KR960013618B1 - C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생산방법 - Google Patents

C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생산방법 Download PDF

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산토리 가부시키가이샤
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Abstract

내용 없음.

Description

C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생산방법
제1도는 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg를 카복시펩티다제 B(CpB)로 처리하여 형성된 hCH-Gly의 용출도이다.
제2도는 동물 세포내에서 C-말단 α-아미드화 효소 XA 457또는 XA799BgLⅡ를 발현하는 플라스미드 pKDPXA457또는 pKDPXA799 BglⅡ의 구조도이다.
제4도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 시험관내 아미드화에 대한 아스코르브산의 효과를 나타내는 그래프이다.
제5도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 시험관내 아미드화에 대한 카탈라제 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
제6도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 시험관내 아미드화에 대한 구리 양이온(Cu+2)의 효과를 나타내는 그래프이다.
제7도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 시험관내 아미드화에 대한 완충용액 및 이의 pH의 효과를 나타내는 그래프이다.
제8도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 시험관내 아미드에 대한 완충액 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
제9도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 시험관내 아미드화에 대한 기질(hCT-Gly)농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
제10도는 XA799BglⅡ에 의한 hCT-Gly의 hCT로의 전환에 대한 시험관내 반응 0,30 및 120분에 수득한 샘플에 대한 C18HPLC로부터의 용출도이다.
제11도는 염기성 아미노산의 아미노산 서열이 상이한 3종류의 키메릭 단백질중 하나를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드의 작제도이다.
제12도는 C-말단 아미노산 서열이 상이한 4종류의 키메릭 단백질의 이.콜라이내 생산성을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 결과도이다.
제13-1내지 13-4도는 플라스미드 pXA457에 존재하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열도이다.
제14-1내지 제14-3도는 플라스미드 pXA799에 존재하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열도이다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 C-말단 α-아미드화된 펩타이드 전구체의 생산방법, C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생산 방법, 및 C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생산에 사용된 C-말단 α-아미드화 효소의 생산방법에 관한 것이다.
2. 관련기술의 설명
mRNA로부터 해독된 후, 일부 종류의 펩타이드 또는 단백질의 경우 진핵 세포내에서 세포내 효소에 의하여 변형되어 천연 형태의 펩타이드 또는 단백질로 완전해짐(해독-후 변형)이 일반적으로 알려져 있지만, 이.콜라이와 같이, 진핵세포 기원의 펩타이드 또는 단백질의 생산에 광범위하게 사용되고 있는 원핵세포 숙주는 발현된 펩타이드 또는 단백질을 해독-후 변형시킬수 없으므로 원핵세포 숙주를 사용하는 재조합 DNA기술로 진핵세포 펩타이드 또는 단백질을 직접 생산하기가 종종 어렵다.
펩타이드 또는 단백질의 진핵세포에 의한 해독-후 변형이 한가지 특징은 펩타이드 또는 단백질의 카복시말단(C-말단)의 α-위치가 아미드화되는, 즉, -COOH가 -CONH2로 전환되는 변형반응이 일어난다는 점이며, 다수의 생리학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 이러한 변형과정을 거치며 일부경우에서는 펩타이드 또는 단백질의 전술한 변형과정이 이의 생리학적 활성에 필수적인 것으로 알려져있다. 예를들면, 천연의 사람 캘시토닌의 C-말단에서 프롤린 아미드 잔기가 프롤린 잔기로 전환됨으로써 이의 생리학적 활성을 본래 활성의 1/1,600로 저하시킨다.
조직에서 발생하는 α-아미드 형성 기전을 규명하는 중요성 및 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 사용하여 C-말단 α-아미드화된 펩타이드를 생산하기 위한 효소의 증진된 유용성으로 인하여 진핵세포에 특징적인 C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생합성에 대한 상세한 기전을 규명하기 위한 다수의 시도가 수행되어 왔다. 이러한 규명과정에서 첫 번째로 아미드화된 펩타이드 전구체의 구조가 아미드화된 펩타이드의 cDNA분석으로부터 규명되고 그 결과 이러한 아미드화된 펩타이드의 일반적인 생합성 기전은 RNA가 아미드화된 펩타이드 전구체로 해독된 다음 C-말단 α-아미드화 효소에 의하여 이의 C-말단의 α-위치에서 아미드화되는 것으로 이해되고 있다.
주목할점은 전술한 반응에서, C-말단 α-아미드화 효소에 대한 기질로서 C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 전구체가 일반식 R-X-Gly(여기에서, R은 펩타이드 또는 단백질의 N-말단쪽의 아미노산 서열은 나타내고, X는 C-말단에서 α-아미드화되는 아미노산 잔기를 나타내며 Gly는 글리신 잔기를 나타낸다)로 표현되는 펩타이드 또는 단백질이다.
한편, 돼지 뇌하수체의 경우, 처음에는 합성기질인 D-Tyr- Val-Gly를 D-Tyr-Val-NH2로 전환시키는 α-아미드화 활성이 특징화되었고[참조문헌 : Bradburg, A.F. et al., Nature 298, 686-688,1982]기질의 C-말단 글리신이 α-아미드화에 대한 질소-공여체 역할을 함이 입증되었다. 또한, 래트의 뇌하수체로부터 유도된 α-아미드화 효소 활성을 띄기 위해서는 구리 양이온, 아스코르브산 및 산소분자가 필요함이 보고되었다[참조문헌 : Eipper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 80, 5144-5148, 1983]. 또한, C-말단 α-아미드화효소도 보고되었지만 [참조문헌 : Husain, I. et al., FEBS Lett., 152 227-281, 1983 ; and Kizer, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 81, 3228-3232, 1984]정제된 효소에 관하여는 보고된 바 없다. 최근에 와서, 소의 뇌하수체로부터 C-말단 α-아미드화 효소가 부분적으로 정제되었으며[참조문헌 : Murthy A. S. N. et al., J. Biol. Chem., 261, 1815-1822, 1986] 분자량과 전기적 전하가 상이한 몇몇 유형의 효소가 존재하는 것으로 나타났다.
최근에 와서는, 제노푸스 래비스(Xenoopus laevis)의 피부로부터 C-말단 α-아미드화 효소를 균질하고 순수한 형태로 분리하는데에 성공하였으며[참조문헌 : Mizuno, K. et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 137, 984-991, 1988, 및 일본국 특허원 제61-131089호], cDNA를 수득하여 서열분석함으로써 제노푸스 리비스 기원의 피부의 C-말단 α-아미드화 효소의 완전한 아미노산 1차 서열의 결정에도 성공하였다[참조문헌 : Mizuno, K. et alm., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148, 546-552, 1987].
한편, 소 뇌하수체의 C-말단 α-아미드화효소의 cDNA가 클로닝 되었으며[참조문헌 : Eipper, B. et al., Mol Endo. 1, 777-790, 1987], 소 뇌하수체의 효소가 제노푸스 래비스 기원의 전술한 효소와는 현격히 상이함이 입증되었다.
전술한 보고│서│에 따르면 진핵세포 기원의 다수의 C-말단 α-아미드화 효소가 존재함이 입증되었으며, 이러한 사실은 각각의 효소에 다른 것들과 특이적으로 상이한 특정 기질이 있으며; 즉, 아직까지는 완전하게 밝혀지지는 않았지만, 특정의 C-말단 α--아미드화 효소가 특정의 α-아미드화된 펩타이드에 대해 존재함을 암시한다.
전술한 바와 같이 규명된 바처럼 진핵세포내 아미드화된 펩타이드의 생합성 기전을 고려해볼때, 후술되는 과정에 의하여 다량의 아미드화된 펩타이드가 생산될수 있을 것으로 기대된다.
즉, 첫 번째로는 일반식 R-X-Gly의 아미드화된 펩타이드 전구체가 이,콜라이 등의 원핵세포내에서 유전공학 처리에 의해 경제적으로 대량 생산되고; 두 번째로는, 진핵세포 기원의 C-말단 α-아미드화 효소가 대량제조되며 ; 마지막으로는, 전구체가 최적 조건하에 C-말단 α-아미드화 효소를 사용하여 목적하는 아미드화된 펩타이드로 전환된다.
전술한 개념을 토대로, 아미드화된 펩타이드를 생산하려는 다수의 시도가 있었다.
즉, 유전공학 처리에 의한 아미드화된 펩타이드 전구체 생산과 관련한 다수의 보고서가 출간되었다.
예를들면, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)단백질의 활성 영역 및 이.콜라이내에서 발현된 사람 캘시토닌 전구체를 포함하는 융합 단백질로부터 사람 캘시토닌 전구체(hCT-Gly)를 생산하는 방법이 문헌[참조 : Bennett A. D. et al., PCT Japanese National Publication No. 60-501391; WO 84/04756]에 기술되어 있다. 그러나, 이러한 방법에 따르면, 44mg의 융합 단백질은 단지 1.1 내지 2.0mg의 사람 캘시토닌 전구체(hCT-Gly)만을 제공함으로, 이러한 방법으로는 hCT-Gly가 효율적으로 생산되지 않는다.
한편, 본 발명가를(일본국 특허원 제63-49723; 유럽 특허 제0281418 A2호)에 의하여 이.콜라이 내에서 발현된 β-갈락토시다제 및 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Arg로부터 유도된 단백질을 포함하는 융합 단백질로부터, 사람 캘시토닌 전구체 잔기를 함유하는, hCT-Gly-Lys-Lys-Arg의 효율적인 생산방법이 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 펩타이드 자체는 C-말단 α-아미드화 효소에 대한 기질이 아니며, 따라서 전구체 hCT-Gly로 전환되어야한다.
더욱이, 산업용으로 충분한 C-말단 α-아미드화 효소의 양을 수득하기 위한 선택 및 방법[참조문헌 : Eeton M.A.W. et al., PCT Japanese National Publication No. 63-501541; WO 87/01729]과 관련하여 돼지 뇌하수체로부터 부분적으로 정제된 C-말단 α-아미드화 효소를 사용한 사람 캘시토닌의 생산방법이 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법, 및 기타의 공지된 방법에 따라서는, 아미드화된, 펩타이드의 산업적 생산에 사용하기 위한 충분량의 C-말단 α-아미드화효소를 수득하기가 경제적인 면에서 볼때 어렵다.
이와 관련하여, 본 발명가들은(일본국 특허원 제62-306867; 유럽 특허 제0299790 A2호)유전공학에 의해 제노푸스 래비스 피부 기원의 C-말단 α-아미드화 효소 및 이의 유도체를 대량으로 제공하는 방법을 개발해 내었다. 그러나, 이.콜라이 내에서 발현된 제노푸스 레비스 기원의 C-말단 α-아미드화 효소 및 이의 유도체는 제노푸스 래비스 피부로부터 정제된 것보다 비교적 좀더 낮은 활성을 나타내므로, α-아미드화된 펩타이드의 대량 생산에 사용하기 위한 비교적 활성이 높은 C-말단 α-아미드화 효소가 요구된다.
전술한 바와같이, C-말단 α-아미드화 효소에 의해 아미드화된 펩타이드를 이의 유도체로부터 시험관 생산하기 위한 최적 조건과 관련하여, 이와같은 효소 반응은 구리 양이온(Cu2+), 산소분자, 아스코르브산, 및 카탈라제에 의존한다. 그러나, 돼지 뇌하수체로부터 부분 정제된 C-말단 α-아미드화 효소를 사용하여, 이 효소에 대한 최적 조건하에서 사람 캘시토닌을 이의 전구체로부터 생산하는 경우, 전구체의 용해도는 효율적인 효소 반응에는 충분치 않다. 따라서, 효율적인 시험관내 효소반응을 달성하기 위해서는 목적 펩타이드에 대한 최적 조건을 찾아내야 한다.
전술한 바와 같이, 대량의 아미드화된 펩타이드를 경제적으로 생산하기 위해서는 적어도 세가지의 기술적인 문제, 즉, (1)목적-아미드화된 펩타이드에 대한 전구체 펩타이드의 효율적인 생산, (2)효능이 높은 C-말단 α-아미드화 효소의 충분량 생산 및 (3) C-말단 α-아미드화 효소를 사용하여 특정 전구체를 목적 펩타이드로 시험관내 전환시키기 위한 최적 조건의 결정 문제가 해결되어야한다. 따라서, 현재로서는 이러한 문제를 해결하려는 연구가 집중적으로 착수되고 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 최적 조건하에서 일반식R-X-Gly로 표현되는 아미드화된 펩타이드 전구체를 대량 생산하는 경제적인 방법, 효능이 높은 C-말단 α-아미드화 효소의 대량 생산 방법 및 아미드화된 펩타이드의 생산 방법을 제공한다.
더욱 구체적으로 말해서, 본 발명은 일반식(I)의 펩타이드 또는 단백질을 카복시펩티다제 B로 가수분해하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 일반식(II)의 펩타이드 또는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
R-X-Gly-B (I)
R-X-Gly (II)
상기식에서, X는 아미노산 잔기를 나타내고, Gly는 일반식(I)의 경우에는 글리신 잔기를 나타내고, 일반식(II)의 경우에는 C-말단 글리신 잔기를 나타내며, B는 리신 또는 아르기닌 잔기, 필수적으로 리신 또는 아르기닌 잔기로 이루어진 올리고펩타이드 또는 리신 및 아르기닌 잔기의 배합물을 나타내며, R은 펩타이드 또는 단백질의 잔여 부분을 나타낸다.
또한, 본 발명은 일반식(II)의 펩타이드 또는 단백질을 제노푸스 래비스 기원의 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체, 또는 사람 갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체로 처리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 일반식(III)의 펩타이드 또는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
R-X-Gly (II)
R-X-NH2(III)
상기 식에서, X는 α-아미드화되는 아미노산 잔기를 나타내고, Gly는 펩타이드 글리신 잔기를 나타내며, R은 펩타이드 또는 단백질의 잔여부분을 나타내며, X-NH2는 C-말단 α-아미드화된 아미노산을 나타낸다.
추가로, 본 발명은 (1)일반식(I)의 펩타이드 또는 단백질을 카복시펩티다제 B로 가수분해시켜 일반식(II)의 중간체 펩타이드 또는 단백질을 생성시키고, (2)일반식(II)의 중간체 펩타이드 또는 단백질을 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체로 처리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 일반식(III)의 펩타이드 또는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
R-X-Gly-B (I)
R-X-Gly (II)
R-X-NH2(III)
상기 식에서, X는 일반식(I)의 경우에는 아미노산 잔기를 나타내고, 일반식(II)의 경우에는, α-아미드화되는 아미노산 잔기를 나타내고, Gly는 일반식(I)의 경우에는 글리신 잔기를 나타내고, 일반식(II)의 경우에는 C-말단 글리신 잔기를 나타내며, B는 리신 또는 아르기닌 잔기, 필수적으로 리신 또는 아르기닌 잔기로 이루어진 올리고펩타이드 또는 리신 또는 아르기닌 잔기의 배합물을 나타내며, R은 펩타이드 또는 단백질의 잔여 부분을 나타내며, X-NH2는 C-말단 α-아미드화된 아미노산을 나타낸다.
본 발명은 또한 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체를 암호화하는 DNA를 함유하고, 이를 발현할수 있는 플라스미드를 사용하여 형질전환시킨 동물 세포를 배양하고 ; 효소 또는 이의 유도체를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한(1)융합 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현백터를 사용하여 형질전환시킨 숙주를 배양하여 일반식(O)의 융합 단백질를 수득하고; (2)융합 단백질을 회수하며; (3)통상적인 방법으로 융합 단백질을 절단하여 파트너 단백질(P)와 일반식(I)의 펩타이드 또는 단백질을 형성시킨 다음; (4)이들의 등전점의 차이를 이용하여 단백질(P)로부터 펩타이드 또는 단백질(I)을 분리해내고 ; (5)펩타이드 또는 단백질(I)을 카복시펩티다제 B로 가수분해하여 목적 펩타이드 또는 단백질(II)를 형성시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 일반식(II)의 펩타이드 또는 단백질을 생산하여 방법을 제공한다.
R-X-Gly-B (I)
R-X-Gly (II)
P-R-X-Gly-B (O)
상기 식에서, X는 아미노산 잔기를 나타내고, Gly는 일반식(II)의 경우에는 C-말단 글리신 잔기를 나타내고 일반식(O) 및 (I)에서는 글리신 잔기를 나타내며, R은 일반식(I) 및 (II)의 경우에는 펩타이드 또는 단백질의 잔여 부분을 나타내고 일반식(O)의 경우에는 단백질의 잔여 부분을 나타내며, P는 융합 단백질의 파트너 단백질을 나타내고, B는 C-말단 리신 또는 이르기닌 잔기 또는 필수적으로 리신 또는 아르기닌 잔기로 이루어진 올리고펩타이드 또는 리신 및 아르기닌 잔기의 배합물을 나타낸다.
본 발명은 또한 (1)융합 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현벡터를 사용하여 형질전환시킨 숙주를 배양하여 일반식(O)의 융합 단백질을 수득하고; (2)융합 단백질을 회수하며; (3)통상적인 방법으로 융합 단백질을 절단하여 파트너 단백질(P)와 일반식(I)의 펩타이드 또는 단백질을 형성시킨 다음 ; (4)이들의 등전점의 차이를 이용하여 파트너 단백질(P)로부터 펩타이드 또는 단백질(I)을 분리해내고; (5)펩타이드 또는 단백질(I)을 카복시펩시다제 B로 가수분해하여 중간체 펩타이드 또는 단백질(II)를 형성시키며; (6)펩타이드 또는 단백질(II)을 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체로 처리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 일반식(III)의 펩타이드 또는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
R-X-Gly-B (I)
R-X-Gly (II)
P-R-X-Gly-B (O)
R-X-NH2(III)
상기 식에서, X는 아미노산 잔기를 나타내고, Gly는 일반식(II)의 경우에는 C-말단 글리신 잔기를 나타내고 일반식(O) 및 (I)에서는 글리신 잔기를 나타내며, R은 일반식(I),(II) 및 (III)의 경우에는 펩타이드 또는 단백질의 잔여 부분을 나타내고 일반식(O)의 경우에는 단백질의 잔여 부분을 나타내며, P는 융합 단백질의 파트너 단백질을 나타내며, B는 C-말단 리신 또는 아르기닌 잔기 또는 필수적으로 리신 또는 아르기닌잔기로 이루어진 올리고펩타이드 또는 리신 및 아르기닌 잔기의 배합물을 나타내며, X-NH2는C-말단 α-아미드화된 아미노산을 나타낸다.
본 발명은 또한-37번 아미노산으로 시작하여 363번을 아미노산으로 끝나는 아미노산 서열(제13-1도 내지 13-3도)을 갖는 C-말단 α-아미드화 효소; 및 -39번 아미노산으로 시작하여 692번 아미노산으로 끝나는 아미노산 서열(제14-1도 내지 14-3도)을 갖는 C-말단 α-아미드화 효소를 제공한다.
바람직한 양태의 설명
(1)아미드화용 전구체 및 이의 생산방법
일반식R-X-Gly(여기에서, X는 아미드시킬 아미노산 잔기를 나타내고, Gly는 C-말단 글리신 잔기를 나타내며, R은 펩타이드 또는 단백질의 잔여 부분을 나타낸다)의 아미드화용 전구체를 효과적으로 제조하기 위해서는, 본 발명에 따라 일반식(I)의 펩타이드 또는 단백질을 카복시펩티다제 B(CpB)로 처리한다.
R-X-Gly-B (I)
상기 식에서, X는 최종적으로 아미드화시킬 아미노산을 나타내고, Gly는 글리신 잔기를 나타내며, B는 C-말단 아르기닌 또는 리신 잔기, 또는 필수적으로 이르기닌 또는 리신 잔기로 이루어진 올리고펩타이드 또는 이르기닌과 리신의 배합물을 나타내며, R은 펩타이드 또는 단백질의 잔여 부분을 나타낸다. 사람 캘시토닌의 전구체는 특정 실시예로서 기술된다. 본 발명가들에 의하여 사람 캘시토닌 전구체 잔기를 함유하는 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg의 효율적인 대량 생산 방법(일본국 특허원 제63-49723호; 유럽 특허 제0281418 A2호)이 보고되었으나, 이러한 펩타이드는 C-말단 α-아미드화 효소에 대한 기질이 아니다.
따라서, 사람 캘시토닌 전구체(hCT-Gly)를 수득하기 위해서는, C-말단 펩타이드 Lys-Lys-Arg가펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg로부터 제거되어야 한다. 본 발명가들은 사람 캘시토닌 전구체 hCT-Gly가 펩타이드를 카복시펩티다제 B(CpB)로 처리함으로써 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg로부터 매우 효율적으로 제조될수 있음을 알아내었다.
주목할점은, 이러한 방법이 일반식(I)의 펩타이드를 일반식(II)의 아미드화용 전구체로 전환시키는 과정에 일반적으로 적용될수 있고, 펩타이드(I)는 통상적인 방법에 따라 화학적 합성이나 유전공학으로 제조할수 있다.
아미드화용 전구체를 제조하기 위한 전술한 방법은 전구체 R-X-Gly가 이.콜라이를 사용하여 융합 단백질로서 직접 생성되는 통상적인 방법보다 우수하다.
예를 들면, 사람 캘시토닌 전구체 hCT-Gly는 아스파트산 잔기 및 리신 잔기를 포함한 33개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드이므로, 거의 중성 pH에서 등전점(pI)이 나타난다. 따라서, 단일 이온-교환 컬럼크로마토그래피로는 융합 단백질을 절단한 후 파트너 단백질로부터 전구체를 분리하기가 어려운데, 그 이유는 대부분의 경우 hCT-Gly는 중성 등전점을 나타내기 때문이다.
이와 반대로, 전구체 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg는 염기성 pI를 나타내므로, 용합 단백질을 형성하는 파트너 단백질로부터 단일 이온 교환 크로마토그래피에 의해 쉽게 분리시킬수 있다.
더욱이, 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg를 CpB로 절단하여 형성시킨 전구체 hCT-Gly는, 중성 pI를 나타내지만, 부산물 및 출발물질이 염기성 pI를 나타내기 때문에, 가능한 부산물 hCT-Gly-Lys 및 hCT-Gly-Lys-Lys 및 출발물질 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg로부터 단일 이온 교환 크로마토그래피에 의해 쉽게 불리할수 있다.
전구체 hCT-Gly가 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg로부터 제조되는, 본 발명의 두 번째 장점은 놀랍게도 이.콜라이 숙주내에서, β-갈토시다제 및 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg부분을 포함하는 융합 단백질이, β-갈락토시다제 및 hCT-Gly부분을 포함하는 융합 단백질에 비하여, 현저히 높은 수율로 생성된다는 사실이 밝혀졌다. 더욱이, 놀랍게도, hCT-Gly-Arg, hCT-Gly-Arg-Arg등을 포함하는 융합 단백질이 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg를 포함하는 융합 단백질에 버금가는 높은 수율로 생성될수 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 hCT-GLY가 파트너 단백질에 연결된 융합 단백질로서 전구체 hCT-Gly가 발현되는 통상적은 방법보다 현격히 유리하다.
상기한 바로부터 명백히 알수 있는 바와같이, 본 발명에 따라, 일반식 R-X-Gly-B에서 B는 아르기닌 또는 리신과 같은 염기성 아미노산 또는 필수적으로 2내지 약 10개의 염기성 아미노산 잔기, 예를들면, 아르기닌 잔기 또는 리신 잔기로 이루어진 올리고펩타이드 또는 아르기닌과 리산 잔기의 배합물일 수 있다.
(2)C-말단 α-아미드화 효소의 생성방법
본 발명가들은 제노푸스 래비스 피부 기원의 C-말단 α-아미드화 효소 및 이의 유도체를 이.콜라이 숙주내에서 대량으로 발현시키는 데에 성공하였다(일본국 특허원 제62-306867; 유럽 특허 0299790 A2호). 그러나, 이와같은 방법에서, C-말단 α-아미드화 효소 및 이의 유도체는 이.콜라이 세포내에서 변성(denaturation)되므로 C-말단 α-아미드화 활성을 보이지 않는다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 상기와 같이 수행하여 제조된 효소의 불활성 형은 복원(renaturation)되어야 한다. 이러한 문제점은 불활성 형을 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 변성제로 처리한 다음 복원시킴으로 써 부분적으로 해결되었지만, 이러한 방법은 제노푸스 래비스 피부로부터 추출된 천연 효소의 경우보다 비교적 활성이 낮은 복원 효소를 제공한다. 본 발명가들은 이.콜라이에서 생성된 효소의 활성이 전술한 바와같이 비교적 낮은 이유를 다음과 같이 생각하였다 : 제노푸스 래비스 피부 기원의 C-말단 α-아미드화 효소, 및 이의 유도체가 다수의 시스테인 잔기를 함유함으로(예를들면, 제노푸스 래비스 피부 기원의 천연 효소는 10개의 시스테인 잔기를 함유한다), 이러한 단백질이 이.콜라이 세포에서 발현되는 경우 이들은 천연 효소에서의 동일한 정확한 디설파이드 결합을 형성할수 없다. 따라서, 본 발명가들은 이.콜라이에서 발현된 효소를 디티오트레이롤 또는 2-머캅토 에탄올등의 환원제를, 전술한 변성체와 함께 처리한 다음, 환원된 단백질을 산화시킴으로써 효소 활성을 증진시키고자 시도하였으나, 이러한 방법은 효소 활성을 증진시키는데는 실패하였다.
전술한 난점을 제거하기 위하여 본 발명은 C-말단 α-아미드화 효소, 또는 이의 유도체를 동물 세포등의 진핵세포에서 발현시키는, 효소 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
제노푸스래비스 기원의 2종류의 C-말단 α-아미드화 효소(XA457 및 XA 799)를 암호화하는 DNA는 각각 플라스미드 pXA 457 및 pXA 799에 각각 클로닝되어 있다(일본국 특허원 제62-306867호; 유럽 특허 제0299790 A2호). 효소 XA 457-암호화 cDNA 의 뉴클레오타이드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열은 제13-1내지 13-4도(상기 특허원 제1-1 내지 1-3도)에 제시되어 있고, 효소 AX799-암호화 cDNA의 뉴클레오타이드 서열, 및 이에 상응하는 아미노산 서열은 제14-1 내지 14-4도(상기 특허원 제16-1내지 16-3도)에 제시되어 있다. 따라서, 본 발명의 경우, 어떠한 효소 또는 이의 유도체를 암호화하는 DNA도 전술한 클로닝된 cDNA를 출발물질로 사용하여 제조할수 있다.
본 발명의 경우, 천연 효소의 예로서는 제13-1내지 13-3도에 제시딘 cDNA에 의해 암호화된 -37번 아미노산에서부터 363범 아미노산까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 언급될수 있고, 효소 유도체의 예로서는 제14-1 내지 14-3도에 제시된 cDNA 에 의해 암호화된 -39번 아미노산부터 692번 아미노산까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 추가의 C-말단 투이신이 언급될수 있다. 전술한 폴리펩타이드를 발현시키기 위해서는, 목적 폴리펩타이드-암호화 cDNA를 SV 40프로모터의 조절하에 놓이도록 삽입시킨 발현 플라스미드 pKDPXA 457 및 pKDPXA 799 BglII를 작제한다. 이어서, 형질감염체 CHO/pKDPXA 457-a 및 CHO/pKDPXA 799 BglII-a를 수득하기 위하여, 상기 플라스미드를 사용하여 CHO(중국산 햄스터 난세포)를 형질감염시킨다. 계속해서, 형질감염된 세포를 메토트렉세이트를 증가하는 농도로 함유하는 배지에서 배양하여 형질감염된 유전자를 증폭시키고, 최종적으로는 증폭시킨 세포를 스크린하여 목적 단백질을 대량 분비하는 클론을 수득하고 세포 상등액중 C-말단 α-아미드화 효소를 2000단위/ml의 양으로분비하는 클론 CHO/10C를 수득한다. XA799 BglII로 명명한, 분비된 C-말단 α-아미드화효소는 황산 암모늄을 사용하여 선택적으로 침전시킬수 있다. 따라서, 대량의 효소를 공업적으로 생산하는데 유용한 방법인, C-말단 α-아미드화 효소의 새로운 생산 방법이 개발된다.
(3)아미드화 반응에 대한 최적 조건의 결정
전술한 바와 같이, 비록 진핵세포가 상이한 유형의 C-말단 α-아미드화 효소를 함유하더라도, 반응에 대한 상세한 기질 특이성 및 최적 조건은 규명되지 않았다.
통상적으로, C-말단 α-아미드화 효소는 이의 최대 활성을 나타내기 위해서는 산소 분자, 구리 양이온 (Cu2+),아스코르브산 및 카탈라제를 필요로한다. 이와 같은 필수적인 요구 조건은 주로 D-Tyr-Val-Gly등의 합성 기질을 사용하여 결정한다.
한편, 일부 부분적으로 또는 완전히 정제된 C-말단 α-아미드화 효소는 최적 pH를 포함한, 특별한 최적 조건이 있다.
따라서, C-말단 α-아미드화 효소를 시험관내에서 사용하여 목적 단백질의 전구체를 이의 상응하는 아미드화된 단백질로 전환시키는 경우, C-말단 α-아미드화 효소에 대한 최적 조건은 효소에 대한 기질로서 전구체에 대한 최적 조건과 동일하지는 않다. 예를들면, 전술한 바와같이, 돼지 뇌하수체로부터 부분 정제된 C-말단 α-아미드화 효소를 사용하여 사람 캘시토닌을 생성시키는 경우, 효소반응에 대한 최적 조건은 사람 캘시토닌 전구체의 용해도를 너무 저하시켜 사람 캘시토닌을 수득할수 없다.
따라서, 목적하는 아미드화는 단백질 또는 펩타이드를 효율적으로 생산하기 위해서는, 사용된 C-말단 α-아미드화 효소와 목적 단백질 또는 펩타이드의 특징조합에 의존하는, 시험관내 효소 반응에 대한 최적 조건이 결정되어야한다.
따라서, 본 발명에서는 효소 XA 799 BglII를 사용하여 사람 캘시토닌을 이의 전구체, 즉, hCT-Gly로부터 생성시키는 경우의 최적 조건을 결정한다. 결정된 조건에는 a) 아스코르브산의 농도, b)카탈라제의 농도, c)구리 양이온(Cu2+)의 농도, d)완충액 및 이의 농도 및 pH, 및 e)전구체, 즉 기질의 농도가 포함된다. 결과적으로, a)아스코르브산의 최적 농도는 1내지 7mM이고, 20mM이상의 농도에서는 아미드화 효율이저하되며; b)카탈라제는 적어도 1μg/ml가 필요하며; c)구리 양이온 농도가 0내지 10μM로 증가될 경우 아미드화 반응 효율이 증가하여 10μM이상의 농도에서는 아미드화 반응 효율에 농도가 영향을 미치지 않으며, d)완충액의 유형, 농도 및 pH에 있어서, pH6내지 7의 10mM암모늄 아세테이트가 최적이며; e)기질의 농도는 5mg/ml까지 허용될수 있는 것으로 밝혀졌다. 전술한 조건하에서, 사람 캘시토닌 전구체hCT-Gly의 용해도는 사람 캘시토니을 생성시키기에 충분함에 주목한다.
따라서, 전술한 조건을 기준으로, 사람 캘시토닌을 효소 XA 799 BglII를 사용하여 전구체 hCT-Gly로부터 효율적으로 생성할수 있다.
본 발명에 따라, 일반식R-X-Gly의 아미드화된 펩타이드 또는 단백질의 전구체, 예를 들면, 사람 캘시토닌전구체 hCT-Gly는 카복시 펩티다제 B(CpB)를 사용하여, 전구체 잔기를 함유하는 일반식 R-X-Cly-B의 출발 펩타이드 또는 단백질, 예를들면, 사람 캘시토닌 전구체 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg에 대한 출발 펩타이드로부터 효율적으로 생산할수 있으며; C-말단 α-아미드화 효소는 동물 세포와 같은 진핵 숙주를 tk용하여 효율적으로 생산할수 있으며; 목적하는 아미드화된 펩타이드 또는 단백질은 최적 효소 반응 존거하에 C-말단 α-아미드화 효소를 사용하여 효율적으로 생성할수 있다.
효소 활성은 일반식 R-X-Gly의 기질을 R-X-NH2로 전환시키는 반응, 예를들면, 합성기질[125I]- Ac-Tyr-Phe-Gly를 [125I]-Ac-Tyr-Phe-NH2로 전환시키는 반응을 사용하여 분석한다.
즉, 표지된 기질(표시된 R-X-Gly)을 트리스-HCI완충액중 시험 효소 용액과 반응시킨, 이 반응 혼합물에 트리스-HCI 완충액 및 에틸 아세테이트를 가하고, 혼합한 후 전체를 원심분리하여 유기상 및 수성상을 분리한다. 비반응 표지된 기질(표지된 R-X-Gly)의 주요 부분은 수성상에 잔류하며, 아미드화된 표지 생성물(표지된 R-X--NH2)을 유기상에 옮기고, 기질 및 생성물을 용이하게 분리할수 있다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명의 C-말단 α-아미드화 효소는 다음의 공정에 따라 기질로서 합성 펩타이드[125I]-Ac-Tyr-Phe-Gly를 사용하여 분석한다. [125I] -Ac-Tyr-Phe-Gly(1pmo1, 70,000-150,000cpm)를 0.2M 트리스-HCI완충액(pH 7.0), 2μM CuSO4, 0.25mM 아스코르브산, 25μg 카탈라제(Boehringer) 및 0.1% 투브롤(PXtype, Nakarai Chemicals)을 함유하는 최종 용적 250μ1중, 효소제제와 함께 인큐베이트한다.
반응 혼합물을 37℃에서 1내지 4시간 동안 유지시킨 다음, 0.75m1의 1M 트리스-HCI 완충액(pH7.0) 및 에틸 아세테이트/물 혼합물의 유기상 2m1를 가한다. 이렇게하여 제조된 반응 혼합물을 볼텍스 혼합기상에서 격렬히 혼합하고, 3000rpm에서 3분간 원심분리한 후에, 분리된 유기상을 다른 시험과에 옮긴다. 유기 및 수성층의 방사능은 2-신틸레이션 계수기로 측정한다. 전술한 조건하에서, [125I]-Ac-Tyr-Phe-Gly의 방사능 98% 이상이 수성상에 잔류하고 [125I]-Ac-Tyr-Phe-NH2의방사능 98% 이상이 유기상에 이동되었다.
전환 수율은 에틸 아세테이트상 등의 유기상내 방사능: 총 방사능의 비율로부터 계산해냈다. 이와 같은 분석에서, 1단위는 1시간 동안 [125I]-Ac-Tyr-Phe-NH2로 50% 전환시키는 효소 활성으로서 정의한다.
본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세히 설명되나 이로써 제한되지는 않는다.
실시예 1
사람 캘시토닌 전구체(hCT-Gly)의 생성
출발 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg는 일본국 특허원 제63-49723호(유럽 특허 제0281418 A2호)에 기술된 HPCT와 동일한 화합물이고, 이 화합물의 제조방법은 인용된 특허 문헌에 기술되어있다.
먼저, 280mg의 펩타이드 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg를 30m1의 0.1N 아세트산에 용해시키고, 이 용액에 30m1의 트리스-HCI(pH 8.0) 및 물을 가하여 230m1의 반응 혼합물(pH 7.8)을 제조한다. 이어서, 반응 혼합물에 560μg의 카복시펩티다제 B(Sigma)를 가하고, 반응을 37℃에서 30분간 수행한다. 반응의 진행을 모니터링하기 위하여, 반응 혼합물의 분취량을 수득하고, YMC로 충진된 컬럼 α-303(0.46cm×15cm; Murα-yama Kagaku Kenkyusho)를 사용하여 고 성능 액체 크로마토그래피하고, 0.1% TFA중 0.1%트리플루오로아세트산(TFA) 및 50% CH3CN로형성된 직선 구배로 용출시켜 표적 펩타이드 hCT-Gly,반응 중간체 hCT-Gly-Lys-Lys 및 hCT-Gly-Lys, 및 출발물질 hCT-Gly-Lys-Lys-Arg를 분리해 내며, 그 결과 반응은 37℃에서30분내에 완료된다(제1도 참조). 반응 혼합물을 HPLC를 위한 YMC로 충진된 컬럼D-ODS-5(2cm×25cm; Murayama Kagaku Kenkyusho)에 걸고, 0.1% TFA내지 50%CH3CH로 용출시켜 분리한다. 이어서, hCT-Gly를 함유하는 분획을 합하여 동결건조시켜, 235mg의 hCT-Gly를 수득한다. 생성물을 6N 염산에서 24시간 동안 가수분해시키고, 아미노산 분석기(Hitachi Seisaku Shu 835-20)로 가수분해물을 분석하여 이론치에 응하는 아미노산 조성물을 수득함으로써 확인된다. 추가로, 단백질 서열분석기(Applied Biosystems; 470A Protein sequencer)를 사용하여 생성물의 아미노산 서열을 부분적으로 결정하며, 수득된 서열은 hCT-Gly의서열과 상응한다. 아미노산 분석 결과를 아래에 나타냈으며, 괄호안의 수는 이론치이다.
Asx 2.83(3), Thr 4.51(5), Ser 0.91(1), Glx 1.94(2), Pro 2.04(2), Gly 4.83(5), Ala 1.78(2), Val 0.98(1), Met 0.97(1), Ile 0.95(1), Leu 2.00(2), Tyr 0.95(1), Phe 2.89(3), Lys 0.99(1), His 0.97(1).
실시예 2
C-말단 α-아미드화 효소의 생성
(1)동물세포 발현 플라스미드 pKDPXA 457 및 pKDPXA 799 Bg1II의 작제
플라스미드 pKDPXA 457 및 pKDPXA 799 Bg1II는 제13-1도 내지 13-3도에 나타낸-37번 아미노산부터 363번 아미노산까지의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 cDNA 및 제14-1도 내지 14-3도에 나타낸-39번 아미노산부터 692번 아미노산까지의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화는 cDNA는 추가의 C-말단 아미노산 Leu를 각각 함유한다. cDNA는 SV 40 프로모터의 하부쪽에 위치하며, 이어서 래비트 β-글로빈 유전자로부터 유도된 폴리 A추가 시그날이 뒤따른다. 이러한 작제에 기인하여, cDNA는 SV 40 프로모터의 조절하에 전사되고, 생성된 mRNA는 스플라이스(splice)되며, 폴리 A는 스플라이스된 mRNA에 첨가된다. 추가로, 발현 플라스미드는 SV 40초기 프로모터의 조절하에 있는 ehfr(디하이드로폴레이트 리덕타제)를 함유함으로써, 삽입 유전자는 동물세포에서 증폭된다.
플라스미드 pKDPXA 457를 사용하여 형질전환시킨 이.콜라이는 이.콜라이 SBM-300으로 명명되고 부다 페이트 조약하에 기탁되어있다[기탁기관 : Fermentation Research Institute Agency of Industrial Scienceand Tchnology(FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubα-shi, Ibaraki-ken 305, J메무. rlxkrqjsgh : FERMBP-2235, 기탁일 : 1989. 1. 11]; 플라스미드 pKDPXA 799Bg1II를 사용하여 형질전환시킨 이.콜라이는 이.콜라이 SBM 301로 명명되고 부다페스트 조약하에 기탁되었다[기탁기관 : FRI, 기탁번호 : FERM-2236, 기탁일 : 1989.1.11
(2)pKDPXA 457또는 pKDPXA 799 Bg1 II의 CHO 세포로의 형질감염
플라스미드 pKDPXA 457또는 pKDPXA 799Bg1II는 칼슘 포스페이트 동시침전법을 사용하여 dhfr(디하이드로폴레이트 리덕타제)유전자가 결손된 CHO세포에 형질감염시킨다. dhfr유전자가 결손된 CHO세포주는 CHO dhfr-세포 SBM 306으로 지칭되고, 부다페스트 조약하에 기탁되어 있다[기탁기관 : FRI, 기탁번호 : FERM BP-2241, 기탁일 : 1989. 1. 11].
먼저, CHO dhfr-세포를 핵산을 함유하고 10% 소태아 혈청(FBS)(Flow,Lab.), 및 50U/m1 페니실린 G 및 50μg/m1스트렙토마이신으로 보충한 최소 필수 배지(MEM) α배지(GIBCO, α+ MEM)에서 배양한다.
이어서, 형질감염시키기 12시간 전에, 배양 세포를 80cm2T-플라스크(T 80 : Nunc)에 1.6×106세포/30m1/T 80플라스크의 밀도로 플레이팅하고, 형질감염시키기 4시간 전에, 배지를 10% FBS 및 항생물질로 보충한 신선한 a+ MEM 30m1로 대치한다.
한편, 10μg의 플라스미드 pKDXA 457또는 pKDPXA 799Bg1II를 240μ1의 멸균수에 용해시키고, 용액에 동일 용적의 완충액 A (0.5M CaCl2, 0.1M HEPES)를 가한 다음, 전체를 혼합한다. 실온에서 10분간 정치시킨후, 480ul의 완충액 B(0.28M NaCl, 0.05M HEPES, 0.75mM NaH2PO4, 0.75mM Na2HPO4)를 혼합물에 가하고, 이 혼합물을 수초간 볼텍스 혼합기상에서 혼합한다. 이어서, 혼합물을 실온에서 20내지 30분간 정치시켜, 플라스미드를 함유하는 칼슘 포스페이트 겔을 형성시킨다.
이어서, 플라스미드를 함유하는 960ul의 칼슘 포스페이트 겔을 전술한 CHO dhfr-세포(1.6×106세포/30ml/T80 플라스크)에 가하고, 플라스크를 4시간 동안 유지시킨다.
이어서, 세포를 FBS 비-함유 a+MEM 10ml로 1회 세척하고, 10% FBS를 함유하는 a+ MEM/글리세롤(4 : 1)의 5ml/T 80플라스크를 세포에 가한다. 정확히 1분 후에, 배지를 흡인 제거하고, 10% FBS를 함유하는 30ml의 a+ MEM을 세포에 가한 다음, 5% CO2존재하에 37℃에서 유지시킨다. 4일간 배양한 후, 세포를 0.25% 트립신 용액(chiba kessei)으로 분산시킨다음 10%투석한 소 태아 혈청(FBSd, HAZELTON)으로 보충한 핵산 비-함유 MEM 배지(α-MEM)에 1.6×106세포/30ml/T 80플라스크의 밀도로 접종한다. 세포를 10일간 배양하고, 이 배지에서 살아남은 세포를 형질감염된 세포로서 선별한다. pKDPXA 457로 감염시킨 세포는 CHO/pKDPXA 457-a로 지칭하고 pKDPXA 799 BglII로 감염시킨 세포는 CHO/pKDPXA 799 BglII-α로 지칭하며, 다음의 실험에 사용한다.
(3)유전자 증폭.
유전자(pKDPXA 457 또는 pKDPXA 799 BglII)를 각각 세포 CHO/pKDPXA 457-α 및 CHO/pKDPXA799BglII-a내에서 증폭시키기 위하여, 세포를 증가하는 농도, 즉, 30nM, 100nM, 300nM, 및 1000nM의 메토토렉세이트(MTX)(Sigma)를 함유하는 배지에서 순서대로 배양하면서 각 단계마다 MTX내성 세포를 선별한다. 이어서, 1000nM MTX에 대한 내성을 획득한 세포를 각각 CHO/pKDPXA 457-1 및 CHO/pKDPXA 799 BglII-1로 지칭하여 신선한 배지에 1.6×106세포/30ml/T 80 플라스크의 밀도로 접종한 다음, 5% CO2 존재하 37℃에서 4일간 배양한다. 이어서, 배양상득액 부분을 사용하여 합성기질 (125I)-Ac-Tyr-Phe-Gly로, C-말단 α-아미드화 효소 활성을 측정한다.
그 결과, CHO/pKDPXA 457-1 및 CHO/pKDPXA 799 BglII-1의 배양 상득액은 각각 1단위/ml 및 310단위/ml의 활성을 나타냈다.
(4)C-말단 α-아미드 화생성 능력의 큰 클론의 확립
전술한 실험은 pKDPXA799BglII로 형질감연된 세포가 pKDPXA457로 형질감염된 세포에 의해 나타난 것보다 더 높은 효소활성을 보이므로, 비교적 효소 생산성이 더 높은 클론을 설정하기 위하여, MTX 100nM-내성 세포 CHO/pKDPXA 799 BglII를 제한 희석 클로닝법에 적용시킨다. 즉, CHO/pKDPXA 799 BglII세포를 각 웰이 평균 3, 1.5, 0.75또는 0.375세포를 함유하는 방식으로, 평판의 웰에 분포시키고, 세포를 100μl/웰 α-MEM에 1주간 배양한다. 배양한후, 현미경하에 단일 콜로니의 발생이 관찰되는 30개의 웰을 선별하고, 웰에100μl 웰 α-MEM을 가한 다음 1주간 추가로 계속 배양한다. 30개의 웰로부터 이들 상등액을 분석하여 이들의 효소 활성을 측정함으로써 CHO/9C로 지칭된 클론이 910단위/ml의 최고효소활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
이어서, MTX를 증가하는 농도로, 즉, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 30μm, 함유하는 배지에 순차적으로 클론 CHO/9C를 배양하면서 각 단계에서MTX-내성 클론을 수득하여 MTX에 대한 내성이 더욱 큰 세포 클론을 수득한다. 수득된 MTX-내성 세포를 4일간 1.6×106세포/30ml/T 80 플라스크 밀도를 배양하고, 상등액을 분석하여 이의 효소 활성을 측정함으로써, MTX3μM-내성 세포가 2860단위/ml에서 최고의 효소 활성을 발휘하는 것으로 나타났다. 효소 생산성이 비교적 높은 클론을 설정하기위하여, MTX3μ M-내성 9C세포를 전술한 바와같이 추가로 클로닝 과정을 수행하여, 그 결과 2000단위/ml C-말단 α-아미드화 효소 활성이상을 발휘하는 클론을 설정하여, CHO/10C로 지칭한다.
(5)세포 클론 CHO/10C 세포의 배양
실시예 2(4)에서 설정된 세포 클론 CHO/10C를 배양하여 C-말단 α-아미드화 효소 유도체를 생성시킨다. 즉, 1×107CHO/10C세포 및 500ml의 α-MEM을 1850cm2로울러바틀(Falcon)에 도입한 다음, 37℃에서 1주간 배양한다. 이어서, 세포를 10% FBS를 함유하는 α-MEM, 3% FBS를 함유하는 α-MEM 및 1% FBS를 함유하는 α-MEM에 37℃에서 24시간 동안 순차적으로 배양한다. 1% FBS를 함유하는 배양액으로부터 상등액을 회수하여, 다음의 실험에 사용한다. 본 상등액은 효소활성이 약 4000단위/ml효소 활성인 것으로 나타났으며, 효소는 XA 799 BglII로 지칭한다.
(6)효소 XA799BglII의 정제
실시예3(5)에서 수득한 상등액 12에 암모늄 설페이트를 가하여 최종 농도가 45%가 되게 하고, 생성된 침전물을 원심분리로 수집하여 20ml의 50mM 트리스-HCI완충액(pH7.0)에 재용액시킨다. 이어서, 수득된 효소 분획을, 합성 기질을 사용하여 이의 활성을 측정하기 위해 분석한 결과, 대부분의 효소 활성이 침전 분획에서 회수됨이 밝혀졌다. 추가로, 각 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과 배지로부터 유도된 대부분의 단백질(주로BSA)이 제3도에 알 수 있는 바와같이, 침전된 분획으로부터 제거된 것으로 나타났다.
수득된 XA 799 BglII를 사용하여 하기 실험에 따라, 시험관내 아미드화에 필요한 조건을 연구한다.
실시예 3
시험관내 아미드화에 대한 조건의 연구
시험관내 아미드화에 필요한 조건을 연구하기 위하여, 실시예 1에서 수득한 hCT-Gly 및 실시예2(6)에서 정제한 XA 799 BglII를 사용한다. 반응에서, 1ml의 반응 혼합물을 37℃에서 배양하고 50μ1의 샘플을 반응 개시후, 0.5, 1, 2 및 4시간일 때 수득한다. 이어서, 샘플에 950μ1의 5N아세트산을 가하고, 20μ1의 혼합물을 컬럼YMCα-302(4.6×150mm)를 사용하고, 10% 암모늄 아세테이트중 24내지 45%로 농도 구배된 아세토니트릴로 18분간 용출시키는, C8-HPLC를 수행하여, 생성된 hCT 및 잔류 hCT-Gky를 측정한다. 합성기질[125I]-Ac-Tyr-Phe-Gly를 [125I]-Ac-Tyr-Phe-NH2로 전환시키기 위해 수득한 상응하는 조건(일본국 특허원 제62-306867호; 유럽 특허 제0299790A2호)을 고려한 반응 조건으로서, (1)아스코르브산 농도,(2)카탈라제 농도, (3) 구리 양이온(Cu2+)농도, (4)완충액의 pH 및 (5)완충액 농도 및 hCT-Gly농도를 연구한다.
(1)아스코르브산 농도(제4도)
아미드화 반응에 미치는 아스코르브산 농도의 효과를 아스코르브산 0,1.0,3.5,7 및 20mM에서 시험한다.
나머지 성분은 다음과같다.
2.5mg/ml hCT-Gly
100mM Tris-H차(pH7.0)
25μg/ml 카탈라제
70μM CuSO4
1860U/ml XA 799 BglII
반응 개시 1시간 뒤의 전환율 [100×hCT/(hCT+hCT-Gly)]를 제4도에 나타냈다. 반응은 아스코르브산 부재하에서는 진행되지 않지만, 1내지 7mM아스코르브산에서는 만족할 만큼 진행된다. 그러나, 20mM아스크로브산에서는 전환율이 감소한다.
(2)카탈라제 농도(제5도)
아미드화 반응에서 카탈라제 농도의 효과는 0.2, 1, 2, 25 및 125μg/ml의 카탈라제로 시험한다. 잔류 성분 은 다음과 같다:
2.5mg/ml hCT-Gly
100mM Tris-HCI(pH7.0)
3.5mM 아스코르브산
70μM CuSO4
1500U/ml XA 799BglII.
반응개시 1시간 후의 전환율은 60내지 75%이고, 카탈라제 농도에 따라 상이하지 않았으나(제5도), 1μg/ml이상의 카탈라제 농도에서는 전환율이 2시간 내에 100%에 도달하였고, 0.2μg/ml카탈라제에서는 전환율이 4시간 내에 단지 93%에 도달하였다.
(3)CuSO4(Cu2+양이온)농도(제6도)
아미드화 반응에 미치는 CuSO4농도의 효과는 0, 1, 10, 70 및 150μM CuSO4에서 시험한다. 잔류 성분은 다음과 같다.
2.5mg/ml hCT-Gly
100mM Tris-HCI(pH7.0)
25μg/ml 카탈라제
3.5mM 아스코르브산
1500U/ml XA 799 BglII.
반응개시 1시간 후의 전환율[100×hCT/(hCT+hCT-Gly)]은 제5도에 나타냈다. CuSO4농도가 1μM에서10μM로 증가함에 따라 아미드화 반응이 증가하지만, CuSO4농도의 더 이상의 증가는 아미드화 비율을 더 높이지 않는다.
(4)완충액(pH)(제7도)
아미드화 반응은 100mM트리스-HCI(pH 7.0, 8.0, 8.5), 100mM MOPS(pH6.5, 7.0, 7.5 및 8.0) 및 100mM의 암모늄아세테이트(pH6.0, 6.5 및 7.0)에 대해 시험한다. 반응 혼합물이 잔여 성분은 다음과 같다.
2.5mg/ml hCT-Gly
20μg/ml 카탈라제
2.0mM 아스코르브산
10μM CuSO4
1000U/ml XA 799BglII.
반응 개시 1시간 뒤의 전환율[100×hCT/(hCT+hCT-Gly)]을 제7도에 나타냈다. 최적 pH는 6내지 7이고, 암모늄 아세테이트의 경우 반응 속도는 MOPS에서보다 비교적 높았다.
(5)완충액(농도)(제8도)
아미드화 반응에 미치는 암모늄 아세테이트의 효과는 암모늄 아세테이트 10. 50 및 100mM에서 시험한다.
반응 혼합물중의 잔여 성분은 다음과 같다.
2.5mg/ml hCT-Gly
20μg/ml 카탈라제
10μM CuSO4
2.0mM 아스코르브산
1000U/ml XA 799 BglII.
반응개시 1시간 뒤의 전환율[100×hCT/(hCT+hCT-Gly)]을 제8도에 나타냈다. 전환율은 80%이고, 암모늄 아세테이트 농도에 따라 거의 상의 하지 않았으나, 비교적 낮은 암모늄 아세테이트 농도에서는 전환율이 약간 더 높았다.
(6)기질(hCT-Gly)농도
아미드화반응에 미치는 hCT-Gly농도의 효과는 2.5mg/ml hCT-Gly에서 시험한다. 반응 혼합물내 잔여 성분은 다음과 같다 :
10mM 암모늄 아세테이트(pH6.0)
20μg/ml 카탈라제
10μM CuSO4
2.0mM 아스코르브산
1000U/ml XA 799BglII.
반응시간과 각각의 hCT-Gly농도에 대한 전환율[100×hCT/(hCT+hCT-Gly)]간의 관계는 제9도에 나타냈다. 2.5mg/ml 기질에서는, 아미드화 반응을 2시간 내에 완료하고, 5.0mg/ml 기질에서는, 아미드 화반응을 4시간내에 완료한다. XA 799BglII 농도는 동일하므로, 5mg/ml hCT-Gly에서 XA 799BglII/hCT-Gly의 양은 2.5mg/ml hCT-Gly농도에서 1/2이다.
실시예 4
hCT의 생성(제10도)
아미드화 반응을 다음의 조건하에서 수행하여 hCT를 생성시킨다 :
2.5mg/ml hCT-Gly
10mM 암모늄 아세테이트(pH6.0)
20μg/ml 카탈라제
10μM CuSO4
2.0mM 아스코르브산
1000U/ml XA 799BglII.
반응 개시전, 반응개시 0.5시간 후, 및 반응 개시 2시간 후에 샘플을 수득하여, C18-HPLC를 수행한다.
용출도를 제10도에 나타냈다. 시간이 경과함에 따라, 기질 hCT-Gly를 나타내는 피크(체류시간 11.8분)가 감소하고생성물 hCT(체류시간 12.9분)을 나타내는 피크가 증가한다. 2시간 동안 반응시킨 후에, 반응 혼합물을 C18-HPLC시키고, hCT를 분리하여 정제한다. hCT의 아미노산 분석으로 측정한 바 hCT를 93.5%수율로 수득한다.
실시예 5
hCT의 확인
실시예 4에서 생성시킨 사람 캘시토닌(hCT)를 다음과 같이 확인한다.
1) 실시예4에서 제조한 hCT에 대하여 실시예 3에서 기술한 조건하에서 HPLC상의 체류시간은 업체[Peptide Institute(Osaka Japan)]로부터구입한 합성 사람 캘시토닌에서와 정확히 동일하다.
2)실시예 4에서 제조한 hCT의 아미노산 분석에 의해 수득한 아미노산 조성은 괄호안에 나타낸 이론치와 일치하였다.
Asx 2.99(3), Thr 4,.72(5), Ser 0.91(1), Glx 2.00(2), P20 1.97(2), Gly 3.96(4), Ala 1.97(2), Val 1.00(1), Met 0.98(1), Ile 0.97(1), Leu 2.00(2), Tyr 1.02(1), Phe 2.95(3), Lys 1.00(1), His 0.97(1).
3)C-말단 P개-NH2를 제외한, 실시예4의 생성물의 전 아미노산 서열은 사람 캐시토닌의 것과 동일한 것으로 확인된다.
4)실시예4에서 생성된 hCT의 C-말단 P20-NH2구조를 확인하기 위하여, hCT를 리실 엔도프로테아제(Wako Junyakn Kogyo Japan)로 처리하여 C-말단 단편 hCT[19-32]를 수득한다. hCT는 18 위치에 리신 잔기를 함유함으로, 리실 엔도프로테아제는 18번 아미노산과 19번 아미노산간의 hCT를 절단한다. 단편 hCT[19-32]의 분자량을 고속 충격(FAB)질량 분광분석으로 측정한 결과로써, 분자량은 이론상에 분자량과 동일한 것으로 밝혀졌으므로, 이로써C-말단-NH2가 존재함을 알수 있다.
상기의 결과로부터, 실시예4에서 수득한 생성물이 사람 캘시토닌인 것으로 확인된다.
실시예 6
융합 단백질 βgal 197 SHPCT의 생성에 미치는 C-말단 아미노산의 효과
융합 단백질 βgal 197HPCT의 생성에 미치는 C-말단 아미노산의 효과를 연구하기 위하여, 실시예1서 사용한 βgal 197(LE)[GKKR]의 C-말단에서 변형시킨 다음의 융합단백질의 생산성을 측정한다:
βgal197S(LE)HPCT[GRRR]
βgal197S(LE)HPCT[GR]
βgal197S(LE)HPCT[G].
상기 식에서, [LE]는 β gal 197S 및 HPCT가 Leu-Gly를 통해 연결되어 있고; [GRRR], [GR] 및 [G]는 융합 단백질이 각각 첨가된 아미노산 Gly-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg 및 Gly를 함유함을 의미한다.
전술한 단백질-암호화 유전자-함유 플라스미드를 각각 사용하여 이.콜라이를 형질전환시키고, 형질전환체를 시험하여 융합 단백질의 생산성을 측정한다.
(1)키메릭 단백질-암호화 유전자를 함유하는 플라스미드의 작제(제11도)
플라스미드 pG97S HPCT(일본국 특허원 제63-49723호; 유럽 특허 제20814182호 실시예 8, 제19도)를 Sal I으로 부분분해하고, 아가로스겔 전기 영동에 의하여 3.9kb DNA단편을 수득한다. 이어서, 상기 DNA단편을 Smal으로 완전히 분해하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 3.9kb DNA단편(1)을 수득한다.
DNA단편(1)을 각각 SmaI 및 SalI 말단을 함유하는 합성 링커 3쌍과 연결시켜 각각 플라스미드 pG97SHPCT(LE)[GRRR],pG97HPCT(LE)[GR], 및 pG97S HPCT(LE)[G]를 각각 수득한다.
SmaI SalI
(2)5' GGGCCGGCGCCGTTAAG 3'
3' CCCGGCCGCGGCAATTCAGCT 5'
(3)5' GGGCCGCTAAG 3'
3' CCCGGCGATTCAGCT 5'
(4) 5' GGGCTAAG 3'
3' CCCGATTCAGCT 5'
이들 플라스미드로 이.콜라이 W 3110을 형질전환시켜, 형질전환체 W3100/pG97S HPCT(LE)[GRRR], W3110/pG97S HPCT(LE)[GR] 및 W3110/pG97S HPCT(LE)[G]를 수득한다.
(2)생산성 시험(제12도)
상기와 같이 제조된 형질전환체W 3110/pG97S HPCT (LE)[GRRR], W3110/pG97S HPCT(LE)[GR], 및 W3110/pG97S HPCT(LE)[G], 및 대조군 W3110/pG97S HPCT를 테트라사이클린이 보충된 배지(2.4% 트립톤, 1.2% 효모 추출액, 및 0.5%글리세롤)에 16시간 동안 배양하고 각 배양액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동한다. 제12도에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질의 생산성은 C-말단 염기성 아미노산(들)을 함유하지 않는 융합 단백질에 대해보다는 C-말단 염기성 아미노산(들)을 함유하는 융합단백질에 대해 뚜렷하게 더 높다.
부다페스트 조약 규칙 13-2하에 기탁된 미생물:
기탁기관 : Fermentation Reserch Institute, Agency of Industrial Science and Technology;
주소 : 일본국 이바라키켄 쓰코바시 1초메 1반 3고; 기탁미생물의 동정; 1, 이.콜라이 SBM 300 FERM BP-2235 1989. 1. 11.
기탁번호 및 기탁일 ; 2, 이.콜라이 SBM 301 FERM BP-2236 1989. 1. 11
3. CHO dhfr(-)세포 SBM 306 FERM BP-2241 1989. 1. 11

Claims (6)

  1. C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체를 암호화하는 DNA를 함유하고이를 발현할수 있는 플라스미드를 사용하여 형질감염시킨 동물 세포를 배양하고, 효소 또는 이의 유도체를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로하여, C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 유도체를 생산하는 방법.
  2. 1항에 있어서, C-말단 α-아미드화 효소가 13-1도 내지 13-3도에 나타낸 바와 같이 -37번 아미노산으로 시작하여 363번 아미노산으로 종결되는 아미노산 서열을 함유하는 XA 457인 방법.
  3. 제1항에 있어서, C-말단 α-아미드화 효소의 유도체가 제14-1도 내지 14-3도에 나타낸 바와같이-39번 아미노산으로 시작하여 692번 아미노산으로 종결되는 아미노산 서열 및 C-말단 루이신을 함유하는 XA 799 BglII인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 형질감염된 동물세포가, SV 40프로모터, 제14-1도내지 1403도에 나타낸 바와같이 -39번 아미노산으로 시작하여 692번 아미노산으로 종결되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA(여기에서, DNA는 SV 40 프로모터와 작용적으로 연결되어 있다) 및 C-말단 루이신, 및 추가로 dhfr유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 형질감염시킨 CHO dgfr(-)세포이고, 형질감염된 동물세포를 최고 3μM까지 증가하는 농도를 메타토렉세이트를 함유하는 배지에서 순차적으로 배양시켜 유전자를 증폭시킴으로써, 효소 유도체를 2000단위/ml 상등액의 양으로 생성하는 방법.
  5. 제13-1도 내지 제13-3도에 나타낸 바와 같이 -37번 아미노산으로 시작하고 363번 아미노산으로 종결되는 아미노산 서열을 지닌 C-말단 α-아미드화효소.
  6. 제14-1도 내지 제14-3도에 나타낸 바와같이 -39번 아미노산으로 시작하고 692번 아미노산으로 종결되는 아미노산 서열을 지닌 C-말단 α-아미드화효소.
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