KR20050113344A

KR20050113344A - 악성 종양이 있는 환자의 혈구로부터 수지상 세포를 제조하는 방법 및 상기 수지상 세포를 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR20050113344A
Application number: KR1020040037943A
Authority: KR
Inventors: 이대희
Original assignee: 이대희
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2005-12-02
Also published as: KR100562274B1

Abstract

본 발명은 (a) 악성 종양이 있는 환자에게 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 3일 동안 투여하여 상기 환자의 골수에서 생성된 조혈모세포(peripheral blood stem cells)를 말초 혈류로 가동화(mobilization)함으로써 골수의 조혈 기능을 촉진시키는 단계; (b) 상기 말초 혈액으로부터 조혈모세포가 포함된 백혈구(blood corpuscles)들을 채집 및 분리하는 단계; 및 (c) 섬유 근육통 증후군 관련 티로신 키나제 3-리간드(Flt3-ligand), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-4(IL-4) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 사용하여, 상기 분리된 혈구 세포를 체외에서(in vitro) 수지상 세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 수지상 세포(dendritic cells)의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 수지상 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 수지상 세포 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 악성 종양(malignant tumors)의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는 말초 혈구 세포를 CD34⁺ 세포, 단핵구, 중성구 등으로 분리하지 않고도 모두에 대해 Flt3-ligand, GM-CSF(CSF2), IL-4 및 TNF-α를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 사용하여 수지상 세포로 분화 유도할 수 있다.

Description

악성 종양이 있는 환자의 혈구로부터 수지상 세포를 제조하는 방법 및 상기 수지상 세포를 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물{A PROCESS OF PREPARING DENDRITIC CELLS FROM BLOOD CORPUSCLES OF PATIENT SUBJECTED TO MALIGNANT TUMOR, AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS SAID DENDRITIC CELLS AS EFFECTIVE INGREDIENT}

본 발명은 수지상세포(dendritic cells)를 이용하여 악성 종양을 치료하기 위하여 제안된 것으로서, 구체적으로는 환자의 말초 혈액으로부터 분리한 조혈모세포가 포함된 백혈구들(leukocytes)을 체외에서(in vitro) 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 가하여 분화 유도한 수지상세포 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수지상세포 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 악성 종양(간암, 위암, 갑상선암, 백혈병 등을 포함함)의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

종래 간암, 위암, 백혈병 환자 등 종양 환자에 대해 쓰이던 외과적 수술, 항암, 화학요법(chemotherapy), 방사선 치료에 의한 종양 환자의 생존율은 별로 개선되지 못했다. 더욱이, 치료된 환자의 약 50%는 다시 재발되거나 전이되어서 대부분 사망했다(문헌[Jourdan JL, Cannan R, Stubbs R : Hepatic resection for metastases in colorectal carcinoma. NZ Med J 112 : 91-93, 1999] 참조). 급성 골수성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL)의 경우에도 항암 요법에 의한 완해(緩解) 유도 후 타인의 조혈모세포를 이식하는 방법이 현재까지 알려진 가장 효과적인 치료법이다. 그러나, 주조직 적합성(major histocompatibility)이 일치하는 골수 공여자를 구하기가 어렵고 설령 공여자를 구했다고 하더라도 이식된 골수가 제 기능을 발휘해서 완전히 환자의 건강이 회복되기까지 약 1년 동안 집중적인 치료와 관리를 받아야 하는 문제점이 있다. 그럼에도 불구하고 급성 백혈병 환자의 3년 생존율은 첫 번째 완해 유도 후 골수 이식을 한 경우 30-60%에 불과하다. 최근에는 자가 조혈모 이식이 증가하고 있는데 이 치료법은 이식된 세포 중에 종양 세포가 오염되어 있을 가능성이 있다는 문제점이 있다.

종래의 외과적 절제 또는 방사선 치료 또는 골수 이식 치료법의 경우 혈류나 림프관을 통하여 원격 장기에 미세전이(micrometastasis) 병변이 남아 있을 수 있으며, 이들 잠복하여 있는 잔류 종양세포들이 다시 증식을 재개함에 따라 대부분의 악성종양 환자들은 평균 10년 내에 재발되어서 사망하게 된다. 또한 항암 화학치료는 골수의 파괴에 의한 조혈 기능의 억제로 인한 부작용 및 종양 세포의 항암제 내성의 발현 등으로 사실상 종양의 완치가 불가능하다.

그 결과 종양 환자에 대한 새롭고 효과적인 전신적인 치료법을 개발해야 할 필요성에 따라 면역 치료법이 개발되고 있다.

면역 치료법은 면역 체계가 종양을 인지하고 공격하는 능력이 있음을 이용한 치료법이다. 이를 이용하여 면역 감시 체계에 근간을 두는 항종양 백신의 개발로서 현재까지 합성 펩타이드 백신, 유전자 백신, 열충격 단백질 백신 등 다양한 방안이 고안되었으나, 항원 제시 세포(antigen presenting cell)를 이용한 방법이 가장 효과적인 것으로 손꼽히고 있다.

그 중에서도 수지상 세포는 생체 내의 가장 강력하고 중요한 항원 제시 세포이므로 항종양 백신 뿐만 아니라 면역 반응이 관여하는 대부분의 질환에서 그 응용 가치가 매우 높다고 할 수 있다. 최근의 연구 결과에 의하면 종양 환자의 체내에 존재하는 성숙한 수지상 세포에서 항원 제시 기능에 결함이 있다는 보고가 있는데 이러한 항원 제시 기능의 장애는 체외에서 환자의 혈구 세포를 수지상 세포로 유도 분화시킨 후 수지상 세포에 고농도의 종양 관련 항원을 감작(인식)시킨 후에 다시 환자에게 재주입하는 수지상 세포를 사용한 항암 요법에 의해 치료될 수 있을 것이다.

그러나, 아직까지 수지상 세포를 이용한 면역 치료법의 표준화는 이루어지지 않고 있으며, 각 연구 기관별로 그 효과를 극대화하고 조절을 용이하게 하기 위한 여러 가지 방법을 발굴하고 있다.

수지상 세포는 다양한 계대(lineages)에서 유래됨이 알려져 있으나, 보통 수지상 세포는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)로 자극된 단핵구 또는 단핵구 전구체(CD34+ cell)를 유도 분화시켜서 사용한다. 전통적인 혈구 분리 방법으로는 수지상세포의 형태학적 특성 때문에 수지상세포의 기능이 보존된 상태로 분리할 수 없다는 어려움 때문에 조혈모세포나 미분화 세포에서 수지상 세포로의 분화를 유도할 수 있는 방법이 모색되고 있다.

수지상 세포는 성숙해 감에 따라 면역 반응이 유발되는데 수지상 세포의 계통은 그들이 상주하는 해부학적인 구획에 따라 4 단계로 구분할 수 있다. 전구 세포는 골수와 혈액에, 미성숙 수지상 세포는 말초의 림프 조직이 아닌 곳에, 성숙 단계 과정으로 이동 중인 수지상 세포는 유입성 림프액과 혈액에, 그리고 성숙한 수지상 세포는 2차 림프조직에 존재한다. 전구 세포는 골수에서 기원하여 혈액으로 들어가서 림프 조직이 아닌 곳에 산재하면서 미성숙 수지상 세포로 분화해 간다.

미성숙 수지상 세포는 항원의 포획과 처리, 주조직 적합체의 생산, 그리고 주조직 적합체-외부 펩타이드의 결합을 생성할 수 있는 능력이 있으나 T세포를 활성화시키는 기능은 거의 없다.

2차 림프 조직으로 이동해 온 수지상 세포는 MHC class I 및 II, leukocyte function associated-3 antigen(LFA-3), CD54, CD40, CD80 및 CD86과 같은 세포 표면 항원과 보조 자극 분자(costimulatory molecule)의 발현 또는 발현의 증가와 두 종류의 CC 케모카인(chemokine) 수용체, CCR1과 CCR5의 발현 감소로 1차 T 세포의 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 가지게 된다.

성숙 단계에서 수지상 세포는 IFN-α와 IL-12를 생성하고 다른 대식세포 염증 단백질-1γ[macrophage inflammatory protein (MIP)-1γ], IL-1, IL-6 및 IL-15들과 함께 1차적인 면역 반응을 유발한다.

수지상 세포에 의해 자극받은 CD4 헬퍼(helper) T 세포는 사이토카인을 분비하여 종양이 있는 병소에서 세포독성 T 세포 뿐만 아니라 자연 살해 세포(natural killer cell), 항원 제시 세포 및 다른 염증 세포들을 활성화시킨다.

이러한 수지상 세포로의 분화와 성장은 각종 사이토카인 등 여러 요소에 의해서 조절된다. 세균이나 염증 반응 산물, 세균의 세포벽 성분인 다당류, IL-1, GM-CSF(CSF2), TNF(종양 괴사 인자)-α 등은 모두 수지상 세포의 성숙을 촉진시킨다. 특히 c-키트 리간드(c-kit ligand)와 섬유 근육통 증후군 관련 티로신 키나제 3-리간드(Flt-3 ligand)는 기질 세포(stromal cells) 표면에 있는 막횡단 단백질(transmembrane protein)로서 티로신 키나제(tyrosine kinase) 수용체와 결합해서 미성숙한 수지상 세포를 지지한다. 활성 상태의 T세포나 다른 세포들의 산물인 GM-CSF나 IL-3 또한 수지상 세포로의 분화를 촉진하고 TNF는 골수구로의 분화 경로를 차단해서 수지상 세포로의 성숙을 촉진한다.

대한민국 공개특허 10-2003-0084826에서는 사람의 말초혈액으로부터 단핵구(mononuclear cells)를 분리한 후 CD+14단구(monocyte)를 분리하여 이를 수지상 세포로 유도하고 있다. 또한 대한민국 공개특허 10-2004-0002409에서도 CD11b-/CD8a + /CD86-등을 분리한 후 이에 사이토카인을 가하여 수지상 세포로 분화 유도하고 있다.

그러나 이런 종래 기술의 경우 목적하는 단구(monocyte)의 분리를 위한 추가 과정이 필요하게 되며 그 과정에서 많은 백혈구의 유실이 발생한다.

본 발명은 종양 환자의 치료를 위해 환자의 혈액을 이용하여 특정 혈구(blood corpscles)를 분리하지 않고 다양한 혈구로부터 체외에서 수지상 세포로 유도 분화시키며 동시에 백혈구 농축액에 혼재되어 있는 림프구들을 종양항원에 대하여 활성화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 유도된 수지상 세포를 포함한 백혈구들을 유효 성분으로 하는 악성 종양의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 수지상 세포는, (a) 악성 종양이 있는 환자에게 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 3일 동안 투여하여 상기 환자의 골수에서 생성된 조혈모세포(peripheral blood stem cells)를 말초 혈류로 가동화(mobilization)함으로써 골수의 조혈 기능을 촉진시키는 단계; (b) 상기 말초 혈액으로부터 조혈모세포가 포함된 백혈구(blood corpuscles)들을 채집 및 분리하는 단계; 및 (c) 섬유 근육통 증후군 관련 티로신 키나제 3-리간드(Flt3-ligand), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-4(IL-4) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 사용하여, 상기 분리된 혈구 세포를 체외에서(in vitro) 수지상 세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.

상기 단계들을 보다 자세히 설명하면 단계 (a)에서는 조혈 기능을 촉진하는 단계로 종양 환자에게 5 ㎍/㎏/day의 용량으로 G-CSF를 3일 동안 피하주사로 투여하였다. 또한 백혈구를 수지상세포로 유도분화를 시킨 후 인식(감작)시킬 표적항원을 채취하기 위하여 환자의 말초혈에서 전혈 20ml을 채혈하여서 혈청을 냉동보관한다.

단계 (b)에서는 혈류 1 ml당 5-10 개(백혈구 10⁹개가 1 ml에 해당)가 존재하는 백혈구(white blood corpuscles)와, 조혈모세포 그리고 현재의 기술로는 분리에 한계가 있어서 섞여 들어온 적혈구들이 농축된 50 ml의 시료와 종양환자의 체내의 혈류에 존재하는 종양관련 항원물질을 채집하기 위하여 말초 혈액 조혈모세포의 수를 측정하고 체중 1 ㎏당 3.3 x 10⁶ 의 말초 혈액 조혈모세포를 항응고 시트레이트 덱스트로오스 제제 A(anticoagulant citrate dextrose formula A, ACD-A)와 Baxter사(Deerfield, IL. USA)의 혈액 세포 분리기(blood cell saparator)(CS-3000 Plus)를 사용하여 말초혈액 약 5,000-10,000 ml을 재순환시키면서 채집한다.

단계 (c)에서는 채집된 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구가 농축된 환자의 말초 혈액 10 mL씩을 X-VIVO 20 배양액 10 ml로 희석한 후 Histopaque-1077 20 mL이 담긴 50 mL 튜브에 조심스럽게 얹은 후 1,800 rpm에서 20분간 원심분리하여 계면층의 백혈구를 파스퇴르 피펫으로 분리하였다. 얻어진 백혈구세포 분획에 인산염 완충 식염수(Phosphate buffered saline)를 섞어 25 mL로 만들고 혈구계로 세포수를 계산한 후 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 세척한 후 상층액은 종양과 관련된 표적항원 감작(인식)용으로 사용하기 위하여 냉동보관하였다.

단계 (d)에서는 환자의 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cells)가 포함된 백혈구(blood corpuscle)들에 대한 1차 배양 단계로 세포가 증식기에 도달할 때까지 배양용 플라스크(T-25cm²)를 사용하여 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 X-VIVO 20 배지를 사용하여 배양한다.

1차 배양이 끝난 말초 혈액 조혈모세포에 대해서 1.5 x 10⁶/ml의 농도로 배양용 플라스크(T-75cm²)에 분주하고 각각 최종 농도 25-50 ng/ml의 Flt3-ligand, 50 ng/ml-1 mg/ml의 GM-CSF(CSF2)와 25 ng/ml의 IL-4 그리고 10 ng/ml의 TNF-α의 cytokines cocktail이 추가로 포함된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 배양해서 수지상세포로 유도 분화시킨다.

배양된 수지상 세포의 검사

유도 분화된 수지상 세포의 표현형을 검사하기 위하여 CD1a, CD83, CD86, 단클론 항체(monoclonal antibodies)를 사용한 형광 현미경법(Fluorescence Microscopy)을 실행하여 세포 표면 항원을 검사한다. 배양 배지 상에서 위상차 현미경을 사용하여 관찰하고, 보다 상세한 세포 구조를 관찰하기 위해서는 김사(Giemsa) 염색을 하거나 전자현미경을 사용한다.

(실시예)

하기 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 상술한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되는 것일 뿐이므로, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 범주가 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1 - 간암 환자로부터 수지상 세포의 분화 유도 및 수지상 세포의 재주입과 평가

실시예 1-1 골수에서 말초 혈액으로의 조혈모세포의 가동화(mobilization) 및 조혈모세포와 백혈구 채집

수지상세포를 사용한 면역 요법에 대해 환자와 보호자에게 충분히 설명하고 서면으로 동의를 받은 후 62세 남자로서 간 우엽에 산재성 간세포 암 진단 후 경동맥 혈관 색전술을 1회 받은 환자에게 5 ㎍/㎏/day의 용량으로 G-CSF를 3 일 동안 투여하고 백혈구를 수지상세포로 유도분화를 시킨 후 인식시킬 표적항원을 채취하기 위하여 환자의 말초혈에서 전혈 20ml을 채혈하여서 혈청을 냉동보관한다. 그 후 말초 혈액 조혈모세포의 수를 측정하고 체중 1 ㎏당 3.3 x 10⁶ 의 말초 혈액 조혈모세포와 함께 백혈구가 농축된 50 ml의 시료를 항응고 시트레이트 덱스트로오스 제제 A(anticoagulant citrate dextrose formula A, ACD-A)와 Baxter사(Deerfield, IL. USA)의 혈액 세포 분리기(CS-3000 Plus)를 사용하여 채집했다.

실시예 1-2 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구의 분리

채집된 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구가 농축된 환자의 말초 혈액 10 mL씩을 X-VIVO 20 배양액 10 ml로 희석한 후 Histopaque-1077 20 mL이 담긴 50 mL 튜브에 조심스럽게 얹은 후 1,800 rpm에서 20분간 원심분리하여 계면층의 조혈모세포와 백혈구를 파스퇴르 피펫으로 분리하였다. 얻어진 조혈모세포와 백혈구 분획에 인산염 완충 식염수(Phosphate buffered saline)를 섞어 25 mL로 만들고 혈구계로 세포수를 계산한 후 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 세척한 후 상층액은 종양과 관련된 표적항원 인식용으로 사용하기 위하여 냉동보관하였다.

실시예 1-3 1차 세포 배양

실시예 1-1에서 채집되고 1-2에서 분리된 환자의 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구를 배양용 플라스크(T-25cm²)를 사용하여 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 X-VIVO 20 배지를 사용하여 세포가 증식기에 도달할 때까지 1차 배양했다.

실시예 1-4 수지상 세포의 분화 유도

상기 실시예 1-3에서 1차 배양이 끝난 말초 혈액 조혈모세포에 대해서 1.5 x 10⁶/ml의 농도로 배양용 플라스크(T-75cm²)에 분주하고 각각 최종 농도 25-50 ng/ml의 Flt3-ligand, 50 ng/ml-1mg/ml의 GM-CSF(CSF2)와 25 ng/ml의 IL-4 그리고 10 ng/ml의 TNF-α가 추가로 포함된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 10 일간 배양해서 수지상세포로 유도 분화시켰다. 배양액은 매 3-4일마다 교환하였고 그때마다 상기의 cytokine을 같은 농도가 되도록 첨가하였다. 이때 교환한 이전의 배양액 내에 존재하는 백혈구들은 버리지 않고 새로운 배양 플라스크에 옮겨서 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 배양해서 수지상세포를 주입할 때 환자에게 다시 투여하였다.

실시예 1-5 유도된 수지상 세포의 관찰

3 일간 배양했을 때 방추상으로 수상 돌기가 세포 표면으로부터 나타나기 시작하였으며(도 2) 6일 동안 배양했을 때 여러 개의 긴 수상 돌기를 가진 수지상 세포로 분화되기 시작하였고(도 3) 12일 동안 배양했을 때 배양용 플라스크(T-75cm²) 바닥은 분화된 수지상 세포로 덮혔다(도 4). 이들 분화된 수지상 세포의 수는 8 x 10⁷개였다. 환자에게 수지상세포를 포함한 백혈구들을 투여하기 하루 전에 분화된 수지상세포에 추가로 종양항원과 관련된 표적항원을 인식(감작)시키기 위하여 환자의 전혈에서 채취하여 냉동보관해둔 5ml 씩의 혈청과 실시예 1-2에서 냉동보관해 둔 혈구를 세척한 상층액 5ml 씩을 각각 배양 플라스크(T-75cm²)에 투입한다.

실시예 1-6 제조된 수지상세포의 재주입 및 임상 평가.

분화된 수지상세포를 환자의 체중 1 kg당 1 × 10⁶- 3 × 10⁶를 80ml의 생리식염수에 현탁시켜서 정중 전완 정맥(median antebrachial vein)으로 약 2 시간에 걸쳐 주입했다. 재 주입하고 고열, 구토 등의 전신 증상이나 혈청 albumin, GOT, GPT, BUN, 크레아티닌(Creatinine) 등의 검사 결과에 이상 소견은 없었고, 4주가 경과한 후 CD3, CD4, CD8, CD4:CD8 비, CD56(NK), 그리고 자연 살해 세포의 활성을 측정하여 면역 치료를 하기 이전의 측정치와 비교하였으며(표 1) 면역 치료 기간 동안 부작용이나 치료 과정에 있어서의 문제점과 치료 결과에 대한 임상 평가를 실행하였다.

표 1. 수지상세포를 사용한 면역치료 실시 전후의 환자의 말초혈액에 존재하는 T 세포와 자연 살해 세포(NK cell)의 상대적 비율 및 NK 세포의 활성

	치료 전	치료 후
CD3(%)	43.5	49.0
CD4(%)	28.2	27.7
CD8(%)	16.2	22.0
CD4 : CD8	1.74 : 1	1.26:1
CD56(%)	14.8	12.4
NK 세포의 활성(%)	15.7	28.9

표 1에서 보는 것처럼 치료 전에 비해 CD3와 CD8의 비율이 증가하였고 자연살해 세포의 활성이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 간암 환자의 말초혈액에서 분리된 조혈모세포와 백혈구를 Flt3-ligand, GM-CSF, IL-4, TNF-α 첨가된 배지에서 배양하여 분화된 다량의 수지상 세포를 환자에게 주입하였을 때 종양세포를 공격하는 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocytes) 수를 반영하는 CD8과 전체 T 세포의 수를 나타내는 CD3의 비율과 전체적인 숫자가 증가하며, 이러한 T 세포들의 공격 활성과 함께 NK 세포(Natural killer cells, 자연살세포)의 활성도 약 2 배이상 상승함으로써 수지상세포를 사용한 면역 치료가 환자의 체내의 면역기능을 촉진하여 실제로 탁월한 임상적 효과를 발휘한다는 것을 알 수 있다. 또한 이러한 치료 효과는 매달 1회씩 5회 연속 약 6개월간 치료 시 기하급수적으로 상승한다.

실시예 2 - 위암 환자로부터 수지상 세포의 분화 유도 및 수지상 세포의 재주입

실시예 2-1 골수에서 말초 혈액으로의 조혈모세포의 가동화(mobilization) 및 조혈모세포와 백혈구 채집

수지상세포를 사용한 면역 요법에 대해 환자와 보호자에게 충분히 설명하고 서면으로 동의를 받은 후 38세 남자로서 위암 진단 후 항암 화학요법을 5회 받은 환자에게 5 ㎍/㎏/day의 용량으로 G-CSF를 3 일 동안 투여하고 백혈구를 수지상세포로 유도분화를 시킨 후 인식시킬 표적항원을 채취하기 위하여 환자의 말초혈에서 전혈 20ml을 채혈하여서 혈청을 냉동보관한다. 그 후 말초 혈액 조혈모세포의 수를 측정하고 체중 1 ㎏당 3.3 x 10⁶ 의 말초 혈액 조혈모세포와 함께 백혈구가 농축된 50 ml의 시료를 항응고 시트레이트 덱스트로오스 제제 A(anticoagulant citrate dextrose formula A, ACD-A)와 Baxter사(Deerfield, IL. USA)의 혈액 세포 분리기(CS-3000 Plus)를 사용하여 채집했다.

실시예 2-2 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구의 분리

채집된 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구가 농축된 환자의 말초 혈액 10 mL씩을 X-VIVO 20 배양액 10 ml로 희석한 후 Histopaque-1077 20 mL이 담긴 50 mL 튜브에 조심스럽게 얹은 후 1,800 rpm에서 20분간 원심분리하여 계면층의 조혈모세포와 백혈구를 파스퇴르 피펫으로 분리하였다. 얻어진 조혈모세포와 백혈구 분획에 인산염 완충 식염수(Phosphate buffered saline)를 섞어 25 mL로 만들고 혈구계로 세포수를 계산한 후 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 세척한 후 상층액은 종양과 관련된 표적항원 인식(감작)용으로 사용하기 위하여 냉동보관하였다.

실시예 2-3 1차 세포 배양

실시예 2-1에서 채집되고 실시예 2-2에서 분리된 환자의 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구를 배양용 플라스크(T-25cm²)를 사용하여 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 X-VIVO 20 배지를 사용하여 세포가 증식기에 도달할 때까지 1차 배양했다.

실시예 2-4 수지상 세포의 분화 유도

상기 실시예 2-2에서 1차 배양이 끝난 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구에 대해서 1.5 x 10⁶/ml의 농도로 배양용 플라스크(T-75cm²)에 분주하고 각각 최종 농도 25-50 ng/ml의 Flt3-ligand, 50 ng/ml-1 mg/ml의 GM-CSF(CSF2)와 25 ng/ml의 IL-4 그리고 10 ng/ml의 TNF-α가 추가로 포함된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 10 일간 배양해서 수지상세포로 유도 분화시켰다. 배양액은 매 3-4일마다 교환하였고 그 때마다 상기의 cytokines을 같은 농도가 되도록 첨가하였다. 이때 교환한 이전의 배양액 내에 존재하는 백혈구들은 버리지 않고 새로운 배양 플라스크에 옮겨서 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 배양해서 수지상세포를 주입할 때 환자에게 다시 재주입하였다.

실시예 2-5 유도된 수지상 세포의 관찰

말초 혈액 조혈모세포와 백혈구를 사이토카인이 혼합된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 3일간 배양했을 때 커다란 세포체에 방추상(紡錘狀)으로 수상(樹狀) 돌기가 세포 표면으로부터 나타나기 시작하였고(도 6) 6 일간 배양했을 때 현저하게 긴 수상 돌기를 가진 수지상 세포로 분화되었으며(도 7) 12 일간 배양했을 때 배양용 플라스크(T-75cm²) 바닥은 분화된 수지상 세포로 덮혔고 크기가 크고 다수의 긴 세포질 돌기를 가진 전형적인 수지상 세포들을 다수 관찰할 수 있었다(도 8). 이들 분화된 세포의 수는 1.4 x 10⁸개 였다. 환자에게 수지상세포를 포함한 백혈구들을 투여하기 하루 전에 분화된 수지상세포에 추가로 종양항원과 관련된 표적항원을 인식(감작)시키기 위하여 환자의 전혈에서 채취하여 냉동보관해둔 5ml 씩의 혈청과 실시예 2-2에서 냉동보관해 둔 혈구를 세척한 상층액 5ml 씩을 각 배양 플라스크(T-75cm²)에 투여했다.

실시예 2-6 형광 현미경법(Fluorescence Microscopy)를 이용한 세포 표면 항원 검사

유도 분화된 수지상 세포의 표현형을 검사하기 위하여 CD1a, CD83, CD86 단클론 항체(monoclonal antibody)를 사용한 형광 현미경법(Fluorescence Microscopy)을 실행하여 세포 표면 항원을 검사하였다.

도 9에서와 같이 수지상 세포의 표면 항원인 CD83가 세포 표면에 발현된 것을 관찰할 수 있어서 유도된 세포는 전형적인 수지상 세포임을 확인할 수 있었다.

실시예 2-7 형태학적 검사

배양 배지 상에서의 수지상 세포의 형태는 위상차 현미경을 사용하여 관찰하였고 김사(Giemsa) 염색을 하여 광학 현미경으로 풍부한 세포질과 미세한 수지상돌기가 발달된 전형적인 수지상 세포의 보다 상세한 세포 구조를 관찰할 수 있었다(도 10).

실시예 3 - 갑상선 유두선암 환자로부터 수지상세포의 분화 유도 및 활성화된 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocytes)의 종양항원에 대한 특이성 검증

실시예 3-1 골수에서 말초 혈액으로의 조혈모세포의 가동화(mobilization) 및 조혈모세포와 백혈구 채집

수지상세포를 사용한 면역 요법에 대해 환자와 보호자에게 충분히 설명하고 서면으로 동의를 받은 후 갑상선 유두선암 환자에게 5 ㎍/㎏/day의 용량으로 G-CSF를 3 일 동안 투여하고 백혈구를 수지상세포로 유도분화를 시킨 후 인식(감작)시킬 표적항원을 채취하기 위하여 환자의 말초혈에서 전혈 20ml을 채혈하여서 혈청을 냉동보관하였다. 그 후 갑상선 유두선암 환자의 말초 혈액 50 ㎖를 헤파린 처리된 튜브(heparinzed tube)에 채취하여 말초 혈액 조혈모세포와 함께 백혈구를 채집했다.

실시예 3-2 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구의 분리

채집된 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구가 포함된 환자의 말초 혈액 10 mL씩을 X-VIVO 20 배양액 10 ml로 희석한 후 Histopaque-1077 20 mL이 담긴 50 mL 튜브에 조심스럽게 얹은 후 1,800 rpm에서 20분간 원심분리하여 계면층의 조혈모세포와 백혈구를 파스퇴르 피펫으로 분리하였다. 얻어진 조혈모세포와 백혈구 분획에 인산염 완충 식염수(Phosphate buffered saline)를 섞어 25 mL로 만들고 혈구계로 세포수를 계산한 후 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 세척한 후 상층액은 종양과 관련된 표적항원 인식(감작)용으로 사용하기 위하여 냉동보관하였다.

실시예 3-3 1차 세포 배양

실시예 3-1에서 채집되고 실시예 3-2에서 분리된 환자의 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구를 배양용 플라스크(T-25cm²)를 사용하여 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 X-VIVO 20 배지를 사용하여 세포가 증식기에 도달할 때까지 1차 배양했다.

실시예 3-4 수지상 세포의 분화 유도

상기 실시예 3-3에서 1차 배양이 끝난 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구에 대하여 1.5 x 10⁶/ml의 농도로 배양용 플라스크(T-75cm²)에 분주하고 각각 최종 농도 25-50 ng/ml의 Flt3-ligand, 50 ng/ml-1mg/ml의 GM-CSF(CSF2)와 25 ng/ml의 IL-4 그리고 10 ng/ml의 TNF-α가 추가로 포함된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 14 일간 배양해서 수지상세포로 유도 분화시켰다. 배양액은 매 3-4일마다 교환하였고 그때마다 상기의 사이토카인(cytokine)을 같은 농도가 되도록 첨가하였다.

실시예 3-5 유도된 수지상 세포의 관찰

말초 혈액 조혈모세포와 백혈구를 사이토카인이 혼합된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 5일간 배양했을 때 커다란 세포체에 방추상으로 수상 돌기가 세포 표면으로부터 나타나기 시작하였으며(도 13b) 8 일간 배양했을 때 현저하게 긴 수상 돌기를 가진 수지상 세포로 분화되었고(도 14a) 14 일간 배양했을 때 배양용 플라스크(T-75cm²) 바닥은 분화된 수지상 세포로 덮혔으며 크기가 크고 다수의 긴 세포질 돌기를 가진 전형적인 수지상 세포들을 다수 관찰할 수 있었다(도 14b). 수지상세포를 포함한 백혈구들을 배양하고 있는 각각의 플라스크에 종양조직과 정상조직을 투여하기 하루 전에 분화된 수지상세포에 추가로 종양항원과 관련된 표적항원을 인식시키기 위하여 환자의 전혈에서 채취하여 냉동보관해둔 5ml 씩의 혈청과 실시예 3-2에서 냉동보관해 둔 혈구를 세척한 상층액 5ml 씩을 각 배양 플라스크(T-75cm²)에 투여하였다.

실시예 3-6 수지상 세포에 의한 갑상선 유두선암 치료의 조직병리학적 확인

고신대학교 복음병원에서 갑상선 유두선암으로 진단된 환자 2예의 말초 혈액을 50 ㎖ 씩 채집하였으며, 갑상선 절제술 후 환자에서 획득한 악성종양조직과 결절주변의 정상조직으로부터 얻은 정상조직을 대상으로 시행하였다.

실시예 3-6-1 헤마톡실린-에오진 염색 후 광학현미경에 의한 확인

절제한 조직을 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 포매된 조직을 4um 두께로 3장씩 박절하고, 각각을 항온기에서 56-58℃로 30분간 건조시킨 후 실온에서 파라핀을 제거한 뒤, 다단계 농도의 알코올로 탈수시킨 후 헤마톡실린-에오진 염색을 실시한 후 이를 광학현미경으로 관찰하였다. 도 11에서는 림프구의 침윤을 받고 있지 않은 정상 갑상선 조직을 확인할 수 있고, 도 12에서는 림프구의 침윤이 증가된 갑상선 유두선암 조직을 확인할 수 있었다,

실시예 3-6-2 자가 T 림프구 활성 관찰

상기의 실시예 3-4에서 14일 동안 배양된 배양액 내에는 상기의 실시예 3-2 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구 분획 중에 다수의 T 림프구(백혈구에 속함)가 혼재하여 있으며 분화된 수지상 세포가 공존하는 두 개의 배양 용기에 배양 14일째 각각 3x2x2 mm 크기의 갑상선암 조직과 대조군용 정상 조직을 넣어 혼합 배양하였다. 이때의 갑상선 종양과 정상 조직은 수술 당시 분리하여 X-Vivo 20배지에 넣어 배양기에서 보관하였던 것을 사용하였다. 혼합 배양 1일째부터 T 림프구를 활성화시키기 위해 1000 IU/㎖의 IL-2(proleukin, Chiron, USA)를 추가하여 7일간 혼합 배양하였다. 광학 현미경으로 관찰한 결과 수지상 세포에 의해 활성화된 T세포는 핵질이 풍부하고 세포의 크기가 거의 2배로 성장해 있었다(도 15).

실시예 3-6-3 전자 현미경을 이용한 T 림프구의 갑상선 조직에 대한 면역반응의 관찰

상기의 실시예 3-6-2에서 3x2x2 mm 크기의 혼합 배양된 종양조직 검체를 0.1 M 인산염 완충액(phosphate buffer solution)에 수세한 후 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 24시간 고정하였다. 후고정은 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)로 하였다. 그 후 1시간 증류수에 수세한 후 에탄올을 이용하여 탈수하고, 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)로 치환하였다. 임계점 건조기를 이용하여 액체 CO₂로 건조한 후 시료대에 부착하였다. 마지막으로 검체를 이온 증착기(ion sputter) 장치 내에서 20nm 골드 팔라듐(gold palladium)을 이용하여 증착한 후 갑상선종양 세포표면에서의 수지상세포, T세포의 분포 및 이동을 주사 전자 현미경(Hitachi, S-520)으로 15 kV에서 관찰 및 촬영하였다.

상기 2명의 환자로부터 채취하여 배양된 정상 조직과 종양 조직에 대한 림프구의 반응을 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과 수지상 세포를 정상 조직에 감작시킨 대조군에 비하여 종양조직에 감작시킨 군에서 배양된 림프구가 보다 더 현저하게 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocytes)로 분화되고 활성화되었으며(도 16a), 세포 표면에도 위족(pseudopodia) 모양의 세포질 돌기가 왕성하게 발달하여 종양조직을 파괴하고 암 조직을 융해(lysis)시키고 있는 부위도 관찰되었다(도 16b). 또한 갑상선 유두선암 조직에 부착되어 있는 veiled cell(세포질 돌기가 면사포모양으로 발달한 수지상세포의 한 유형)형태의 수지상세포를 관찰할 수 있었다(도18a, 도18b). 반면 정상 대조군에서는 T 림프구는 위족(pseudopodia) 모양의 세포질 돌기가 발현되지 않은 불활성 상태였고 정상 조직에 대한 면역학적인 조직 손상을 유발하지도 않았다(도 17). 또한 정상 조직에서는 부착된 수지상세포가 관찰되지 않았다. 이로서 자가 수지상세포를 사용하여 활성화된 자가 T 림프구는 정상조직은 파괴하지 않고 종양조직만을 선택적으로 파괴한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4 - 백혈병 환자로부터 수지상 세포의 분화 유도

실시예 4-1 말초 혈액으로부터 백혈병성 백혈구의 채집과 분리

실험 내용에 대해 환자와 보호자에게 충분히 설명하고 동의를 받은 후 완해(complete remission)가 유도된 급성 백혈병 환자의 말초혈액 60 ㎖을 채집했다. 이 중 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 수지상세포로 유도분화를 시킨 후 인식(감작)시킬 표적항원을 채취하기 위하여 환자의 전혈 20ml을 따로 처리하여서 혈청을 냉동보관하였다.

헤파린이 섞인 말초혈 20 mL씩을 Histopaque-1077 20 mL이 담긴 50 mL 튜브에 조심스럽게 얹은 후 1,800 rpm에서 20분간 원심분리하여 계면층의 백혈구를 파스퇴르 피펫으로 분리하였다. 얻어진 백혈병성 백혈구 분획에 인산염 완충 식염수를 섞어 25 mL로 만들고 혈구계로 세포수를 계산한 후 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 세척한 후 상층액은 종양과 관련된 표적항원 인식(감작)용으로 사용하기 위하여 냉동보관하였다.

실시예 4-2 1차 세포 배양

백혈병성 말초 혈액 백혈구의 침전이 있는 튜브에 배지 15 mL를 첨가하여 잘 섞어준 후 세포를 배양용 플라스크(T-25cm²)를 사용하여 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 X-VIVO 20 배지를 사용하여 1차 배양했다.

실시예 4-3 수지상 세포의 분화 유도

상시 실시예 4-2의 1차 배양이 끝난 백혈병성 말초 혈액 백혈구에 대해서 1.5 x 10⁶/ml의 농도로 배양용 플라스크(T-75cm²)에 분주하고 각각 최종 농도 25-50 ng/ml의 Flt3-ligand, 50 ng/ml-1 mg/ml의 GM-CSF(CSF2)와 25 ng/ml의 IL-4 그리고 10 ng/ml의 TNF-α가 추가로 포함된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 12 일간 배양해서 수지상 세포로 유도 분화시켰다. 분화된 수지상세포에 추가로 종양항원과 관련된 표적항원을 인식시키기 위하여 환자의 전혈에서 채취하여 냉동보관해둔 5ml 씩의 혈청과 실시예 4-1에서 냉동보관해 둔 혈구를 세척한 상층액 5ml 씩을 각각 배양 플라스크(T-75cm²)에 투여한다.

실시예 4-4 유도된 수지상 세포의 관찰

백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인이 혼합된 X-VIVO 20 배지에서 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기를 사용하여 3일간 배양했을 때 커다란 세포체에 방추상으로 수상 돌기가 세포 표면으로부터 나타나기 시작하였다(도 19). 배양 6일째 현저하게 긴 수상 돌기를 가진 수지상 세포로 분화되었으며(도 20), 배양 12일째 배양용 플라스크(T-75cm²) 바닥은 분화된 수지상 세포로 덮혔으며 크기가 크고 다수의 긴 세포질 돌기를 가진 전형적인 수지상 세포들을 다수 관찰할 수 있었다(도 21). 이들 분화된 세포의 수는 8 x 10⁷개 였다.

실시예 4-4 형광 현미경법(Fluorescence Microscopy)을 이용한 수지상 세포 표면 항원 검사

유도 분화된 수지상세포의 표현형을 검사하기 위하여 CD1a, CD83, CD86 단클론 항체를 사용한 형광 현미경법을 실행하여 세포 표면 항원을 검사하였다. 실행 결과 수지상 세포의 표면 항원인 CD1a, CD83, CD86가 세포 표면에 발현된 것을 관찰할 수 있었다(도 23). 도 23a는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후에 분화된 수지상 세포 표면의 CD83을 mAbs anti-CD83으로 염색한 모습을 찍은 형광 현미경 사진이고, 도 23b는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후의 분화된 수지상 세포 표면의 CD86을 mAbs anti-CD86으로 염색한 모습을 찍은 형광 현미경 사진이며, 도 23c는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후의 분화된 수지상 세포 표면의 CD1a를 mAbs anti-CD1a로 염색한 모습을 찍은 형광 현미경 사진이다.

실시예 4-5 형태학적 검사

배양 배지 상에서의 형태는 위상차 현미경을 사용하여 관찰하였고 보다 상세한 세포 구조를 관찰하기 위해서는 김사(Giemsa) 염색을 하였다.

Giemsa 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰한 결과 풍부한 세포질과 미세한 수지상 돌기가 발달된 전형적인 수지상 세포의 보다 상세한 세포 구조를 관찰할 수 있었다(도 24).

상기한 구성의 본 발명에 의하여 암 환자의 말초 혈액 조혈모세포와 백혈구로부터 체외 배양법으로 수지상 세포의 분화 유도가 가능한지 확인하였다.

본 발명에서는 말초 혈구 세포를 CD34⁺ 세포, 단핵구(mononuclear cells), 중성구(Neutrophils) 등으로 분리하지 않고 모두에 대해 Flt3-ligand, GM-CSF(CSF2), IL-4 및 TNF-α를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 사용하여 분화 유도시켰을 때 말초 혈구 세포들이 수지상 세포로 유도 분화 되었다.

본 발명의 혈구로부터 분화 유도된 수지상 세포를 환자의 체중 1 kg당 10⁶개를 80ml의 식염수에 현탁시켜서 간암 환자 전완 정맥(median antebrachial vein)으로 주입하였을 때 임상 효과가 있었고, 갑상선암 환자의 경우 본 발명의 수지상 세포가 T 림프구를 활성화시키며 그 활성화된 T 림프구가 갑상선암 조직과 세포만을 선택적으로 직접 공격하여 암세포를 융해시키는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 동일한 조건에서 정상조직과 혼합 배양된 대조군에서는 자가 조직에 대한 파괴나 면역 반응이 나타나지 않았다.

본 발명으로 유도된 수지상 세포는 본래 수지상 세포와 형태 및 그 기능에 있어서 차이가 없는 바 앞으로 인체의 생리학적 및 면역학적 항암 치료 기전이 매우 합리적으로 응용될 수 있을 것으로 전망된다.

도 1은 간암 환자로부터 분리된 조혈모세포가 포함된 말초 혈액 백혈구의 모양을 400배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 2는 섬유 근육통 증후군 관련 티로신 키나제 3-리간드(Flt3-ligand), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-4(IL-4) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)이 첨가된 배지에서 3일 동안 배양된 후에 도 1의 조혈모세포가 포함된 말초 혈액 백혈구가 방추형(紡錘形)의 세포로 분화된 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 3은 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 6일 동안 배양된 후에 도 1의 조혈모세포가 포함된 말초 혈액 백혈구가 세포체의 크기가 증가하고 긴 수지상(樹枝狀)의 세포질 돌기를 가진 세포로 분화된 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 4는 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양된 후에 도 1의 조혈모세포가 포함된 말초혈의 백혈구들로부터 분화 유도된 수지상세포의 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 5는 위암 환자로부터 분리된 조혈모세포가 포함된 말초혈 백혈구들의 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 6은 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 3일 동안 배양된 후에 도 5의 조혈모세포가 포함된 말초 혈액 백혈구가 방추형(紡錘形)의 세포로 분화된 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 7은 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 6일 동안 배양된 후에 도 5의 조혈모세포가 포함된 말초 혈액 백혈구가 세포체의 크기가 증가하고 긴 수지상(樹枝狀)의 세포질 돌기를 가진 세포로 분화된 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 8은 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양된 후에 조혈모세포가 포함된 말초혈의 백혈구들로부터 분화 유도된 수지상세포의 모양을 400배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 9는 도 5의 조혈모세포가 포함된 말초혈의 백혈구들을 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후에 분화된 수지상세포 표면의 CD83을 mAbs anti-CD83으로 염색하여 관찰한 형광현미경 사진이다.

도 10은 도 5의 조혈모세포가 포함된 말초혈의 백혈구들을 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후에 분화된 수지상세포를 김사(Giemsa) 염색법에 의해 염색하여 400배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 11은 정상 갑상선 조직을 헤마톡실린-에오진(hematoxylin eosin) 염색을 실시하여 100배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 12는 갑상선 유두선암 조직을 헤마톡실린-에오진 염색을 실시하여 100배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 13a는 갑상선 유두선암 환자로부터 분리된 조혈모세포가 포함된 말초혈의 백혈구들을 100배 확대한 사진이고, 도 13b는 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 5일 동안 배양한 후의 분화 과정에 있는 수지상 세포를 400배 확대한 사진이다.

도 14a는 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 8일 동안 배양한 후의 분화 과정에 있는 수지상 세포를 400배 확대한 사진이고, 도 14b는 14일 동안 배양한 후의 분화된 수지상 세포를 400배 확대한 사진이다.

도 15는 수지상 세포에 의해 활성화된 핵질이 풍부하고 세포의 크기가 거의 2배로 성장한 T세포의 모습을 400배 확대한 사진이다.

도 16a는 종양조직에 감작시킨 수지상세포에 의해 활성화된, 세포 표면에 위족(pseudopodia) 모양의 세포질 돌기가 왕성하게 발달한 T세포의 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이다. 도 16b는 종양조직에 감작시킨 수지상 세포에 의해 활성화된 T세포(Cytotoxic T lymphocytes)가 종양조직을 파괴하여 암 조직을 융해(lysis)시키고 있는 부위에 대한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이다.

도 17은 정상 갑상선 조직에 감작시킨 수지상세포에 의해 활성화되지 않아 세포질 돌기도 뚜렷하게 발현되지 않고 세포의 크기도 활성화된 T세포 보다 작은 T세포와 정상 조직의 파괴가 관찰되지 않은 주사 전자 현미경 사진이다.

도 18a는 갑상선 유두선암 조직에 부착되어 있는 veiled cell(세포질 돌기가 면사포모양으로 발달한 수지상세포의 한 유형)형태의 수지상세포를 5,000배로 확대한 주사 전자 현미경 사진이고, 도18b는 10,000배로 확대한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이다.

도 19는 백혈병 환자로부터 분리된 말초 혈액 백혈구의 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 20은 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 3일 동안 배양한 후에 방추형(紡錘形)의 세포로 분화된 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 21은 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인이 첨가된 배지에서 6일 동안 배양한 후에 세포체의 크기가 증가하고 긴 수지상(樹枝狀)의 세포질 돌기를 가진 세포로 분화된 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 22는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후에 백혈병성 말초 혈액 백혈구들로부터 분화 유도된 수지상세포의 모양을 200배 확대한 광학현미경 사진이다.

도 23a는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후에 분화된 수지상 세포 표면의 CD83을 mAbs anti-CD83으로 염색한 모습을 찍은 주사형광현미경 사진이고, 도 23b는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후의 분화된 수지상 세포 표면의 CD86을 mAbs anti-CD86으로 염색한 모습을 찍은 형광현미경사진이며, 도 23c는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후의 분화된 수지상 세포 표면의 CD1a를 mAbs anti-CD1a로 염색한 모습을 찍은 형광현미경사진이다.

도 24는 도 19의 백혈병성 말초 혈액 백혈구를 사이토카인 칵테일이 첨가된 배지에서 12일 동안 배양한 후에 분화된 수지상 세포를 김사(Giemsa) 염색법에 의해 염색하여 400배 확대한 광학현미경 사진으로서 커다란 세포 크기와 풍부한 세포질과 잘 발달된 세포질 돌기를 볼 수 있다.

Claims

(a) 악성 종양이 있는 환자에게 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 피하주사로 3일 동안 투여하여 상기 환자의 조혈모세포(peripheral blood stem cells)를 골수로부터 말초 혈액 쪽으로 가동화(mobilization)함으로써 조혈 기능을 촉진시키는 단계;

(b) 상기 환자로부터 말초 혈액을 채집하여 말초 혈액 조혈모세포와 혈구(blood corpuscles)를 분리하는 단계;

(c) 섬유 근육통 증후군 관련 티로신 키나제 3-리간드(Flt3-ligand), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-4(IL-4) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 사용하여, 상기 분리된 말초혈액조혈모세포와 혈구 세포를 체외에서(in vitro) 수지상 세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 수지상 세포(dendritic cells)의 제조 방법.
제1항의 상기 (b)단계에서 상기 환자로부터 말초혈액을 채집하는 데 있어서,

환자의 말초혈액에 존재하는 말초혈액 조혈모세포와 백혈구(white blood corpuscle) 그리고 종양환자의 체내의 혈류에 존재하는 종양관련 항원 물질이 농축된 50 ml의 시료를 채집하기 위하여 말초 혈액 조혈모세포의 수를 측정하고 체중 1 ㎏당 1x 10⁶-4 x 10⁶ 개의 말초 혈액 조혈모세포와 함께 백혈구를 항응고제와 혈액 세포 분리기(blood cell separator)를 사용하여 말초혈액 약 5,000-10,000 ml을 재순환시키면서 채집하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 악성 종양은 간암, 위암, 갑상선 유두선암 또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 악성 종양이 있는 환자에게 5-10 ug/kg/day의 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 25-50 ng/ml의 섬유 근육통 증후군 관련 티로신 키나제 3-리간드(Flt3-ligand), 50 ng/ml-1 mg/ml의 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 25-50 ng/ml의 인터류킨-4(IL-4) 및 10-20 ng/ml의 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함하는 사이토카인 칵테일(cytokines cocktail)을 사용하는 것을 특징으로 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제조된 수지상 세포로서 그 표면에 CD1a, CD83 및 CD86 항원을 포함하는 수지상 세포.
제6항의 수지상 세포 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 악성 종양의 치료용 또는 예방용 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 수지상 세포의 양은 환자의 체중 1 kg당 1x10⁶- 3x10⁶개로서 80ml의 생리식염수에 현탁될 수 있는 정도의 양인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.