KR102624406B1 - 스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 엑소좀 생산 방법 - Google Patents
스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 엑소좀 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스피룰리나를 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀 생산 방법에 관한 것이다.
여러 가지 성체줄기세포(adult stem cell) 중에 하나인 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 복부 지방조직(abdominal fat tissue), 탯줄(umbilical cord), 제대혈(umbilical cord blood), 태반(placenta), 치아펄프(teeth pulp) 등 우리 몸의 다양한 조직에 광범위하게 분포되어있으며, 손상 및 마모된 조직을 재생시키고 필요에 따라 여러 가지 성장인자, 싸이토카인 등의 유효 단백질을 발현하여 각 조직의 정상적인 작용을 유지하고 나아가 개체의 항상성(homeostasis)을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다.
중간엽줄기세포는 1970년대에 골수에서 콜로니 단일체(colony forming unit)로 처음 발견되었으며, 다양한 세포로 분화가 가능한 분화능(differentiation properties)를 가지고 있어 많은 연구가 진행되어왔다. 이런 중간엽줄기세포가 뼈, 연골, 근육 등으로 분화하는 분화능을 이용하여, 귀나 코의 연골, 심근조직, 간, 치아를 포함한 각종 뼈, 방광, 요도, 피부 등의 바이오 장기를 개발하여 손상된 장기를 대체 이식하려는 조직공학적 연구 및 노력을 많이 기울였으나, 환자 치료에 적용하기 까지는 더욱 많은 연구 개발이 필요한 상황이다.
많은 연구가 중간엽줄기세포의 분화능을 이용한 각종 장기 및 신체조직 개발에 집중되어 있었지만, 많은 노력에도 불구하고 뚜렷한 성과를 거두지 못하고 있던 중, 2000년대 이후, 중간엽줄기세포의 기질세포 특성(stromal property)이 발견되었으며, 이에 대한 연구가 집중되면서부터 중간엽줄기세포의 개발에 대한 관심이 중간엽줄기세포의 분화능 보다는 기질세포 특성을 치료제 개발에 응용하는 방향으로 바뀌게 되었다.
중간엽줄기세포는 인체 내 다양한 조직에 존재하며 여러 가지 유용 단백질을 발현 및 분비하는 기질세포의 특성을 가지고 있다. 중간엽줄기세포는 체내의 다양한 자극이나 환경의 변화에 따라 다양한 성장인자(growth factors) 및 사이토카인(cytokine)을 발현 분비하고 주위 세포와의 복잡한 상호작용 및 메커니즘(molecular interaction and mechanism)에 의한 개체의 항상성 유지에 가장 중요한 역할을 한다. 이와 같은 중간엽줄기세포의 개체의 항상성을 유지시켜주는 기질세포 특성을 이용하여, 아직 마땅한 치료제가 개발되지 않은 자가면역 질환들을 비롯한 여러 난치병의 치료제 개발에 응용되고 있다.
중간엽줄기세포 치료제는 크게 자가세포치료제와 동종세포치료제 두 가지로 나눌 수 있다. 현재까지 자가 골수유래 중간엽줄기세포를 이용한 급성심근경색과 루게릭병 치료제, 자가 지방유래 중간엽줄기세포를 이용한 크론성누공, 동종 제대혈유래 중간엽줄기세포를 이용한 무릎연골결손 치료제, 동종 골수유래 중간엽줄기세포를 이용한 급성이식편대숙주병 등의 몇몇 질병의 치료제가 임상 3상을 마치고 품목허가(Biologics License Application; BLA)를 획득하여 임상치료에 사용되고 있다. 그러나, 줄기세포 치료제의 안정성에 대한 인식의 부족과 너무 높은 치료비의 부담 때문에 시장의 점유율은 미미한 상태이다.
이러한 중간엽줄기세포의 한계점인 안정성에 대한 우려와 고비용의 문제점에 대한 대안으로 줄기세포가 분비하는 여러 성장인자나 사이토카인 등 유용 단백질을 함유한 시크리톰(세포로부터 세포 배양액에 분비된 모든 물질의 총체적 집합)을 무균상태에서 생산된 줄기세포 배양액으로부터 농축 또는 분리하여 다양한 질병 치료 및 미용에 이용하는 방법의 개발이 활발히 진행되고 있다.
또한, 중간엽줄기세포 시크리톰에 대한 연구가 활발하게 진행됨에 따라 중간엽줄기세포 상층액에 분비되는 지름이 30 내지 150um의 작은 소낭체인 엑소좀의 존재가 알려지고 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
최근 기술의 발달로 세포 배양 후 얻어지는 세포 상층액으로부터 엑소좀의 분리가 가능해지고, 특히 엑소좀의 생성과정과 세포 내 외에서의 역할이 밝혀지면서 다양한 질병의 진단과 치료제 및 미용에 응용하는 연구 개발이 활발하게 진행되어 엑소좀이 부각되고 있다.
중간엽줄기세포의 세포 상층액은 다른 세포에 비하여 상대적으로 많은 양의 엑소좀을 함유하고 있어 이를 분리하여 질병의 진단, 치료제의 전달 매체 등으로 사용하기 위한 연구 개발이 활발하게 진행되고 있다.
엑소좀은 세포 내에서의 생성과정에서 그 세포의 DNA와 RNA를 포함한 다양한 단백질을 포함하고, 이들 물질을 다른 세포에 전달하는 작용을 한다. 엑소좀은 세포와 마찬가지로 이중인지질막(phospholipid bilayer membrane)으로 이루어져 있어 피부세포로 포접되어 들어갈 수 있으므로, 중간엽줄기세포 시크리톰에서 발견되는 다양한 유용 단백질을 용이하게 피부세포로 전달하여 미백이나 주름개선 등의 미용효과와 상처치료 등의 치료효과를 볼 수 있어 화장품 원료로의 개발도 활발히 진행되고 있다.
인체 유래물을 미용이나 치료제로 사용할 때 안정성의 문제가 크게 제기되는데, 엑소좀의 경우는 매우 까다로운 엑소좀 분리 방법으로 인하여 다른 인체유래 물질이 가지고 있는 안정성의 문제에서 벗어날 수 있는 장점이 있다.
중간엽줄기세포는 세포가 처해있는 환경과 세포가 받는 자극에 따라 발현되는 시크리톰 뿐만 아니라 엑소좀의 양과 질에서 큰 차이가 나타난다. 실험실에서 중간엽줄기세포를 배양하여 시크리톰 및 엑소좀을 생산할 때, 그 생산량을 증가시키기 위하여 세포에 물리적, 화학적 또는 생물학적 자극 등 다양한 자극을 사용할 수 있다. 현재 이들 자극 중에서 초기에 많이 사용되었던 것은 세포가 성장에 필요한 영양소를 결핍시켜 세포로부터 많은 양의 시크리톰 및 엑소좀을 생산하도록 유도하는 방법이었다. 그 후에 자외선(UV light)이나 전리방사선(ionizing radiation) 또는 리포다당류(lipopolysaccharide; LPS)와 같은 생화합 물질을 이용하여 세포에 자극을 가함으로써 다량의 시크리톰과 엑소좀을 생산하도록 유도하고 있다. 이와 같이 외부에서 가해지는 자극은 세포자멸사(apoptosis)를 유발하게 되고 세포는 이 환경을 극복하고자 다양하고 많은 양의 시크리톰을 발현하게 되는데 이와 함께 엑소좀의 생성도 증가하게 되는 것으로 알려져 있다.
그러나 세포자멸사를 유발하는 방법 자체가 세포의 활성을 저하시키기 때문에 시크리톰 및 엑소좀 생산의 증대를 유도하는 방법에는 한계가 있다. 더구나 사람에게 사용할 세포 상층액을 생산하는 배지에 동물의 혈청을 사용할 수 없으므로 무혈청배지를 사용해야 함에 세포 상층액에 함유되어있는 시크리톰 및 엑소좀의 생산성이 급격히 저하되어 한번 배양한 중간엽줄기세포로부터 최대 2회의 상층액만을 회수할 수 있기 때문에 중간엽줄기세포의 시크리톰 및 엑소좀의 매우 낮은 생산성이 큰 문제로 남아있다.
이에 본 발명자들은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함함으로써, 세포를 한번 배양하여 14회까지 그 배양액을 회수할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 기존의 엑소좀 생산 방법에 비해 엑소좀 회수의 효율이 획기적으로 증가되었다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 하기의 단계를 포함하는 엑소좀 생산 방법에 관한 것이다.
일반 세포성장 배지(growth medium; GM)에서 중간엽줄기세포를 배양용기 표면의 80 내지 90%까지 배양하는 단계 제1 배양 단계; 및
스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 제2 배양 단계.
상기 제1 배양 단계에서 배양용기 표면의 80 내지 90%까지 배양하지 않으면 세포 수가 너무 적어 엑소좀 생산량이 줄어들고, 이를 초과하면 세포들이 배양용기 표면에 붙어있지 못하고 뜨게 되어 사용할 수 없게 된다.
상기 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 포함되지 않은 DMEM/F-12인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산 방법은 제1 배양 단계 이 후에 중간엽줄기세포를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 세척은 인산완충용액(PBS)로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제2 배양 단계는 24 내지 48 시간, 24 내지 42 시간, 24 내지 36 시간, 24 내지 30 시간, 예를 들어, 24시간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산 방법은 제2 배양 단계 이 후에 세포 상층의 배지를 회수하는 회수단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 생산 방법은 제2 배양 단계 및 회수 단계를 반복 수행하는 것일 수 있다.
상기 반복 수행은 1 내지 14회, 2 내지 14회, 3 내지 14회, 4 내지 14회, 5 내지 14회, 6 내지 14회, 7 내지 14회, 8 내지 14회, 9 내지 14회, 10 내지 14회, 11 내지 14회, 12 내지 14회 또는 13 내지 14회, 예를 들어, 14회 반복 수행하는 것일 수 있다.
상기 생산 방법은 제2 배양 단계 및 회수 단계를 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상, 11회 이상, 12회 이상, 13회 이상, 예를 들어, 14회 반복 수행하여 회수된 세포상층액의 단백질 농도가 50 ug/ml 이상, 45 ug/ml 이상, 40 ug/ml 이상, 35 ug/ml 이상, 30 ug/ml 이상, 25 ug/ml 이상 또는 20 ug/ml 이상, 예를 들어, 18.9 ug/ml 이상인 것일 수 있다.
상기 생산 방법은 세포 상층액으로부터 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 엑소좀 분리 단계는 수크로즈 쿠션 초고속원심분리 방법을 통해 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 엑소좀 분리 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
세포 상층액을 원심분리용 필터 유닛을 이용하여 농축하는 농축 단계;
원심분리하여 상층액을 수득하는 원심분리 단계;
상층액을 초고속원심분리하여 침전물을 수득하는 전 초고속원심분리 단계;
침전물을 밀도구배 초고속원심분리하는 밀도구배초고속원심분리 단계; 및
엑소좀을 포함하는 층을 초고속원심분리하여 엑소좀을 침전시키는 후 초고속원심분리단계.
상기 농축 단계는 분자량 3KDa 이하만 통과시키는 원심분리용 필터를 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 농축 단계는 4oC에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 원심분리 단계는 10,000xg에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 원심분리 단계는 4oC에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 원심분리 단계는 30분간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 전 초고속원심분리 단계는 150,000xg에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 전 초고속원심분리 단계는 4oC에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 전 초고속원심분리 단계는 2시간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 밀도구배 초고속원심분리 단계는 침전물을 PBS에 풀어준 후, 수크로즈 밀도구배를 만들어 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 밀도구배 초고속원심분리 단계는 150,000xg에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 밀도구배 초고속원심분리 단계는 4oC에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 밀도구배 초고속원심분리 단계는 12시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 후 초고속원심분리 단계는 150,000xg에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 후 초고속원심분리 단계는 4oC에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 후 초고속원심분리 단계는 2시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
스피룰리나는 남조류(blue-green algae)의 일종으로 학명은 사이노박테리아(Cyanobacteria 또는 Spirulina maxima)로 분류되고 건조된 무게(dry weight)의 약 60%가 단백질이며 많은 비타민과 무기질 등 인체에 필요한 거의 모든 영양소가 고루 들어 있는 완전 식품 중의 하나로 널리 알려져 있는 해조류이다.
또한, 스피룰리나 추출물은 혈액순환, 항염증, 항알러지, 미백 등의 생물학적 활성을 나타내는 물질을 함유하고 있는 안정성이 입증된 천연 물질로 화장품의 원료로도 많이 활용되고 있다.
스피룰리나 추출물 (spirulina extract; SE)은 하기 방법으로 제조하였다.
건조 분말 스피루리나 원물에 70% 에탄올을 10배수를 넣어 8시간 초음파 처리 후, 65℃에서 4시간 추출하고, 추출물을 여과지(Hyundai Micro No.51)를 사용하여 감압여과 하였다. 여과지를 통과한 액상은 45℃에서 감압농축 후 동결건조 하여 스피룰리나 추출물을 만들었다. 해당 추출물을 3차증류수에 녹여 1% 용액을 만든 후, 0.22um 필터 유닛을 이용하여 무균상태의 스피룰리나 추출용액을 만들었다.
상기 제2 배양단계의 무혈청배지에 첨가된 상기 스피룰리나 추출용액의 농도는 0.01 내지 3.0 mg/ml, 0.01 내지 2.8 mg/ml, 0.01 내지 2.6 mg/ml, 0.01 내지 2.4 mg/ml, 0.01 내지 2.2 mg/ml, 0.01 내지 2.0 mg/ml, 0.01 내지 1.8 mg/ml, 0.01 내지 1.6 mg/ml, 0.1 내지 3.0 mg/ml, 0.1 내지 2.8 mg/ml, 0.1 내지 2.6 mg/ml, 0.1 내지 2.4 mg/ml, 0.1 내지 2.2 mg/ml, 0.1 내지 2.0 mg/ml, 0.1 내지 1.8 mg/ml, 예를 들어, 0.1 내지 1.6 mg/ml인 것일 수 있다.
이 외에도 스피룰리나 추출물 제조 방법에는 물을 이용하여 추출하는 방법, 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)를 이용하여 추출하는 방법, 라이소자임(Lisozyme) 및 소화효소를 이용하여 추출하는 방법 등이 있으며 어느 한 방법에 한정하는 것은 아니다.
우리 인체에는 다양한 중간엽줄기세포가 존재하며, 각 중간엽줄기세포는 주어진 환경과 자극에 따라 서로 다른 시크리톰을 분비하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명의 중간엽줄기세포는 제대유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC), 지방유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC), 골수유래 줄기세포, 치아펄프유래 줄기세포 및 태반유래 줄기세포를 포함하는 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 지방유래 중간엽줄기세포 또는 제대유래 중간엽줄기세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 중간엽줄기세포를 배양하여 얻어지는 엑소좀의 생산 정도를 확인하기 위하여 지표물질로 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)와 인터루킨-8(IL-8)을 사용하였다.
상기 간세포성장인자는 성체 내 다양한 조직의 기질세포에서 분비되며, 발생과정에서 상피-간엽 상호작용의 매개체로서 각종 내장기관 골격계 및 태반의 형성에 관계하는 성장인자이며, 손상된 피부의 재생에 깊이 연관되어 있다.
이러한 간세포성장인자는 피부에 손상이 발생되면 호중구(neutrophils), 단핵구(monocytes), 비만세포(mast cells) 등이 상처 주위로 모여드는 것을 촉진시켜 상처 주위의 감염을 막아주고, 내상피세포와 케라티노사이트(keratinocyte)의 환부로의 이동 및 증폭을 촉진하여 상처주위의 혈관신생을 도와 환부에 새로운 상피형성을 재생시키는 데 중요한 역할을 담당하며, 다양한 내장기관 및 내장기관의 내상피세포의 재생에 필수적인 인자로써 다양한 장 질환의 치료제로 개발이 기대되는 물질이다.
상기 인터루킨-8(IL-8)은 CXCL-8 유전자에 의하여 전사되어 합성된 사이토카인으로써, IL-8 및 IL-8 수용체는 바이러스나 병원균의 감염 시 상피세포(epithelial cell)나 내피세포(endothelial cell)에서 생성되어 대식세포(macrophages), 중성구(neutrophil) 등의 면역 세포들이 감염된 부위로 이동(chemotactic)하는 것을 도우며, 이들 세포의 식세포활동(phagocytosis)을 촉진시켜 감염된 바이러스나 병원균을 제거하는데 중요한 역할을 한다.
감염에 의하여 IL-8의 농도가 높아지면 대식세포나 중성구 등 면역세포의 활동이 증가하여 자연적으로 감염부위에 염증반응이 일어나기 때문에, IL-8은 염증인자(pro-inflammatory agent)로 알려져 있다.
최근에 IL-8은 톨-라이크 수용체 3(Toll-like receptor 3: TLR3)의 리간드인 폴리리보이노신익-폴리리보씨키딜릭산(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid; poly I:C)에 의하여 생성되어, 피부 상피(epidermis)의 케라티노사이트(epidermis)로 변하는 하켓세포(HaCaT cell)의 이동을 유도하여 상처치료에 크게 기여함이 밝혀졌다.
이 작용은 IL-8의 항체를 넣어주면 상처치료가 지연되는 결과를 초래함으로써 IL-8이 상처치료에 중요한 역할을 하고 있음을 다시 한번 입증되었다. IL-8은 이 외에도 혈관신생에도 중요한 역할을 하며 특히 종양의 형성에도 관련된 것으로 알려져 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 엑소좀을 포함하는 상처 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 상처는 다양한 원인에 의해서 발생할 수 있으며, 의학용어로는 창상이라고도 한다.
상기 창상은 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 질병을 의미하여, 예를 들어, 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창, 자창, 할창, 총창, 폭창 및 교창이 있다. 창상의 형태로는 표피박리창, 피하출혈, 좌상, 좌창, 변상창 등이 있으나, 크게 나누면 폐쇄창과 개방창으로 나누어진다.
이러한 창상은 일반적으로 상해를 받은 세포의 변성 및 사멸, 주위의 조직으로부터의 유주세포 및 조직액의 유출, 섬유소의 석출과 육아조직의 형성의 순서로 치료되게 된다.
상기 약제학적 조성물은 엑소좀의 약제학적 유효량을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 1일 당 0.0001 내지 1000ug(마이크로그램, 0.001 내지 1000ug, 0.01 내지 1000ug, 0.1 내지 1000ug, 또는 1.0 내지 1000ug일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 엑소좀을 포함하는 피부상태 개선용 화장품 조성물에 관한 것이다.
상기 피부상태 개선이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하며, 예를 들어, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 여드름 개선, 피부재생 또는 미백인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장품 조성물은 상술한 본 발명의 엑소좀의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부상태 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 엑소좀과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 피부상태 개선이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하며, 예를 들어, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 여드름 개선, 피부재생 또는 미백인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등일 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 엑소좀의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
상기 식품이 음료인 경우에는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 엑소좀을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한 점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등, 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀 생산 방법에 관한 것으로, 상처치료, 피부 미백 효과를 나타내는 엑소좀을 대량 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀 생산 방법을 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC를 SFM+SE로 배양한 세포 상층액에서 분리한 ASCexo(+) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC를 SFM-only로 배양한 세포 상층액에서 분리한 ASCexo(-) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 USC를 SFM+SE로 배양한 세포 상층액에서 분리한 USCexo(+) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 USC를 SFM-only로 배양한 세포 상층액에서 분리한 USCexo(-) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM+SE로 배양한 ASC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 ASCexo(+)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM-only로 배양한 ASC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 ASCexo(-)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM+SE로 배양한 USC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 USCexo(+)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM-only로 배양한 USC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 USCexo(-)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASCexo(+)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASCexo(-)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 USCexo(+)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 USCexo(-)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-)의 미백효과를 확인한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-)의 상처회복 효과(Wound healing)를 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC를 SFM+SE로 배양한 세포 상층액에서 분리한 ASCexo(+) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC를 SFM-only로 배양한 세포 상층액에서 분리한 ASCexo(-) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 USC를 SFM+SE로 배양한 세포 상층액에서 분리한 USCexo(+) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 USC를 SFM-only로 배양한 세포 상층액에서 분리한 USCexo(-) 소포체가 엑소좀임을 유동세포분석(flow cytometry)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM+SE로 배양한 ASC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 ASCexo(+)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM-only로 배양한 ASC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 ASCexo(-)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM+SE로 배양한 USC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 USCexo(+)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 SFM-only로 배양한 USC 세포 상층액에서 분리한 엑소좀 USCexo(-)의 투과전자현미경 촬영 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASCexo(+)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASCexo(-)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 USCexo(+)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 USCexo(-)를 나노입자 분석기(Nano Particle Tracking Analyzer)를 이용한 정량 및 정성 분석 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-)의 미백효과를 확인한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-)의 상처회복 효과(Wound healing)를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지(SFM+SE)로 지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양
인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC)를 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지(serum free media + spirulina extract; SFM+SE)로 배양하여 세포 상층액을 생산하였다. 이때 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, ASC를 10% 우태아혈청을 포함하는 줄기세포성장배지 (growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 90% 이상 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지(SFM+SE)를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포 상층액 및 엑소좀을 함유하고 있음)를 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 4일간 반복하여 세포 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 상층액은 300xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포 상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
실시예 2. 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지(SFM+SE)로 제대 유래 중간엽줄기세포 배양
인체 제대 유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC)를 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지(serum free media + spirulina extract; SFM+SE)로 배양하여 세포 상층액을 생산하였다. 이때 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, USC를 10% 우태아혈청을 포함하는 줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 90% 이상 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지(SFM+SE)를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포 상층액 및 엑소좀을 함유하고 있음)를 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 4일간 반복하여 세포 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 상층액은 300xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포 상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
비교예 1. 스피룰리나 추출물이
무첨가된 무혈청배지(SFM-only) 지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양
인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC)를 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 무혈청배지(SFM-only)로 배양하여 세포 상층액을 생산하였다. 이때 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, ASC를 10% 우태아혈청을 포함하는 줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 90% 이상 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 무첨가된 무혈청배지(SFM-only)를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포 상층액 및 엑소좀을 함유하고 있음)를 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 무첨가된 무혈청 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 4일간 반복하여 세포 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 상층액은 300xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포 상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
비교예 2. 스피룰리나 추출물이 무첨가된 무혈청배지(SFM-only)로 제대 유래 중간엽줄기세포 배양
인체 제대 유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC)를 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 무혈청배지(SFM-only)로 배양하여 세포 상층액을 생산하였다. 이때 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, USC를 10% 우태아혈청을 포함하는 줄기세포성장배지 (growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 90% 이상 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 추출물이 무첨가된 무혈청배지(SFM-only)를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포 상층액 및 엑소좀을 함유하고 있음)를 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 무첨가된 무혈청 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 4일간 반복하여 세포 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 상층액은 300xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포 상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
제조예. 세포 상층액으로부터 엑소좀 분리
수크로즈 쿠션 초고속원심분리 방법을 이용하여 세포 상층액으로부터 엑소좀을 분리하였다 (도 1). 구체적으로, 세포 상층액을 분자량 3KDa 이하만 통과시키는 원심분리용 필터(3KDa MWCO) 유닛을 이용하여 4oC에서 농축하고, 10,000xg에서 30분 동안 원심분리(4℃)한 후 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 150,000xg에서 2시간 동안 초고속원심분리(4℃)하고, 상층액을 제거한 후 엑소좀을 포함하고 있는 침전물을 PBS에 풀어준 후, 수크로즈 밀도구배를 만들어 150,000xg 에서 12시간 동안 밀도구배 초고속원심분리(4℃)하였다. 밀도구배로부터 엑소좀을 함유하고 있는 우유빛 층을 회수하여 PBS로 희석한 후 다시 150,000xg에서 2시간 동안 초고속원심분리(4℃하고, 상층액을 제거한 후 엑소좀 펠릿을 PBS에 풀어주어 엑소좀을 회수하였다.
실험예. 엑소좀 유동세포분석(flow cytometry)
분리된 물질이 엑소좀임을 확인하기 위하여, 한사바이오메드(HansaBioMed)의 엑소좀 FACS 키트(Cat#: HBM-FACS-C)을 이용, 제조사가 제공한 방법으로 확인 실험을 진행하였다. 상기 키트는 엑소좀 표준액을 포함하고 있어, 표준액의 엑소좀과 분리된 물질을 항-인간 CD63 항체와 반응 및 비교하여 엑소좀임을 확인하는 것이다.
구체적으로, 표준엑소좀에 100ul의 탈이온수를 넣어 1ug/ml의 엑소좀 표준액을 준비하고 엑소좀 표준액 5ul에 2.5ul 엑소-비드(Exo-bead)를 넣고, 중간엽줄기세포 상층액으로부터 분리한 엑소좀 에는 12.5ul 엑소-비드를 넣어 섞어 준 후 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, 각 각의 튜브에 700ul PBS를 넣어 준 후 4℃에서 다음 날까지 반응시켰다. 다음날 각 튜브를 4,500xg로 4℃에서 5분동안 원심분리하여 상층액은 제거하고 킷트에 포함된 샘플버퍼(sample buffer)의 희석액 1ml을 넣고 15분 동안 상온에서 반응시킨 후 다시 4500xg로 4℃에서 5분동안 원심분리하여 상층액은 제거하고 샘플버퍼에 200배 희석한 1차 항체 100ul를 넣어준 후 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 두 차례 원심분리 세척을 한 후 상층액은 제거하고 샘플버퍼에 1000배 희석한 2차 항체 100ul와 함께 4℃에서 1시간동안 반응시킨 후 다시 두 차례 원심분리 세척한 후 상층액을 제거하고 500ul 세척액으로 세포를 풀어준 후 Beckman Coulter의 Navios로 유동세포분석(flow cytometry)을 진행했다.
SFM+SE나 SFM-only 에서 배양한 ASC와 USC 세포 상층액을 수크로즈 쿠션 초고속원심분리 방법으로 추출한 상기 소포체들의 X-Amean 값이 모두 엑소좀 표준액의 X-Amean 값(12.21)과 유사하거나 소폭 높은 값을 보였다(도 2 ~ 5). 이는 상기 방법에 의하여 분리된 소포체들이 엑소좀 특유의 표면 마커(surface marker)를 가지고 있는 엑소좀임을 입증해 주는 것이다.
실시예 4. 엑소좀의 투과전자현미경(TEM)분석
상기 ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-)를 투과전자현미경(transmission electron microscope: TEM)으로 분석 엑소좀의 모양과 크기를 관찰하여, 그 결과를 도 6 내지 9에 나타내었다.
도 6 내지 9에서 확인할 수 있듯이, ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-) 모두 전형적인 엑소좀의 모양과 크기를 나타내고 있다.
실시예 5. 엑소좀의 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analysis)
상기 ASC 유래 엑소좀 ASCexo(+)와 ASCexo(-), USC 유래 엑소좀 USCexo(+)와 USCexo(-)을 나노입자분석기(NanoSight LM-10, NanoSight Ltd, Amesbury, UK)로 분석 엑소좀의 크기와 상대적인 엑소좀의 농도를 관찰하였다.
표 1과 도 10 ~ 13에서 보는 바와 같이 나노입자분석기로 측정한 ASC와 USC 유래 엑소좀의 크기(mode 값)는 70 ~ 150nm로써 전형적인 엑소좀임을 확인했다. 스피룰리나 추출물이 첨가된 세포 상층액에서 추출한 ASCexo(+)와 USCexo(+)의 지름은 각각 117.4nm와 149.1nm 이었으며 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 세포 상층액에서 추출한 엑소좀 ASCexo(-)와 USCexo(-)의 지름은 각각 70.4nm와 98.7nm로 나타났다. 위의 엑소좀 크기에서 보듯이 스피룰리나 추출물을 첨가함으로써 스피룰리나 추출물이 없는 배지에서 분리한 엑소좀보다 지름이 ASCexo(+)는 67%, USCexo(+)는 51% 크기의 증가함을 나타낸다.
| Exosome | Diameter (mode) | Protein concentration |
| ASCexo(+) | 117.4 7.1nm | 357.7 ± 9.9ug/ml |
| ASCexo(-) | 70.4 0.0nm | 129.1 ± 7.6ug/ml |
| USCexo(+) | 149.1 9.3nm | 419.1± 6.1ug/ml |
| USCexo(-) | 98.7 5.4nm | 160.4± 7.2ug/ml |
실시예 6. 엑소좀의 단백질 농도
엑소좀은 이중인지질막으로 둘러싸인 소낭체로써 이중인지질막과 지질막 내부에 많은 단백질을 포함하고 있다. 따라서 엑소좀의 단백질 함량을 이용하여 간접적으로 엑소좀을 정량할 수 있다. 엑소좀에 포함되어 있는 단백질의 양을 BCA 시약(Pierce, Cat# 23225)을 이용하여 측정하였다.
위의 표 1에서 보는 바와 같이, 스피룰리나 추출물이 첨가된 세포 상층액에서 분리한 엑소좀의 단백질 함량이 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 세포 상층액에서 분리한 엑소좀의 단백질 함량보다 약 2~3배 증가함을 볼 수 있다. 이와 같은 단백질 함량의 증가는 스피룰리나 추출물의 첨가에 의한 엑소좀의 크기(지름)가 약 1.5배 증가하여 생기는 부피의 증가에 기인한다고 할 수 있다. 즉, 세포 상층액을 생산할 때 스피룰리나 추출물을 첨가함으로써 엑소좀의 평균 크기가 증가하고 이 엑소좀 크기의 증가에 따라 엑소좀이 전달하는 단백질 및 다른 전달물질의 양도 약 2~3배 증가한다 할 수 있다.
실시예 7. 마이크로어레이를 이용한 엑소좀의 성장인자 및 싸이토카인 분석
중간엽줄기세포 유래 엑소좀에 함유된 다양한 성장인자와 사이토카인의 농도를 측정하기위하여 Raybiotech Quantibody의 Human Growth Factor Array (Cat. # QAH-GF-1-1)와 Human Cytokine Array Q1 (Cat. # QAH-CYT-1)을 이용하여 마이크로어레이를 제조사에서 권장하는 실험 방법에 의하여 실시하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
각 웰에 샘플희석 용액을 100ul씩 넣고 약 30분 정도 상온에서 반응시킴으로 용기의 표면을 블락시킨 후 용액을 제거했다. 각 웰에 100ul의 마이크로어레이 표준액 또는 시료를 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 150ul의 세척액I으로 5분씩 5회 세척했다. 글래스 슬라이드와 슬라이드 프레임 박스에 넣고 세척액I에 약 20분 동안 부드럽게 흔들어 준 후 세척액II로 2번 세척하였다. 상기의 각 웰에 항체 복합 용액을 80㎕씩 넣고 항체 항원의 반응을 위하여 2시간 동안 실온에서 반응시키고 150ul의 세척액II로 5분씩 2번 세척하였다. 각 웰에 80ul의 검출 항체 칵테일을 넣고 상온에서 2시간 반응시키고 다시 150ul의 세척액II로 5분씩 2번 세척하였다. 그리고 시아닌 형광 염료가 결합된 스트렙타아비딘 80㎕를 각 웰에 첨가하고 알루미늄 호일을 덮어 빛을 차단하거나 암소 하에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 첨가된 용액을 제거하고 세척용액으로 5회 세척한 뒤, 각 웰로부터 세척용액을 완전히 제거하였다. 그리고 마이크로어레이 레이저 스캐너를 이용하여 상기 표본을 분석하였으며, 표준용액 검출양과 비교하여 시료의 사이토카인 또는 성장인자의 함유량을 계산하였다.
ASC와 USC의 엑소좀에 함유되어 있는 성장인자와 사이토카인의 농도를 레이바이오텍의 마이크로어레이로 분석하여, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
| Growth Factors | ASCexo(+) | ASCexo(-) | USCexo(+) | USCexo(-) |
| AR | 194 +/- 12 | 101 +/- 7 | 172 +/- 10 | 158 +/- 6 |
| BDNF | 7 +/- 0 | 7 +/- 0 | 12 +/- 1 | 7 +/- 0 |
| bFGF | 12 +/- 0 | 3 +/- 0 | 19 +/- 1 | 13 +/- 0 |
| BMP-4 | 1333 +/- 97 | 352 +/- 17 | 1366 +/- 205 | 1461 +/- 95 |
| BMP-5 | 2703 +/- 204 | 3526 +/- 196 | 3415 +/- 149 | 5116 +/- 265 |
| BMP-7 | 798 +/- 24 | 1232 +/- 77 | 1144 +/- 50 | 1511 +/- 80 |
| b-NGF | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 |
| EGF | 1 +/- 0 | 0 +/- 0 | 2 +/- 0 | 0 +/- 0 |
| EGF R | 1858 +/- 203 | 2343 +/- 90 | 2261 +/- 254 | 2722 +/- 247 |
| EG-VEGF | 51 +/- 5 | 29 +/- 2 | 51 +/- 4 | 41 +/- 3 |
| FGF-4 | 2245 +/- 102 | 948 +/- 34 | 2256 +/- 94 | 1216 +/- 90 |
| FGF-7 | 109 +/- 6 | 76 +/- 4 | 128 +/- 3 | 126 +/- 5 |
| GDF-15 | 72 +/- 4 | 55 +/- 4 | 450 +/- 38 | 149 +/- 11 |
| GDNF | 36 +/- 2 | 22 +/- 3 | 42 +/- 1 | 29 +/- 1 |
| GH | 251 +/- 3 | 171 +/- 4 | 300 +/- 8 | 255 +/- 8 |
| HB-EGF | 100 +/- 5 | 32 +/- 1 | 106 +/- 2 | 70 +/- 5 |
| HGF | 117 +/- 3 | 433 +/- 33 | 251 +/- 12 | 523 +/- 16 |
| IGFBP-1 | 99 +/- 3 | 135 +/- 6 | 128 +/- 3 | 140 +/- 10 |
| IGFBP-2 | 297 +/- 3 | 160 +/- 6 | 323 +/- 33 | 238 +/- 15 |
| IGFBP-3 | 2387 +/- 109 | 1739 +/- 85 | 3113 +/- 83 | 2500 +/- 62 |
| IGFBP-4 | 4772 +/- 289 | 3154 +/- 148 | 5730 +/- 136 | 4763 +/- 261 |
| IGFBP-6 | 2556 +/- 17 | 2073 +/- 71 | 2124 +/- 107 | 1483 +/- 40 |
| IGF-I | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 200 +/- 17 | 0 +/- 0 |
| Insulin | 341 +/- 7 | 721 +/- 18 | 596 +/- 16 | 1139 +/- 36 |
| MCSF R | 165 +/- 9 | 35 +/- 1 | 201 +/- 13 | 119 +/- 4 |
| NGF R | 203 +/- 5 | 93 +/- 3 | 233 +/- 7 | 139 +/- 6 |
| NT-3 | 124 +/- 2 | 20 +/- 1 | 150 +/- 3 | 78 +/- 0 |
| NT-4 | 180 +/- 10 | 117 +/- 6 | 218 +/- 10 | 171 +/- 8 |
| OPG | 50 +/- 3 | 22 +/- 2 | 187 +/- 2 | 42 +/- 1 |
| PDGF-AA | 3 +/- 0 | 0 +/- 0 | 38 +/- 1 | 30 +/- 1 |
| PIGF | 36 +/- 2 | 25 +/- 1 | 46 +/- 2 | 39 +/- 1 |
| SCF | 116 +/- 13 | 33 +/- 2 | 157 +/- 7 | 54 +/- 7 |
| SCF R | 181 +/- 23 | 93 +/- 6 | 188 +/- 12 | 139 +/- 17 |
| TGF | 297 +/- 14 | 158 +/- 10 | 322 +/- 17 | 220 +/- 12 |
| TGF1 | 5205 +/- 74 | 9330 +/- 349 | 7844 +/- 133 | 12092 +/- 471 |
| TGF3 | 1191 +/- 14 | 359 +/- 13 | 1266 +/- 73 | 620 +/- 12 |
| VEGF | 42 +/- 2 | 20 +/- 1 | 62 +/- 2 | 86 +/- 4 |
| VEGF R2 | 277 +/- 6 | 162 +/- 10 | 327 +/- 15 | 272 +/- 6 |
| VEGF R3 | 198 +/- 4 | 106 +/- 4 | 225 +/- 16 | 176 +/- 8 |
| VEGF-D | 86 +/- 5 | 39 +/- 3 | 126 +/- 7 | 77 +/- 6 |
| Cytokines | ASCexo(+) | ASCexo(-) | USCexo(+) | USCexo(-) |
| IL-1a | 71 +/- 3 | 15 +/- 1 | 66 +/- 3 | 26 +/- 1 |
| IL-1b | 31 +/- 4 | 0 +/- 0 | 42 +/- 2 | 0 +/- 0 |
| IL-2 | 22 +/- 1 | 3 +/- 0 | 23 +/- 1 | 18 +/- 2 |
| IL-4 | 35 +/- 5 | 0 +/- 0 | 45 +/- 2 | 0 +/- 0 |
| IL-5 | 27 +/- 3 | 0 +/- 0 | 47 +/- 4 | 20 +/- 2 |
| IL-6 | 23 +/- 3 | 4 +/- 0 | 14 +/- 1 | 9 +/- 1 |
| IL-8 | 3 +/- 0 | 1 +/- 0 | 3 +/- 0 | 2 +/- 0 |
| IL-10 | 499 +/- 42 | 66 +/- 9 | 520 +/- 69 | 292 +/- 33 |
| IL-12p70 | 9 +/- 1 | 0 +/- 0 | 8 +/- 0 | 1 +/- 0 |
| IL-13 | 3 +/- 0 | 0 +/- 0 | 4 +/- 0 | 3 +/- 0 |
| GM-CSF | 4 +/- 0 | 0 +/- 0 | 13 +/- 0 | 2 +/- 0 |
| GRO | 2103 +/- 73 | 42 +/- 4 | 1633 +/- 122 | 209 +/- 17 |
| IFN | 103 +/- 7 | 0 +/- 0 | 183 +/- 17 | 174 +/- 7 |
| MCP-1 | 47 +/- 4 | 0 +/- 0 | 24 +/- 1 | 20 +/- 1 |
| MIP-1a | 139 +/- 11 | 0 +/- 0 | 115 +/- 13 | 9 +/- 0 |
| MIP-1b | 15 +/- 2 | 2 +/- 0 | 11 +/- 0 | 3 +/- 0 |
| MMP-9 | 109 +/- 13 | 0 +/- 0 | 96 +/- 1 | 1 +/- 0 |
| RANTES | 251 +/- 9 | 0 +/- 0 | 13 +/- 0 | 0 +/- 0 |
| TNF | 18 +/- 1 | 0 +/- 0 | 27 +/- 1 | 16 +/- 1 |
| VEGF | 99 +/- 9 | 42 +/- 3 | 88 +/- 4 | 99 +/- 11 |
마이크로어레이 데이터를 이용하여, 무혈청 배지에 첨가한 스피룰리나 추출물이 엑소좀에 포함된 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 스피룰리나 추출물에 의하여 발현이 증가 또는 감소한 이들 성장인자와 사이토카인의 수를 파악하여 비교하였다 (표 4).
마이크로어레이로 측정한 60개의 이들 성장인자와 사이토카인 중에서 약 80%의 단백질은 스피룰리나 추출물에 의하여 발현 농도가 증가하였고 약 20%의 단백질은 그 농도가 감소하였다. 즉 스피룰리나 추출물에 의하여 엑소좀에 포접되는 단백질 중에 일부는 그 발현이 억제되었지만 대부분의 단백질은 그 발현이 촉진되었다.
| 엑소좀 | 증가한 단백질 | 감소한 단백질 | 유사한 단백질 |
| ASC | 80% | 16% | 4% |
| USC | 79% | 19% | 2% |
실시예 8. 미백효과 (Melanin Synthesis Inhibition Assay)
ASC와 USC 엑소좀의 미백에 미치는 효과를 측정하기 위하여 B16BL6 세포를 이용하여 멜라닌색소합성억제(Melanin synthesis inhibition assay) 실험을 실시하였다. 실험 방법은 다음과 같다.
B16BL6 melanoma 세포를 1Х105 cells/well 농도로 6 well plate에 분주 하여 24시간 동안 배양한다. 24시간 후, 배지를 제거하고 세포를 1x PBS로 1회 씻어준 후 1% FBS가 함유된 새 배지를 첨가한다. 엑소좀을 각 세포에 처리한 후 72시간 동안 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양한다. 72시간 후 배지는 제거하고 1x PBS로 세포를 1회 씻어준다. 0.05% Trpysin-EDTA를 각 세포에 500ul 처리한 후 세포들을 회수한다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 남은 세포에 1N NaOH를 150ul 첨가하여 70℃에서 1시간 동안 세포를 완전히 녹여 준다. 그리고 96-well plate에 얻은 용액을 각각 분주하여 520nm에서 흡광도 값을 확인한다.
스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 ASC과 USC의 엑소좀을 10% 함유한 배양액으로 B16BL6세포를 배양하여 멜라닌색소합성억제 효과를 관찰하였다(도면 14). 표 5와 도 14에서 보듯이 스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 엑소좀의 멜라닌색소 합성억제 효과가 스피룰리나 추출물을 첨가하지 않고 생산한 엑소좀보다 높았다.
| Exosome/ | Melanin Synthesis Inhibition (%) | |
| control | SFM+SE | SFM-only |
| Arbutin 10ug/ml | 41 | |
| ASC Exosome | 16 | 15 |
| USC Exosome | 14 | 10 |
실시예 9. 상처회복 효과(Wound healing)
ASC와 USC 엑소좀의 상처회복에 미치는 효과를 측정하기 위하여 Fibroblast NIH3T3 세포의 이동성(migration property)을 이용하여 상처회복 실험을 실시하였다. 실험 방법과 결과는 다음과 같다.
Fibroblast NIH3T3 세포를 세포를 2.5Х105 cells/well 농도로 24-well plate에 분주 하여 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 200ul 팁을 이용하여 각 well의 중앙에 상처를 주었다. 배지를 제거하고 세포를 1x PBS로 1회 세척한 후 1% FBS가 함유된 새 배지를 첨가한다. 엑소좀을 각 웰의 세포에 처리한 후 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 48시간 경과 후 세포사진 촬영 및 세포간격을 측정하여 상처 회복능을 확인하였다.
스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 ASC와 USC의 엑소좀을 10% 함유한 배양액으로 섬유아세포를 배양하여 상처회복 효과를 확인하였다(도 15). 표 6 와 도 15에서 보듯이 스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 엑소좀의 상처회복 효과가 스피룰리나 추출물을 첨가하지 않고 생산한 엑소좀보다 높았다.
| control | Wound Recovery (%) | |
| SFM | 14 | |
| 4%FBS | 28 | |
| Exosome | SFM+SE | SFM-only |
| ASC Exosome | 44 | 41 |
| USC Exosome | 49 | 45 |
Claims (10)
- 하기의 단계를 포함하는, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법:
줄기세포성장배지에서 중간엽줄기세포를 배양용기 표면의 80 내지 90%까지 배양하는 단계 제1 배양 단계; 및
스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 제2 배양 단계. - 제1항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 24 내지 48 시간 수행하는 것인, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 0.01 내지 3.0 mg/ml 농도의 스피룰리나 추출물을 무혈청 배지에 첨가하여 중간엽줄기세포를 배양하는 것인, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생산 방법은 제2 배양 단계 이 후에 세포 상층의 배지를 회수하는 회수 단계를 추가로 포함하는 것인, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 방법은 제2 배양 단계 및 회수 단계를 1 내지 14회 반복 수행하는 것인, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 방법은 세포 상층액으로부터 엑조좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 제대유래줄기세포, 지방조직유래줄기세포, 골수유래줄기세포, 치아펄프유래줄기세포 및 태반유래줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 엑소좀의 크기를 증가시키는 방법.
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|---|---|---|---|---|
| US20080085330A1 (en) * | 2005-05-02 | 2008-04-10 | Cyndy Davis Sanberg | Compounds for stimulating stem cell proliferation including spirulina |
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|---|---|---|---|---|
| KR102394636B1 (ko) * | 2015-06-30 | 2022-05-09 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법 |
| KR101975109B1 (ko) * | 2017-09-19 | 2019-05-03 | 경희대학교 산학협력단 | 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물 |
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2021
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