JP4599355B2 - プロテインaアフィニティークロマトグラフィーの間のプロテインaの浸出の低減 - Google Patents
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Description
[発明の分野]
本発明はタンパク質の精製に関する。特に、本発明は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけた組成物の温度又はpHを低下させることにより、あるいはそれに一又は複数のプロテアーゼインヒビターを添加することによってプロテインAアフィニティークロマトグラフィー中のプロテインAの浸出を低減する方法に関する。
タンパク質の大規模で経済的な精製は、バイオテクロノジー産業にとってますます重要な問題となっている。一般に、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含む組換え型プラスミドの挿入により対象のタンパク質を産生するように遺伝子操作された哺乳類又はバクテリア何れかの細胞株を用いて、細胞培養によって産生される。使用される細胞株は生きている生物体であるので、それには、通常は動物の血清の製剤から供給される、糖、アミノ酸、及び増殖因子を含む複合増殖培地を与えなければならない。ヒトの治療用として使うために十分な純度で細胞に与えた化合物の混合物から、また細胞自体の副生成物から所望のタンパク質を分離することは、大変な挑戦である。
本発明は、CH2/CH3領域を含むタンパク質を精製する方法において、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけたタンパク質と一又は複数の不純物を含む組成物の温度を約3℃から約20℃までの範囲に低減させることを含み、プロテインAの浸出を減少させる方法に関する。
(a)タンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーから回収したタンパク質を含む組成物中の浸出したプロテインAを測定し;
(b)プロテインAの浸出が検出された場合には、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけたタンパク質と一又は複数の不純物を含む組成物の温度を約3℃から約20℃までの範囲に低減させて、プロテインAの浸出を減少させることを
含んでなる方法に関する。
[定義]
ここで用いられる場合、「プロテインA」という用語は、その天然源から回収されるプロテインA、合成的に(例えば、ペプチド合成あるいは組換え技術により)産生されるプロテインAで、CH2/CH3領域を持つタンパク質と結合する能力を保持しているそれらの変異体又は誘導体を含んでいる。プロテインAはRepligen, Pharmacia and Fermatechから商業的に購入することができる。
ここで、「浸出」とは、それが結合した固相からのプロテインA(その断片を含む)の脱着又は洗浄を意味する。浸出は、機械的剪断、低pHへの暴露、タンパク分解活性等々のような様々なメカニズムから生じうる。
「プロテアーゼ」は、限定されるものではないが、セリン、システイン、メタロ及びアスパラギン酸プロテアーゼを含むタンパク分解酵素である。対象のタンパク質を含有する組成物中に存在しているプロテアーゼはそのタンパク質を産生する組換え宿主から、又はそのタンパク質の天然源から誘導されうる。プロテアーゼの例には、サーモリシン、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、カリクレイン、トロンビン、パパイン、プラスミン、カテプシンB、レニン、キモシン等々が含まれる。
「プロテアーゼインヒビター」は、プロテアーゼの酵素活性をある程度まで減少させる化合物又は組成物である。プロテアーゼインヒビターの例には、フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニル-フルオライド塩酸塩(AEBSF)(PEFABLOC(登録商標)SC)、ロイペプチン、ペプスタチン、ベンズアミジン、金属イオンキレート剤、例えばEDTA又はメタロプロテアーゼ活性を阻害するイミダゾール等々が含まれる。好適なプロテアーゼインヒビターはメタロプロテアーゼ活性(例えばEDTA)を阻害し、及び/又はある種のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部分で、一般的にはその抗原結合あるいは可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;単鎖抗体分子類;ダイアボディ(diabodies);線形抗体;及び抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれる。
「トラスツズマブ (Trastuzumab)」あるいは「ハーセプチン(HERCEPTIN)(登録商標)」は、配列番号1の軽鎖アミノ酸配列と、配列番号2の重鎖アミノ酸配列を含んでなるか、あるいはHER2に結合する能力を保持し、HER2を過剰発現する腫瘍細胞の成長を阻害するそのアミノ酸配列変異体(出典明示によりここに取り込む米国特許第5677171号参照)を含んでなるヒト化抗HER2抗体である。
「ヒト化2C4」は、配列番号3の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号4の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなるか、あるいはHER2に結合する能力を保持し、HER2のリガンド活性化をブロックするそのアミノ酸配列変異体(出典明示によりここに取り込む国際公開第01/00245号参照)を含んでなるヒト化抗HER2抗体である。
ここでのプロセスはプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって不純物からCH2/CH3領域含有タンパク質を精製することを含む。好ましい実施態様では、タンパク質は、CH2/CH3領域に融合し、又は結合した抗体、イムノアドヘシンあるいはタンパク質である。そのような分子を産生するための技術を以下に検討する。
本発明によって精製される好ましいタンパク質は抗体である。本発明の範囲に入る抗体は、トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))(Carterら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289(1992), 米国特許第5725856号)及びヒト化2C4(国際公開第01/00245号, Adamsら)を含む抗HER2抗体;例えば米国特許第5736137号におけるようなキメラ抗CD20「C2B8」(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))、米国特許第5721108B1号におけるような2H7抗体のキメラ又はヒト化変異体、あるいはトシツモマブ(Tositumomab)(BEXXAR(登録商標))のような抗CD20抗体;抗IL-8抗体(St Johnら Chest, 103:932 (1993),及び国際公開番号WO95/23865);例えばヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1アバスチン(AVASTIN)(登録商標)(Kimら Growth Factors, 7:53-64 (1992),国際公開番号WO96/30046、及びWO98/45331、1998年10月15日公開)のようなヒト化及び/又は親和成熟抗VEGF抗体を含む抗VEGF抗体;抗前立腺幹細胞抗原(PSCA)抗体(国際公開第01/40309号);S2C6及びそのヒト化変異体(国際公開第00/75348号)を含む抗CD40抗体;抗CD11a抗体(米国特許第5622700号、国際公開第98/23761号,Steppeら Transplant Intl. 4:3-7 (1991)、及び Hourmantら Transplantation 58:377-380 (1994));抗CD18(1997年4月22日発行の米国特許第5622700号、又は1997年7月31日公開の国際公開第97/26912号);抗IgE抗体(E25、E26及びE27を含む;1998年2月3日発行の米国特許第5714338号、あるいは1992年2月25日発行の米国特許第5091313号、1993年3月4日公開の国際公開第93/04173号、又は1998年6月30日出願の国際出願第PCT/US98/13410号、米国特許第5714338号、Prestaら, J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)、及び国際公開第95/19181号);抗Apo-2レセプター抗体(1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号);cA2(REMICADE(登録商標))、CDP571及びMAK-195(1997年9月30日発行の米国特許第5672347号, Lorenzら J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)及び Dhainautら Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)を参照のこと)を含む抗TNF-α抗体;抗組織因子(TF)抗体(欧州特許第0420937B1号,1994年11月9日許可);抗ヒトα4β7インテグリン抗体(1998年2月19日公開の国際公開第98/06248号);抗内皮増殖因子レセプター(EGFR)抗体(例えば1996年12月19日公開の国際公開第96/40210号におけるようなキメラ化あるいはヒト化225抗体);OKT3(1985年5月7日発行の米国特許第4515893号)のような抗CD3抗体;CHI-621(SIMULECT(登録商標))及びZENAPAX(登録商標)(1997年12月2日発行の米国特許第5693762号参照)のような抗CD25抗体あるいは抗Tac抗体;cM-7412抗体(Choyら, Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996))のような抗CD4抗体;CAMPATH-1H(Riechmannら, Nature 332:323-337 (1988))のような抗CD52抗体;Grazianら J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)におけるようなFcγRIに対するM22抗体のような抗Fcレセプター抗体;hMN-14(Sharkeyら、Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995))のような抗癌胎児性抗原(CEA)抗体;huBrE-3、hu-Mc3及びCHL6を含む乳房上皮細胞に対する抗体(Cerianiら, Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995);及びRichmanら, Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995));C242のような大腸癌腫細胞に結合する抗体(Littonら, Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996));抗CD38抗体、例えばAT13/5(Ellisら, J. Immunol. 155(2):925-937 (1995));HuM195(Jurcicら, Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995))及びCMA-676又はCDP771のような抗CD33抗体;LL2あるいはLymphoCide(Juweidら、Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995))のような抗CD22抗体;17-1A(PANOREX(登録商標))のような抗EpCAM抗体;アブシキマブ(abciximab)あるいはc7E3Fab(REOPRO(登録商標))のような抗GpIIb/IIIa抗体;MEDI-493(SYNAGIS(登録商標))のような抗RSV抗体;PROTOVIR(登録商標)のような抗CMV抗体;PRO542のような抗HIV抗体;抗HepB抗体OSTAVIR(登録商標)のような抗肝炎抗体;抗CA125抗体、例えばOvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;VITAXIN(登録商標)を含む抗αvβ3抗体;ch-G250のような抗ヒト腎臓細胞癌腫抗体;ING-1;抗ヒト17-1A抗体(3622W94);抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体R24;抗ヒト扁平上皮細胞癌腫(SF-25);及びSmart ID10及び抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)のような抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体などを含むが、それらに制限されない。ここでの抗体に対して好ましい標的抗原は、HER2レセプター、VEGF、IgE、CD20、CD11a及びCD40である。
特に上で特定した抗体とは別に、熟練した実務者は、例えば以下に記載の技術を使用して、対象抗原に対して抗体を産生させることができるであろう。
ここでの抗体は対象の抗原に対して産生される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原;米国特許第5091178号参照)に対して産生された抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子(例えばレセプター)又はリガンド、例えば成長因子でありうる。例示的な抗原は、以下のセクション(3)に記述されるタンパク質を含む。本発明に包含される抗体に対する典型的な分子標的は、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22及びCD34のようなCDタンパク質;EGFR、HER2、HER3あるいはHER4レセプターのようなErbBレセプターファミリーのメンバー;細胞接着分子、例えばLFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及びαv/β3インテグリンで、そのα又はβ何れかのサブユニットを含むもの(例えば抗CD11a、抗CD18あるいは抗CD11b抗体);VEGFのような成長因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC,あるいはここで言及された他の抗原の任意のものを含む。
抗体の調製に役立つ他の抗原及びその形態は当業者には明らかであろう。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原及びアジュバントの複数回の皮下注射(sc)又は腹腔内(ip)注射によって動物中で産生させる。抗原を免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、大豆トリプシンインヒビターに、二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を経由して結合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基経由)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はRとR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを使用して、結合させることは有用でありうる。
モノクローナル抗体はKohlerら, Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作られうるか、あるいは組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作られうる。
ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター又はマカクザルのような他の適切なホスト動物が、上に記載したようにして免疫されて、免疫化に使われるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、あるいは産生する能力を有するリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫されうる。ついでリンパ球はポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適切な培養培地中に播種し成長させる。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素(HGPRT又はHPRT)が欠けると、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的にはHGPRT欠乏細胞の成長を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン(HAT培地)を含む。
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生のために分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降あるいはラジオイムノアッセイ(RIA)あるいは酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)のようなインビトロ結合アッセイによって定量される。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析あるいはアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水流体あるいは血清から適切に分離される。好ましくは、ここに記述されるプロテインAアフィニティークロマトグラフィー法が用いられる。
DNAはまた例えば相同のマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインをコード配列に置換することにより(米国特許第4816567号; Morrisonら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984))、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で連結することによって、改変することができる。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体はMcCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990) に記載された技術を使用して産生された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarksら, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)には、それぞれファージライブラリーを使用するマウス及びヒト抗体の分離について記述されている。続く文献には、鎖シャッフリング(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))による高親和性(nM範囲)ヒト抗体の産生、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse ら, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))について記載がある。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ法の実行可能な代替策である。
ヒト化抗体は非ヒトである供給源からその中に導入される一又は複数のアミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりWinter及び共同研究者(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って本質的に実施できる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット(best-fit)」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーからスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトFRとして受容される(Simsら,J. Immunol., 151:2296 (1993))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体のために使用することができる(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaら, J. Immunol, 151:2623 (1993))。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。他の実施態様では、選択された抗体は単鎖Fv断片(scFv)である。国際公開第93/16185号を参照のこと。
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する。そのような分子は通常二つの抗原に結合するだけであるが(つまり二重特異性抗体、BsAbs)、ここで使用される場合、三重特異性抗体のような更なる特異性を備えた抗体もこの表現に包含される。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、二つの鎖が異なる特異性を持っている二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づく(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第93/08829号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は、無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つを、次にメルカプトエチルアミンによる還元でFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ECD))を免疫グロブリン重鎖のFc領域と組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端的に融合されるが、N末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない;特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を114として残基216)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(a)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(b)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される:
(a)ACL-ACL;
(b)ACH-(ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH,又はVLCL-ACH);
(c)ACL-ACH-(ACL-ACH,ACL-VHCH,VLCL-ACH,又はVLCL-VHCH);
(d)ACL-VHCH-(ACH,又はACL-VHCH,又はVLCL-ACH);
(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH,又はVLCL-ACH);及び
(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2;
ここで、各Aは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである;これらは、免疫グロブリンの結合する(J)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4816567号に開示されている。
他の実施態様では、精製されるタンパク質は、CH2/CH3領域へ融合されるか、コンジュゲートされるものである。そのような融合タンパク質を産生して、タンパク質の血清半減期を増加させ及び/又はプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製を容易にしてもよい。このようにしてコンジュゲートされ得る生物学的に重要なタンパク質の例には次のものが含まれる:レニン;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α-1-アンチトリプシン;インシュリンA鎖;インシュリンB鎖;プロインシュリン;濾胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;VIIIC因子、IX因子、組織因子、及びウィルブランズ(Willbrands)因子などの凝固因子;プロテインCなどの抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;プラスミノーゲン活性化剤、例えばウロキナーゼ又はヒト尿素又は組織型プラスミノーゲンアクチベータ(t-PA);ボンベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子-α及びβ;エンケファリン分解酵素;RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted);ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP-1-α);ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン;ミューラー阻害物質;リラキシンA-鎖;リラキシンB-鎖;プロレラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;β-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質;DNアーゼ;IgE;CTLA-4のような細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモン又は成長因子のレセプター;プロテインA又はD;リウマチ因子;脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5又は-6(NT-3、NT-4、NT-5、又はNT-6)、又はNGF-β等の神経成長因子等の神経成長因子;血小板誘導成長因子(PDGF);aFGF及びbFGF等の線維芽細胞成長因子;上皮成長因子(EGF);TGF-α及びTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、又はTGF-β5を含む、TGF-βのようなトランスフォーミング成長因子(TGF);インシュリン様成長因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II);des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インシュリン様成長因子結合タンパク質;CD3、CD4、CD8、CD19及びCD20等のCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えば、M-CSF、GM-CSF、及びG-CSF;インターロイキン(ILs)、例えば、IL-1からIL-10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス性抗原、例えばAIDSエンベロープの一部等;輸送タンパク質;ホーミングレセプター;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及びVCAM;腫瘍関連抗原、例えばEGFR、HER2、HER3又はHER4レセプター;及び上に列挙したポリペプチドの何れかの断片が含まれる。
ここに記載された方法を用いて精製されるタンパク質は、一般的に組換え技術を使用して産生されるか、又は天然の供給源から単離される。組換えタンパク質を産生する方法は、例えば、特に出典明示によりここに取り込まれる米国特許5534615号及び同4816567号に記載されている。
好ましくは、CH2/CH3領域を含む対象のプロテイン又は生成物は、抗体、例えばHER2、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、IgE、CD20、CD40、CD11a、組織因子(TF)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、インターロイキン−8(IL-8)、上皮細胞増殖因子レセプター(EGFR)、HER3、HER4、α4β7あるいはα5β3からなる群から選択される抗原に結合するものである。例えば、抗体は、そのような抗体のプロテインAアフィニティークロマトグラフィー中のプロテインAの浸出と共にHER2抗原に結合し得、特に問題があることが見出された。ここでの抗体の更なる特定の例には、トラスツズマブ、ヒト化2C4、ヒト化CD11a抗体、又はヒト化VEGF抗体が含まれる。対象となる他のCH2/CH3領域を含むプロテインは、イムノアドヘシン類、例えばTNFレセプターイムノアドヘシン(例えばエタネルセプト(etanercept)、ENBREL(登録商標)である。
一実施態様では、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー中に浸出するプロテインAを伴うタンパク質の感受性が先ず評価される。よって、タンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけ、回収された組成物中に浸出したプロテインAを測定する。例えば、回収された組成物は、対象タンパク質1mg当たり約20ngを超えるプロテインA(ng/mg)、例えば約20ng/mgから約500ng/mgのプロテインAを含む場合、これは浸出プロテインAのレベルが許容できない程であると考えられ、この場合には、続くタンパク質のプロテインAクロマトグラフィー精製に、回収された組成物中のプロテインAの量を低減させる方法が含まれるであろう。好ましくは、これらの工程の実施後の回収タンパク質組成物中のプロテインAの量は、対象タンパク質1mg当たりのプロテインAが約0ng(ng/mg)から約15ng/mgの範囲にある。
浸出したプロテインAを測定するための好ましいアッセイはELISAである。例えば、サンドイッチELISAを使用してもよい。このアッセイ形式では、抗プロテインA抗体を96ウェルマイクロタイタープレートにコーティングしてもよい。サンプルを0.2mg/mLの生成物抗体に希釈し、ウェルに塗布する。サンプル中のプロテインAを被覆抗体に結合させ、結合したプロテインAの量を、西洋わさびペルオキシターゼ(HRP)に結合させた抗プロテインAを用いて検出することもできる。生成物抗体による被覆抗体及びHRP結合抗体へのプロテインAの結合阻害を防止するために、0.2mg/mLの均質な生成物抗体でスパイクされる個々のプロテインA標準曲線を使用して、希釈サンプルにおいて生成物抗体が作用する阻害に適合させてもよい。この方法では多くの時間を要し、コストもかかるが、プロテインAレベルはより正確かつ厳密に決定される。例示的なプロテインAサンドイッチELISAを、以下の実施例に更に詳細に記載する。
一実施態様では、上述した温度低下は、例えばプロテアーゼインヒビター(類)を添加することにより、及び/又はプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけられる組成物のpHを低下させることにより、プロテインAの浸出を低減する一又は複数の方法と組み合わせることができる。
種々の例示的な平衡、充填、洗浄、及び溶出バッファー及び方法を以下に記載する。
任意の準備工程として、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー用の固相は、対象タンパク質のクロマトグラフィーの前に適切なバッファーで平衡に保たれる。例えば、平衡バッファーは25mMトリス、25mM NaCl、5mM EDTA、pH 7.1でよい。
しばしば、ある種の不純物(例えば、タンパク質がCHO細胞の中で産生されるチャイニーズハムスター卵巣タンパク質、CHOP)が、固相、タンパク質又はプロテインAに非特異的に結合するおそれがある。このようなことが生じるならば、対象タンパク質を溶出させる前に、このような不純物を除去するために「中間洗浄工程」を使用してもよい。固相は、中間洗浄工程の開始前に、平衡バッファーで平衡にしておいてもよい。
使用される塩は、対象タンパク質に基づいて選択されうるが、好ましくは、特に抗体がトラスツズマブ等の抗HER2抗体である場合はアセテート(酢酸塩)(例えば酢酸ナトリウム);又は特に抗体がE26等の抗IgE抗体である場合はシトラート(クエン酸塩)(例えばクエン酸ナトリウム)である。
中間洗浄バッファーのpHは、好ましくは約4〜約8、より好ましくは約4.5〜約5.5、最も好ましくは約5.0である。他の好ましい実施態様では、pHは約7.0である。
このようにして回収されたタンパク質は、製薬的に許容可能な担体で製剤化されてもよく、またこのような分子に公知の様々な診断、治療又は他の用途に使用される。
プロテインAの浸出を低減させるための温度低下
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー中
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーは、抗体を精製するための、強力で幅広く使用されているツールである。それにより、宿主細胞タンパク質、DNA、及び小分子が、生成物から効率的に除去される。集菌細胞培養液(HCCF)は、樹脂に直接充填することができ、抗体がプロテインAに結合する。低pHで結合した抗体が溶出するが、生成物プール中に浸出プロテインAを運びうる。プロテインAリガンドは、黄色ブドウ球菌から誘導され、免疫原性であるために、下流プロセシングにより生成物プールから除去しなければならない。
プロテインAの浸出の温度依存性を特徴付けるために、プロテインAの浸出に対する温度の影響を、次のタンパク質に関して評価した:
1.組換えヒト化HER2抗体のトラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 米国特許第5725856号、米国特許第5821337号、及び本願の図4A−B。
2.ヒト化CD11a抗体のMHM24、PAPTIVA(商標);Wertherら J. Immunology 157: 4986-4995 (1996), 米国特許第5622700号、国際公開第98/23761号、及び本願の図6A−B。
3.ヒト化VEGF抗体 A4.6.1,F(ab)-12, アバスチン(登録商標);Kimら, Growth Factors, 7:53-64 (1992), Prestaら Cancer Research 57: 4593-4599 (1997), 国際公開第96/30046号、1998年10月15日に公開された国際公開第98/45331号、及び本願の図7A−B。
4.ヒト化2C4;国際公開第01/00245号、及び本願の図5A−B。
小スケール:小規模実験をAKTA EXPLORER 100(商標)を使用して実施した。カラムと5mlステンレススチール上流ラインを、実験の所望温度に制御した水浴中に浸漬して温度を制御した。流入ラインは、製造規模のタンクでのHCCFのチルド冷却効果と同様に、プロテインAカラムに入れる前に、HCCFを冷却又は加熱する熱交換器として作用した。所望の温度が確実に達成されるように流出温度を測定した。
数セットのプロテインA実験を、種々の抗体に対するPROSEP A(商標)及びPROSEP vA(商標)からのプロテインA浸出の温度依存性を決定するために実施した。それぞれのタイプの樹脂の種々のロットを試験した。各条件で3回試験した。それぞれ使用前に、カラムを、3カラム容量(CV's)の溶出バッファー、及び3CV'sの再生バッファーを用いて事前サイクルにかけ、それぞれの使用後に、0.1Mの酢酸ナトリウム、2%のベンジルアルコール、pH5.0中に保存した。トラスツズマブを7つの温度設定(10、12、15、18、20、25及び30℃)にて実験した。他の抗体を3つの温度設定(10、20及び30℃)で実験した。定誤差を低減させるため温度は順序をバラバラにして実験した。6回の400Lの実験からのトラスツズマブHCCFを比較した。一ロットの20℃の樹脂に一ロットのトラスツズマブHCCFを使用し、プロテインAの浸出に対する床高の影響を調べた。
フルスケール(12000Lの細胞培養):全容量100.5L PROSEP vA(商標)用に、カラムを、直径が80cm、高さが20cmのものにした。5つの集菌をプロテインA工程を介して回収した。HCCFを収集し、充填期間中、15+/−3℃に保持した。
プロテインAの浸出に対する温度の影響を特徴付けるために、小スケールでの7通りまでの温度で、PROSEP A(商標)又はPROSEP vA(商標)にてプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを実施することにより、数種の抗体をHCCFから精製した。プロテインAの浸出は、試験した抗体においては、様々な程度で温度による影響を受ける(図1)。HER2抗体、トラスツズマブ及びヒト化2C4の溶出中、プロテインAの浸出は最も有意に影響を受けるが、ヒト化VEGF及びヒト化CD11a抗体では、温度による影響はわずかしか受けない。ランダムな実験順序と関連して小さな誤差バーは、プロテインAの浸出に対する温度の影響の真実性を確実にしている。グラフの傾向線は各セットのデータの指数適合を表す。このタイプの非線形相関は、温度活性化タンパク分解的切断と一致した。
400Lのパイロットプラント実験からのトラスツズマブHCCFのいくつかのロットを、室温で、PROSEP A(商標)において実験し、プロテインAの浸出に対するHCCFのロット間変動の影響を調査した。結果を以下の表1に示す。各ロットのHCCFを、PROSEP A(商標)において3回運転した。ロットには、0.2〜1.1ng/mgの小さな標準偏差を有する4〜13ng/mgの範囲のプロテインA浸出が見られた。これらの数値はトラスツズマブを使用した以前のプロテインA ELISAの結果と比較して低い。また、その日になされたELISAにおける正のコントロールでの実験も低かった。他の日時にアッセイされたサンプルとではなく、互いにのみ比較した結果では、トラスツズマブHCCFのロット間での浸出において、いくらかの変動が示された。
直径0.66cm、高さ20cmのカラムに充填されたPROSEP A(商標)樹脂について実験を3回実施した。カラムを平衡にし、 25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 7.1で洗浄し、25mMのトリス、25mMのNaCl、0.5MのTMAC、5mMのEDTA、pH5.0で洗浄し、25mMのクエン酸塩、pH2.8で溶出させ、0.1Mのリン酸で再生させ、0.2Mの酢酸ナトリウム、 2%のベンジルアルコール、pH5.0に、 40CV/hrで保存した。400Lのパイロットプラント実験からのトラスツズマブを、20cmの床高で流し、20gトラスツズマブ/L樹脂に充填し、25mMのクエン酸塩pH2.8で溶出させ、0.1AUから2CV'sをプールした。
実験を、直径0.66cm、高さ20cmのカラムに充填されたPROSEP vA(商標)樹脂において、トラスツズマブHCCFを使用し、20℃で実施した。カラムを平衡にし、 25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA、pH7.1で洗浄し、25mMのトリス、25mMのNaCl、0.5MのTMAC、5mMのEDTA、pH5.0又は7.1で洗浄し、25mMのクエン酸塩、pH2.8、又は0.1Mの酢酸、pH2.9で溶出させ、0.1Mのリン酸で再生させ、0.2Mの酢酸ナトリウム、 2%のベンジルアルコール、pH5.0に、 40CV/hrで保管した。トラスツズマブパイロットプラント400L HCCFの力価は0.7mg/mlであり、カラムには、樹脂1リットル当たり20gのトラスツズマブを充填した。溶出プールを0.2AU〜2CV'sまで収集した。
浸出したプロテインAを、樹脂1リットル当たり14gのヒト化2C4抗体を充填した、床高20cmのカラムにおいて実験した、ヒト化2C4抗体100万分の1単位で示している。カラムを平衡にし、 25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA、pH7.1で洗浄し、25mMのトリス、25mMのNaCl、0.5MのTMAC、5mMのEDTA、pH7.1で洗浄し、0.1Mの酢酸、pH2.9で溶出させ、0.1Mのリン酸で再生させ、0.2Mの酢酸ナトリウム、 2%のベンジルアルコール、pH5.0に、 40CV/hrで保管した。いくつかの運転では、25mMのクエン酸塩、pH2.8で溶出させた。プールを0.5AU〜2CV'sプール容量まで収集した。ラボスケールの実験は直径0.66cmのカラムを用いて実施し、パイロットスケールの実験は、PROSEP A(商標)を含有する直径10cmのカラムを使用して実施した。パイロットスケールでは、3回のヒト化2C4抗体の実験を酢酸塩を用いて溶出させ、2回のヒト化2C4抗体の実験をクエン酸塩を用いて溶出させた。ラボスケールでは、3回のヒト化2C4抗体の実験を、それぞれの溶出バッファーを用いて実施した。
HCCFを15+/−3℃まで冷却し、カラムは100.5L、直径80cm、高さ20cmであり、クエン酸塩を用いて溶出させた。温度を、HCCFタンク、ポンプとカラム間、カラム出口において測定した。カラムを平衡にし、 25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA、pH7.1で洗浄し、25mMのトリス、25mMのNaCl、0.5MのTMAC、5mMのEDTA、pH5.0で洗浄し、25mMのクエン酸塩、pH2.8で溶出させ、0.1Mのリン酸で再生させ、0.2Mの酢酸ナトリウム、2%のベンジルアルコール、pH5.0に保存した。
抗体のプロテインAアフィニティークロマトグラフィー中、温度は様々な程度で、プロテインAの浸出に影響を与える。いくつかの抗体は、他のものよりもより大きな影響を受ける;HER2抗体トラスツズマブ及びヒト化2C4抗体は、大きく影響を受けた。低浸出の抗体は、全て床高14cmのカラムで運転し、0.1Mの酢酸で溶出させたが、高浸出のものは、床高20cmで運転し、25mMのクエン酸を使用して溶出させた。床高との相関関係を調査し、プロテインAの浸出に対して何の影響も有さないことが見出された。クエン酸塩又は酢酸塩溶出はプロテインAの浸出に対して本質的に等価な効果を有する。
HCCFの温度を調節することにより、プロテインAプール中のプロテインAのレベルを調節又は低減することができる。同様の試験をパイロットスケールで実施した。2つのロットのトラスツズマブHCCFを、5通りの温度にて、1.26LのPROSEP vA(商標)カラムで実験し、溶出プールにおけるプロテインAのレベルを測定した。プロテインAの浸出は、小スケールでの同じHCCF実験、及び小スケールでの他のロットのHCCFで、全く同じように温度に依存した。大規模では、トラスツズマブHCCFを15+/−3℃まで冷却し、プロテインAの浸出を10ng/mg以下に調節した。全ての抗体は温度による影響を受けるが、程度は様々である。全てのスケールにおいて、充填中のHCCFの温度を調節することで、プロテインAの浸出を調節することができた。HCCFの温度の上昇が、プロテインAの浸出に対して指数関数的に増加する効果を有している。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー中のプロテインAの浸出を低減させるためのプロテアーゼインヒビター
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞によって組換え産出される抗体等の抗体の、回収プロセスにおける最初の捕捉工程として、プロテインAクロマトグラフィーを使用することができる。この工程は高純度を達成し、さらに高収率も維持する。溶出プールへのプロテインAリガンドの浸出は、この工程の欠点であり、浸出したプロテインAを除去するための後続するクロマトグラフィー工程が必要になる可能性もある。プロテインAクロマトグラフィーに使用可能なPROSEP A(商標)及びPROSEP vA(商標)は、制御孔質ガラス(CPG)骨格上に固定されたプロテインAリガンドを含む。
プロテインAは、限定するものではないが、機械的剪断、溶出段階中の低pHへの暴露、及び/又はタンパク質分解アッセイを含む、いくつかのメカニズムを通して、CPG骨格から浸出しうる。上述した実施例1に示すように、プロテインAの浸出は、充填中の温度に依存することが示された。
またプロテインAの浸出は、集菌細胞培養液(HCCF)のpH処理により、部分的に阻害されることも示された。特に、pH3でHCCFを2時間インキュベートすると、約30ppmから4ppmまで、浸出性が低減する。
Claims (14)
- CH2/CH3領域を含むタンパク質を精製する方法において、
(a)タンパク質と一又は複数の不純物を含む組成物に3℃から15℃の範囲の温度でプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを施して、精製された組成物を得、
(b)得られた精製された組成物を回収し、
(c)上記精製された組成物中の浸出したプロテインAを測定し、ここで、
(i)上記精製された組成物は0ngプロテインA/mgタンパク質から15ngプロテインA/mgタンパク質を含み、
(ii)上記組成物の試料の室温でのプロテインA精製によって得られた精製された組成物が20ngプロテインA/mgタンパク質を越えて含む方法。 - プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかける組成物をプロテアーゼインヒビターに暴露することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項1に記載の方法。
- 抗体が、HER2、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、IgE、CD20、CD40、CD11a、組織因子(TF)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、インターロイキン−8 (IL−8)、上皮細胞増殖因子レセプター(EGFR)、HER3、HER4、α4β7及びα5β3からなる群から選択される抗原に結合する、請求項3に記載の方法。
- 抗体がトラスツズマブ、ヒト化2C4、ヒト化CD11a抗体、及びヒト化VEGF抗体からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 抗体がHER2抗原に結合する、請求項3に記載の方法。
- 抗体がトラスツズマブ又はヒト化2C4である、請求項6に記載の方法。
- タンパク質がイムノアドヘシンである、請求項1に記載の方法。
- イムノアドヘシンがTNFレセプターである、請求項8に記載の方法。
- CH2/CH3領域を含むタンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製する方法において、
(a)タンパク質の試料をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーから回収したタンパク質を含む組成物中の浸出したプロテインAを測定し;
(b)工程(a)において20ngプロテインA/mgタンパク質を越えるプロテインAの浸出が検出された場合には、3℃から15℃の範囲の低減された温度で、タンパク質と一又は複数の不純物を含む更なる組成物のプロテインAクロマトグラフィー精製を実施し、プロテインAの浸出を減少させることを含んでなる方法。 - プロテインAアフィニティークロマトグラフィー中におけるプロテインAの浸出を低減させる方法において、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけた組成物におけるプロテアーゼ活性を減少させることを含んでなり、組成物がCH2/CH3領域を含むタンパク質と一又は複数のプロテアーゼを含み、プロテアーゼ活性を低下させるために3℃から15℃の範囲の低減された温度でプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを実施し、プロテアーゼ活性の低下を確認する方法。
- プロテアーゼ活性を低下させるためにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにかけた組成物をプロテアーゼインヒビターに暴露することを含む、請求項11に記載の方法。
- プロテアーゼインヒビターがEDTA又は4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニル-フルオライド塩酸塩(AEBSF)である、請求項12に記載の方法。
- プロテインAアフィニティークロマトグラフィーの前に組成物のpHを2.5から3.5までの範囲のpHに調節することを含む、請求項11に記載の方法。
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