ、これに対応して血漿の該阻害剤レベルが減少す
る。この状態をもつ個人の80％までは慢性の肺および
（または）肝臓疾患で死に至ると考えられている。Ｚ−
対立遺伝子変異体蛋白質自体は野生型蛋白質と同じ抗エ
ラスターゼ活性を有することは注目すべきである。かか
る個人のATレベルは野生型ATの静脈内投与によって増強
することができる〔ガデク（Gadek）ら、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal
of Clinical Investigation 68,1158−1165（1981）参
照〕。しかし、野生型蛋白質はこれらの患者にとって異
種であるので、幾人かのZZ個人は野生型蛋白質にアレル
ギーになると期待され得る。かくして、本発明はある種
のAT欠損患者に於て非免疫原となり得るＺ−対立遺伝子
変異体の生成方法を提供する。
抗トロンビン活性を有することが示されているArg359
−ATは血液凝固阻止に有用でもあり得る。天然産アンチ
トロンビンIIIは、通常、体内で血液凝固を調節する働
きがある。アンチトロンビンIIIは播種血管内凝固の治
療のため〔ガスナー（Gassner）ら、Wien. Klin. Woche
nschr.91:51−53、1979;およびヘルグレン（Hellgre
n）,M.他、Gynecol. Obstet. Invest.16:107−118、198
3〕、および他の症状の治療に於てへパリンの代替物と
して〔バーンハート（Bernhardt）,W.およびノバコバ−
バネット（Novakova−Banet）,A.,Ric. Clin. Lab.13:6
1−66、1983〕用いられて来た。
−ATは血液凝固阻止に有用でもあり得る。天然産アンチ
トロンビンIIIは、通常、体内で血液凝固を調節する働
きがある。アンチトロンビンIIIは播種血管内凝固の治
療のため〔ガスナー（Gassner）ら、Wien. Klin. Woche
nschr.91:51−53、1979;およびヘルグレン（Hellgre
n）,M.他、Gynecol. Obstet. Invest.16:107−118、198
3〕、および他の症状の治療に於てへパリンの代替物と
して〔バーンハート（Bernhardt）,W.およびノバコバ−
バネット（Novakova−Banet）,A.,Ric. Clin. Lab.13:6
1−66、1983〕用いられて来た。
特に、本発明は野生型ヒトAT遺伝子のcDNAまたはその
相補的からなる１本鎖DNA鋳型の作製に関する。突然変
異させようとするコドンに於て１個または２個以上の誤
対合を含む直線状オリゴヌクレオチドプライマーを、突
然変異誘発部位の５′側のアニーリングする第２プライ
マーと一緒に鋳型ヘアニーリングさせる。好ましい第２
プライマーは市販されておりかつM13ベクター中のラッ
ク（lac）Ｚ遺伝子へハイブリダイゼーションするM13の
万能プライマーである〔メッシング（Messing）,Meth.
in Enzymology 101:20−77、1983〕。該オリゴヌクレオ
チドを延長しかつ末端に於て結合させて２本鎖ギャップ
つき環状DNAを得る。この２本鎖DNAを用いて宿主微生物
大腸菌（E.coli）をトランスフェクションし、突然変異
体および野生型DNA分子の混合物を含む集団をもたら
す。突然変異体DNAオリゴヌクレオチドをプローブとし
て用いるプラークハイプリダイゼーションによって突然
変異体DNA分子を選択する。このDNAをシーケンシング
（sequenced）変化したコドンの存在を証明した後、適
当な表現ベクター中へクローニングすることができる。
突然変異誘発AT蛋白質は、細菌または酵母あるいは他の
前核類または真正核類中で表現させることができる。
相補的からなる１本鎖DNA鋳型の作製に関する。突然変
異させようとするコドンに於て１個または２個以上の誤
対合を含む直線状オリゴヌクレオチドプライマーを、突
然変異誘発部位の５′側のアニーリングする第２プライ
マーと一緒に鋳型ヘアニーリングさせる。好ましい第２
プライマーは市販されておりかつM13ベクター中のラッ
ク（lac）Ｚ遺伝子へハイブリダイゼーションするM13の
万能プライマーである〔メッシング（Messing）,Meth.
in Enzymology 101:20−77、1983〕。該オリゴヌクレオ
チドを延長しかつ末端に於て結合させて２本鎖ギャップ
つき環状DNAを得る。この２本鎖DNAを用いて宿主微生物
大腸菌（E.coli）をトランスフェクションし、突然変異
体および野生型DNA分子の混合物を含む集団をもたら
す。突然変異体DNAオリゴヌクレオチドをプローブとし
て用いるプラークハイプリダイゼーションによって突然
変異体DNA分子を選択する。このDNAをシーケンシング
（sequenced）変化したコドンの存在を証明した後、適
当な表現ベクター中へクローニングすることができる。
突然変異誘発AT蛋白質は、細菌または酵母あるいは他の
前核類または真正核類中で表現させることができる。
本明細書中で使用する“DNA構造物”、“ベクタ
ー”、“プラスミド”という用語は、ヒトの介在によっ
て変性されているDNA分子あるいはかく変性されている
分子のクローンであるDNA分子であって、そうでなけれ
ば天然には存在しない方法で結合させかつ配列させたDN
Aのセグメントを含むDNA分子を構成する。本明細書中で
使用する“表現ベクター”という用語は、宿主生物中へ
形質転換させるときそれ自体の複製を保証する遺伝情報
と宿主生物中で表現されるべき少なくとも１つの遺伝子
ならびに転写の開始、翻訳の開始、プロモーター領域お
よびある場合には読み終り領域のための部位のような、
表現が起こるために必要となり得る他の制御機能を含む
DNA構造物である。“表現”という用語は、通常の用途
に於ては、宿主生物中に存在する遺伝子によって暗号づ
けされる蛋白質生成物がある生物によって合成される条
件を意味すると定義される。“ギャップつき”という用
語は、実質的に２本鎖であるが１本鎖領域を含むDNA分
子を意味する。
ー”、“プラスミド”という用語は、ヒトの介在によっ
て変性されているDNA分子あるいはかく変性されている
分子のクローンであるDNA分子であって、そうでなけれ
ば天然には存在しない方法で結合させかつ配列させたDN
Aのセグメントを含むDNA分子を構成する。本明細書中で
使用する“表現ベクター”という用語は、宿主生物中へ
形質転換させるときそれ自体の複製を保証する遺伝情報
と宿主生物中で表現されるべき少なくとも１つの遺伝子
ならびに転写の開始、翻訳の開始、プロモーター領域お
よびある場合には読み終り領域のための部位のような、
表現が起こるために必要となり得る他の制御機能を含む
DNA構造物である。“表現”という用語は、通常の用途
に於ては、宿主生物中に存在する遺伝子によって暗号づ
けされる蛋白質生成物がある生物によって合成される条
件を意味すると定義される。“ギャップつき”という用
語は、実質的に２本鎖であるが１本鎖領域を含むDNA分
子を意味する。
物質および方法 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。M13宿
主株、万能プライマーおよびベクターはベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratori
es）から得た。制限エンドヌクレフアーゼは、ベデスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ne
w England BioLabs）、ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）
から得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌細胞
の形質転換、DNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klenow）
断片）を用いるDNA断片の平滑化（blunting）方法、T4D
NAリガーゼを用いるDNA断片の接合方法を含む一般的ク
ローニング方法はマニアテイス（Maniatis）らが記載し
ている〔モレキュラー・クローニング（Molecular Clon
ing）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A. Laboratory
Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982〕。
主株、万能プライマーおよびベクターはベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratori
es）から得た。制限エンドヌクレフアーゼは、ベデスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ne
w England BioLabs）、ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）
から得、メーカーの指令書に従って使用した。細菌細胞
の形質転換、DNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klenow）
断片）を用いるDNA断片の平滑化（blunting）方法、T4D
NAリガーゼを用いるDNA断片の接合方法を含む一般的ク
ローニング方法はマニアテイス（Maniatis）らが記載し
ている〔モレキュラー・クローニング（Molecular Clon
ing）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A. Laboratory
Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982〕。
一般的な部位特異性突然変異誘発方法は、ゾラー、マ
ークJ.（Zoller,Mark J.）およびM.スミス（M.Smith）
著、“M13誘導ベクター中へクローニングされたDNA断片
のオリゴヌクレオチド指示突然変異誘発（Oligonucleot
ide Directed Mutagenesis of DNA Fragments Cloned I
nto M13Derived Vectors）”、マニュアル・フォー・ア
ドバンスト・テクニックス・イン・モレキュラー・クロ
ーニング・コース（Manual for Advanced Techniques i
n Molecular Cloning Course）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harber Labor
atory）、1983に記載されている。
ークJ.（Zoller,Mark J.）およびM.スミス（M.Smith）
著、“M13誘導ベクター中へクローニングされたDNA断片
のオリゴヌクレオチド指示突然変異誘発（Oligonucleot
ide Directed Mutagenesis of DNA Fragments Cloned I
nto M13Derived Vectors）”、マニュアル・フォー・ア
ドバンスト・テクニックス・イン・モレキュラー・クロ
ーニング・コース（Manual for Advanced Techniques i
n Molecular Cloning Course）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harber Labor
atory）、1983に記載されている。
野生型AT中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリ
ゴヌクレオチドは、ビューケージ（Beaucage）およびカ
ルサーズ（Caruthers）、テトラヘドロン・レターズ（T
etrahedron Letters）22:1859−1862、1981およびマッ
テウチ（Matteuch）およびカルーサーズ（Caruther
s）、J.Am.Chem.Soc.103:3138（1981）に一般的に記載
されている亜燐酸トリエステル法により、マッテウチ
（Matteuch）およびカラーザーズ（Caruthers）、テト
ラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）21:719
−722（1980）に記載されているようなポリマー支持体
を用いて作製することができる。別法では、アプライド
・バイオシステムズ・モデル380−ADNA合成装置のよう
な機械によって、オリゴヌクレオチドを合成することが
できる。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性用ゲル
上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製す
ることができる。オリゴヌクレオチドは、５′−端に於
て、（ガンマ）32P−ATPおよびポリヌクレオチドキナー
ゼによって燐酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の
検定はマクサム（Maxam）およびギルバート（Gilbert）
法、メソド・イン・エザイモロジー（Methods in Enzym
ology）、65:57（1980）で行うことができる。
ゴヌクレオチドは、ビューケージ（Beaucage）およびカ
ルサーズ（Caruthers）、テトラヘドロン・レターズ（T
etrahedron Letters）22:1859−1862、1981およびマッ
テウチ（Matteuch）およびカルーサーズ（Caruther
s）、J.Am.Chem.Soc.103:3138（1981）に一般的に記載
されている亜燐酸トリエステル法により、マッテウチ
（Matteuch）およびカラーザーズ（Caruthers）、テト
ラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）21:719
−722（1980）に記載されているようなポリマー支持体
を用いて作製することができる。別法では、アプライド
・バイオシステムズ・モデル380−ADNA合成装置のよう
な機械によって、オリゴヌクレオチドを合成することが
できる。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性用ゲル
上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製す
ることができる。オリゴヌクレオチドは、５′−端に於
て、（ガンマ）32P−ATPおよびポリヌクレオチドキナー
ゼによって燐酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の
検定はマクサム（Maxam）およびギルバート（Gilbert）
法、メソド・イン・エザイモロジー（Methods in Enzym
ology）、65:57（1980）で行うことができる。
野生型アルファ−１−抗トリプシン遺伝子からなる１本
鎖DNAの作製 ヒトATの優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、DN
Aハイブリダイゼーションプローブとして 々配列を用
いる常法〔クラチ（Kurachi）ら、Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA,78、6820−830（1980）；およびチャンドラ（Ch
andra）ら、Biocham. Biophys. Res. Com.,103、751−7
58（1981）〕によってヒト肝臓cDNAライブラリーから単
離することができる。AT遺伝子は1446bp Pst1断片とし
て単離され、Pst1消化プラスミドpUC13〔ビエイラ（Vie
ira）ら、ジーン（Gene）、19、259−268（1982）記載
の方法で作製、但し1ac Z遺伝子に於ける開始に於て第
２図に示す多重制限部位を含む〕中へ挿入されてAT遺伝
子の３′側のポリリンカー中にBam H1部位を含む組換型
プラスミドpUCα１を与える。プラスミドpUCα１はBam
H1で消化されてAT配列を得る。1320bp Bam H1断片を次
にM13mp10中に結合し〔メッシング（Messing、メソド・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）10
1:20−77（1983）〕、得られた組換型ファージを用いて
大腸菌（E.coli）K12（JM103）をトランスフェクション
する。AT遺伝子を含む１本鎖閉環状DNAを、次にゾラー
（Zoller）およびスミス（Smith）の方法（上掲）で単
離する。
鎖DNAの作製 ヒトATの優勢形のための暗号づけをする遺伝子は、DN
Aハイブリダイゼーションプローブとして 々配列を用
いる常法〔クラチ（Kurachi）ら、Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA,78、6820−830（1980）；およびチャンドラ（Ch
andra）ら、Biocham. Biophys. Res. Com.,103、751−7
58（1981）〕によってヒト肝臓cDNAライブラリーから単
離することができる。AT遺伝子は1446bp Pst1断片とし
て単離され、Pst1消化プラスミドpUC13〔ビエイラ（Vie
ira）ら、ジーン（Gene）、19、259−268（1982）記載
の方法で作製、但し1ac Z遺伝子に於ける開始に於て第
２図に示す多重制限部位を含む〕中へ挿入されてAT遺伝
子の３′側のポリリンカー中にBam H1部位を含む組換型
プラスミドpUCα１を与える。プラスミドpUCα１はBam
H1で消化されてAT配列を得る。1320bp Bam H1断片を次
にM13mp10中に結合し〔メッシング（Messing、メソド・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）10
1:20−77（1983）〕、得られた組換型ファージを用いて
大腸菌（E.coli）K12（JM103）をトランスフェクション
する。AT遺伝子を含む１本鎖閉環状DNAを、次にゾラー
（Zoller）およびスミス（Smith）の方法（上掲）で単
離する。
野生型AT中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリゴ
ヌクレオチドの作製 下記第１表に示すオリゴヌクレオチドを通常の亜隣酸
トリエステル法またはアプライド・バイオシステムズ・
モデル380−Ａ合成装置で合成した後、変性用ポリアク
リルアミドゲル上で精製することができる。このオリゴ
ヌクレオチドは、アミノ酸358のコドンのための適当な
誤対合が存在する以外は第１図に示す野生型ヒトATのア
ミノ酸356−360のための暗号づけをする。
ヌクレオチドの作製 下記第１表に示すオリゴヌクレオチドを通常の亜隣酸
トリエステル法またはアプライド・バイオシステムズ・
モデル380−Ａ合成装置で合成した後、変性用ポリアク
リルアミドゲル上で精製することができる。このオリゴ
ヌクレオチドは、アミノ酸358のコドンのための適当な
誤対合が存在する以外は第１図に示す野生型ヒトATのア
ミノ酸356−360のための暗号づけをする。
上記のものよりも長いオリゴヌクレオチドを使用でき
ることは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のた
め、第１表中に示したものの代わりに他の突然変異体コ
ドンを用いることができることも言うまでもない。オリ
ゴヌクレオチドは、長さが15−21ヌクレオチドの範囲で
ありかつ少なくともヌクレオチド1184−1198を含むこと
が好ましい。
ることは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のた
め、第１表中に示したものの代わりに他の突然変異体コ
ドンを用いることができることも言うまでもない。オリ
ゴヌクレオチドは、長さが15−21ヌクレオチドの範囲で
ありかつ少なくともヌクレオチド1184−1198を含むこと
が好ましい。
もう１つのオリゴヌクレオチドは第２表に示すように
して作製され、AT配列中のアミノ酸342のためのコドン
の周りにほぼ中心を置く配列に対応する。第２表のオリ
ゴヌクレオチドはアミノ酸342のためのコドンに於ける
誤対合を含み、それによってリジンのコドンが含まれて
Ｚ−対立遺伝子変異体を生じる。
して作製され、AT配列中のアミノ酸342のためのコドン
の周りにほぼ中心を置く配列に対応する。第２表のオリ
ゴヌクレオチドはアミノ酸342のためのコドンに於ける
誤対合を含み、それによってリジンのコドンが含まれて
Ｚ−対立遺伝子変異体を生じる。
上記よりも長いオリゴヌクレオチドが利用できること
は言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第２
表に示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用い
ることができることも言うまでもない。オリゴヌクレオ
チドは、長さが15−21ヌクレオチドでありかつヌクレオ
チド1135−1149を含むことが好ましい。
は言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、第２
表に示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用い
ることができることも言うまでもない。オリゴヌクレオ
チドは、長さが15−21ヌクレオチドでありかつヌクレオ
チド1135−1149を含むことが好ましい。
オリゴヌクレオチドの延長および結合 上に挙げたオリゴヌクレオチドのおのおのを、M13の
万能プライマーのような第２プライマーと一緒に野生型
AT遺伝子を含む１本鎖組換型M13ファージDNAとアニーリ
ングさせる。典型的な操作に於ては、20pmolの燐酸化Ｚ
−対立遺伝子オリゴヌクレオチドと20pmolのM13プライ
マーとをATcDNAを含む組換型M13ファージ1pmolと混合
し、アニーリングさせた。このオリゴヌクレオチドを、
次にDNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klenow）フラグメ
ント〕を用いて延長し、合成鎖の末端をT4DNAリガーゼ
を用いて接合させた。得られたDNA分子はAT暗号領域に
わたって明らかに二本鎖でありかつM13ベクター領域に
わたって部分的に１本鎖である。これらのギャップ付き
DNA環をコンピテント大腸菌（E.coli）K12（JM101）中
へトランスフェクションして細菌DNA修復系によってギ
ャップを埋めて活性ファージを作ることができる。突然
変異体分子の集団は、ファージDNAをニトロセルロース
フィルターに結合させて32Pでラベルした突然変異誘発
性オリゴヌクレオチドでプローブするプラーク・リフト
（plaque−lift）ハイブリダイゼーション法〔ゾラー
（Zoller）ら、上掲〕によって野生型から識別される。
本操作の背後にある原理は、突然変異誘発性オリゴヌク
レオチドが野生型クローンとよりも安定な複式を突然変
異体クローンと形成する（野生型クローンとのハイブリ
ダイゼーションは誤対合を生ずる）ということである。
低温に於けるハイブリダイゼーションの後、突然変異体
分子だけがプローブとハイブリッドを形成するまで洗浄
温度を上げる。典型的には、23℃の温度でハイブリダイ
ゼーションを行った後、23℃、37℃、50℃、55℃で逐次
洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを行うこと
ができる。突然変異体ファージを次に単離し、再度プレ
ートにまき、サンガー（Sanger）ら（J. Mol. Biol.14
3:161、1983）およびサンガー（Sanger）ら、（Proc. N
at. Acad. Sci. USA.,74:5463、1977）のジデオキ（did
eoxy）法を用いるシーケンシング（Sequencing）によっ
て突然変異の存在を証明することができる。
万能プライマーのような第２プライマーと一緒に野生型
AT遺伝子を含む１本鎖組換型M13ファージDNAとアニーリ
ングさせる。典型的な操作に於ては、20pmolの燐酸化Ｚ
−対立遺伝子オリゴヌクレオチドと20pmolのM13プライ
マーとをATcDNAを含む組換型M13ファージ1pmolと混合
し、アニーリングさせた。このオリゴヌクレオチドを、
次にDNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klenow）フラグメ
ント〕を用いて延長し、合成鎖の末端をT4DNAリガーゼ
を用いて接合させた。得られたDNA分子はAT暗号領域に
わたって明らかに二本鎖でありかつM13ベクター領域に
わたって部分的に１本鎖である。これらのギャップ付き
DNA環をコンピテント大腸菌（E.coli）K12（JM101）中
へトランスフェクションして細菌DNA修復系によってギ
ャップを埋めて活性ファージを作ることができる。突然
変異体分子の集団は、ファージDNAをニトロセルロース
フィルターに結合させて32Pでラベルした突然変異誘発
性オリゴヌクレオチドでプローブするプラーク・リフト
（plaque−lift）ハイブリダイゼーション法〔ゾラー
（Zoller）ら、上掲〕によって野生型から識別される。
本操作の背後にある原理は、突然変異誘発性オリゴヌク
レオチドが野生型クローンとよりも安定な複式を突然変
異体クローンと形成する（野生型クローンとのハイブリ
ダイゼーションは誤対合を生ずる）ということである。
低温に於けるハイブリダイゼーションの後、突然変異体
分子だけがプローブとハイブリッドを形成するまで洗浄
温度を上げる。典型的には、23℃の温度でハイブリダイ
ゼーションを行った後、23℃、37℃、50℃、55℃で逐次
洗浄し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを行うこと
ができる。突然変異体ファージを次に単離し、再度プレ
ートにまき、サンガー（Sanger）ら（J. Mol. Biol.14
3:161、1983）およびサンガー（Sanger）ら、（Proc. N
at. Acad. Sci. USA.,74:5463、1977）のジデオキ（did
eoxy）法を用いるシーケンシング（Sequencing）によっ
て突然変異の存在を証明することができる。
細菌表現ベクター中への配列に於ける突然変異体のクロ
ーニング 突然変異体AT暗号領域は、複製型のBam H1およびPst1
による消化によって閉環状DNAから取除くことができ
る。突然変異体AT遺伝子を含む断片を、Bam H1およびPs
t1消化ベクターM13TACまたはM13mp10中へ挿入すること
ができる。ファージM13mp10はＰ−Ｌバイオケミカルズ
（Ｐ−L Biochemicals）またはベテスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Bethesde Research Laboratories）から
市販されている。得られた構造物は、上述のように大腸
菌（E.coli）K12（JM103）を形質転換させるために用い
ることができる。
ーニング 突然変異体AT暗号領域は、複製型のBam H1およびPst1
による消化によって閉環状DNAから取除くことができ
る。突然変異体AT遺伝子を含む断片を、Bam H1およびPs
t1消化ベクターM13TACまたはM13mp10中へ挿入すること
ができる。ファージM13mp10はＰ−Ｌバイオケミカルズ
（Ｐ−L Biochemicals）またはベテスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Bethesde Research Laboratories）から
市販されている。得られた構造物は、上述のように大腸
菌（E.coli）K12（JM103）を形質転換させるために用い
ることができる。
ファージM13mp10をEco R IおよびBam H1で消化してM1
3TACを作製する。得られた付着末端に、Ｐ−Ｌバイオケ
ミカルズ（Ｐ−L Biochemicals）から購入した、下記構
造を有し AATTCATGGAG GTACCTCCTAG かつ５個の主燐酸塩が欠損している合成DNAアダプター
を結合させて構造物mp10Aを生成させる。かくして、構
造物mp10AはAT遺伝子のための開始コドンと第１アミノ
酸（Glu）コドンとを与えるATGGAGを含む配列について
のEco R IおよびBam H1制限部位を含む。mp10のもとのE
co R IとBam H1との間の領域のためのアダプターの置換
はラックオペロン解読フレームを破壊し、得られたトラ
ンスフェクタントは白色プラークを与える。
3TACを作製する。得られた付着末端に、Ｐ−Ｌバイオケ
ミカルズ（Ｐ−L Biochemicals）から購入した、下記構
造を有し AATTCATGGAG GTACCTCCTAG かつ５個の主燐酸塩が欠損している合成DNAアダプター
を結合させて構造物mp10Aを生成させる。かくして、構
造物mp10AはAT遺伝子のための開始コドンと第１アミノ
酸（Glu）コドンとを与えるATGGAGを含む配列について
のEco R IおよびBam H1制限部位を含む。mp10のもとのE
co R IとBam H1との間の領域のためのアダプターの置換
はラックオペロン解読フレームを破壊し、得られたトラ
ンスフェクタントは白色プラークを与える。
ベクターmp10AをAva IIで消化し、付着末端をDNAポリ
メラーゼのクレナウ（Klenow）フラグメントを用いて埋
める。この後でEco R Iで消化しかつS1ヌクレアーゼを
用いて付着末端を除去する。得られた平滑末端断片がmp
10Bである。trp−ラックプロモーターからなるDNA断片
を市販プラスミドpDR540〔Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ
−L Biochemicals）〕から取り出す。このプラスミドpD
R540をHind IIIで切断し、付着端をクレナウ（Klenow）
ポリメラーゼで埋める。配列CCTCGAGGを有するリンカー
をこの平滑末端に結合し、過剰のリンカーをXho Iによ
る消化によって除去する。得られたpDR540Xとして知ら
れている構造物はpDR540のHind III部位の代わりにXho
I部位を含む。Xho1およびBam H1によるpDR540Xの消化お
よびそれに続くクレナウ（Klenow）フラグメントを用い
る末端の平滑化によってtrp−ラックプロモーター（TA
C）とシャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配列と
を含む断片を得る。trp−ラックプロモーターを含む上
記断片をmp10B断片中に挿入してハイブリッドファージm
p10Cを生成する。mp10Bの平滑化Ava IIをTAC含有断片の
平滑化Xho Iへ結合することによって結合部にXho I部位
を再生する。TAC断片の平滑化Bam H1部位のmp10Bの平滑
化Eco R I末端への結合によってこの結合部にNco I部位
（CCATGG）を生じる。断片の正しい指向は、青色プラー
クの生成によってスクリーニングすることができる。フ
ァージmp10Cは、もとのBam H1部位中へのAT遺伝子の挿
入を容易にするために除去されねばならないATG開始コ
ドンの上流に位置する第2Bam H1を含む。この異質のBam
H1部位を除去するため、mp10CをBam H1による２回の消
化にかける。第１の部分的消化の後で、クレナウ（Klen
ow）ポリメラーゼによって付着末端を埋め、Xho Iで消
化し、アガロースゲル上で精製する。正しい断片はNco
I制限部位を含む断片として確認される。mp10Cの第２の
Bam H1消化は完了まで行い、付着末端をクレナウ（Klen
ow）ポリメラーゼを用いて埋め、α−32P−dNTP′ｓを
用いてBal31エキソヌクレアーゼによる平滑末端のその
後のマニキュアリングの監視を容易にする。Bal31エキ
ソヌクレアーゼにより標識末端から５塩基対を除去し、
それによってBam H1部位を除去する。プロモーターを含
む配列をXho Iで除去し、ゲル精製する。mp10とpDR540
誘導断片とを一緒に結合し、大腸菌（E.coli）K12（JM1
03）〔メッシング、J.（Messing,J.）ら1981ヌクレイッ
ク・アミド・Res.（Nucleic Acids Res.）9:309、Ｐ−
Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals）から市
販〕中へクローニングし、Nco I感受性および青色プラ
ークの生成でスクリーニングする。得られたベクターは
M13TACである。
メラーゼのクレナウ（Klenow）フラグメントを用いて埋
める。この後でEco R Iで消化しかつS1ヌクレアーゼを
用いて付着末端を除去する。得られた平滑末端断片がmp
10Bである。trp−ラックプロモーターからなるDNA断片
を市販プラスミドpDR540〔Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ
−L Biochemicals）〕から取り出す。このプラスミドpD
R540をHind IIIで切断し、付着端をクレナウ（Klenow）
ポリメラーゼで埋める。配列CCTCGAGGを有するリンカー
をこの平滑末端に結合し、過剰のリンカーをXho Iによ
る消化によって除去する。得られたpDR540Xとして知ら
れている構造物はpDR540のHind III部位の代わりにXho
I部位を含む。Xho1およびBam H1によるpDR540Xの消化お
よびそれに続くクレナウ（Klenow）フラグメントを用い
る末端の平滑化によってtrp−ラックプロモーター（TA
C）とシャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配列と
を含む断片を得る。trp−ラックプロモーターを含む上
記断片をmp10B断片中に挿入してハイブリッドファージm
p10Cを生成する。mp10Bの平滑化Ava IIをTAC含有断片の
平滑化Xho Iへ結合することによって結合部にXho I部位
を再生する。TAC断片の平滑化Bam H1部位のmp10Bの平滑
化Eco R I末端への結合によってこの結合部にNco I部位
（CCATGG）を生じる。断片の正しい指向は、青色プラー
クの生成によってスクリーニングすることができる。フ
ァージmp10Cは、もとのBam H1部位中へのAT遺伝子の挿
入を容易にするために除去されねばならないATG開始コ
ドンの上流に位置する第2Bam H1を含む。この異質のBam
H1部位を除去するため、mp10CをBam H1による２回の消
化にかける。第１の部分的消化の後で、クレナウ（Klen
ow）ポリメラーゼによって付着末端を埋め、Xho Iで消
化し、アガロースゲル上で精製する。正しい断片はNco
I制限部位を含む断片として確認される。mp10Cの第２の
Bam H1消化は完了まで行い、付着末端をクレナウ（Klen
ow）ポリメラーゼを用いて埋め、α−32P−dNTP′ｓを
用いてBal31エキソヌクレアーゼによる平滑末端のその
後のマニキュアリングの監視を容易にする。Bal31エキ
ソヌクレアーゼにより標識末端から５塩基対を除去し、
それによってBam H1部位を除去する。プロモーターを含
む配列をXho Iで除去し、ゲル精製する。mp10とpDR540
誘導断片とを一緒に結合し、大腸菌（E.coli）K12（JM1
03）〔メッシング、J.（Messing,J.）ら1981ヌクレイッ
ク・アミド・Res.（Nucleic Acids Res.）9:309、Ｐ−
Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals）から市
販〕中へクローニングし、Nco I感受性および青色プラ
ークの生成でスクリーニングする。得られたベクターは
M13TACである。
酵母中に於ける表現ベクターのクローニング 酵母中に於けるクローニングおよび表現のために、Ba
m H1断片のような変異体配列を含むM13ファージの複製
型から変異体AT配列を単離し、Bam H1消化プラスミドHA
T4中へ挿入することができる。プラスミドHAT4は、下記
の方法で作られたものである。プラスミドpJDB248〔ベ
ッグズ（Beggs）、ネーチャー（Nature）275:104−10
9、1978）をEco R Iで部分的に消化し、pMB9配列を除去
した。プラスミドpBR322〔ボリバー（Bolivar）ら、ジ
ーン（Gene）2:95−113、1977〕をEco R Iで開裂し、pM
B9配列の代わりに直線状pJDB248へ接合させた。得られ
たプラスミドはC1/1として知られている。プラスミドpT
PIC10〔アルバー（Alber）およびカワサキ（Kawasak
i）、J.Mol.App.Genet １:419−434、1982〕から、部分
的Bgl II消化、再結合、Kpn Iによる消化によって酵母T
PIプロモーターを除去した。得られた直線状プラスミド
約50μｇを５単位のBal31で、30℃に於て５分間処理し
た。このDNAを、次にDNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Kl
enow）フラグメント〕で処理して分子の末端を平滑化し
た。次に、Hind IIIリンカーを添加した。TPI暗号領域
の位置＋４に於てHind IIIリンカーを含むプラスミドが
同定された。このプラスミドをHind IIIで切断し、Bal3
1で数秒間消化し、DNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klen
ow）フラグメント〕で平滑化した。次に、Eco R Iリン
カー（GGAATTCC）を添加し、このDNAをBgl IIおよびEco
R Iで消化し、TPIプロモーターからなる断片を単離し
た。この断片を、Bgl IIおよびEco R Iで直線状にして
あるYRp7′〔スティンチコム（Stinchcomb）ら、ネーチ
ャー（Nature）282:39−43、1979〕中へ挿入した。TE32
と呼ばれる１つのかかるプラスミドは、TPI配列中のお
よそ−14の位置にEco R Iリンカーを含んでいた。TE32
をEco R IおよびBam H1で切断し、下記配列 AATTCATGGAG GTACCTCCTAG を有するリンカーの10倍過剰と結合させた。得られたプ
ラスミドをBam H1で切断し、再結合させてプラスミドTE
A32を生成させた。次に、TEA32から、約900塩基対のBgl
II−Bam H1断片としてTPIプロモーター断片を除去し、
C1/1のBam H1部位中へ挿入した。プラスミドpUCα１を
次にXba Iで開裂し、プラスミドpTPIC10〔アルバー（Al
ber）およびカワサキ（Kawasaki）、上掲〕から得られ
た、700塩基対Xba I−Eco R I断片のような酵母TPI終了
暗号をAT配列の下流に挿入した。次に、Eco R I部位にE
co R I−Bam H1合成DNAアダプターを付加した。得られ
たプラスミドをBam H1で消化してAT暗号配列とTPI終了
暗号とからなる約2100塩基対の断片を遊離させた。この
断片をC1/1とTPIプロモーターとからなるプラスミドのB
am H1部位中へ挿入した。得られたプラスミドをHAT4と
名付けた。ここに得た表現ベクターを酵母株の形質転換
に用いて突然変異誘発蛋白質を表現させた。好ましい酵
母株宿主はGK100、ATCC No.20669およびS.セレビシアエ
（S.Cerevisiae）株E2−7B、ATCC No.20689である。
m H1断片のような変異体配列を含むM13ファージの複製
型から変異体AT配列を単離し、Bam H1消化プラスミドHA
T4中へ挿入することができる。プラスミドHAT4は、下記
の方法で作られたものである。プラスミドpJDB248〔ベ
ッグズ（Beggs）、ネーチャー（Nature）275:104−10
9、1978）をEco R Iで部分的に消化し、pMB9配列を除去
した。プラスミドpBR322〔ボリバー（Bolivar）ら、ジ
ーン（Gene）2:95−113、1977〕をEco R Iで開裂し、pM
B9配列の代わりに直線状pJDB248へ接合させた。得られ
たプラスミドはC1/1として知られている。プラスミドpT
PIC10〔アルバー（Alber）およびカワサキ（Kawasak
i）、J.Mol.App.Genet １:419−434、1982〕から、部分
的Bgl II消化、再結合、Kpn Iによる消化によって酵母T
PIプロモーターを除去した。得られた直線状プラスミド
約50μｇを５単位のBal31で、30℃に於て５分間処理し
た。このDNAを、次にDNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Kl
enow）フラグメント〕で処理して分子の末端を平滑化し
た。次に、Hind IIIリンカーを添加した。TPI暗号領域
の位置＋４に於てHind IIIリンカーを含むプラスミドが
同定された。このプラスミドをHind IIIで切断し、Bal3
1で数秒間消化し、DNAポリメラーゼＩ〔クレナウ（Klen
ow）フラグメント〕で平滑化した。次に、Eco R Iリン
カー（GGAATTCC）を添加し、このDNAをBgl IIおよびEco
R Iで消化し、TPIプロモーターからなる断片を単離し
た。この断片を、Bgl IIおよびEco R Iで直線状にして
あるYRp7′〔スティンチコム（Stinchcomb）ら、ネーチ
ャー（Nature）282:39−43、1979〕中へ挿入した。TE32
と呼ばれる１つのかかるプラスミドは、TPI配列中のお
よそ−14の位置にEco R Iリンカーを含んでいた。TE32
をEco R IおよびBam H1で切断し、下記配列 AATTCATGGAG GTACCTCCTAG を有するリンカーの10倍過剰と結合させた。得られたプ
ラスミドをBam H1で切断し、再結合させてプラスミドTE
A32を生成させた。次に、TEA32から、約900塩基対のBgl
II−Bam H1断片としてTPIプロモーター断片を除去し、
C1/1のBam H1部位中へ挿入した。プラスミドpUCα１を
次にXba Iで開裂し、プラスミドpTPIC10〔アルバー（Al
ber）およびカワサキ（Kawasaki）、上掲〕から得られ
た、700塩基対Xba I−Eco R I断片のような酵母TPI終了
暗号をAT配列の下流に挿入した。次に、Eco R I部位にE
co R I−Bam H1合成DNAアダプターを付加した。得られ
たプラスミドをBam H1で消化してAT暗号配列とTPI終了
暗号とからなる約2100塩基対の断片を遊離させた。この
断片をC1/1とTPIプロモーターとからなるプラスミドのB
am H1部位中へ挿入した。得られたプラスミドをHAT4と
名付けた。ここに得た表現ベクターを酵母株の形質転換
に用いて突然変異誘発蛋白質を表現させた。好ましい酵
母株宿主はGK100、ATCC No.20669およびS.セレビシアエ
（S.Cerevisiae）株E2−7B、ATCC No.20689である。
また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ベクタ
ー、例えばYEp13〔ブローチ（Broach）ら、ジーン（Gen
e）8:121:133、1979〕、YRp7〔ストルール（Struhl）
ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA76:1035−1039、197
9〕、C1/1（上記）、および２μまたはARS配列を含む他
のプラスミドおよびそれらの誘導体中へ挿入することも
できる。
ー、例えばYEp13〔ブローチ（Broach）ら、ジーン（Gen
e）8:121:133、1979〕、YRp7〔ストルール（Struhl）
ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA76:1035−1039、197
9〕、C1/1（上記）、および２μまたはARS配列を含む他
のプラスミドおよびそれらの誘導体中へ挿入することも
できる。
別法では、該AT突然変異体配列を宿主の染色体中へ組
込むことによって表現を得ることができる。この場合に
は、AT配列を、適正な方向づけで、適当な転写プロモー
ターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。
込むことによって表現を得ることができる。この場合に
は、AT配列を、適正な方向づけで、適当な転写プロモー
ターおよび終了暗号配列へ連鎖させる。
酵母中に於けるX358−ATの表現 酵母中に於けるVal358−ATの表現 酵母中に於ける突然変異体AT遺伝子の表現のための好
ましいベクターはC1/1誘導pFATPOT〔第３図;pFATPOTで
形質転換されたS.セレビシアエ（S.Cerevisiae）株E18
が受入れNo.20699でATCCに寄託されている。pFATPOTは
この形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって入手でで
きる〕である。ベクターpFATPOTはampr、UEU2およびC1/
1の２μ領域からなり、表現単位はS.セレビシアエ（S.C
erevisiae）三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）プロモータ
ー、pUCα１からの野生型AT配列、およびS.セレビシア
エ（S.Cerevisiae）TPI転写終了暗号；およびシゾサッ
カロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）三
炭糖燐酸イソメラーゼ（POT1）遺伝子からなる。三炭糖
燐酸イソメラーゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質
転換させるときは、プラスミド上のPOT1遺伝子が宿主細
胞の欠損を補い、富んだ培地上での成長中、高いコピー
数でプラスミドを保つことができる。
ましいベクターはC1/1誘導pFATPOT〔第３図;pFATPOTで
形質転換されたS.セレビシアエ（S.Cerevisiae）株E18
が受入れNo.20699でATCCに寄託されている。pFATPOTは
この形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって入手でで
きる〕である。ベクターpFATPOTはampr、UEU2およびC1/
1の２μ領域からなり、表現単位はS.セレビシアエ（S.C
erevisiae）三炭糖燐酸イソメラーゼ（TPI）プロモータ
ー、pUCα１からの野生型AT配列、およびS.セレビシア
エ（S.Cerevisiae）TPI転写終了暗号；およびシゾサッ
カロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）三
炭糖燐酸イソメラーゼ（POT1）遺伝子からなる。三炭糖
燐酸イソメラーゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質
転換させるときは、プラスミド上のPOT1遺伝子が宿主細
胞の欠損を補い、富んだ培地上での成長中、高いコピー
数でプラスミドを保つことができる。
第３図について説明する。pUCα１をBam H Iで開裂
し、AT配列からなる約1400bp断片をゲル精製した。この
断片を、次にBam H1消化M13mp10（複製型）と適当な方
向づけで結合させて第１表のオリゴヌクレオチドを有す
る１本鎖ファージのハイブリダイゼーションを可能にし
た。次に、AT配列を上記のようにして突然変異誘発して
配列暗号づけVal358−ATを生成させた。次に、複製型DN
AのBam H IおよびXba Iによる消化によってM13ベクター
から突然変異誘発配列を除去した。この突然変異体AT配
列を、Bam H IおよびXba Iによる消化によって直線状に
してあるpUC13中へ挿入した。得られた組換型プラスミ
ドをpUZC37と名付けた。
し、AT配列からなる約1400bp断片をゲル精製した。この
断片を、次にBam H1消化M13mp10（複製型）と適当な方
向づけで結合させて第１表のオリゴヌクレオチドを有す
る１本鎖ファージのハイブリダイゼーションを可能にし
た。次に、AT配列を上記のようにして突然変異誘発して
配列暗号づけVal358−ATを生成させた。次に、複製型DN
AのBam H IおよびXba Iによる消化によってM13ベクター
から突然変異誘発配列を除去した。この突然変異体AT配
列を、Bam H IおよびXba Iによる消化によって直線状に
してあるpUC13中へ挿入した。得られた組換型プラスミ
ドをpUZC37と名付けた。
再び第３図について説明する。Val358−ATのための酵
母表現ベクターは下記の方法で作られた。pUZC37から、
Bam H IおよびXba Iによる消化によって突然変異体AT配
列を精製した。pFATPOTから、Bam H IおよびBgl Iによ
る消化によって、TPIプロモーターとampr遺伝子の上流
部分とからなる断片を除去し、ゲル精製した。３つの断
片を一緒に結合し、大腸菌（E.coli）RRI（ATCC31343）
の形質転換に用いた。形質転換体をアンピシリン耐性で
スクリーニングした。得られたプラスミドをpFATPOT37
と名付けた。
母表現ベクターは下記の方法で作られた。pUZC37から、
Bam H IおよびXba Iによる消化によって突然変異体AT配
列を精製した。pFATPOTから、Bam H IおよびBgl Iによ
る消化によって、TPIプロモーターとampr遺伝子の上流
部分とからなる断片を除去し、ゲル精製した。３つの断
片を一緒に結合し、大腸菌（E.coli）RRI（ATCC31343）
の形質転換に用いた。形質転換体をアンピシリン耐性で
スクリーニングした。得られたプラスミドをpFATPOT37
と名付けた。
S.セレビシアエ（S.Cerevisiae）株E18〔アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）に寄託、受入れ番号No.20743〕を
pFATPOT37で形質転換し、培地Ｉ（グルコース６％、酵
母エキス２％、硫酸アンモニウム0.5％）中で定常期ま
で１晩中成長させ、測定標準としてヒトα−１抗トリプ
シン〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）〕お
よびpFATPOTで形質転換した酵母中で生成したMet358−A
Tを用い、下記のようにしてエラスターゼ阻害活性およ
びトリプシン阻害活性の生成を測定した。測定用酵母試
料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、ガラスビーズで細胞を摩
砕して作製した。
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）に寄託、受入れ番号No.20743〕を
pFATPOT37で形質転換し、培地Ｉ（グルコース６％、酵
母エキス２％、硫酸アンモニウム0.5％）中で定常期ま
で１晩中成長させ、測定標準としてヒトα−１抗トリプ
シン〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）〕お
よびpFATPOTで形質転換した酵母中で生成したMet358−A
Tを用い、下記のようにしてエラスターゼ阻害活性およ
びトリプシン阻害活性の生成を測定した。測定用酵母試
料は、燐酸塩緩衝食塩水中で、ガラスビーズで細胞を摩
砕して作製した。
酵母中に於けるArg358−ATの表現 Arg358−ATのための酵母表現ベクターを、pFATPOT37
について記載したようにして作製した。但し突然変異誘
発段階に於てオリゴヌクレオチドATACCCAGGTCTATCCCCを
用いた。最終表現ベクターをpFATPOT136と名付けた。S.
セレビシアエ（S.Cerevisiae）株E18をpFATPOT136で形
質転換し、下記のようにして成長させ、測定した。結果
を第３表に示す。
について記載したようにして作製した。但し突然変異誘
発段階に於てオリゴヌクレオチドATACCCAGGTCTATCCCCを
用いた。最終表現ベクターをpFATPOT136と名付けた。S.
セレビシアエ（S.Cerevisiae）株E18をpFATPOT136で形
質転換し、下記のようにして成長させ、測定した。結果
を第３表に示す。
エラスターゼ阻害測定 pH8.8の0.2Mトリス中に１μg/μの豚膵臓エラスタ
ーゼ〔シグマ（Sigma）〕を含む溶液10μをAT含有試
料200μに加えた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて全容1ml
とし、混合物を４℃に於て15分間インキュベートした。
次に、pH8.8の0.4Mトリス中に1mg/mlのエラスチン−オ
ルセインを含む溶液1mlを加え、混合物を、15分間隔で
混合しながら37℃に於て60分間インキュベートした。混
合物を遠心分離し、上澄液のA590を測定した。ヒトATな
らびに上記のようにして作製したMet358−AT、Val358−
AT、Arg358−ATについての測定結果を第３表中に示す。
ーゼ〔シグマ（Sigma）〕を含む溶液10μをAT含有試
料200μに加えた。燐酸塩緩衝食塩水を加えて全容1ml
とし、混合物を４℃に於て15分間インキュベートした。
次に、pH8.8の0.4Mトリス中に1mg/mlのエラスチン−オ
ルセインを含む溶液1mlを加え、混合物を、15分間隔で
混合しながら37℃に於て60分間インキュベートした。混
合物を遠心分離し、上澄液のA590を測定した。ヒトATな
らびに上記のようにして作製したMet358−AT、Val358−
AT、Arg358−ATについての測定結果を第３表中に示す。
トリプシン阻害活性 AT含有試料50μに、2.5mM HCl中に６μg/mlのトリ
プシン（牛膵臓から、シグマ（Sigma）〕を含む溶液40
μを添加し、pH8.2の0.1Mトリス、0.02M CaCl2で容積
を500μに調節し、室温で10分間インキュベートし
た。燐酸塩緩衝食塩水中10mg/mlのアゾコル（Azocoll）
〔カルバイオケム（Calbiochem）〕を含む溶液1mlを添
加し、混合物を、10分間間隔で混合しながら37℃に於て
30分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上澄
液のA520を測定した。ヒトATならびに上記のようにして
作製したMet358−AT、Val358−AT、Arg358−ATについて
の測定結果を第３表に示す。
プシン（牛膵臓から、シグマ（Sigma）〕を含む溶液40
μを添加し、pH8.2の0.1Mトリス、0.02M CaCl2で容積
を500μに調節し、室温で10分間インキュベートし
た。燐酸塩緩衝食塩水中10mg/mlのアゾコル（Azocoll）
〔カルバイオケム（Calbiochem）〕を含む溶液1mlを添
加し、混合物を、10分間間隔で混合しながら37℃に於て
30分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上澄
液のA520を測定した。ヒトATならびに上記のようにして
作製したMet358−AT、Val358−AT、Arg358−ATについて
の測定結果を第３表に示す。
本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵母細胞の
抽出物から免疫吸着によって精製することができる。免
疫吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシンに対する
親和性精製抗体を、キュアトレカサス（Cuatrecasas）
（J. Biol. Chem.245:3059、1970）の方法に従ってCNBr
活性化セファロースに共有結合させることによって調製
することができる。破壊した細胞を、0.5MのNaClを含む
pH7.2の燐酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出液をカラ
ムに適用し、カラムを3M NaSCNで溶出した。
抽出物から免疫吸着によって精製することができる。免
疫吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシンに対する
親和性精製抗体を、キュアトレカサス（Cuatrecasas）
（J. Biol. Chem.245:3059、1970）の方法に従ってCNBr
活性化セファロースに共有結合させることによって調製
することができる。破壊した細胞を、0.5MのNaClを含む
pH7.2の燐酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出液をカラ
ムに適用し、カラムを3M NaSCNで溶出した。
本発明の部位特異性突然変異誘発AT蛋白質は、遺伝的
ZZ−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損なら
びにATの不十分なレベルまたは患者が野生型ATと抗原反
応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用であり
得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻害性肺
疾患や成人呼吸困難症候群のような肺嚢の進行性消化に
関する他の肺疾患を治療することができる。ヘビースモ
ーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫も治療
することができる。嚢胞性線維症や関節炎のような必ず
しも肺に関係のない疾患をも治療することができる。ア
ルファ−１−抗トリプシンの総説についてはガデク（Ga
dek）（上掲）を参照されたい。
ZZ−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損なら
びにATの不十分なレベルまたは患者が野生型ATと抗原反
応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用であり
得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻害性肺
疾患や成人呼吸困難症候群のような肺嚢の進行性消化に
関する他の肺疾患を治療することができる。ヘビースモ
ーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫も治療
することができる。嚢胞性線維症や関節炎のような必ず
しも肺に関係のない疾患をも治療することができる。ア
ルファ−１−抗トリプシンの総説についてはガデク（Ga
dek）（上掲）を参照されたい。
ATの突然変異体形の上記用途に加えて、アミノ酸358
に於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異からな
る蛋白質は、例えば播種血管内凝固の治療に於て血液凝
固防止のために用いることができる。
に於けるメチオニンからアルギニンへの突然変異からな
る蛋白質は、例えば播種血管内凝固の治療に於て血液凝
固防止のために用いることができる。
本発明の蛋白質は、通常の製剤用担体と混合すること
ができる。好ましくは、本発明の蛋白質は、静脈内また
は吸入によって投与することができる。有効投与量は、
症状の重度および患者の体重によって異なるが、本発明
の蛋白質を0.5−10.0g/週の範の投与量で静脈内投与す
ることが多くの場合有効である。投与方法が吸入の場合
には、上記よりも低い投与量で有効であり得る。部位特
異性突然変異誘発ATが消化管中での早期分解を防ぐため
のカプセルまたは被覆担体内で保護されるならば経口投
与も有効であり得る。
ができる。好ましくは、本発明の蛋白質は、静脈内また
は吸入によって投与することができる。有効投与量は、
症状の重度および患者の体重によって異なるが、本発明
の蛋白質を0.5−10.0g/週の範の投与量で静脈内投与す
ることが多くの場合有効である。投与方法が吸入の場合
には、上記よりも低い投与量で有効であり得る。部位特
異性突然変異誘発ATが消化管中での早期分解を防ぐため
のカプセルまたは被覆担体内で保護されるならば経口投
与も有効であり得る。
本発明の特別な好ましい実施態様について説明した
が、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろ
う。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべき
ものである。
が、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろ
う。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべき
ものである。
第1A図および第1B図は、ヒトアルファ−１−抗トリプシ
ンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのDNAおよ
びアミノ酸配列であり、 第２図はラックＺ遺伝子の開始に於ける多重制限部位か
らなるpUC13のDNA配列であり、 第３図は突然変異体Val358−AT配列を含むベクターpFAT
POT37の作製のためのスキームである。
ンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのDNAおよ
びアミノ酸配列であり、 第２図はラックＺ遺伝子の開始に於ける多重制限部位か
らなるpUC13のDNA配列であり、 第３図は突然変異体Val358−AT配列を含むベクターpFAT
POT37の作製のためのスキームである。
フロントページの続き (72)発明者 グレン ヒトシ カワサキ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト シツクステイー ンス アベニユー 1547 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ，309［12］（1983）Ｐ．694−698 Ｎａｔｕｒｅ，304（1983）Ｐ．230− 234 Ｎａｔｕｒｅ，298（1982）Ｐ．329− 334
Claims (1)
- 【請求項１】X358−アルファ−１−アンチトリプシン
（式中Ｘは、バリン又はアルギニンである）で表される
アミノ酸配列をコードする構造遺伝子を含むDNA構造物
で、宿主微生物を形質転換する工程を含み、該遺伝子が
哺乳類のアルファ−１−アンチトリプシンの組換え変異
体をコードし、且つ該DNA構造物が前記宿主微生物中で
複製能力を有するものである、哺乳類のアルファ−１−
アンチトリプシン変異体を発現する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US58941084A | 1984-03-14 | 1984-03-14 | |
| US589410 | 1984-03-14 | ||
| US709382 | 1985-03-07 | ||
| US06/709,382 US4711848A (en) | 1984-03-14 | 1985-03-07 | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5115129A Division JP2750257B2 (ja) | 1984-03-14 | 1993-04-06 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6112289A JPS6112289A (ja) | 1986-01-20 |
| JP2539781B2 true JP2539781B2 (ja) | 1996-10-02 |
Family
ID=27080550
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60051553A Expired - Fee Related JP2539781B2 (ja) | 1984-03-14 | 1985-03-14 | アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
| JP5115129A Expired - Fee Related JP2750257B2 (ja) | 1984-03-14 | 1993-04-06 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
| JP9275648A Pending JPH10113193A (ja) | 1984-03-14 | 1997-10-08 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5115129A Expired - Fee Related JP2750257B2 (ja) | 1984-03-14 | 1993-04-06 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
| JP9275648A Pending JPH10113193A (ja) | 1984-03-14 | 1997-10-08 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4711848A (ja) |
| EP (2) | EP0155188B1 (ja) |
| JP (3) | JP2539781B2 (ja) |
| AT (1) | ATE99358T1 (ja) |
| AU (1) | AU593766B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341219C (ja) |
| DE (1) | DE3587703D1 (ja) |
Families Citing this family (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA8410063B (en) * | 1984-01-30 | 1985-10-30 | Smith Kline Rit | Expression of human alpha-1-antitrypsin in yeast |
| US4732973A (en) * | 1984-06-14 | 1988-03-22 | Chiron Corporation | Active site modified protease α-1-antitrypsin inhibitors |
| DE3585969D1 (de) * | 1984-06-14 | 1992-06-11 | Chiron Corp | Protease-inhibitoren des alpha-1-antitrypsin typs mit modifizierter aktiever stelle und deren herstellung. |
| EP0169114B1 (fr) * | 1984-06-19 | 1991-01-16 | Transgene S.A. | Dérivés de l'alpha 1-antitrypsine humaine et procédé pour leur préparation |
| US5422090A (en) * | 1984-08-13 | 1995-06-06 | Biotechnology Australia, Pty., Ltd. | Human PAI-2 |
| CA1299120C (en) * | 1984-10-22 | 1992-04-21 | Glenn Kawasaki | Stable dna constructs for expression of alpha-1-antitrypsin |
| US5871956A (en) * | 1984-12-06 | 1999-02-16 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| US6132990A (en) * | 1984-12-06 | 2000-10-17 | Amgen Boulder Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US5900400A (en) * | 1984-12-06 | 1999-05-04 | Amgen Inc. | Serine protease inhibitor analogs |
| ATE92935T1 (de) * | 1984-12-06 | 1993-08-15 | Synergen Biolog Inc | Serinproteaseinhibitoren und isolierungsverfahren dazu. |
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