ES2881359T3 - Determinación de la pureza de proteínas multiméricas - Google Patents
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Abstract
Una composición, que comprende: una mezcla de proteínas para separar y detectar una primera proteína de una u otras proteínas en la mezcla, en donde dicha composición comprende: una primera proteína, una o más de otras proteínas y un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a una de dichas una o más de otras proteínas para formar un complejo con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado; en donde dicho ligando modificado tiene un punto isoeléctrico menor que un ligando sin modificar; caracterizado por que dicha primera proteína es una proteína de múltiples subunidades y dicha primera proteína y dichas una o más de otras proteínas tienen proporciones de carga respecto a la masa similares.
Description
DESCRIPCIÓN
Determinación de la pureza de proteínas multiméricas
Listado de secuencias
Al mismo tiempo que la presente especificación se presenta un archivo de texto de un listado de secuencias que cumple con la Norma ST.25 (1998) de la OMPI. Los contenidos del archivo de texto se incorporan en este documento por referencia. El archivo de texto que contiene el listado de secuencias se denomina "10141US01 ST25" y se creó el 11 de abril de 2016 y contiene aproximadamente 19.025 bytes de información.
Antecedentes
Campo
La invención se dirige en general a composiciones, sistemas y métodos para detectar una o más especies de polipéptidos en una mezcla compleja de polipéptidos y complejos de polipéptidos. Específicamente, la invención incluye composiciones, sistemas y métodos para detectar homodímeros en una mezcla de multímeros que incluyen anticuerpos biespecíficos.
Técnica relacionada
Los anticuerpos monoclonales representan una clase importante de agentes terapéuticos para diferentes enfermedades. Existe un interés creciente en aumentar la versatilidad de los anticuerpos monoclonales, siendo un enfoque el diseño y la generación de anticuerpos biespecíficos (bsAb). La expresión convencional de un bsAb usando dos cadenas pesadas y dos ligeras dará como resultado múltiples (hasta diez) productos proteicos multiméricos indeseables debido a la asociación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras. La coexpresión de dos cadenas pesadas únicas y una cadena ligera común minimizará el número de productos secundarios en dos especies homodiméricas, que se podrían necesitar eliminar posteriormente durante la purificación. Por tanto, existe una necesidad de métodos eficaces y efectivos para detectar y diferenciar los productos secundarios de homodímeros del heterodímero deseado (bsAb). Se desvelan los reactivos y los métodos para estimar la pureza de un bsAb que consiste en dos cadenas pesadas únicas y dos cadenas ligeras idénticas.
Sumario
Los presentes solicitantes han desarrollado reactivos y procesos para detectar productos secundarios de homodímeros dentro de una mezcla de productos multiméricos. Los reactivos incluyen un ligando que se une a una subunidad específica de los productos secundarios de homodímeros. Los procesos incluyen formas modificadas de electroforesis de zona capilar (CZE; del inglés, capillary zone electrophoresis), denominadas electroforesis capilar de afinidad (ACE; del inglés, affinity capillary electrophoresis), en la que el ligando se combina con la mezcla de productos multiméricos antes de la electroforesis; y electroforesis capilar de afinidad parcialmente rellena (PF-ACE; del inglés, partially filled ACE), en la que el capilar se rellena parcialmente con el ligando antes de someter a electroforesis la mezcla de productos multiméricos. Los productos multiméricos incluyen un heterodímero, que contiene una primera subunidad y una segunda subunidad; un primer homodímero, que contiene dos primeras subunidades (también conocido como "homo-B"); y un segundo homodímero, que contiene dos segundas subunidades (también conocido como "homo-A"). El ligando se une a una subunidad específica, en algunas realizaciones a la primera subunidad y en otras realizaciones, a la segunda subunidad.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición, que comprende:
una mezcla de proteínas para separar y detectar una primera proteína de una u otras proteínas en la mezcla, en donde dicha composición comprende:
una primera proteína,
una o más de otras proteínas y
un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a una de dichas una o más de otras proteínas para formar un complejo con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado; en donde dicho ligando modificado tiene un punto isoeléctrico menor que un ligando sin modificar; caracterizado por que dicha primera proteína es una proteína de múltiples subunidades y dicha primera proteína y dichas una o más de otras proteínas tienen proporciones de carga respecto a la masa similares.
La presente invención proporciona además un sistema que comprende:
a. una composición con una mezcla de proteínas que comprende:
una primera proteína, una o más de otras proteínas y un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a dichas una o más de otras proteínas para formar
uno o más complejos con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado y dicha primera proteína;
b. un capilar;
c. un detector;
d. un ánodo en o cerca de un extremo del capilar;
e. un cátodo en o cerca del otro extremo del capilar; y
f. un suministro de energía.
La presente invención proporciona además un método para separar y detectar una primera proteína en una mezcla de proteínas que tiene proporciones de carga respecto a la masa sustancialmente similares, comprendiendo dicho método:
a. poner en contacto dicha mezcla de proteínas con un ligando modificado que comprende un resto ácido y no se une a la primera proteína pero se une a otras proteínas en la mezcla de proteínas que tienen proporciones de carga respecto a la masa similares para formar una muestra;
b. aplicar dicha muestra a un capilar que comprende un tapón de ligandos que comprende un ligando modificado adicional;
c. aplicar un voltaje a dicho capilar para permitir a dicha primera proteína moverse a través del capilar a una tasa más rápida que las otras proteínas para separar la primera proteína de las otras proteínas; y
d. detectar dicha primera proteína.
En una realización, la mezcla de proteínas multiméricas se produce mediante células que contienen ácidos nucleicos heterólogos que expresan la primera subunidad y la segunda subunidad. En realizaciones particulares, las células son células de mamífero utilizadas en la producción a escala industrial de moléculas bioterapéuticas como anticuerpos monoclonales. Las células incluyen células CHO y sus derivados (células CHO-K1 y células EESYR®).
En una realización, el homodímero (el primer homodímero o el segundo homodímero) se detecta a través de electroforesis de zona capilar disminuyendo la proporción carga/masa del heterodímero y otro homodímero. La carga/masa disminuye cuando uno de los ligandos se une a una de las subunidades, dando como resultado la formación de un complejo que tiene una carga/masa disminuida, que ralentiza enormemente la movilidad del complejo a través del capilar relativo a la subunidad no unida y su homodímero. Por ejemplo, cuando la mezcla de multímeros se combina con el ligando que se une a la segunda subunidad (segundo ligando), ese segundo ligando se unirá al heterodímero (que contiene una primera subunidad y una segunda subunidad) y al segundo homodímero (que contiene dos segundas subunidades). El primer homodímero permanece sin unirse y por tanto, tiene una proporción de carga respecto al tamaño mayor y una movilidad aumentada simultánea a través del capilar. Por tanto, durante la electroforesis, el primer pico de homodímero se detecta primero y su pico está bien separado del segundo homodímero y heterodímeros que forman complejo. Asimismo, cuando la mezcla de multímeros se combina con el primer ligando, la movilidad electroforética del primer homodímero y el heterodímero que forman complejo disminuye, permitiendo detectar el segundo homodímero como un pico bien separado. Este procedimiento se denomina electroforesis capilar de afinidad (ACE).
En otra realización, el capilar está precargado con el tapón de ligandos. Cuando la mezcla de multímeros se carga y se somete a electroforesis a través del capilar, cada especie de multímero encontrará el "tapón de ligandos" en el capilar. Cualquier multímero que contenga una subunidad que se una al ligando, se unirá al ligando y su movilidad electroforética se retrasará (es decir, desplazamiento de movilidad). A continuación, el homodímero sin unir queda libre para moverse a través del capilar separado de los multímeros unidos al ligando. Este procedimiento se llama electroforesis capilar de afinidad parcialmente rellena (PF-ACE).
Para detectar tanto el primer homodímero como el segundo homodímero, se realizan al menos dos procedimientos separados, uno utilizando el primer ligando para detectar el segundo homodímero y otro usando el segundo ligando para detectar el primer homodímero. Opcionalmente, se puede ejecutar un procedimiento de CZE convencional para detectar el heterodímero, que teniendo una carga/masa similar en ambos homodímeros se detectará en el mismo "pico" que los homodímeros. La fracción de heterodímeros se cuantifica restando el primer homodímero detectado en el primer procedimiento ACE o PF-ACE y restando el segundo homodímero detectado del mismo modo en el segundo procedimiento.
En una realización, la primera subunidad contiene un dominio CH3 de inmunoglobulina que permite que la primera subunidad se una a la proteína A y la segunda subunidad contiene un dominio CH3 de inmunoglobulina variante que no permite que la segunda subunidad se una a la proteína A. En una realización, cada homodímero es un anticuerpo monoespecífico que tiene una especificidad distinta y el heterodímero es un anticuerpo biespecífico específico tanto para el antígeno afín del primer homodímero como para el antígeno afín del segundo homodímero. En una realización, cada uno de los tres anticuerpos (por ejemplo, bsAb o hetero-AB, homo-A, homo-B) contiene cadenas ligeras idénticas y la primera y segunda subunidades se refieren a cadenas pesadas. Si bien los anticuerpos se denominan homodímeros y heterodímeros, en realidad, normalmente son tetrámeros. Dado que las cadenas ligeras son las mismas para cada especie multimérica, esencialmente se ignoran a efectos nomenclaturales. En una realización específica, la primera cadena pesada puede unirse a la proteína A y la segunda cadena pesada contiene las
sustituciones H95R e Y96F del dominio CH3, que anula la unión de la proteína A (numeración de acuerdo con IMGT; véase Lefranc, M.-P., (2008) 40 Mol. Biotechnol. 101-111).
En una realización, el ligando es un anticuerpo que se une a una subunidad. El primer ligando es un anticuerpo que se une a la primera subunidad, pero no a la segunda subunidad; y el segundo ligando es un anticuerpo que se une a la segunda subunidad, pero no a la primera subunidad. En una realización, el pI (punto isoeléctrico) del ligando es diferente o está modificado para ser diferente del pI de cada uno de los multímeros (por ejemplo, más ácido o pI más bajo).
Dibujos
La Figura 1 es un diagrama esquemático que representa un anticuerpo biespecífico (hetero-AB) y los productos secundarios relacionados con el producto (homo-A y homo-B) expresados durante la producción. La sustitución dipeptídica en el dominio CH3 carente de unión a la proteína A está indicada por la estrella rellena de seis puntas.
La Figura 2 representa los electroferogramas de homo-A (a), homo-B (b), bsAb1 (c), mezcla de homo-A, homo-B y bsAb (d) y una escalera de pesos moleculares (e) analizada mediante CE-SDS en condiciones reductoras.
La Figura 3 muestra los electroferogramas representativos de bsAb1 (traza a), mAb homo-B (traza b), mAb homo-A (traza c) y una mezcla 1:2:1 de homo-A:bsAb1:homo-B (traza d) separados a través de CZE.
La Figura 4 representa los electroferogramas CZE de bsAb2 (traza a), de los mAb homo-B (traza b) y homo-A (traza c).
La Figura 5 representa los electroferogramas de muestras de bsAb3 (traza a), bsAb3 en presencia de mAb antiA (traza b) y bsAb3 en presencia del ligando de afinidad del mAb antiB (traza c).
La Figura 6 representa un cromatograma de SE-HPLC que representa la unión estequiométrica del ligando específico de la cadena B al bsAb3. La traza a representa bsAb3, la traza b representa el anticuerpo antiB y la traza c representa la combinación de bsAb3 y el anticuerpo antiB.
La Figura 7 representa los electroferogramas de muestras de bsAb-3 (traza A), en presencia de ligando anticadena B en las condiciones de ACE (traza B) y PF-ACE (traza C).
La Figura 8 representa los electroferogramas de mAb homo-B libre (traza A), mAb homo-B en presencia de mAb anticadena-B (traza B) o mAb anticadena-A (traza C). También se muestran los electroferogramas de mAb homo-A libre (traza D) y mAb homo-A en presencia de mAb anticadena-A (traza E) o mAb anticadena-B (traza F).
La Figura 9 representa electroferogramas de bsAb3 (traza a) y bsAb3 enriquecidos con un 5% de impurezas de mAb (traza b) en presencia de mAb antiA (traza c) o mAb antiB (traza d).
La Figura 10 representa el área de pico corregida para el homodímero A (homo-A) sobre la concentración relativa (porcentaje) de homo-A.
La Figura 11 representa el área de pico corregida para el homodímero B (homo-B) sobre la concentración relativa (porcentaje) de homo-B.
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni condiciones experimentales particulares descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que habitualmente comprende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención.
Como se utiliza en el presente documento, el término "ligando" se refiere a cualquier molécula que se une a otra molécula. "Ligando" tiene el significado tradicional en las técnicas bioquímicas como un agonista o antagonista que se une a un receptor afín. "Ligando", como se utiliza en el presente documento, también abarca la interacción anticuerpoantígeno, en la que el anticuerpo es el ligando y el antígeno es su pareja de enlace afín o viceversa, en la que el antígeno es el ligando y el anticuerpo (o fragmento del mismo) es la pareja de enlace afín. La presente invención
emplea un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a una de dichas una o más de otras proteínas para formar un complejo con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado; en donde dicho ligando modificado tiene un punto isoeléctrico menor que un ligando sin modificar.
Un ligando puede ser cualquier molécula que se una a una molécula "afín", incluidos anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas scFv, moléculas trampa, concatámeros de receptores, moléculas recombinantes o sintéticas que contienen una o más CDR, antígenos, haptenos, epítopos recombinantes, ligandos canónicos, receptores, fragmentos de receptores solubles, receptores nucleares, esteroides, péptidos, aptámeros, ARN, ADN, moléculas orgánicas, moléculas pequeñas y similares.
La expresión "tapón de ligandos" se refiere a un área rica en ligandos dentro del capilar, generalmente cerca del extremo de carga (por ejemplo, cerca del extremo del ánodo) del capilar. El capilar puede estar precargado con ligando, que forma un "tapón" que se une a (es decir, "captura") la pareja de enlace afín del ligando según esa pareja de enlace afín migra a lo largo del capilar, formando un complejo que tiene una movilidad alterada.
El término "complejo" se refiere e incluye entidades moleculares de orden superior que comprenden al menos dos entidades moleculares, tales como moléculas pequeñas, metales, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, aptámeros u otras entidades moleculares. El término "complejo" incluye proteínas de múltiples subunidades. Por ejemplo, la hemoglobina es un complejo que contiene dos cadenas de globina alfa, dos cadenas de globina beta, cuatro grupos hemo que contienen hierro y CO2 u O2. Por ejemplo, un receptor unido a su ligando afín es un complejo, un anticuerpo unido a un antígeno es un complejo y una enzima unida a un sustrato o unida a un sustrato y a un cofactor es un complejo. Como se utiliza en algunas realizaciones desveladas en el presente documento, "complejo" incluye un homodímero o heterodímero unido a un ligando. Un complejo también puede denominarse "entidad molecular" o "entidad". Por ejemplo, un homodímero o heterodímero unido a su ligando, que es un complejo, puede denominarse a sí mismo como una "entidad" o "entidad molecular". En la presente invención, el ligando modificado comprende un resto ácido y no se une a la primera proteína pero es capaz de unirse a una de dichas una o más de otras proteínas para formar un complejo con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado; en donde dicho ligando modificado tiene un punto isoeléctrico menor que un ligando sin modificar.
Como se utiliza en el presente documento, el término "multímero" y la expresión "proteína multimérica" se usan indistintamente para indicar una proteína hecha de más de una subunidad componente. Las subunidades pueden estar unidas juntas o asociarse de otra manera para formar el multímero. La unión o asociación puede ser a través de uno o más enlaces intermoleculares cualesquiera, incluyendo os enlaces covalentes y no covalentes. Un "homodímero" es un multímero que comprende dos o más subunidades que son las mismas o funcionalmente equivalentes. Como se utiliza en el presente documento, un homodímero comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que son las mismas o funcionalmente equivalentes, pero el homodímero puede incluir subunidades adicionales también. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal contiene dos cadenas pesadas idénticas. Como tal, el anticuerpo monoclonal puede considerarse que es un "homodímero". Sin embargo, un anticuerpo monoclonal canónico completo también contiene dos cadenas ligeras y por tanto, puede denominarse un tetrámero. Un "heterodímero" es un multímero que comprende dos o más subunidades que no son las mismas o que no son funcionalmente equivalentes. El heterodímero puede contener subunidades adicionales además de las dos subunidades distintas. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, de modo que una mitad del anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada y una cadena ligera) se une a un epítopo y la otra mitad del anticuerpo (por ejemplo, otra cadena pesada y la misma cadena ligera, la misma cadena pesada y otra cadena ligera u otra cadena ligera y otra cadena pesada) se une específicamente a otro epítopo. El anticuerpo biespecífico es un tetrámero. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico es un heterodímero, ya que ese término se refiere a que las cadenas pesadas no son iguales o no son funcionalmente equivalentes.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "subunidad" o "subunidad de componente" significa un componente de un multímero, normalmente (pero no siempre) un polipéptido. El polipéptido componente es de una sola cadena y puede tener cualquier tamaño, desde tres aminoácidos a varios miles de aminoácidos de largo.
Como se utiliza en el presente documento, el término "unir" o el término "unido" significa la asociación de una molécula con otra a través de fuerzas no covalentes. Unirse o estar unido implica una fuerza relativamente fuerte (micromolar o por debajo de Kd), tal como la de entre un anticuerpo y su antígeno o entre un ligando y su receptor. Las fuerzas no covalentes incluyen puentes de hidrógeno, interacciones ion-dipolo y dipolo inducidas por iones, interacción iónica, fuerzas de Van der Waals, interacción hidrófoba, enlace de halógeno, interacciones pi-pi e interacción catión pi-anión pi. Véase Wang et al., (2001) 30 Ann. Rev. Biophys. Biomol Structure 211-243.
El término "unir", "entrecruzar", "unido" o "entrecruzado" se utiliza generalmente para expresar la asociación covalente de dos o más subunidades para formar una proteína más compleja.
Las expresiones "CH3", "dominio CH3" y "dominio CH3 de inmunoglobulina" se usan indistintamente y denotan la región de una cadena pesada de inmunoglobulina que abarca de aproximadamente el aminoácido 341 al extremo C,
de acuerdo con el sistema de numeración EU (Edelman et al., (1969) 63(1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78-85). El dominio CH3 está implicado en la unión de la proteína A, de modo que, por ejemplo, los dominios CH3 de IgG1, IgG2 e IgG4 humanas modulan la unión a la proteína A, pero el dominio CH3 de IgG3 no (Van Loghem et al., Staphylococcal protein A and human IgG subclasses and allotypes, 15(3) Scand. J. Immunol. 275-8 (1982)). Las sustituciones de aminoácidos H95R e Y96F en el dominio CH3 (numeración IMGT; H435R e Y436F en el sistema de numeración EU) anulan la unión de la proteína A (patente de Estados Unidos n.° 8.586.713 (concedida el 19 de noviembre de 2013)).
Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene una región variable de cadena pesada (HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste en un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, c DR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. El término "anticuerpo" incluye la referencia a inmunoglobulinas tanto glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase. El término "anticuerpo" incluye moléculas de anticuerpo preparadas, expresadas, creadas o aisladas por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula hospedadora transfectada para expresar el anticuerpo. Para una revisión de la estructura de anticuerpos, véase Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol.
55-77 (2003); y M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983).
El término anticuerpo también incluye un "anticuerpo biespecífico", que incluye una inmunoglobulina heterotetramérica que puede unirse a más de un epítopo diferente. Una mitad del anticuerpo biespecífico, que incluye una sola cadena pesada y una sola cadena ligera y seis CDR, se une a un antígeno o epítopo y la otra mitad del anticuerpo se une a un antígeno o epítopo diferente. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico puede unirse al mismo antígeno, pero en diferentes epítopos o a epítopos no solapantes. En algunos casos, ambas mitades del anticuerpo biespecífico tienen cadenas ligeras idénticas, si bien conservan la especificidad dual. Los anticuerpos biespecíficos se describen generalmente en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0331527 (30 de diciembre de 2010).
La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "fragmento de anticuerpo"), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserva(n) la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Entre los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo se incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de una sola rama de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 241:544-546), que consiste en un dominio VH, (vi) una CDR aislada y (vii) un scFv, que consiste en los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, unidos por un enlazador sintético para formar una sola cadena proteica en que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes. Otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos también están incluidas en el término "anticuerpo" (véanse, por ejemplo, Holliger et al. (1993) 90 PNAS USA 6444 6448; y Poljak et al. (1994) 2 Structure 1121-1123).
Todavía adicionalmente, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo puede formar parte de una molécula de inmunoadhesión mayor, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o de porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región del núcleo de estreptavidina para fabricar una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al., (1995) "6 Human Antibodies and Hybridomas" 93-101) y el uso de un resto de cisteína, un péptido marcador y un marcador de polihistidina C-terminal para producir moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al., (1994) 31 Mol. Immunol. 1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina de anticuerpos completos. Asimismo, pueden obtenerse anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales comúnmente conocidas en la materia (véase Sambrook et al., 1989).
Las "proteínas de fusión de Fc" comprenden parte o la totalidad de dos o más proteínas, una de las cuales es una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina, que de otro modo no se encuentran juntas en la naturaleza. La preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., (1991) 88 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10535; Byrn et al., (1990) 344 Nature 677; y Hollenbaugh et al., (1992) "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11. "Las proteínas de fusión de receptor Fc" comprenden uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplado a una fracción Fc, que, en algunas realizaciones, comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de Fc contiene dos o
más cadenas de receptor distintas que se unen a uno o más ligandos. Por ejemplo, la proteína de fusión a Fc puede ser una trampa, tal como, por ejemplo, una trampa de IL-1 (por ejemplo, rilonacept, que contiene la región de unión al ligando IL-1RAcP fusionada a la región extracelular de IL-1R1 fusionada a Fc de hIgG1; véase la Patente de los Estados Unidos n.° 6.927.004) o una trampa de VEGF (por ejemplo, aflibercept, que contiene el dominio de Ig 2 del receptor Flt1 de VEGF fusionado al dominio de Ig 3 del receptor Flk1 de VEGF fusionado a Fc de hIgGI; véanse las patentes de Estados Unidos n.° 7.087.411 (concedida el 8 de agosto de 2006) y n.° 7.279.159 (concedida el 9 de octubre de 2007).
La expresión "proteína A" como se utiliza en el presente documento significa formas naturales, formas recombinantes, formas modificadas, formas modificadas por ingeniería genética y derivados de la proteína A de la pared celular de Staphylococcus aureus de 42 kDa que se unen a los dominios Fc de IgG1, IgG2 e IgG4, pero no a IgG3 (Dima et al., (1983) 13(8) Eur. J. Immunol. 605-14). La proteína A modificada por ingeniería genética puede ser, por ejemplo, un tetrámero del dominio Z, un tetrámero del dominio Y o una proteína A modificada por ingeniería genética que carece de los dominios D y E. Estos ejemplos de proteína A modificada por ingeniería genética no pueden unirse (o si acaso, se unen con una afinidad muy baja) al dominio VH3 de una inmunoglobulina, pero aún pueden unirse a los dominios CH3 de IgG1, IgG2 y IgG4. La proteína A modificada se analiza en Minakuchi et al., (2013) 22(9) Protein Sci. 1230-8. Las proteínas disponibles en el mercado incluyen MabSelect® (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), MabSelect Sure (Ge Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey) Prosep Ultra® (Millipore, Billerica, Massachusetts) y Poros A® (Perspective Biosystems, Framingham, Massachusetts).
La cromatografía de afinidad de proteína A utiliza la afinidad de la proteína A por el dominio Fc para purificar proteínas que contienen Fc. En la práctica, la cromatografía de proteína A implica el uso de proteína A inmovilizada en un soporte sólido. Véase Gagnon, Protein A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems 155-198 (1996). El soporte sólido es una matriz no acuosa sobre la que se adhiere la proteína A. Tales soportes incluyen agarosa, sefarosa, vidrio, sílice, poliestireno, nitrocelulosa, carbón vegetal, arena, celulosa y cualquier otro material adecuado. Los métodos para fijar proteínas a soportes sólidos adecuados son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ostrove, (1990) en Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357 371. Tales soportes sólidos, con y sin proteína A inmovilizada, están fácilmente disponibles de muchas fuentes comerciales, tales como Vector Laboratory (Burlingame, California), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California), BioRad (Hercules, California), Amersham Biosciences (parte de GE Healthcare, Upsala, Suecia), Pall (Port Washington, Nueva York) y EMD-Millipore (Billerica, Massachusetts). La proteína A inmovilizada en una matriz de vidrio de poro está disponible en el mercado como PROSEP®-A (Millipore). La fase sólida también puede ser una matriz a base de agarosa. La proteína A inmovilizada sobre una matriz de agarosa está disponible en el mercado como MABSELECT™ (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, Pensilvania).
El término "capilar" se refiere a un sustrato a través o en el que viajan una o más entidades moleculares, en algunos casos a diferentes tasas para permitir la separación. Un capilar puede estar hecho de cualquier material, tal como vidrio o un polímero. Por ejemplo, se usaron capilares de sílice fundidos descubiertos (40 o 50 pm) en algunos experimentos ilustrativos más adelante (comercializados por Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona). Un capilar puede ser un tubo hueco de una longitud que sea mayor que su diámetro. Un capilar se usa generalmente para separar biomoléculas u otras entidades moleculares basadas en la masa y/o carga de la entidad. Por ejemplo, cuando un potencial eléctrico se coloca a través del capilar, las entidades moleculares migran a través del capilar a una tasa determinada por su proporción de carga respecto al tamaño. Para proporcionar el potencial eléctrico, un extremo del capilar está unido a un cátodo (carga negativa) ("extremo catódico del capilar") y el otro extremo del capilar está unido a un ánodo (carga positiva) ("extremo anódico del capilar"). Las entidades cargadas positivamente migrarán hacia el cátodo.
Se proporciona un "detector" o "ventana del detector" en un punto a lo largo del eje largo del capilar, para que sirva como una ventana para detectar entidades moleculares según pasen. Las entidades moleculares pueden detectarse mediante uno o más métodos conocidos cualesquiera en las técnicas de detección de moléculas. Por ejemplo, las proteínas pueden detectarse mediante absorbancia de radiación electromagnética a 220 nm o 280 nm (ADN a 260 nm) ("detección de absorbancia UV"). Véase C. Stoscheck, (1990) 182 Methods in Enzymology 50-69. La fluorescencia inducida por láser (CE-LIF; del inglés, laser-induced fluorescence) también puede emplearse para detectar entidades moleculares mediante la fluorescencia nativa (para aquellas moléculas que tienen fluorescencia nativa) o mediante la detección de entidades marcadas. Por ejemplo, puede usarse un láser de 280 nm o 295 nm para inducir la fluorescencia natural de la tirosina, el triptófano y la fenilalanina de las proteínas y detectarse la luz emitida (por ejemplo, el sistema de caracterización de proteínas PA 800 de Beckman Coulter, Beckman Coulter, Brea, California). Las entidades moleculares también pueden detectarse mediante LIF mediante la derivatización de la entidad con marcadores de fluoróforo, excitando la entidad derivatizada con un láser (por ejemplo, láser de iones de argón que emite a 488 nm, láser de HeCd que emite a 442 nm o láser de diodo que emite a 473, 410, 405 o 425 nm) y detectar la longitud de onda de emisión. Esos marcadores incluyen, entre otros, isotiocianato de fluoresceína (FlTC), éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), 6-oxi-(acetato de N-succinimidil)-9-(2-metoxicarbonilo) (SAMF), O acetato de N-hidroxisuccinimidil fluoresceína (SIFA), 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (BD-F), 3-(2-furoil)quinolina-2-carboxaldehído (FQ), 5-(4,6-dicrolotriazinil)aminofluoresceína (DTAF) y 3-(4-carboxibenzoil) -2-quinolincarboxaldehído (Cb QCa ). Véase E. Szoko and T. Tábi, (2010) 53(5) J. Pharma. and Biomed. Analysis 1180 1192.
El término "célula" se refiere a una célula procariota o eucariota. Una célula es capaz de expresar un polipéptido o proteína que sea útil, entre otras cosas, como reactivo o como fármaco terapéutico (Kipriyanov y Little, (1999) 12 Molecular Biotechnology 173-201). El polipéptido o proteína expresado puede localizarse dentro de la célula, localizarse en la membrana celular o pared celular o secretarse por la célula. Las células procariotas incluyen células bacterianas como Escherichia coli (Spaduit et al., (2014) 32(1) Trends Biotechnol. 54-60). Las células eucariotas incluyen células de plantas como tabaco, Arabidopsis, patata, maíz, zanahoria y cártamo (Yusibov et al., (2011) 7:3 Human Vaccines 313-321; K. Ko, (2014) 33(3) Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy 192 198). Las células eucariotas incluyen células de levadura como Saccaromyces cerevisiae y Pichia pastoris (Spaduit, et al., (2011) 3(5) MAbs 453-60). Las células eucariotas incluyen células de insectos como las células Sf9 (Huang et al., (2006) 26(2A) Anticancer Res. 1057-63). Las células eucariotas incluyen células de mamíferos como las células BSC, células HeLa, células HepG2, células LlC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLCPK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK, células BHK-21, "células CHO", células CHO-K1, células EESYR®, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 3T3, células 293, células RK, células Per.C6 y células de embrión de pollo. Una "línea celular de ovario de hámster chino (CHO)" o una o más de diversas variantes específicas de células CHO, tal como la línea celular CHO-K1, está(n) optimizada(s) para la producción de proteína a gran escala, tal como en la producción de anticuerpos. La línea celular EESYR® es una línea celular CHO especializada optimizada para la producción potenciada de proteínas de interés. Para una descripción detallada de las células EESYR®, véase la Patente de los Estados Unidos n.° 7.771.997 (concedida el 10 de agosto de 2010).
El término "movilidad" se refiere al movimiento de una entidad molecular (incluyendo un complejo) a través de un medio. El medio puede ser un gel, una película, aire u otro gas, tampón acuoso y otro líquido, un capilar, una película delgada, partículas de tamizado o similar. La entidad molecular puede moverse a través de, entre otros, un campo eléctrico, un campo magnético, un campo gravitacional, por difusión simple o a través de tamizado molecular. La movilidad generalmente está relacionada con el volumen, la masa o la carga de la entidad molecular. Para la difusión, una entidad molecular que tiene una masa mayor tiene menor movilidad que una entidad o complejo que tiene una masa menor. La movilidad de una entidad molecular en un campo eléctrico (es decir, "movilidad electroforética") depende de la proporción carga respecto a masa de la entidad. La carga de la entidad depende en parte de la estructura tridimensional de la entidad, su punto isoeléctrico, su estado de desnaturalización o natividad, su estado de solvatación e hidratación, el tampón y pH del medio. Véase Barroso et al., (2015) 854 Analytica Chimica Acta 169 177. Cuanto mayor sea la proporción de carga respecto al tamaño de la entidad molecular, mayor será la movilidad electroforética (es decir, mayor velocidad a través del medio).
Ligandos
La presente invención emplea un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a una de dichas una o más de otras proteínas para formar un complejo con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado; en donde dicho ligando modificado tiene un punto isoeléctrico menor que un ligando sin modificar; caracterizado por que dicha primera proteína es una proteína de múltiples subunidades y dicha primera proteína y dichas una o más de otras proteínas tienen proporciones de carga respecto a la masa similares.
También se desvela un ligando que se une a una primera subunidad de una proteína de múltiples subunidades y no se une a una segunda subunidad de la proteína de múltiples subunidades. El ligando se utiliza para identificar aquellas moléculas que contienen una primera subunidad, directa o indirectamente, a través de una resta. En una realización alternativa, el ligando se une a la segunda subunidad y no a la primera subunidad. Generalmente, el ligando se une a una subunidad de un heterodímero, pero no a la otra subunidad del heterodímero.
En algunos casos, cada una de las subunidades primera y segunda contiene un dominio CH3 de inmunoglobulina. Dado que una cadena pesada de inmunoglobulina contiene un dominio CH3, cada subunidad puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina. La proteína de múltiples subunidades, por tanto, en algunos casos es un anticuerpo que contiene dos cadenas pesadas distintas. Tal anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que tenga especificidad de epítopo dual.
De acuerdo con algunos protocolos para producir anticuerpos biespecíficos (u otros heteromultímeros), el dominio CH3 de una subunidad es capaz de unirse a la proteína A (CH3) y el CH3 de la otra subunidad no se une a la proteína A o se une en una afinidad muy reducida (CH3*). Por tanto, el anticuerpo biespecífico se une a la proteína A mejor que un anticuerpo con dos dominios CH3 que tienen capacidad de unión a la proteína A reducida o nula (es decir, CH3*), pero no tan bien como el anticuerpo con dos dominios CH3 de unión a la proteína A. Esta unión diferencial a la proteína A puede usarse para separar el anticuerpo biespecífico de cualesquier homodímeros que estén presentes. En una realización, el CH3* comprende sustituciones de aminoácidos H95R e Y96F (numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de exones IMGT), que reducen o anulan la unión de la proteína A.
Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede producirse mediante la expresión en una célula (por ejemplo, célula CHO o derivado de célula CHO, tal como EESYR®), tanto de una primera cadena pesada específica de un primer
epítopo como de una segunda cadena pesada específica de un segundo epítopo. Dado que el anticuerpo contiene dos cadenas pesadas, se producirían por la célula al menos tres formas de anticuerpo: un homodímero específico del primer epítopo que tiene dos primeras cadenas pesadas idénticas (también conocido como homo-B), un homodímero específico del segundo epítopo que tiene dos segundas cadenas pesadas idénticas (también conocidas como homo-A) y un heterodímero específico de ambos epítopos y que tiene tanto una primera como una segunda cadena pesada (también conocido como hetero-AB). En algunos esquemas de purificación, la separación del homodímero de unión a proteína A (homo-B) y el heterodímero de unión a proteína A (hetero-AB) es menos que perfecta y el heterodímero resultante (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) está contaminado con homodímero.
Un objeto particular de la invención es determinar la pureza del heterodímero producido por las células y purificado por cromatografía de proteína A, al distinguir los homodímeros del heterodímero. En algunos casos, los atributos biofísicos de los homodímeros y el heterodímero (Ab) (por ejemplo, masa, punto isoeléctrico, contenido de aminoácidos y similares) son lo suficientemente similares como para hacer difícil la identificación y cuantificación específicas de cada especie. Por tanto, el ligando (L) se utiliza para unir selectivamente uno de los homodímeros y el heterodímero y no unir el otro homodímero. Tal unión forma un complejo (también conocido como Ab-L) que tiene atributos biofísicos alterados y distintivos, que permite al experto en la materia distinguir el homodímero no unido del homodímero unido y del heterodímero unido. En algunos casos, el complejo tiene alterada la movilidad electroforética, lo que permite una mayor separación o resolución del homodímero que no forma complejos de los complejos asociados al ligando.
El ligando puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra proteína de unión a antígeno que se une específicamente a una de las subunidades (por ejemplo, la primera subunidad o la segunda subunidad, pero no ambas). En una realización, en donde (a) el heterodímero es un anticuerpo biespecífico, (b) la primera subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que se une a la proteína A, (c) la segunda subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que no se une a la proteína A (por ejemplo, el CH3* que contiene las sustituciones de aminoácidos H95R e Y96F) y (d) el ligando es un anticuerpo que se une a la primera subunidad, el ligando comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente y/o las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (LCDR) 1, 2 y 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente (por ejemplo, anticuerpo antiB).
En otra realización, en donde (a) el heterodímero es un anticuerpo biespecífico, (b) la primera subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que se une a la proteína A, (c) la segunda subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que no une proteína A (por ejemplo, el CH3* que contiene las sustituciones de aminoácidos H95R e Y96F) y (d) el ligando es un anticuerpo que se une a la segunda subunidad, el ligando comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente y/o las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (LCDR) 1, 2 y 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente (por ejemplo, anticuerpo antiB).
Sistema para detectar o cuantificar anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos (bsAb) poseen dos especificidades de unión distintas y tienen una amplia gama de aplicaciones clínicas, incluida la terapia del cáncer (Kufer et al., (2004) 22(5) Trends Biotechnol. 238-44; y Lameris et al., (2014) S1040-8428 (14) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2014, 00135-8.) Los bsAb pueden entrecruzar y activar receptores heterodiméricos, que de otro modo son difíciles de activar a través de la terapia de combinación de fármacos o la monoterapia tradicionales (J.R. Cochran, (2010) 2(17) Sci Transl Med. 17ps5).
La fabricación de bsAb a escala comercial es un reto. Se han adoptado múltiples enfoques para generar bsAb viables adecuados para uso terapéutico (R.E. Kontermann (2012) 4:2 MAbs 182-97). Uno de estos enfoques implica el uso de una cadena ligera común que une covalentemente dos cadenas pesadas únicas (cadena A y cadena B) (Davis et al., Solicitud PCT N.° WO2010151792, 29 de diciembre de 2010; 2011; Babb et al., Solicitud PCT N.° WO2013184761, 12 de diciembre de 2013). La primera cadena pesada (también conocida como "primera subunidad" o "cadena B"), la segunda cadena pesada (también conocida como "segunda subunidad" o "cadena A") y la cadena ligera común se coexpresan durante la producción y a continuación, se ensamblan en tres productos: homo-A, homo-B y hetero-AB. Los homodímeros (homo-A u homo-B), consisten en dos cadenas pesadas idénticas (AA o BB) y dos cadenas ligeras idénticas. El producto bsAb (hetero-AB) consiste en dos cadenas pesadas únicas (cadena A y cadena B) y dos cadenas ligeras idénticas. Teóricamente, los tres productos deben expresarse en una proporción de 1:2:1 (homo-A, hetero-AB y homo-B) (Fig. 1). Una de las cadenas pesadas, la cadena A, anula la unión a la proteína A y permite la purificación selectiva del bsAb (hetero-AB), que resulta de una afinidad de unión intermedia a la columna de proteína A en comparación con la unión más estrecha de homo-B o la unión más débil de Ab monoespecíficos homo-A.
A pesar de todos estos avances en la fabricación de bsAb, podrían estar presentes todavía pequeñas cantidades de homodímeros (homo-A y homo-B) en los fármacos de bsAb purificados. Dependiendo de su antígeno diana, incluso
una pequeña cantidad de homodímero podría presentar potencialmente un modo de acción diferente o una vía de degradación diferente y por tanto, afectar a la potencia y la inmunogenicidad del producto bsAb (Woods et al., (2013) 5 mAbs 711-722). Por tanto, es crítico desarrollar un método analítico para evaluar la pureza de los bsAb.
Las similitudes estructurales y fisicoquímicas entre las impurezas del producto homodimérico y el heterodímero hacen la separación y la cuantificación extremadamente difícil. Los ensayos de pureza basados en la separación tradicionales, tales como la electroforesis en gel y la cromatografía de exclusión por tamaño, carecen de la resolución para distinguir los bsAb de sus impurezas homodiméricas. Recientemente, se ha notificado un enfoque basado en LC-MS para estimar la pureza de los bsAb (Id.). Aunque la espectrometría de masas (MS; del inglés, mass spectromety) se aplica de forma rutinaria para caracterizar la pureza de bsAb, su aplicación para cuantificar bsAb sobre homodímeros implica modificaciones, tales como desglicosilación. La heterogeneidad que surge de la velocidad de ionización y el truncamiento de la lisina C-terminal limita además la aplicación de la espectrometría de masas para la evaluación de la pureza de los bsAb.
La electroforesis capilar (CE; del inglés, capillary electrophoresis) se usa para caracterizar anticuerpos (Jorgenson et al., (2000) 72 Anal. Chem. 111-128). Las formas de CE incluyen la electroforesis capilar - dodecilsulfato sódico (CE-SDS), isoelectroenfoque capilar (IEFc) y electroforesis de zona capilar (CZE). El mecanismo de separación de CZE se basa en la proporción carga respecto a tamaño. La CZE se emplea en algunos ensayos de anticuerpos que utilizan capilares no recubiertos (He et al., (2010) 82(8) Anal. Chem. 3222-30). Además, la CZE combinada con electroforesis capilar de afinidad parcialmente rellena (PF-ACE) se ha utilizado para determinar la identidad de especies moleculares concretas (Brown et al., (2005) 540 Analytica Chimica Acta 403-410). PF-ACE aprovecha el cambio en la movilidad del analito (por ejemplo, bsAb, homo-A y homo-B) debido a su afinidad selectiva hacia ligandos específicos de cadena. PF-ACE se puede emplear ortogonal al enfoque basado en LC-MS existente (Woods, 2013).
La presente invención proporciona un sistema que comprende
a. una composición con una mezcla de proteínas que comprende:
b. un capilar;
c. un detector;
d. un ánodo en o cerca de un extremo del capilar;
e. un cátodo en o cerca del otro extremo del capilar; y
f. un suministro de energía.
En otro aspecto, la invención proporciona un sistema, por ejemplo, un sistema CZE, que comprende un ligando, un primer homodímero, un segundo homodímero, un heterodímero, un capilar, un detector, un ánodo en o cerca de un extremo del capilar, un cátodo en o cerca del otro extremo del capilar y un suministro de energía. En una realización, el primer homodímero comprende al menos dos primeras subunidades idénticas (por ejemplo, cadenas pesadas de inmunoglobulina capaces de unirse a la proteína A), el segundo homodímero comprende al menos dos segundas subunidades idénticas (por ejemplo, cadenas pesadas de inmunoglobulina incapaces de unirse a la proteína A) y el heterodímero comprende una primera subunidad y una segunda subunidad. El detector puede colocarse en cualquier lugar a lo largo del capilar. Generalmente, las entidades moleculares tendrán una carga positiva global y por tanto, migrarán hacia el cátodo bajo un campo eléctrico. Por tanto, en algunas realizaciones, el detector se coloca cerca del extremo catódico del capilar. El detector puede detectar proteínas y puede emplear, entre otros, un método de detección de UV, en el que se mide la absorbancia de luz a 210 nm o 280 nm o la fluorescencia inducida por láser, en el que se detecta(n) fluorescencia nativa o marcadores fluorescentes.
En una realización, el ligando (que es específico para la primera subunidad o la segunda subunidad, pero no para ambas), el primer homodímero, el segundo homodímero y el heterodímero se cargan en el capilar en o cerca del extremo anódico del capilar. En algunos casos, la mezcla puede cargarse cerca del extremo catódico o en cualquier posición a lo largo del capilar. El ligando se une a su subunidad afín y forma un complejo con el heterodímero y uno de los homodímeros, pero no con el otro homodímero. Por tanto, cuando el ligando se une a la primera subunidad, se forman complejos que comprenden el primer homodímero y el ligando (primer complejo) y el heterodímero y el ligando (segundo complejo). Como alternativa, cuando el ligando se une a la segunda subunidad, se forman complejos que comprenden el segundo homodímero y el ligando (tercer complejo) y el heterodímero y el ligando (cuarto complejo). En cada caso, los complejos tienen una movilidad electroforética menor que el homodímero no unido (sin formar complejo). En algunas realizaciones, es decir, cuando el heterodímero es un anticuerpo biespecífico, la primera subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que es capaz de unirse a la proteína A y la segunda subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que es incapaz de unirse a la proteína A (es decir, que contiene el dominio CH3* sustituido por H95R e Y96F).
De acuerdo con este sistema y este método, los complejos se retrasan durante la progresión a través del capilar y no cruzan la ventana del detector al mismo tiempo que el homodímero sin formar complejo. El homodímero sin formar complejo por tanto, se detecta y cuantifica sin ningún heterodímero y otro homodímero que interfiera. En el caso de anticuerpos biespecíficos, un ensayo de ACE utiliza el ligando que se une a la cadena pesada de CH3 sin sustituir, en la que el dímero CH3*:CH3* (homo-A) permanece sin formar complejo. El homodímero CH3*:CH3* (homo-A) se detecta y cuantifica. El otro ensayo de ACE independiente (que puede ejecutarse por separado y/o en paralelo al
primer ensayo de ACE) usa el ligando que se une al dominio CH3* sustituido por H95R e Y96F. En este punto, el dímero CH3:CH3 (homo-B) permanece sin formar complejo y se detecta y cuantifica. En la realización en la que se realizan ambos ensayos de ACE, se pueden cuantificar ambos homodímeros. En este punto, el heterodímero biespecífico puede cuantificarse restando la cantidad de cada homodímero, determinada por los ensayos de ECA independientes, a la cantidad total de dímero (CH3:CH3 CH3:CH3* CH3*:CH3*) (homo-B hetero-AB homo-A) determinado en un ensayo de CZE sin ningún ligando o utilizando una curva estándar que se generó para muestras de homo-A y/u homo-B enriquecidas.
El sistema y método en otra realización utiliza un tapón de ligandos insertado cerca del extremo (de carga) anódico del capilar, entre el puerto de carga y el detector (PF-ACE). En este punto, la mezcla de multímeros (que comprende el primer homodímero, el segundo homodímero y el heterodímero) se carga en el capilar delante del tapón de ligandos. A medida que los multímeros migran a través del capilar, las entidades moleculares constituyentes se encuentran con el tapón de ligandos, momento en el que se forman los complejos de ligando-multímero, reduciendo así la movilidad electroforética de todas las especies excepto de los homodímeros que no se unen al ligando. Cuando el ligando se une a la primera subunidad, el homodímero que comprende dos segundas subunidades (y ninguna primera subunidad) permanece sin unirse y no tiene una movilidad electroforética afectada.
De acuerdo con algunas realizaciones en las que el heterodímero es un anticuerpo biespecífico, la primera subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina capaz de unirse a la proteína A (también conocida como subunidad B) y la segunda subunidad es una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene un dominio CH3 sustituido por H95R y Y96F (es decir, CH3*) (también conocido como subunidad-A), el ligando que se une a la primera subunidad es un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3, que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente y que comprenden las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1, 2 y 3, que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. En este punto, el ligando que se une a la segunda subunidad es un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3, que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente y que comprenden las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1, 2 y 3, que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente.
Ejemplos
Ejemplo 1: Pureza mediante electroforesis de zona capilar (CZE)
Para evaluar la pureza de un anticuerpo biespecífico ("bsAb"), se realizó CE-SDS en condiciones reductoras. Los resultados de c E-SDS obtenidos para muestras de bsAb (heterodímero), homo-A (segundo homodímero) y homo-B (primer homodímero) (Fig. 2, trazas a-c) en condiciones reductoras revelaron tres picos, correspondientes a la cadena ligera (Fig. 2, pico 1), la cadena pesada no glucosilada (Fig. 2, pico 2) y la cadena pesada (Fig. 2, pico 3). La muestra de comezcla de homo-A:bsAb1:homo-B (proporciones molares 1:2:1) que se preparó añadiendo homo-A y homo-B al bsAb1 purificado también dio como resultado tres picos con tiempos de migración similares (Fig. 2, traza d). Los electroferogramas para los bsAb, los homodímeros y su comezcla no resultaron distinguibles, indicando una limitación de este método de separación basado en tamaño (Fig. 2). Se observaron resultados similares para CE-SDS en condiciones no reductoras. Estos resultados no son sorprendentes, dado que los anticuerpos ensayados poseen pesos moleculares muy similares. La selectividad de separación adecuada es fundamental para resolver estos componentes homodiméricos de bsAb.
Se ha demostrado que CZE es una herramienta poderosa para resolver mAb estrechamente relacionados (He, 2010). La pureza de bsAb1 se evaluó mediante CZE, un método que separa los analitos basándose en su proporción de carga respecto al tamaño. Los analitos con una mayor proporción de carga respecto al tamaño migran más rápido a través del capilar. Relativo a la muestra pura de bsAb-1 (Fig. 3, traza a), homo-A, con una mayor proporción de carga respecto al tamaño, migra más rápido a través del capilar (Fig. 3, traza b). Homo-B, con una menor proporción de carga respecto al tamaño, migra más lentamente a través del capilar (Fig. 3, traza c). Dado que bsAb contiene un brazo de la cadena pesada de homo-A (cadena-A) y el otro de homo-B (cadena-B) y tiene un pI correspondiente (8,01), la movilidad electroforética de bsAb se encuentra entre homo-A y homo-B (Fig. 3, traza a). El grupo de picos principales 2, 3 y 4 corresponden al homo-A, bsAb y homo-B respectivamente. Los picos menores observados en los electroferogramas surgen de variantes de carga o variantes de tamaño de anticuerpos. Se preparó una mezcla de homo-A, bsAb y homo-B (relación 1:2:1) añadiendo homo-A y homo-B al bsAb purificado. A continuación, la mezcla se analizó mediante CZE. La traza de CZE de la mezcla contiene cuatro conjuntos de picos, que representan homo-A (grupo de picos 2), bsAb (grupo de picos 3) y homo-B (grupo de picos 4) (Fig. 3, traza d). La intensidad de pico más baja observada para el pico de homo-B podría atribuirse a una combinación de movilidad electroforética más lenta y a múltiples variantes de carga de especies de homo-B que se distribuyen a lo largo del electroferograma. La comezcla de homo-A:bsAb1:homo-B, que no tuvo separación en CE-SDS (Fig. 2) mostró resultados prometedores en CZE. El perfil de CZE para bsAb1 (Fig. 3) está bien resuelto y por tanto, la identificación y cuantificación de pureza es prometedora. La separación de CE-SDS se realizó en un bioanalizador de Agilent utilizando el kit Protein 230 de Agilent.
Ejemplo 2: Pureza mediante electroforesis capilar de afinidad de relleno parcial
La CZE se limita a muestras que contienen entidades con diversas proporciones de carga respecto a tamaño. Dado que este no es siempre el caso, CZE no se puede aplicar a muchos candidatos de bsAb. Por ejemplo, bsAb2 y homodímeros relacionados poseen pI y tamaños similares y por tanto, comparten perfiles de CZE muy similares (Fig. 4, trazas a-c). Debido a la falta de separación de las diversas entidades moleculares, la identificación de especies moleculares componentes individuales no fue práctica.
Otro enfoque viable para cuantificar la pureza es la electroforesis capilar de afinidad (ACE). En ACE, se prepara una mezcla de un anticuerpo (Ab) y un ligando (L), que forma un complejo anticuerpo-ligando (Ab-L), (véase la ecuación 1). A continuación, la mezcla se inyecta en el capilar y se somete a electroforesis. ACE se basa en las diferencias en la movilidad electroforética entre Ab, L y Ab-L. Cuando un antígeno o un anticuerpo específico de cadena se utiliza como un ligando, la cuantificación de homodímeros se vuelve independiente de la resolución basal entre diversas especies. El cambio de movilidad selectiva de especies individuales se puede utilizar para estimar la cantidad de homodímeros residuales.
A b L í± A b -L (1)
En ACE, se puede utilizar un antígeno como un ligando para un anticuerpo afín. Como alternativa, se puede utilizar un anticuerpo específico de cadena (antiA o antiB) como el ligando para el anticuerpo afín. El anticuerpo antiA (también conocido como "segundo ligando") se une específicamente a un anticuerpo que contiene la cadena A (homo-A y bsAb). De manera similar, el anticuerpo antiB (también conocido como "primer ligando") se une a un anticuerpo que contiene la cadena B (homo-B y bsAb).
En una realización, el anticuerpo antiA comprende las CDR de cadena pesada y cadena ligera que tienen secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-12. En una realización, el anticuerpo antiA comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En una realización, el anticuerpo antiA comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.
En una realización, el anticuerpo antiB comprende las CDR de cadena pesada y cadena ligera que tienen secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-6. En una realización, el anticuerpo antiB comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. En una realización, el anticuerpo antiA comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
En una realización, los puntos isoeléctricos teóricos (pI) de los anticuerpos específicos de cadena A y los específicos de cadena B son 6,55 y 6,64 respectivamente. Los picos que surgen de analitos (bsAb u homodímeros) que poseen un pI y tamaño similares podrían comigrar con mAb específicos de cadena e interferir con la identificación y la cuantificación. Para evitar esta posible interferencia, las movilidades electroforéticas de los anticuerpos específicos de cadena se modificaron a través de biotinilación. El kit y el procedimiento biotina sulfo-NHS EZ-Link™ (Thermo Scientific, Rockford, Illinois) se utilizaron para biotinilar los anticuerpos antiA y antiB (Daniels y Amara, (1998) 296 Methods Enzymol. 307-18; Thermo Scientific, Instrucciones: biotina sulfo-NHS EZ-Link™, Doc. n.° 1850.3, disponible en https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0011580_EZ_Sulfo _NHS_Biotin_UG.pdf, 29 de abril de 2015). Se encuentran disponibles varios ésteres de NHS de biotina con distintas propiedades y longitudes de brazo separador. Brevemente, los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) de biotina (por ejemplo, biotina sulfo-NHS, que es soluble en agua) se dejaron reaccionar en tampones de pH 7-9 con grupos amino primarios (-NH2) de lisina y los disponibles en los extremos N de cada polipéptido.
La biotinilación a través del acoplamiento de amina primaria y la modificación de la cadena lateral de lisina alteró la carga de los anticuerpos específicos de cadena hacia la acidez y por tanto, sus velocidades electroforéticas se redujeron, dando como resultado una pérdida de señal detectable dentro del tiempo de ejecución experimental. La ausencia de cualesquier picos detectables de anticuerpos específicos de cadena hizo que la identificación y cuantificación de especies moleculares de interés fuera directa.
Para el análisis de ACE, se utilizaron como ligandos anticuerpos antiA o antiB. ACE se realizó utilizando un complejo bsAb-ligando preparado mezclando bsAb3 y anticuerpos antiA o antiB en una proporción molar de 1:2. Tras la formación de complejos, se esperaba que se modificara la movilidad electroforética de bsAb3 y se anticipó que no quedaría ninguna señal residual de bsAb3 libre. Sin embargo, para los complejos bsAb3-antiA y bsAb3-antiB se detectaron grandes cantidades de picos residuales en un tiempo de migración similar al de bsAb3 libre (Fig. 5, trazas b y c). Los datos de ACE obtenidos para diversas proporciones de complejos de bsAb y antiB (1:0,5, 1:1 y 1:3) demostraron que el pico residual se observó incluso en presencia de un exceso de ligando antiB. Para investigar
adicionalmente si el bsAb3 sin unir residual estuvo presente en la preparación del complejo bsAb3-antiB, se realizó un experimento SE-HPLC en el que se indicó una buena resolución entre bsAb3 (Fig. 6, traza a; pico 4) y antiB (Fig. 6, traza b; pico 3). Los resultados de SE-HPLC indican la presencia de complejo bsAb3-antiB (Fig. 6, traza c; picos 1 y 2) y un exceso de antiB (Fig. 6, traza c; pico 3). Sin embargo, hay poca o ninguna evidencia de la presencia de bsAb3 no unido. Estos resultados sugieren que la presencia de picos residuales en niveles altos podría atribuirse a la disociación del analito-ligando (por ejemplo, bsAb^L ^ bsAb L) a alto voltaje aplicado durante los experimentos de CZE (Fig. 5). La disociación del complejo analito-ligando se ha notificado previamente en métodos de separación basados en afinidad, tales como CE (S. Krylov, (2006) 11(2) J Biomol Screen 115-122). Se encontró que los intentos previos de separar una mezcla de equilibrio que contiene ADNmc y proteína de unión a ADNmc en un capilar experimentaron una disociación continua, dando como resultado picos y "manchas" exponenciales. Tanto el ligando como la diana se disociaron a lo largo de la electroforesis (Id.). Para algunos bsAb, la presencia de picos residuales y "manchas" observados en el análisis de ACE interfiere con el análisis de la pureza.
Para evitar los efectos de disociación, se desarrolló y utilizó la electroforesis capilar de afinidad parcialmente rellena (PF-ACE) (Brown et al., 540 Analytica Chimica Acta 403-410(2005)). PF-ACE se realiza rellenando parcialmente el capilar con el ligando antes de la inyección de la muestra. Según migran los analitos a través de la zona del ligando de afinidad, se forma un complejo ligando-analito y su movilidad cambia en comparación con el analito libre. La movilidad de cualquier analito residual que no se una al ligando de afinidad permanece sin cambios. Por tanto, PF-ACE puede proporcionar una estimación precisa de las abundancias relativas de cualquier analito residual presente en un bsAb.
Se ejecutaron experimentos y se recogieron datos para el complejo bsAb3-antiB en condiciones de ACE y PF-ACE. Los picos de bsAb3 residuales que se observaron en condiciones de ACE debido a la disociación del complejo analitoligando no se detectaron en condiciones de PF-ACE (Fig. 7). En condiciones de ACE, una vez el analito se disocia del complejo analito-ligando, no puede volver a formar el complejo de nuevo. En condiciones de PF-ACE, la migración del analito a través del tapón de ligandos permite que el analito vuelva a formar un complejo analito-ligando, incluso si el analito se disoció anteriormente. Los picos de homo-B que se observaron en ausencia de una zona de ligando de afinidad, se desplazaron y se mostraron como pérdida de señal cuando se realizó PF-ACE con mAb antiB (Fig. 8, trazas A y B). Este efecto se debe a la formación del complejo de mAb homo-B-antiB. En cambio, la migración del mAb homo-B a través de un capilar parcialmente lleno con un mAb antiA permanece sin cambios en relación con la traza que no contiene zona de ligando de afinidad, ya que el mAb homo-B no se une al mAb antiA (Fig. 8, trazas A, C). De manera similar, se observaron cambios de movilidad solo para uniones específicas (es decir, homo-A antiA u homo-B antiB) y no mediante otros ligandos (Fig. 8, trazas D y F). Estos resultados indican que el ensayo de PF-ACE es altamente específico para cambios de movilidad basados en ligandos específicos de cadena.
Ejemplo 3: Detección y cuantificación de mAb homodímero en muestras biespecíficas
Para evaluar la pureza de bsAb a través del ensayo PF-ACE, una muestra de bsAb3 se enriqueció con pequeñas cantidades (5%) de homo-A y homo-B para que sirvieran como "impurezas" de homodímeros. Las trazas de CZE y PF-ACE resultantes se muestran en la Fig. 9. La traza 'a' muestra el electroferograma de bsAb3. La traza 'b' muestra el electroferograma de bsAb3 enriquecido con impurezas de homo-A y homo-B al 5%. La adición de homo-A y homo-B en bsAb3 dio como resultado un aumento en las intensidades de dos picos (compárense la traza a y la traza b, picos 2 y 4). Basándose en las movilidades electroforéticas de los homodímeros purificados, estos dos picos se identificaron provisionalmente, como homo-A y homo-B respectivamente. Estas identidades se confirmaron en experimentos de PF-ACE en las trazas c y d. La traza d muestra el bsAb3-antiB de PF-ACE donde los picos residuales representarían especies homo-A. El pico residual observado en d tiene un tiempo de migración similar al pico 2 en la traza b, verificando por tanto la identidad del pico en la muestra enriquecida. Se observaron resultados similares para bsAb3-antiA de PF-ACE (Fig. 9, traza c, homo-B). Una pequeña cantidad de pico residual observado en la Fig. 9, traza c, se excluyó de la cuantificación, dado que corresponde a un contaminante observado en bsAb3 y no proviene de las muestras enriquecidas. Basándose en PF-ACE, se estimó que la cantidad de homo-A y homo-B presentes en las muestras enriquecidas fue de un 5,2 % y un 5,2 % respectivamente. Estos valores concuerdan bien con la cantidad enriquecida de un 5% y están dentro de los errores experimentales.
Para evaluar el límite de detección (LOD; del inglés, limit of detection) y el límite de cuantificación (LOQ; del inglés, limit of quantification), se realizó una recuperación de picos añadiendo diversas cantidades de homo-A y homo-B a bsAb3 purificado. Se prepararon nueve muestras de bsAb3 que contuvieron una amplia gama de mAb homo-A y homo-B (0,1 %-5 % por concentración) para estudiar el nivel de homodímeros presentes en estas muestras enriquecidas. Las trazas de PF-ACE de bsAb3 que contienen homo-A y homo-B en ausencia de un ligando de afinidad dieron como resultado un electroferograma que comprende picos que corresponden a bsAb3, homo-A y homo-B. Los electroferogramas indican la existencia de mAb homodiméricos en cada una de las muestras de bsAb3 enriquecidas. Se observó una respuesta lineal (R2 = 0,999) excelente para homo-A (Fig. 10) y homo-B (Fig. 11) con concentraciones crecientes en muestras de bsAb3 enriquecidas. En conjunto, se determinó experimentalmente que el LOQ del homodímero tuvo un valor de 0,1%.
Claims (15)
1. Una composición, que comprende:
una mezcla de proteínas para separar y detectar una primera proteína de una u otras proteínas en la mezcla, en donde dicha composición comprende:
una primera proteína,
una o más de otras proteínas y
un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a una de dichas una o más de otras proteínas para formar un complejo con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado; en donde dicho ligando modificado tiene un punto isoeléctrico menor que un ligando sin modificar; caracterizado por que dicha primera proteína es una proteína de múltiples subunidades y dicha primera proteína y dichas una o más de otras proteínas tienen proporciones de carga respecto a la masa similares.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde:
(a) dicho ligando modificado comprende un enlace covalente con un resto de lisina en dicho ligando modificado; (b) dichas una o más de otras proteínas incluye(n) una proteína de múltiples subunidades; o
(c) dicho ligando modificado comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionada(s) del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha primera proteína comprende dos primeras subunidades idénticas.
4. La composición de la reivindicación 3, en donde dicha primera proteína es un anticuerpo monoespecífico y dichas una o más de otras proteínas es (son) un anticuerpo biespecífico.
5. La composición de la reivindicación 3, en donde dicha primera proteína es un anticuerpo monoespecífico y dichas una o más de otras proteínas es (son) un anticuerpo monoespecífico.
6. Un sistema que comprende:
a. una composición con una mezcla de proteínas que comprende:
una primera proteína, una o más de otras proteínas y un ligando modificado que comprende un resto ácido y que no se une a la primera proteína pero que es capaz de unirse a dichas una o más de otras proteínas para formar uno o más complejos con una proporción de carga respecto a la masa menor que dichas una o más de otras proteínas sin dicho ligando modificado y dicha primera proteína;
b. un capilar;
c. un detector;
d. un ánodo en o cerca de un extremo del capilar;
e. un cátodo en o cerca del otro extremo del capilar; y
f. un suministro de energía.
7. El sistema de la reivindicación 6, en donde:
(a) dicho ligando modificado comprende un enlace covalente con un resto de lisina en dicho ligando modificado; (b) dicho capilar comprende un tapón de ligandos colocado entre dicho ánodo y dicho detector y dicho tapón de ligandos comprende dicho ligando modificado; o
(c) dicho ligando modificado comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionada(s) del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
8. El sistema de la reivindicación 6, en donde dicho detector se coloca cerca de dicho extremo catódico del capilar y dicha mezcla de proteínas se coloca en dicho capilar en dicho extremo anódico del capilar.
9. El sistema de la reivindicación 8, en donde dicho detector detecta 200 nm a 280 nm de absorbancia de luz o fluorescencia inducida por láser.
10. Un método para separar y detectar una primera proteína en una mezcla de proteínas que tienen proporciones de carga respecto a la masa similares, comprendiendo dicho método:
a. poner en contacto dicha mezcla de proteínas con un ligando modificado que comprende un resto ácido y no se une a la primera proteína pero se une a otras proteínas en la mezcla de proteínas que tienen proporciones de carga respecto a la masa similares para formar una muestra;
b. aplicar dicha muestra a un capilar que comprende un tapón de ligandos que comprende un ligando modificado adicional;
c. aplicar un voltaje a dicho capilar para permitir a dicha primera proteína moverse a través del capilar a una tasa más rápida que las otras proteínas para separar la primera proteína de las otras proteínas; y
d. detectar dicha primera proteína.
11. El método de la reivindicación 10, en donde dicho ligando modificado comprende un enlace covalente con un resto de lisina en dicho ligando modificado.
12. El método de la reivindicación 11, en donde el ligando modificado comprende biotina.
13. El método de la reivindicación 10, en donde dicho capilar comprende un extremo catódico, un extremo anódico y una ventana del detector colocada cerca de dicho extremo catódico y en donde dicho tapón de ligandos se coloca cerca de dicho extremo anódico.
14. El método de la reivindicación 13, en donde dicha primera proteína se detecta a través de dicha ventana del detector mediante un detector que mide la absorbancia en una longitud de onda que varía de 200 nm a 280 nm o la fluorescencia inducida por láser.
15. El método de la reivindicación 10, en donde:
(a) dicho ligando modificado comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionada(s) del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; o
(b) dicha primera proteína es un primer anticuerpo monoespecífico bivalente y dicha mezcla de proteínas comprende un anticuerpo biespecífico y un segundo anticuerpo monoespecífico bivalente.
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