KR20110017345A

KR20110017345A - 혈관내피전구세포 이동 촉진제

Info

Publication number: KR20110017345A
Application number: KR1020100077874A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 홍현숙
Original assignee: 주식회사 셀앤바이오
Priority date: 2009-08-13
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2011-02-21
Also published as: EP2464372A4; WO2011019221A3; US20120142596A1; EP2464372A2; WO2011019221A2

Abstract

본 발명은 서브스턴스-P(Substance P, SP)를 포함하는 혈관내피 전구세포 이동 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 서브스턴스-P는 골수로부터 혈관내피 전구세포의 이동 촉진에 활성을 나타내며, 이를 통해 혈관형성(vasculogenesis) 을 촉진시켜, 허혈성 혈관 손상 및 외상성 혈관손상을 동반한 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 당뇨성 궤양 등의 질환에 탁월한 효과를 나타낸다.

Description

혈관내피전구세포 이동 촉진제{An agent for stimulating mobilization of endothelial progenitor cells}

본 발명은 서브스턴스-P를 포함하는 혈관내피전구세포 이동 촉진제에 관한 것이다.

허혈성 혈관 손상은 혈관 폐쇄 혹은 혈관 손상으로 인해 혈액이 제대로 제공되지 않아 충분한 산소가 전달되지 못하여 발생하게 되고, 이러한 상태는 조직 세포의 대량 괴사를 일으켜 생명에 치명적인 영향을 미친다. 그 대표적인 예로 심근경색, 협심증, 뇌졸증, 치매 등을 들 수 있다(Mymensingh Med J. 18, 264-72, 2009, Cardiol Rev, 16, 163-71, 2008). 따라서, 손상된 혈관을 신속하게 재생시키는 것은 상기 질병의 치료에 제일 중요한 단계이다.

혈관이 형성되는 과정은 혈관신생(angiogenesis)과 혈관형성 (vasculogenesis)을 통해 일어나는 것으로 알려져 왔었다. 혈관신생(angiogenesis)는 이미 존재하는 혈관으로부터 혈관 내피 세포가 뻗어나가(sprouting) 새로운 혈관을 형성하는 것을 의미하며, 혈관형성(vasculogenesis)은 혈관 내피 전구세포 (Endothelial Progenitor Cell, 이하 'EPC'라 함)가 손상부위로 이동하여 분화되어 새로이 만들어진 혈관 내피 세포들에 의한 새로운 혈관이 만들어지는 과정을 말한다. 손상 부위가 적을 경우 혈관신생(angiogenesis) 과정으로 주변의 혈관 내피세포의 이동으로 혈관 재생이 가능하지만, 손상 부위가 큰 경우 골수 등으로부터 EPC의 이동(mobilization)을 동반, 혈관형성(vasculogenesis)이 진행되어야 한다.

EPC는 미분화 혈관 내피 전구세포로서 성숙한 혈관 내피세포로 분화가 가능하며, EPC의 기원은 골수 조혈 모세포(bone marrow bone marrow-derived hematopoetic cells), 단핵구 (monocytic and nonmonocytic mononuclear cells), 및 조직 내 세포(tissue-resident cells)등으로 알려져 있는데, 그 중에서도 특히 골수가 1차 공급원(primary source)으로 작용한다(Stem Cell Rev, 3, 218-225, 2007).

골수 내에 존재하는 EPC는 여러 가지 인자들의 신호를 통해, 골수로부터 이동(mobilization)되어 손상 혈관 부위로 이동하여 혈관 재생에 참여하게 되는 것으로 알려져 있다. EPC의 이러한 역할은 혈관 재생이 시급한 허혈성 혈관 손상 질환에 매우 중요하다. 대표적인 허혈성 질환인 심근 경색(myocardiac infarction, 이하 MI라 함)에서 EPC 연구가 많이 진행되었는데, Badorff, C et al (2003)은 EPC를 MI환자에게 이식함으로써 부작용 없이 심근기능이 회복됨을 보고하였고, Yoon et al (2005) 역시 EPC를 심근 경색환자에 이식한 결과, 심장 기능의 회복을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 혈관 재생 및 또는 혈관 신생 기능이 EPC에 의해 직, 간접적인 방법으로 촉진되어 일어날 것으로 예상되고 있다.

EPC의 역할에 대한 중요성이 커짐에 따라 EPC의 골수로부터 이동하여 손상부분으로의 homing 하는 기전에 대한 관심이 증가하였다. 현재 임상에 사용중인 G-CSF와 GM-CSF는 원래 호중구 및 대식세포의 증식 및 이동 촉진인자로 밝혀졌으나, 최근 G-CSF가 EPC이동에 대한 효과가 밝혀지면서, 치료용 EPC를 말초혈액에서 유리시키는 인자로 사용 되고 있다. 이 외에 VEGF 또는 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 또는 SDF-1(stromal cell-drived factor-1) 등도 EPC의 이동을 조절하는 것으로 알려진 인자들이다. 특히 SDF-1은 저산소 (hypoxia)에 발현되는 것으로 CXCR4 수용체에 반응하여 골수로부터 EPC를 이동시킴과 손상부위로 homing에 관여하는 것으로 그 역할이 밝혀지게 되었다(Am J Physiol Cell Physiol. 292:C987-95, 2007, 2005). 또한 G-CSF와 SDF-1의 동시 적용이 신생 혈관 효과를 극대화 시킨다는 보고도 있다(Cardiovasc Res. 73, 823-832, 2007).

현재 G-CSF를 혈관재생 목적으로 임상에 사용 중이나 많은 부작용을 동반하는 것으로 알려져 있다. 그 예로 백혈구증가증, 비장비대증, 수질의 골격통 오심, 구토, 설사, 점막염, 혈구 감소성 발열, 발열, 탈모, 근신경 미 골격계 쇠약, 수분저류, 흉통, 식욕감퇴, 구순염, 변비, 인후염, 두통, 발진, 호흡곤란, 등 많은 부작용이 제시된다. 따라서, 염증유발 등 부작용이 없는 EPC mobilization 에 특이적인(specific)인 물질의 개발이 절실히 요구된다.

서브스턴스-P(이하, 'SP' 또는 '서브스턴스 P')는 오랫동안 중추신경계에서 통증을 전달하는 신경전달물질로 알려져 있었고, 11개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 사람, 쥐, 토끼에서 동일한 아미노산 서열을 가지고 있어 종간 구별이 없는 일종의 신경호르몬이다. 서브스턴스-P는 신경 세포뿐만 아니라 비신경 조직에서도 발현되는데, 상피세포, 내피세포 (Watanabe M et al Jpn J Ophthalmol. 46, 616-20, 2002), 대식세포, 호중구 (Ho W. Z. J Immunol. 159, 5654-60 1997), 암세포 (Singh D et al. PNAS 97, 388-393, 2000) 등에서 발현이 확인되었다. 서브스턴스-P는 세포표면의 뉴로키닌 수용체 (neurokinin receptor, NK-1, Nk-2, NK-3) 에 결합하여, G-protein-coupled receptor를 통해 신호를 전달하는 단백질이다. 이 수용체는 각막상피세포 (Watanabe M et al Jpn J Ophthalmol. 46, 616-20, 2002), 피부각질세포 (Leu J Y et al. Br J Dermatol. 155, 657-62 2006), 중배엽줄기세포 등에서 발현된다. 이런 다양한 조직에서의 발현 및 작용을 통해 서브스턴스-P가 기존에 알려진 기능인 통증전달 외에, 신경-면역계 상호 조절, 골수 섬유증, 암세포 증식 등 에서 중요한 역할을 할 것으로 기대하고 있다.

중배엽줄기세포에 대한 서브스턴스-P의 작용은 Pranela Rameshwar (2001) 연구에서 보고되었는데, 이에 따르면 서브스턴스-P가 중배엽 줄기세포가 조혈세포의 지지 작용에서 긍정적인 역할을 한다고 제시하고 있다. 즉, 서브스턴스-P가 중배엽 줄기세포를 자극하여 여러 가지 사이토카인 및 성장 인자를 분비하여 조혈작용 (hematopoiesis)을 촉진시키므로 면역계 조절에도 관여할 수 있음이 밝혀졌다(Pranela Rameshwar. et al. Journal of Neuroimmunology 121, 22-31, 2001).

서브스턴스-P는 IGF 또는 EGF와 함께 사용시 주위 상피세포의 이동을 촉진시키므로 각막 재생을 촉진시키는 기능이 밝혀졌다(Nakamura M. et al. Diabetologia. 46,839-42, 2003), Yamada N et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.45, 1125-31, 2004). 이러한 서브스턴스-P의 각막상피세포 이동 촉진효과를 이용하여 일본 Santen제약에서는 서브스턴스-P를 함유한 안약 개발을 진행하고 있다. 또한 Rook JM (2007)은 인트라사이트 겔과 서브스턴스-P를 혼합하여 상처에 적용하여 상처 치유가 빨라지는 것을 확인하였다.

서브스턴스-P의 다양한 활용 및 기대효과가 증가하고 있지만, 대부분 서브스턴스-P를 국소 적용한 경우로서, 주변 조직의 세포 자극을 통해 그 효과가 나타나므로 작은 손상의 경우 효과적이지만, 손상이 큰 경우는 치유가 지연되거나 일어나지 않을 수 있다. 특히 난치성 상처 및 궤양의 경우에는 혈관의 분포가 부족하고 지속적인 염증 반응, 감염 등이 동반되어 조직재생이 지연되고 있다. 이러한 질환은 혈관 재생이 촉진되어야 함으로 손상 주변 세포의 자극만으로는 치유가 불가능하고, 혈액으로부터 EPC의 유입이 수반 되어야 한다(Gibran N. S. et al Journal of Surgical Research 108, 122-128, 2002).

최근까지 서브스턴스-P의 많은 역할들이 보고되어 왔지만, EPC와 관련한 서브스턴스-P의 기능은 보고된 바가 없었다. 이에, 서브스턴스-P가 EPC 이동에 특이적 기능은 보유하고 있다면, 이는 허혈성 혈관손상을 동반한 다양한 질환에 혈관 재생촉진제로서 중요한 역할을 할 것으로 기대가 되었던 바, 예의 연구를 거듭하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 골수의 혈관내피전구세포를 혈관손상 부위로 이동시켜, 혈관 형성(vasculogenesis)을 촉진하고, 혈관 손상 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 내지 제제를 제공하고자 한다.

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈관내피전구세포 이동 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈관내피 전구세포의 골수로부터 혈액 중으로의 이동 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈관형성(vasculogenesis) 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈관내피전구세포 이동에 의한 혈관형성(vasculogenesis) 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈관내피 전구세포의 골수로부터 혈액 중으로의 이동 촉진에 의한 혈관신생 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 허혈성 혈관손상(ischemic vascular injury) 또는 외상성 혈관손상(traumatic vascular injury)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 또는 당뇨성 궤양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 골수내투여, 정맥투여, 피하투여, 복강투여용 조성물이다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분인 서브스턴스-P 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여경로를 고려하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다. 이러한 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 연고제, 크림제, 겔제, 점적제, 에어로졸, 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕괴제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 경우 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 제제화 할 수 있다.

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 조성물의 혈관형성(vasculogenesis) 촉진용 용도, 혈관내피전구세포 이동 촉진용도, 혈관내피 전구세포 이동에 의한 혈관형성(vasculogenesis) 촉진 용도, 혈관내피 전구세포의 골수로부터 혈액 중으로의 이동 촉진용도, 및 그 이동 촉진에 의한 혈관신생 촉진용도를 제공한다.

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 조성물의 허혈성 혈관 손상 또는 외상성 혈관손상 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 또는 당뇨성 궤양의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는 혈관 신생 관련 질환, 바람직하게는 허혈성 혈관 손상 질환 또는 외상성 혈관 손상 질환, 보다 바람직하게는 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 또는 당뇨성 궤양 등의 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 "치료학적으로 유효한 양"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 혈관형성(vasculogenesis) 관련 질환, 바람직하게는 허혈성 혈관 손상 질환 또는 외상성 혈관 질환, 보다 바람직하게는 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 당뇨성 궤양 등의 질환을 치료하는 방법에 있어서, 성인의 경우, 서브스턴스-P를 1일 1회 투여시, 0.001 - 0.5 mg/일, 바람직하게는 0.0001 - 0.005 mg/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 조성물은 경구, 설하, 직장, 피부, 피하, 근육, 복강, 정맥, 동맥, 뇌척수강내, 골수내 등으로 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 혈관내피전구세포의 이동을 유발하기 위한 유효량의 서브스턴스-P를 포함하는 혈관내피전구세포의 이동 촉진제를 제공한다.

본 발명의 혈관내피전구세포 이동 촉진제는 골수로부터 혈액으로 혈관내피전구세포의 이동을 촉진한다. 서브스턴스-P에 의해 골수로부터 혈액으로 이동한 혈관내피전구세포는 손상된 혈관 부위로 이동하여 혈관형성(vasculogenesis)에 참여한다. 서브스턴스-P가 골수 내 혈관내피전구세포의 이동을 자극한다는 것은 본 발명자들에 의하여 최초로 밝혀진 것이다.

본 발명의 혈관내피전구세포의 이동 촉진제는 허혈성 혈관 손상 또는 외상성 혈관손상의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있으며, 따라서, 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 또는 당뇨성 궤양의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 혈관내피전구세포의 이동 촉진제의 제형, 투여량, 투여경로 등은 당업계에서 통상적으로 사용되는 범주에서 결정될 수 있으며, 또한, 이에 관하여는 서브스턴스-P를 포함하는 조성물에 관하여 본 명세서에 기재된 사항을 참고할 수 있다.

본 발명은 또한 대상체에 혈관내피전구세포의 이동을 유발하기 위한 유효량의 서브스턴스 P를 투여하는 것을 포함하는 혈관내피전구세포의 이동을 촉진하는 방법을 제공한다.

대상체에 서브스턴스 P를 투여되면 골수 내 혈관내피전구세포가 골수로부터 혈액으로, 바람직하게는 손상된 혈관으로의 이동하여 혈관형성(vasculogenesis)이 촉진된다. 서브스턴스-P의 투여는 당업계에서 통상적으로 행하여지는 경로를 채택할 수 있으며, 바람직하게는 골수내, 정맥, 피하, 또는 복강으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 정맥으로 투여될 수 있다. 본 발명의 서브스턴스-P는 골수로 직접 투여되는 경우 뿐만 아니라 정맥을 통해 투여되는 경우에도 우수한 혈관내피전구세포 이동 촉진능을 나타낸다.

상기 혈관내피전구세포의 이동을 촉진하는 방법을 적용하기 위한 대상체로는 허혈성 혈관 손상 또는 외상성 혈관손상, 보다 구체적으로는 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 및 당뇨성 궤양로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 상기 질환의 위험을 가지는 환자가 바람직하다.

본 발명은 또한 (a) 골수로부터 혈관내피전구세포의 이동을 유발하기 위한 유효량의 서브스턴스-P를 대상체에 투여하여 골수로부터 혈액으로 혈관내피전구세포의 이동을 촉진하는 단계; (b) 혈액으로부터 혈관내피전구세포를 회수하는 단계; 및 (c) 회수된 혈관내피전구세포를 대상체에 도입하는 단계를 포함하는, 대상체의 혈관 손상 조직에서 혈관형성(vasculogenesis)을 촉진하는 방법을 제공한다.

상기 (a)단계에서, 서브스턴스-P의 투여는 통상적으로 행하여지는 경로를 채택할 수 있으며, 바람직하게는 골수내, 정맥, 피하, 또는 복강으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 정맥으로 투여될 수 있다. 다른 골수 유래 혈관내피전구세포 이동 촉진제, 예컨대, G-CSF와 달리, 서브스턴스-P는 골수로 직접 투여되는 경우 뿐만 아니라 정맥을 통해 투여되는 경우에도 혈관내피전구세포의 혈액으로의 이동을 충분히 촉진하기 때문에 골수 유래 혈관내피전구세포 채취의 어려움을 덜어준다.

상기 (b) 단계에서, 혈액은 대상체로부터 얻은 말초혈액일 수 있으며, 혈액으로부터 혈관내피전구세포의 회수는 당업계에 알려진 통상의 방법에 의하여 행하여 질 수 있다. 예컨대, 말초 혈액으로부터 단핵구 세포를 분리하여, 피브로넥틴(Fibronectin)이 코팅된 디쉬에 세포를 넣고 EGM(endothelial growth medium)에서 배양하여 EPC 만을 선별적으로 증식시켜 얻을 수 있다.

상기 (c) 단계에서, 회수된 혈관내피전구세포의 대상체 내 도입은 당업계에서 통상적으로 행하여지는 방법으로 행하여질 수 있으며, 예컨대, 회수된 혈관내피전구세포를 겔 형태 또는 용액 형태 (hydrogel 또는 피브린 글루 또는 콜라겐 등)로 상처 부위에 직접 도포하거나, 정맥, 피하 등의 경로로 투여하여 적용될 수 있다.

본 발명에 의한 서브스턴스-P를 포함하는 조성물은 혈관내피전구세포 이동 촉진효과, 및 이를 통한 혈관형성(vasculogenesis) 촉진 효과를 나타낸다. 본 발명에 의한 조성물은 또한 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 당뇨성 궤양 등 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.

도1은 SP의 정맥내 투여에 의한 EPC 이동 촉진 효과를 확인한 그래프이다.
도2는 SP 투여 후 얻은 말초혈액으로부터 EPC 마커 (CD34, UAE-1)를 이용하여 EPC의 존재를 확인한 사진이다.
도3은 SP 투여 후 얻은 말초혈액으로부터 얻은 세포의 tube 생성능을 확인한 사진이다.
도4는 마우스의 피부 상처에 EPC를 적용한 모습을 나타낸 사진이다.
도5은 마우스의 피부 상처에 EPC를 적용한 상처 부위 단면을 나타낸 사진이다.
도6은 마우스의 피부 상처에 EPC를 적용한 상처 부위의 표피와 진피의 변화를 현미경을 이용하여 정량화한 그래프이다.
도7은 SP의 골수강내 투여에 의한 EPC 이동 촉진 효과를 확인한 그래프이다.
도8은 SP와 G-CSF를 각각 정맥 주사 후 말초혈액의 EPC 양을 나타낸 그래프이다.
도9는 SP와 G-CSF를 각각 정맥 주사후 말초혈액의 호중구(neutrophil), 단핵백혈구(monocyte), 림프구(lymphocyte)의 양을 나타낸 그래프이다.
도10은 SP와 G-CSF를 각각 골수 주사 후 얻은 말초혈액의 EPC 양을 나타낸 그래프이다.
도11은 SP와 G-CSF를 각각 골수 주사후 말초혈액의 호중구, 단핵백혈구, 림프구, 호산구(eosinophil)의 양을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1. SP 의 정맥투여에 의한 EPC 이동 촉진 효과 확인

(1) SP의 정맥 투여

토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=3)에 케타라 (50mg/ml 유한양행)과 럼푼 (Xylazine hydrochloride, 23.32mg /ml, 바이엘코리아 주식회사)을 2:1로 섞은 다음 총 900 마이크로리터(케타라 600 마이크로리터: 럼푼 300 마이크로리터)를 근육에 주사하였다. 근육 주사 10분 후 동일한 마취제 (케타라 200 마이크로리터: 럼푼 100 마이크로리터)를 토끼 귀의 정맥에 주사하고, 완전히 마취가 된 후 투여를 시작하였다. SP를 5nmole/kg으로 생리식염수에 용해시켜 1ml을 토끼의 귀 정맥에 천천히 투여하였다. 대조군으로 1×PBS 1ml을 귀 정맥에 투여하였다.

상기 투여 24시간 후 동량을 각각 1회 더 주사하였다.

(2) 말초혈액의 회수

첫 번째 주사 3일 후에 토끼 귀 혈관에서 채혈한 말초 혈액을 10ml 분리하고, 이를 PBS로 2배 희석한 후 미리 튜브에 담아둔 Ficoll 위에 조심스럽게 얹었다 (Ficoll: 말초혈액= 1:1 v/v). 그 후 2200rpm에서 25분간 원심분리하였다. 아래로부터 적혈구층, ficoll층, 단핵세포층(mononuclear cell층), 혈장층 순으로 얻어지는 데, 최상층인 혈장층을 제거하고 단핵세포층 만을 분리하여 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 얻어진 단핵세포층에 PBS 30ml을 넣고 1500rpm, 5분간 원심분리를 하였다(washing step). 원심 분리후 가라 앉은 세포 펠렛을 EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza) 배지로 현탁하였다.

(3) EPC 선택적 배양

위에서 배지로 현탁한 세포를 피브로넥틴이 코팅된 100mm 디쉬 (Falcon)에 접종하고, EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza)에서 2주일간 배양하였다(5% CO₂, 37도). 배양 후 생성된 콜로니를 카운팅하고 그 결과를 도1에 나타내었다. 도1 나타난 바와 같이, PBS를 투여한 대조군의 말초혈액에서는 EPC가 거의 발견되지 않는 것에 반하여, SP를 정맥 투여한 후 얻은 말초 혈액 중에는 EPC의 양이 상당히 증가하였음을 확인하였다. 이는 SP의 EPC 이동 촉진 효과를 확인한 것이다.

(4) 분리·배양된 세포의 확인

1) 면역조직화학 염색

EPC 마커인 CD34, UEA를 사용하여 말초 혈액 중 EPC 존재 여부를 확인하기 위하여 상기 혈액으로부터 분리하여 배양한 EPC (2x10⁴ cells/well) 를 각각 CD34, UEA용 커버슬립에서 배양하였다. 24시간 동안 5% CO₂, 37도 인큐베이터에서 배양한 후, PBS로 세포를 세척하였다. 3.7% 파라포름알데히드로 고정한 후 세포를 다시 PBS로 세척하였다.

상기 세척한 세포를 20% Goat serum으로 블로킹하고 항-CD34 항체를 실온에서 1시간 동안 처리하였다. PBS로 다시 세포를 세척하고 FITC-결합 항-마우스 IgG를 실온에서 1시간동안 처리하였다. 여분의 항체 제거를 위해 PBS로 세포를 세척하고 DAPI로 대비염색(counterstaining) 후 마운팅(mounting)하였다. 마운팅 후 형광 현미경 (leica)으로 발현을 관찰하였다. 이를 관찰한 사진을 도2에 나타내었다 (도2A).

상기 세척한한 세포를 20% Goat serum으로 블로킹하고 UEA-비오틴을 실온에서 1시간 동안 처리였다. PBS로 다시 세포를 세척하고 스트렙타비딘 (Streptavidin)-FITC를 실온에서 1시간 동안 처리하였다. PBS로 세포를 세척하고 DAPI로 대비염색 후 마운팅하였다. 마운팅 후 형광 현미경(leica)으로 발현을 관찰하였다. 이를 관찰한 사진을 도2에 나타내었다 (도2B).

SP 대신 PBS를 투여한 대조군에 대하여 위와 동일한 과정을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다 (도2C). 음성 대조군으로 이차 항체를 처리하여 발현 여부를 확인하였다. (도2C)

도2에 나타난 바와 같이 SP 정맥 투여 후 얻은 말초 혈액 중에 EPC가 다량 포함되어 있음이 확인할 수 있었다.

2) in-vitro 튜브 생성능력 확인

혈액으로부터 분리하여 배양한 EPC의 혈관 생성능을 확인하기 위해 세포를 Matrigel (BD)에서 배양하였다. Matrigel을 96well plate 각 well에 200 마이크로리터씩 넣고 37도에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 Matrigel이 들어있는 각 웰에 2x10⁴ cell씩 넣고 12시간 동안 배양하였다. 그 후 현미경으로 튜브 형성 여부를 관찰하였다. 그 결과를 도4에 나타내었다 (도4A). 중배엽 줄기세포(MSC)의 경우 위와 동일하게 배양하는 경우 도4B에 나타난 바와 같이 군집을 형성하였다. SP 정맥 투여 후 얻은 말초혈액 중에 포함된 EPC의 혈관생성 능력을 확인할 수 있었다.

3) in-vivo 혈관 생성능력 확인

누드 balb/c 마우스를 각 그룹당 3마리씩 준비하였다. 스킨에 8mm biopsy punch로 상처를 만들어 진피와 상피를 모두 제거하였다. 상처 후 3일째에 준비된 EPC를 마리당 1x10⁶ cell씩 이식하였다.

세포를 준비한 후 각각 형광 물질로 표지한다. 이 세포를 하이드로겔로 현탁하여 잘 섞이도록 한다. 이 하이드로겔은 폴록사머 또는 콜라겐이 첨가된 하이드로겔 형태로 체내에 이식시 반고체 형태로 굳는다. 하이드로겔에 섞인 세포를 상처 부위에 이식한다.

컨트롤은 세포 없이 하이드로겔만을 도포하였다.

드레싱은 메피텔과 테가덤으로 하였다. 이식 후 1주일째 마우스를 희생하고 피부 샘플을 분리하였다. 상처 재생정도와 혈관 생성능을 보기위해 스킨 조직을 ㅍ파라핀 절단하고 그 단면을 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신으로 염색하였다. 염색 후 혈관 생성 여부를 관찰하고, 상피와 진피 조직의 재생여부는 image J 프로그램을 이용하여 정량하였다.

그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다. 도4는 마우스의 피부 상처(skin wound) 부위를 나타낸 사진이고, 도5는 상처 부위의 스킨 조직의 단면을 나타낸 사진이다. 도5에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 혈관이 전혀 형성되지 않았지만 SP 정맥 투여 후 말초혈액에서 얻어 배양한 EPC를 이식한 마우스의 스킨 조직에서는 혈관이 형성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도6에 나타난 바와 같이, 상피 이동(epithelial migration)이 다량 일어났으며, 상피와 진피의 재생이 보다 신속히 진행됨을 확인할 수 있었다.

즉, SP를 투여한 마우스로부터 얻은 말초혈액으로부터 배양한 EPC 투여한 군의 진피부분에 혈관이 많이 형성되고, 상피와 진피의 재생정도가 가속화됨이 확인되었다.

실시예 2. SP 의 골수 내 투여에 의한 EPC 이동 촉진 효과의 확인

(1) SP 골수 투여 후 골수천자액 내 EPC 확인

1) SP의 골수 투여

토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=4)를 케타라 (50mg/ml 유한양행) 및 럼푼 (Xylazine hydrochloride, 23.32mg/ml, 바이엘코리아 주식회사)을 2:1로 섞은 다음 총 900 마이크로리터 (케타라 600 마이크로리터: 럼푼 300 마이크로리터)를 근육에 주사하였다. 근육 주사 5분 후 동일한 마취제 (케타라 200 마이크로리터: 럼푼 100 마이크로리터)를 토끼 귀의 정맥에 주사하고, 완전히 마취가 된 후 투여를 시작하였다. 오른쪽 골반골 후극돌기(iliac crest)에 SP (Sigma, 4nmole/kg in saline)를 18G spinal needle을 이용하여 주사 부피를 0.1 ml 로 하여 주사하였다.

음성 대조군으로 다른 그룹에 1×PBS 1ml을 왼쪽 골반골 후극돌기 (iliac crest)에 18G spinal needle을 이용하여 주사 부피를 0.1 ml로 하여 주사하였다.

양성 대조군으로 오른쪽 골반골 후극돌기(iliac crest)에 G-CSF (CJ pharma, 류코카인-주 150; 2.5㎍/kg)를 18G spinal needle을 이용하여 주사 부피를 0.1 ml로 하여 주사하였다.

상기 투여 24시간 후 동량을 각각 1회 더 주사하였다.

2) 골수 천자액의 회수

주사 24시간 후에 골수에서 골수천자액(Bone marrow aspirate) 4ml을 분리하여 이를 PBS로 2배 희석한 후 미리 튜브에 담아둔 Ficoll (GE Health care) 위에 조심스럽게 얹었다 (Ficoll:bone marrow aspirate= 1:1 v/v). 그 후 2200rpm에서 25분간 원심분리하였다. 아래로부터 적혈구층, ficoll층, 단핵세포층(mononuclear cell층), 혈장층 순으로 얻어지는 데, 상기 혈장층 제거한 후 단핵세포층 만을 분리하여 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 얻어진 단핵세포층에 PBS 30ml을 넣고 다시 원심분리를 하였다(washing step).

3) EPC 선택적 배양

상기 분리된 세포를 피브로넥틴(Fibronectin)이 코팅된 100mm 디쉬 (Falcon)에 접종하고, EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza)에서 1주일간 배양하였다(5% CO₂, 37도). 배양 후 CFU를 측정하여 음성 대조군인 PBS를 주사한 그룹 및 양성 대조군인 G-CSF를 주사한 그룹과 비교하였다. 그 결과 증가한 정도를 fold로 비교하여 도7에 나타내었다.

음성 대조군에 비해 EPC 이동 인자로 알려져 있는 G-CSF를 투여한 군에서 이동된 EPC의 양이 약 4배 정도 더 증가한 데 비해, 본 발명의 조성물인 SP를 투여한 군에서는 음성 대조군에 비해서 약 10~12배, 양성 대조군인 G-CSF 투여 군에 비해서도 약 3배의 EPC 이동 촉진 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

(2) SP 골수 투여 후 말초혈액 내 EPC 확인

1) 골수 투여

토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=3)에 케타라 (50mg/ml 유한양행)과 럼푼 (Xylazine hydrochloride, 23.32mg /ml, 바이엘코리아 주식회사)을 2:1로 섞은 다음 총 900 마이크로리터 (케타라 600 마이크로리터: 럼푼 300 마이크로리터)를 근육에 주사하였다. 근육 주사 10분 후 동일한 마취제 (케타라 200 마이크로리터: 럼푼 100 마이크로리터)를 토끼 귀의 정맥에 주사하고, 완전히 마취가 된 후 투여를 시작하였다.

한 그룹에는 SP 를 생리식염수에 용해시켜 SP(Sigma, 4nmole/kg in saline)를 오른쪽 골반골 후극돌기(iliac crest)에 18G spinal needle을 이용하여 주사 volume을 0.1 ml로 하여 주사하였다.

음성 대조군으로 다른 그룹에 1ㅧPBS 1ml을 왼쪽 골반골 후극돌기 (iliac crest)에 18G spinal needle을 이용하여 주사 부피를 0.1 ml로 하여 주사하였다.

상기 투여 24시간 후 동량을 각각 1회 더 주사하였다.

2) 말초혈액 회수

첫 번째 주사 3일 후에 채혈한 말초 혈액을 10ml 분리하고, 이를 PBS로 2배 희석한 후 미리 튜브에 담아둔 Ficoll 위에 조심스럽게 얹었다 (Ficoll: 말초혈액= 1:1 v/v). 그 후 2200rpm에서 25분간 원심분리하고, 최상층인 혈장층 제거하고 단핵세포층 만을 분리하여 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 얻어진 단핵세포층에 PBS 30ml을 넣고 1500rpm, 5분간 원심분리를 하였다(세척 단계).

3) EPC 선택적 배양

상기 분리한 세포를 EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza) 배지로 ㅎ현탁한 후, 현탁한 세포를 피브로넥틴이 코팅된 100mm 디쉬 (Falcon)에 접종하고, EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza)에서 2주일간 배양하였다(5% CO₂, 37℃).

비교실험예 1

(1) SP와 G-CSF의 정맥 투여 후 말초혈액 내 세포 프로파일 비교

1) 정맥 투여 후 말초혈액 내 EPC 이동 촉진 효과 비교 (EPC 콜로니 생성 비교)

실시예 1의 (1)에 기재된 것과 동일한 방법으로 한 그룹(토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=3))에 대해여 SP를, 다른 그룹(토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=3))에 대하여 양성대조군으로 G-CSF(CJ pharma, 류코카인-주 150; 2.5㎍/kg)를 0.1ml 각각 투여 후 1일, 2일, 3일째 5ml - 15ml 만큼 양의 말초혈액을 분리한 후 이를 PBS로 2배 희석한 후 미리 튜브에 담아둔 Ficoll 위에 조심스럽게 얹었다 (Ficoll: 말초혈액= 1:1 v/v). 그 후 2200rpm에서 25분간 원심분리하고, 최상층인 혈장층 제거하고 단핵세포층 만을 분리하여 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 얻어진 단핵세포층에 PBS 30ml을 넣고 1500rpm, 5분간 원심분리를 하였다(세척 단계). EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza) 배지로 suspension한 세포를 피브로넥틴이 코팅된 100mm 디쉬 (Falcon)에 접종하고, EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza)에서 2주일간 배양하였다(5% CO₂, 37도). 배양 후 생성된 콜로니를 톨루이딘 블루(toluidin blue)로 염색하여 계수하였다.

그 결과를 도8에 나타내었다. 도8에 나타난 바와 같이, G-CSF 정맥 투여의 경우 첫째날 말초혈액 내 EPC가 일시적으로 증가하였다가 둘째날 이후 EPC가 말초혈액 내에서 발견되지 않았던 것에 반하여, SP 정맥 투여의 경우 말초혈액 내 EPC의 양이 지속적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. G-CSF와 달리 SP는 정맥 내 투여시 장기간에 걸쳐 말초혈액으로의 우수한 EPC 이동 촉진 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

2) 정맥 투여 후 말초혈액의 전 혈액 세포수(CBC: Complete Blood Cell Counting) 비교

위의 SP, G-CSF 정맥 투여 후 1일, 2일, 3일째 얻은 말초 혈액 1ml을 EDTA가 포함된 바이얼에 넣고 응고되지 않도록 잘 섞어주었다. 혈중 세포로부터 EPC 분리 실험 시 동일한 조건에서 혈액 1ml에 대한 전 혈액 세포수를 로얄 ARC(한국)에 의뢰하여 계수하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, G-CSF는 염증 세포인 호중구(neutrohil)와 단핵백혈구(monocyte)를 현저히 증가시켰으나, SP의 경우 PBS를 투여한 대조군과 유사한 염증 세포 프로파일을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, SP는 염증세포의 이동을 유발하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, SP는 염증 유발과 같은 부작용 없이 EPC 만을 특이적으로 이동시키는 것을 확인하였다.

(2) SP와 G-CSF의 골수 투여 후 말초혈액 내 세포 프로파일 비교

1) 골수 투여 후 말초혈액 내 EPC 이동 촉진 효과 비교 (EPC 콜로니 생성 비교)

실시예 2의 (2)에 기재된 것과 동일한 방법으로 한 그룹(토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=3))에 대해여 SP를, 다른 그룹(토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=3))에 대하여 양성대조군으로 G-CSF(CJ pharma, 류코카인-주 150; 2.5㎍/kg)를 0.1ml 각각 투여 후 1일, 2일, 3일째 5ml - 15ml 만큼 양의 말초혈액을 분리한 후 이를 PBS로 2배 희석한 후 미리 튜브에 담아둔 Ficoll 위에 조심스럽게 얹었다 (Ficoll: 말초혈액= 1:1 v/v). 그 후 2200rpm에서 25분간 원심분리하고, 최상층인 혈장층 제거하고 단핵세포층 만을 분리하여 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 얻어진 단핵세포층에 PBS 30ml을 넣고 1500rpm, 5분간 원심분리를 하였다(washing step). EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza) 배지로 suspension한 세포를 피브로넥틴이 코팅된 100mm 디쉬 (Falcon)에 접종하고, EGM-2 (Endothelial growth medium-2, Lonza)에서 2주일간 배양하였다(5% CO₂, 37도). 배양 후 생성된 콜로니를 톨루이딘 블루(toluidin blue)로 염색하여 계수하였다.

그 결과를 도10에 나타내었다. 도10에 나타난 바와 같이, 골수에 직접 투여한 경우 SP는 C-CSF와 비교하여 빠른 EPC 이동 촉진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

2) 골수 투여 후 말초혈액의 전 혈액 세포수(CBC: Complete Blood Cell Counting) 비교

위의 SP, G-CSF 골수 투여 후 1일, 2일, 3일째 얻은 말초 혈액 1ml을 EDTA가 포함된 바이얼에 넣고 응고되지 않도록 잘 섞어주었다. 혈중 세포로부터 EPC 분리 실험 시 동일한 조건에서 혈액 1ml에 대한 전 혈액 세포수를 로얄 ARC에 의뢰하여 계수하였다. 그 결과를 도11에 나타내었다.

도11에 나타난 바와 같이, G-CSF는 염증 세포인 호중구, 호산구 (eosinophil), 단핵백혈구를 현저히 증가시켰으나, SP는 상대적으로 염증 유발과 같은 부작용 없이 줄기세포만을 특이적으로 이동시키는 것을 확인하였다.

Claims

골수로부터 혈관내피전구세포의 이동을 유발하기 위한 유효량의 서브스턴스-P를 포함하는 혈관내피전구세포의 이동 촉진제.
제1항에 있어서, 혈관내피전구세포의 이동은 골수로부터 혈액으로의 이동인 혈관내피전구세포의 이동 촉진제.
제1항에 있어서, 혈관내피전구세포의 이동은 골수로부터 손상된 혈관으로의 이동인 혈관내피전구세포의 이동 촉진제.
제3항에 있어서, 혈관내피전구세포가 골수로부터 손상된 혈관으로 이동하여 혈관형성(vasculogenesis)에 참여하는 혈관내피전구세포의 이동 촉진제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 골수내투여, 정맥투여, 피하투여, 또는 복강투여용인 혈관내피전구세포의 이동 촉진제.
제5항에 있어서, 정맥투여용인 혈관내피전구세포의 이동 촉진제.
서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈관형성(vasculogenesis) 촉진용 조성물.
제7항에 있어서, 허혈성 혈관 손상 또는 외상성 혈관 손상의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
제8항에 있어서, 심근경색, 협심증, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 및 당뇨성 궤양로부터 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 골수내투여, 정맥투여, 피하투여, 또는 복강투여용인 조성물.
제10항에 있어서, 정맥투여용인 조성물.