PL201246B1

PL201246B1 - Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd fuzyjny, multimer obejmujący dwa lub więcej polipeptydów fuzyjnych, wektor, wektor ekspresyjny, układ wektor-gospodarz do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydów fuzyjnych i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL201246B1
Application number: PL348529A
Authority: PL
Inventors: Neil Stahl; George D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2009-03-31
Also published as: ATE336583T1; NO20011513L; NZ510720A; HK1045847B; AU758970C; FR10C0025I1; US20020164690A1; ES2267300T3; CA2345109A1; DK1229047T3; IL142103A; JP2002525119A; WO2000018932A3; CA2345109C; DE122010000023I1; DE69932832T2; CN100345970C; US20020012962A1; NO2011003I1; EP1405915A1

Abstract

1. Izolowana cz asteczka kwasu nukleinowego koduj aca polipeptyd fuzyjny, znamienna tym, ze obejmuje: a) fragment wiaz acy interleukin e 1 (IL-1) domeny zewn atrzkomórkowej sk ladnika determinuj a- cego specyficzno sc receptora IL-1; b) fragment wi azacy IL-1 domeny zewn atrzkomórkowej sk ladnika przenosz acego sygna l receptora IL-1; c) sk ladnik multimeryzuj acy; przy czym sk ladnik multimeryzuj acy c) laczy si e ze sk ladnikiem multimeryzuj acym c) zawartym w innym polipeptydzie fuzyjnym tworz ac multimer tych polipetydów fuzyjnych; i przy czym multimer wiaze i zatrzymuje IL-1, i dzia la jako antagonista IL-1. PL PL PL PL

Description

(21) Numer zgłoszenia: 348529 (13) (22) Data zgłoszenia: 22.09.1999 ^{(51) IntCL}

C12N 15/62 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: C^{12N 15/12} (²⁰⁰⁶°¹)

22.09.1999, PCT/US99/22045 C07K 14/715 (2006.01) (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

06.04.2000, WO00/18932 PCT Gazette nr 14/00

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd fuzyjny, ,5., multimeaobejmujący dwa lub więcej poiipeptydów , wektor, ⁽ ) wektoa ekspresyjny, układ v^^łtorr^g^c^^ⁱ^c^c^^z: do wytwarzania poNpeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydów fuzyjnych i kompozycja farmaceutyczna
	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo: 25.09.1998,US,60/101,858	REGENERON PHARMACEUTICALS, INC., Tarrytown,US
19.05.1999,US,09/313,942	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 03.06.2002 BUP 12/02	Neil Stahl,Carmel,US George D. Yancopoulos,Yorktown Heights,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2009 WUP 03/09	(74) Pełnomocnik: Elżbieta Pietruszyńska-Dajewska, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

(57) 1 . lodowana ząąstczkka kwauu ukkleinoweoo kddująaa ooliepptdO fuyyjyy , naaminnaatym, że obejmuje:

a) fragment wiążący interleukinę 1 (IL-1) domeny zewnątrzkomórkowej składnika determinującego specyficzność receptora IL-1;

b) fragment wiążący IL-1 domeny zewnątrzkomórkowej składnika przenoszącego sygnał receptora IL-1;

c) składnik multimeryzujący;

przy czym składnik multimeryzujący c) łączy się ze składnikiem multimeryzującym c) zawartym w innym polipeptydzie fuzyjnym tworząc multimer tych polipetydów fuzyjnych; i przy czym multimer wiąże i zatrzymuje IL-1, i działa jako antagonista IL-1.

PL 201 246 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd fuzyjny, multimer obejmujący dwa lub więcej polipeptydów fuzyjnych, wektor, wektor ekspresyjny, układ wektor-gospodarz do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydów fuzyjnych i kompozycja farmaceutyczna.

W publikacji patentowej nr WO 93/19777 ujawniono białka fuzyjne obejmujące polipeptyd receptora czynnika martwicy nowotworu i co najmniej jeden dodatkowy polipeptyd wybrany spośród interleukiny 1 (IL-1R) i drugiego polipeptydu TNF-R. W publikacji patentowej nr WO 98/08969 ujawniono rozpuszczalne białko cząsteczki pomocniczej receptora interleukiny 1 (IL-1R AcM), które jest członkiem nadrodziny Ig oraz izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące ludzkie ILR-1 AcM, wektory komórki gospodarza i rekombinacyjne metody ich wytwarzania. W publikacji patentowej nr WO 97/31010 ujawniono białko receptorowe oznaczone jako 2F1, sekwencję aminokwasową, która, jak się uważa, wskazuje, że to białko jest członkiem rodziny receptora IL-1. W opisie EP-A-0 460, 846 ujawniono białka receptora IL-1 typu II, DNA i wektory ekspresyjne kodujące IIL-R oraz sposoby wytwarzania IL-1 R typu II jako produktów rekombinowanej hodowli komórkowej.

Ponadto w publikacji nr WO 95/11303 ujawniono białko antagonisty cytokiny zdolne do wiązania się z cytokiną z utworzeniem niefunkcjonalnego kompleksu obejmującego rozpuszczalny składnik α determinujący specyficzność receptora oraz zewnątrzkomórkową domenę składnika β receptora cytokinowego.

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd fuzyjny, charakteryzująca się tym, że obejmuje:

a) fragmenn wiążący interleukinę 1 (IL--1 domeny zewnątrzkomórkowej składnika determinującego specyficzność receptora IL-1;

b) fraamθnt wiążącc i L·- domenyzzwnątrzkomórkowej sskaanika przznoszącceo syynał reecetora IL-1;

c) składnik multimeryzujący;

przy czym składnik multimeryzujący c) łączy się ze składnikiem multimeryzującym c) zawartym w innym polipeptydzie fuzyjnym tworząc multimer tych polipeptydów fuzyjnych; i przy czym multimer wiąże i zatrzymuje IL-1, i działa jako antagonista IL-1.

Korzystnie składnik a) białka fuzyjnego obejmuje fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny typu I IL-1 R a składnik b) fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny IL-1R AcP.

Korzystnie składnik a) białka fuzyjnego obejmuje fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny typu II IL-1 R a składnik b) fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny IL-1 R AcP.

Korzystnie multimer stanowi dimer.

Korzystnie składnik multimeryzujący obejmuje domenę pochodzącą z immunoglobuliny.

Korzystniej domena pochodząca z immunoglobuliny jest wybrana spośród domeny Fc z IgG, łańcucha ciężkiego z IgG oraz łańcucha lekkiego z IgG.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa kodująca składnik a) znajduje się przed sekwencją kodującą składnik b).

Korzystnie sekwencja nukleotydowa kodująca składnik a) znajduje się za sekwencją kodującą składnik b).

Przedmiotem wynalazku jest ponadto multimer obejmujący dwa lub więcej polipeptydów fuzyjnych, charakteryzujący się tym, że kodowane są one przez dowolną cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1-8, przy czym multimer wiąże się i zatrzymuje IL-1, i działa jako antagonista IL-1.

Korzystnie stanowi dimer obejmujący dwa takie polipeptydy fuzyjne.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, charakteryzujący się tym, że obejmuje dowolną cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że obejmuje dowolną cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z sekwencją kontrolną ekspresji.

Przedmiotem wynalazku jest też układ wektor-gospodarz do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, charakteryzujący się tym, że obejmuje wektor ekspresyjny określony powyżej oraz komórkę gospodarza.

Korzystnie komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna, komórka drożdży, komórka owadzia lub komórka ssacza.

Korzystnie komórkę gospodarza stanowi komórka E. coli, komórka COS, komórka CHO, komórka 293, komórka BHK lub komórka NSO.

PL 201 246 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania polipeptydów fuzyjnych, polegający na tym, że hoduje się komórki układu wektor-gospodarz określone powyżej w warunkach pozwalających na wytwarzanie tych polipeptydów fuzyjnych i odzyskuje się tak wytworzone polipeptydy fuzyjne.

Korzystnie ponadto obejmuje etap, w którym pozwala się na tworzenie multimerów polipeptydów fuzyjnych określonych powyżej. Korzystniej jako multimery otrzymuje się dimery określone powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że obejmuje multimer określony powyżej, lub dimer określony powyżej, w farmakologicznie dopuszczalnej cieczy, nośniku stałym lub semi-stałym, połączony z nośnikiem lub cząsteczką ukierunkowującą i/lub wprowadzony do liposomów, mikrokapsułek lub preparatu o kontrolowanym uwalnianiu.

Rozwiązania według wynalazku zilustrowano na rysunku, figury 1-4.

Figura 1. Uporządkowane wiązanie składników receptora w modelu generycznego receptora cytokiny. Model wskazuje, że cytokiny zawierają do 3 miejsc wiążących receptor i oddziaływują z innymi składnikami receptora poprzez wiązanie pierwszego opcjonalnego składnika α, następnie wiązanie β1, a potem β2. Składniki β dla wielu receptorów cytokinowych oddziaływują przez regiony przezbłonowe (zacienione pola) z rodziną Jak/Tyk cytoplazmatycznych białkowych kinaz tyrozynowych. Dopiero po dimeryzacji składników β rozpoczynane jest przekazywanie sygnału, co schematycznie przedstawiono jako fosforylacje tyrozynowe (P) składników β i kinaz Jak/Tyk.

Figura 2A-2E: Kodująca sekwencja nukleotydowa i przypuszczalna sekwencja aminokwasowa białka fuzyjnego oznaczonego jako 569, które jest zdolne do wiązania cytokiny IL-1 z utworzeniem nieczynnego kompleksu.

Figura 3. Przedstawia, że białko chwytające 1SC569 (opisane na fig. 2A-2E) jest zdolne antagonizować działanie IL-1 i blokować produkcję IL-6 przez komórki MRC 5 po potraktowaniu ich IL-1.

Figura 4. Białko chwytające ludzką IL-1 blokuje in vivo działanie podawanej egzogennie huIL-1. Myszy BALB/c zaszczepiano podskórnie huIL-1 (0,3 pg/kg) w czasie 0. Dwadzieścia cztery godziny przed wszczepieniem huIL-1, zwierzęta traktowano wstępnie nośnikiem lub 150-krotnym nadmiarem molarnym białka chwytającego huIL-1. Dwie godziny przed uśmierceniem (26 godz.), myszy zaszczepiano ponownie drugą porcją huIL-1 (0,3 pg/kg, podskórnie). Próbki krwi zbierano w różnych czasach i testowano surowice na poziom IL-1 (wyrażone jako średnia +/- SEM, n=5 na grupę).

Jako „fragment wiążący -1 rozumie się minimalny fragment domeny zewnątrzkomórkowej, konieczny do wiązania lL-1. Jest jasne dla specjalisty, że definiującą charakterystykę receptora IL-1 jest obecność dwóch domen podobnych do fibronektyny, które zawierają kanoniczne cysteiny z regionu kasety WSXWS (Bazan, J.F., 1990, PNAS 87: 6934-6938). Sekwencje kodujące domeny zewnątrzkomórkowe składnika wiążącego receptora IL-1 i składnika przenoszącego sygnał receptora IL-1 mogą być także wykorzystane do otrzymywania określonego tu fuzyjnego polipeptydu. Jednakże, uważa się, że fragmenty mniejsze niż domena zewnątrzkomórkowa będą aktywnie wiązać IL-1 i dlatego też, wynalazek rozważa polipeptydy fuzyjne obejmujące minimalny fragment domeny zewnątrzkomórkowej konieczny do związania IL-1 jako fragment wiążący IL-1.

Wynalazek obejmuje „składnik określający specyficzność z receptora IL-1 i „składnik przenoszący sygnał z receptora IL-1. Niezależnie od nomenklatury zastosowanej do oznaczania poszczególnych składników lub podjednostek receptora IL-1, specjalista jest w stanie rozpoznać, który składnik lub podjednostka receptora jest odpowiedzialny za określanie celu komórkowego cytokiny, i będzie wiedział, który ze składników stanowi „składnik określający specyficzność. Podobnie, niezależnie od zastosowanej nomenklatury, specjalista będzie wiedział, który składnik lub podjednostka receptora będą stanowić „składnik przenoszący sygnał. Stosowane tu określenie „składnik przenoszący sygnał dotyczy składnika natywnego receptora, który nie jest składnikiem określającym specyficzność i który nie wiąże się, lub wiąże się słabo z cytokiną w nieobecności składnika określającego specyficzność. W receptorze natywnym, „składnik przenoszący sygnał może uczestniczyć w przenoszeniu sygnału.

Przykłady składników receptora, które można zastosować do wytworzenia antagonistów tu opisanych przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1

Cytokina	składnik określający specyficzność	składnik przenoszący sygnał
Interleukina 1 (IL-1)	typ I IL-1R (ref. 1) typ II IL-1R (ref. 1) IL-1RI (ref. 2) IL-1RII (ref. 2)	IL-1R AcP (ref. 1, 2)

PL 201 246 B1

Refencje cytowane w Tabeli 1:

1. Greenfeder, i wsp., Journal of Biological Chemistry 270: 13757-13765 (1995) - patrz str. 13757, kol. 1, linia 6 do kol. 2, linia 3 i kol. 2, linie 10-12; str. 13764, kol. 2, ostatnie 3 linie i strona 13765, kol. 1, linie 1-7;

2. Wesche, i wsp. Journal of Biological Chemistry 272: 7727-7731 (1997), patrz str. 7731, linie 20-26.

W przygotowaniu sekwencji kwasu nukleotydowego kodującej polipeptyd fuzyjny według wynalazku, pierwszy, drugi i trzeci składnik polipeptydu fuzyjnego są kodowane przez pojedynczą nić nukleotydów, która ekspresjonowana w układzie wektor-gospodarz, daje monomeryczny polipeptyd fuzyjny. Ekspesjonowane monomery mogą następnie multimeryzować ze względu na oddziaływania pomiędzy składnikami multimeryzującymi (stanowiącymi trzeci składnik polipeptydu fuzyjnego). Otrzymywanie w ten sposób polipeptydów fuzyjnych zapobiega konieczności oczyszczania heterodimerycznej mieszaniny, która może powstać w przypadku, gdy pierwszy i drugi składnik są produkowane jako oddzielne cząsteczki i następnie poddawane multimeryzacji.

Przykładowo, zgłoszenie patentowe U.S. nr: 5,470,952 złożone 28 listopada 1995 opisuje produkcję białek heterodimerycznych, które działają jako antagoniści CNTF lub IL-6. Heterodimery są oczyszczane z linii komórkowych transfekowanych jednocześnie odpowiednimi składnikami alfa (α) i beta (β). Następnie heterodimery są oddzielane od homodimerów za pomocą metod takich jak pasywna elucja z preparatu, niedenaturujące żele poliakrylamidowe, lub wysokociśnieniowa chromatografia kationo wymienna.

Konieczność wykonywania tych etapów oczyszczania została pominięta zgodnie z wynalazkiem.

Ponadto, międzynarodowe zgłoszenie PCT WO 96/11213 opublikowane 18 kwietnia 1996 zatytułowane „Dimeryczne Inhibitory IL-4, stwierdza, że zgłaszający przygotował homodimery, w których dwa receptory IL-4 są związane poprzez polimerowy łącznik i otrzymał heterodimery w których receptor IL-4 jest połączony przez polimerowy łącznik z łańcuchem gamma receptora IL-2. Opisywanym łącznikiem polimerowym jest glikol polietylenowy (PEG). Dwa składniki receptorowe, IL-4R i IL-2R gamma są osobno ekspresjonowane i oczyszczane. Pegylowane homodimery i heterodimery są następnie otrzymywane poprzez łączenie składników za pomocą dwufuncyjnego odczynnika PEG. Zaletą niniejszego wynalazku jest pominięcie czasochłonnych i kosztownych etapów oczyszczania i pegylacji.

W korzystnej realizacji wynalazku, sekwencja nukleotydowa kodująca pierwszy składnik znajduje się przed sekwencją nukleotydową kodującą drugi składnik. W innej realizacji wynalazku sekwencja nukleotydowa kodująca pierwszy składnik znajduje się za sekwencją nukleotydową kodującą drugi składnik. Dalsze realizacje wynalazku mogą być otrzymywane poprzez zmianę kolejności pierwszego, drugiego i trzeciego składnika polipeptydu fuzyjnego. Przykładowo, jeśli sekwencję kodującą pierwszy składnik oznaczymy jako 1, sekwencję kodującą drugi składnik oznaczymy jako 2, a sekwencję kodującą trzeci składnik oznaczymy jako 3, to porządek składników w izolowanym kwasie nukleinowym według wynalazku czytana od 5' do 3' końca może przyjmować następujące sześć kombinacji: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 albo 3,2,1.

Cytokiną wiązaną przez fuzyjny polipeptyd jest interleukina 1.

W korzystnej realizacji wynalazku składnik multimeryzujący zawiera domenę pochodzącą z immunoglobuliny. Korzystnie domena pochodząca z immunoglobuliny jest wybrana z grupy w której skład wchodzą: domena Fc z IgG, łańcuch ciężki z IgG oraz łańcuch lekki z IgG. W innej realizacji, składnik multimeryzujący może być domeną Fc, z której usunięto pierwsze pięć aminokwasów (obejmujących cysteinę) w celu uzyskania składnika multimeryzującego określanego jako Fc(AC1). Alternatywnie, składnik multimeryzujący może być domeną Fc, w której pierwsze pięć aminokwasów zostało zastąpione innym aminokwasem takim jak, przykładowo seryna lub alanina.

Przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku kodowany jest polipeptyd fuzyjny. Korzystnie, M polipeptydy fuzyjne są w postaci multimerycznej, ze względu na działanie trzeciego składnika multimeryzacyjnego. W korzystnej realizacji, multimer jest dimerem. Odpowiednimi składnikami multimeryzacyjnymi są sekwencje kodowane przez region zawiasowy łańcucha ciężkiego immunoglobulin (Takahashi i wsp., 1982, Cell 29:671-679); sekwencjami genów immunoglobulin, i ich fragmentami. W zalecanej realizacji wynalazku, sekwencje genów immunoglobulin, zwłaszcza kodujące domenę Fc, są wykorzystywane do kodowania trzeciego składnika multimeryzacyjnego.

Układ gospodarz-wektor do produkcji polipeptydu fuzyjnego według wynalazku zawiera wektor ekspresyjny według wynalazku, który został wprowadzony do odpowiedniej komórki gospodarza pozwalającej na ekspresję fuzyjnego polipeptydu. Korzystnie odpowiednia komórka gospodarza jest

PL 201 246 B1 komórką bakteryjną, taką jak E.coli, komórką drożdżową, taką jak Pichia pastoris, komórką owadzią, taką jak Spodoptera frugiperda lub komórką ssaczą, taką jak komórki COS, CHO, 293, BHK albo NSO.

Opisana tu technologia może być wykorzystana do opracowania białek wychwytujących cytokiny dla dowolnej cytokiny, która wykorzystuje składnik α nadający specyficzność, oraz składnik β, który gdy związany jest ze specyficznym składnikiem α, posiada wyższe powinowactwo do cytokiny niż ten składnik osobno. Zatem, antagoniści według wynalazku stanowią antagonistów dla interleukiny 1. Greenfeder, i wsp., Journal of Biological Chemistry 270: 13757-13765 (1995). Guo I wsp., J. Bioch. Chem., 70:27562-27568 (1995).

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają opisanych powyżej antagonistów w farmakologicznie dopuszczalnym ciekłym, stałym lub semi-stałym nośniku, połączonych z nośnikową lub ukierunkowującą cząsteczką (np. przeciwciałem, hormonem, czynnikiem wzrostu, itp.) i/lub włączonych w liposomy, mikrokapsułki i preparaty o kontrolowanym uwalnianiu (włączając komórki ekspresjonujące antagonistów) przed podawaniem in vivo. Na przykład, kompozycja farmaceutyczna może zawierać w wodnym roztworze, takim jak sterylna woda, roztwór soli fizjologicznej, bufor fosforanowy lub roztwór dekstrozy, jeden lub więcej antagonistów. Alternatywnie, aktywne czynniki mogą być zawarte w preparacie stałym (np. wosk) lub semi-stałym (np. żelatyna) formulacji, który, w razie takiej potrzeby, może być implantowany do organizmu pacjenta. Podawanie może być przeprowadzone jakąkolwiek ze znanych w dziedzinie dróg podawania, włączając, lecz nie ograniczając, do podawania dożylnego, dokanałowego, podskórnego, wstrzykiwania do określonych tkanek, tętnic, jamy nosowej, podawania drogą doustną lub w implancie.

Podawanie może skutkować rozprowadzeniem czynnika aktywnego według wynalazku w całym organizmie lub w określonym obszarze. Na przykład, w pewnych warunkach, dotyczących odległych regionów układu nerwowego, pożądane jest podawanie czynnika aktywnego drogą dożylną lub dokanałową. W pewnych sytuacjach w, lub w pobliżu nieprawidłowo funkcjonującego obszaru mogą być umieszczone implanty zawierające czynniki aktywne. Odpowiednie implanty obejmują, lecz nie ograniczają się do piany żelowej, wosku lub wszczepów opartych na mikrocząsteczkach.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1 - Klonowanie składników polipeptydu fuzyjnego

Zewnątrzkomórkowe domeny ludzkich receptorów cytokin uzyskano za pomocą standardowych technik PCR, stosując tkankowe cDNA (CLONTECH), wklonowano do wektora ekspresyjnego pMT21 (Genetics Institute, Inc.) i zsekwencjonowano za pomocą standardowych technik sekwencjonowania, za pomocą sekwencera ABI 373A DNA oraz zestawu sekwencyjnego Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). W przypadku IL-IRAcP, klonowano nukleotydy od 1 do 1074 (odpowiadające aminokwasom 1-358) z sekwencji Genbank AB006357. W przypadku IL-1RI, klonowano nukleotydy od 55 do 999 (odpowiadające aminokwasom 19-333) z sekwencji GenbankX16896.

P r z y k ł a d 2 - Otrzymywanie fuzyjnych polipeptydów (białek wychwytujących cytokiny)

Sekwencje nukleotydowe kodujące białka wychwytujące cytokiny otrzymano z poszczególnych klonowanych DNA (opisanych powyżej) poprzez standardowe klonowanie i techniki PCR. Sekwencje znajdowały się w ramce odczytu, tak, że sekwencja kodująca pierwszy składnik fuzyjnego polipeptydu była połączona z sekwencją kodującą drugi składnik fuzyjnego polipeptydu, po którym następowała domena Fc (zawias, region CH2 i CH3 ludzkiej IgG1), jako składnik związany z multimeryzacją. Wstawiano w ramkę dodatkowe nukleotydy pomiędzy sekwencje kodujące pierwszy i drugi składnik fuzyjnego polipeptydu, w celu dodania regionu łączącego pomiędzy dwoma składnikami (patrz Figura 2AFigura 2E-białko wychwytujące 569).

W przypadku białka wychwytującego IL-1, 569 (Figura 2A-Figura 2E), składnik IL-1R AcP jest umieszczony na 5' końcu i poprzedza składnik IL-1RI, a następnie składnik Fc. Końcowe produkty klonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pCDNA3.1 (STRATAGENE).

W sekwencji 569 (Figura 2A-Figura 2E), nukleotydy od 1 do 1074 kodują składnik IL1RacP, nukleotydy 1075-1098 kodują region łączący, nukleotydy 1099-2043 kodują składnik IL1RI, a nukleotydy 2044-2730 kodują domenę Fc.

Konstrukty DNA poddawano przejściowej transfekcji w komórkach COS lub stabilnie transfekowano w komórkach CHO, stosując standardowe techniki, dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Płyny znad hodowli gromadzono i poddawano oczyszczaniu stosując standardowe techniki chromatografii powinowactwa na białku A oraz sączenie molekularne (patrz, na przykład, Harlow i Lane, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold pring Harbor Laboratory, 1988).

PL 201 246 B1

P r z y k ł a d 3: Oznaczenie biologiczne MRC5 dla białek wychwytujących IL-1

Ludzkie komórki fibroblastów płuc MRC5 odpowiadają na IL-1 poprzez wydzielenie IL-6, dzięki czemu zostały wykorzystane do analizy zdolności białek wychwytujących IL-1 do blokowania produkcji

IL-6 zależnej od IL-1. Białko wychwytujące IL-1, 1SC569 (Figura 2A-Figura 2E) badano względem

IL-1-RI.Fc, będącego zewnątrzkomórkową domeną receptora IL-1 typu I, połączonego z domeną Fc.

Komórki MRC5 zawieszono w ilości 1x10⁵ komórek na ml podłoża, a następnie nałożono na płytkę po 0,1 ml komórek (10,000 komórek na studzienkę) do studzienek 96-studzienkowej płytki hodowli tkankowej. Płytki inkubowano przez 24 godziny w 37°C przy wilgotności 5% z CO2 w inkubatorze.

Białko wychwytujące IL-1 i rekombinowane ludzkie białko IL-1 w różnych dawkach, inkubowano wstępnie na 96 studzienkowej szalce hodowli tkankowej przez 2 godziny w 37°C. 0,1 ml tej mieszaniny dodano następnie na 96-studzienkową płytkę, zawierającą komórki MRC5, w taki sposób, by końcowe stężenie białka wychwytującego IL-1 wynosiło 10 nM, a końcowe stężenia IL-1 wynosiło w zakresie od 2,4 pM do 5 nM. Studzienki kontrolne zawierały jedynie białko wychwytujące lub nie zawierały niczego.

Następnie płytki inkubowano przez 24 godziny w 37°C przy wilgotności 5% z CO2 w inkubatorze. Płyn znad hodowli gromadzono i analizowano poziom IL-6 za pomocą zestawu R&D Systems Quantikine Immunoassay Kit, zgodnie z zaleceniami producenta.

Wyniki

Figura 3 przedstawia białko wychwytujące 569 (Figura 2A-Figura 2E), zdolne do antagonizacji wpływu IL-1 i blokowania produkcji IL-6 z komórek MRC5 po potraktowaniu IL-1. Przy stężeniu 10 nM, białko wychwytujące 569 jest zdolne do blokowania produkcji IL-6, aż do stężenia IL-1 wynoszącego 3 nM. Przeciwnie, IL-1RI.Fc jest o wiele słabszym antagonistą IL-1. Jest on jedynie zdolny do blokowania wpływu IL-1 aż do około 10-20 pM. Zatem, białko wychwytujące 569 jest średnio 100 razy lepszym białkiem blokującym IL-1 niż IL-1RI.Fc.

P r z y k ł a d 4: Blokowanie wstrzykiwanej IL-1 przez białko wychwytujące IL-1 in vivo

IL-1 jest związaną ze stanem zapalnym cytokiną. Wykazano, że systematyczne podawanie IL-1 wywołuje silną odpowiedź u zwierząt, włączając przejściową hiperglikemię, niskie stężenie insuliny we krwi, gorączkę, brak łaknienia i podwyższony poziom interleukiny 6 (IL-6) w surowicy (Reimers, 1998). Ze względu na to, że myszy wykazują wrażliwość zarówno na mysią, jak i na ludzką IL-1, do testów in vivo badania wpływu wiązania ludzkich specyficznych antagonistów IL-1 zastosowano ludzką IL-1. Taki model, wykorzystujący myszy, zastosowano w celu określenia zdolności ludzkiego białka wychwytującego IL-1 do przeciwdziałania in vivo skutkom podawania egzogennej ludzkiej IL-1. Pozwala to na szybkie określenie skuteczności in vivo ludzkiego białka chwytającego IL-1 i może być wykorzystane w analizie wspomagającej selekcję cząsteczek.

Plan eksperymentu:

Myszom wstrzykiwano podskórnie ludzką IL-1 (0,3 pg/kg). Dwadzieścia cztery godziny przed wstrzyknięciem ludzkiej IL-1, zwierzętom podano nośnik lub 150-krotny nadmiar ludzkiego białka wychwytującego IL-1 (0,54 mg/kg). Dwie godziny przed uśmierceniem (26 godz.) myszom dokonano drugiego wstrzyknięcia ludzkiej IL-1 (0,3 pg/kg). Próbki krwi gromadzono w różnych odstępach czasu, a następnie analizowano surowicę pod kątem poziomu zawartości IL-6.

Wyniki

Podawanie ludzkiej, egzogennej IL-1 powodowało gwałtowną indukcję wzrostu poziomu IL-6 w surowicy. Przy zastosowaniu 150-krotnego nadmiaru molarnego, ludzkie białko wychwytujące IL-1 całkowicie blokowało wzrost IL-6 (Figura 4). Ponadto, skutki obecności ludzkiego białka wychwytującego IL-1 pozostawały, przez co najmniej kolejne 24 godziny, zapobiegając wzrostowi IL-6, nawet gdy podawano ponownie IL-1 (Figura 4). Takiego typu długotrwały skutek sugeruje, że, w przypadku przewlekłego stosowania, nie jest konieczne codzienne wstrzykiwanie ludzkiego białka chwytającego IL-1.

Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do celu wskazanego przez opisane tu specyficzne rozwiązania. W rzeczywistości, mogą być możliwe dla specjalistów w dziedzinie różne dodatkowe, obok opisanych, modyfikacje wynalazku płynące z zamieszczonego opisu i towarzyszących mu figur. Takie modyfikacje są zgodne z celem wynalazku i załączonymi zastrzeżeniami.

PL 201 246 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd fuzyjny, znamienna tym, że obejmuje:

a) ffaamentwiąążąc i nterleuuinę 1 ( IL-11 domeny zzwnąftzzomórkkwejsSłaanikk ddterminującego specyficzność aeceptoaa IL-1;

b) ffagment wią—ący IL-- domenn zewnątrakomórkowej stadnika praznęssąąceo ssygnł receptora IL-1;

c) składnik multimeryzujący;

pazy czym składnik multimeryzujący c) łączy się ze składnikiem multimeryzującym c) zawartym w innym polipeptydzie fuzyjnym tworząc multimer tych polipetydów fuzyjnych; i przy czym multimer wiąże i zatrzymuje IL-1, i działa jako antagonista IL-1.
2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że składnik a) białka fuzyjnego obejmuje fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny typu I IL-1R a składnik b) fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny IL-1R AcP.
3. Cząsteccka weeług z^^tr^. 1, znamienna tym, że składnik aa białła fuzyjąeeo obejmuja fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny typu II IL-1R a składnik b) fragment wiążący IL-1 zewnątrzkomórkowej domeny IL-1R AcP.
4. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że multimer stanowi dimer.
5. Cząsteecka weeług zzdtra. 0 zzai^em tym, że dSłaanik móltlmetayującc oObjmóją dc>menę pochodzącą z immunoglobuliny.
6. Cząsteeckaweeług zzdtra. d, zr^nr^^^^r^nty^n^, żż ddmenę zpohoodącc z i mmóuęoloOulinę jest wybrana spośród domeny Fc z IgG, łańcucha ciężkiego z IgG oraz łańcucha lekkiego z IgG.
7. Czącteecąaweeługzzdtrz. 0 z znmieenntyrn. żż ssnwenęjąnngiee-yydwe ZaOująccsSłaanik a) znajduje się przed sekwencją kodującą składnik b).
8. Czącteecąaweeług zzdtrz. 0 z znmieenntyrn. żż ssnwenęjąnngiee-yydwe kaOującc βΜθΙnik a) znajduje się za sekwencją kodującą składnik b).
9. Multlmer oOejmójącc dww I uu więę^ pplippetyydw nugzjąęyh, zzamieenatym, żż ka0dwedę są one przez dowolną cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1-8, przy czym multimer wiąże się i zatrzymuje IL-1, i działa jako antagonista IL-1.
10. Multlmerweeługzzdtra. 9,zznmieenatym. żż stadęwi oOejmójąccdwe ładiepplippetydy fuzyjne.
11. Werae-ι zznmieena t^m, Zż zObjmóją zcącteecąa Zw^s zngieinęweeg zkłańloną w zastrz. 1-8.
12. ννοΜ^ znkstansjąę, zzamieena ttyn, dż zOejmójadowelną zcącteecąa Zw^s sngieinęwego określoną w zastrz. 1-8, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z sekwencją kontrolną ekspresji.
13. Ukkaa wejae-aggsspOdłz do wetwełaznia ppli|:>p^pi^c^u 1ugzjąęeg, znamieena tym, że obb0 muje wektor ekspresyjny określony w zastrz. 12, oraz komórkę gospodarza.
14. Ukłaaweeługzzdtra. O, zznmieenatym. żż ZameraaggsspOdłaz sSa^wi Zameraa dbateryjna, komórka drożdży, komórka owadzia lub komórka ssacza.
15. weeług zzdSra. 13, zznmieenatym. żż kameraaggsspOdłzz stadęwi kamerZaE. coli, komórka COS, komórka CHO, komórka 293, komórka BHK lub komórka NSO.
16. SppsSó weCwełazdia zplippetyydw 1ugzCaęyh, zznrmeena t^m, Zż ((^Ιιύ się SamerZi sgładu wektor-gospodarz określone w zastrz. 13 lub 14 lub 15 w warunkach pozwalających na wytwarzanie tych polipeptydów fuzyjnych i odzyskuje się tak wytworzone polipeptydy fuzyjne.
17. Bsposó weeług zzdtra. (1, zzamieena tiyn, Zż ppsęato ζ^ψ, w ppowela się na tworzenie multimerów polipeptydów fuzyjnych określonych w zastrz. 9.
18. SppsSó weeług zzdtra. (1, zznmieena ttm, że j aak πι.^Κ:ϊγ^^-ζ' o-razmóje sśę 0ϊγ·00-ζ oSłzślone w zastrz. 10.
19. Komepozyjafałmeacnjyycąę,zznrmeenntym. żż zOejmója móltlme- oSreńlosęw zzaSz. Z, lub dimer określony w zastrz. 10, w farmakologicznie dopuszczalnej cieczy, nośniku stałym lub semistałym, połączony z nośnikiem lub cząsteczką ukierunkowującą i/lub wprowadzony do liposomów, mikrokapsułek lub preparatu o kontrolowanym uwalnianiu.