CN110337299A - 用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可预防、改善或治疗包括过敏性疾病等的过敏性免疫疾病的组合物的制备方法，以及通过上述方法制备的组合物。本发明通过简单且容易的工序来从未成熟树突状细胞以高产率诱导出具有免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞，并由此可有效预防、改善或治疗过敏性免疫疾病。

Description

用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及可预防、改善或治疗包括过敏性疾病等的过敏性免疫疾病的组合物及通过上述方法制备的组合物。
背景技术
在免疫系统中，免疫反应与免疫耐受互相协调并保持平衡。在发生过度免疫反应的情况下，可发生过敏性疾病或自身免疫疾病等，其对人类生存和生活质量具有很大影响。
过敏(Allergy)是指对过敏原等非自身(non-self)物质的免疫机制引起的病理性过敏反应，由抗体或细胞介导。过敏反应表现为Th2(T-helper type 2)细胞反应，其涉及细胞因子，如白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)和肿瘤坏死因子(TNF)-a，趋化因子如T细胞表达和分泌(regulated upon activation，normal T-cellexpressed&secreted，RANTES)、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)和巨噬细胞趋化蛋白-3(macrophage chemoattractant protein-3，MCP-3)在过敏性炎症反应中起重要作用。并且，还包括对自身(self)物质具有病理性过度敏反应的自身免疫疾病(autoimmunity)。
由过敏反应引起的疾病有哮喘、鼻炎、荨麻疹和过敏性反应等，一些过敏反应包括通过与特定过敏抗原遗传结合来引起的过敏性哮喘及湿疹等。这种过敏的特征在于它们通常由无害的物质引起(花粉、霉菌、动物毛和头皮屑、灰尘、螨虫和花生等)。
作为目前开发的治疗过敏性疾病的治疗方法，有一种鉴定过敏患者患有的过敏性疾病的过敏原后，将其少量给药几年并逐渐减少过敏原的方法。然而，这种治疗的缺点在于治疗需要数年时间，并且存在可引起过敏性休克等的问题。此外，具有使用DNA疫苗得方法、阻断免疫球蛋白E(IgE)与肥大细胞受体结合的治疗法及以及对引起过敏的作为细胞因子的白细胞介素-4的抗体治疗法等，但是其缺点在于这些治疗费用昂贵或者尚未完全表明其治疗效果。
另一方面，树突状细胞作为对先天免疫及因后天性因果选择性产生的获得性免疫调节起到中枢作用的细胞，具体地，是一种执行将主要从外部侵入的抗原的信息呈递给T细胞的功能的代表性的抗原呈递细胞之一。
上述树突状细胞根据起源(origin)、表型(phenotype)及功能(function)等由各种部分亚群(subpopulations)组成。具体地，对应于各种病原菌来源刺激，浆细胞样树突状细胞(plasmacytoide dendritic cells，pDC)可以以高水平生产I型IFN。其通过这些表面表型区别于常规树突状细胞(conventional DCs，cDCs)。上述浆细胞样树突状细胞表达B220，且以低水平表达CD11c，相反地，常规树突状细胞以高水平表达CD11c及CD11b，但是不表达B220。上述浆细胞样树突状细胞及树突状细胞在未成熟树突状细胞成熟的过程获取使得它们可用作和谐免疫反应的有效刺激物。
如上所述，已知浆细胞样树突状细胞在因DNA病毒或单链RNA病毒而传染时通过分泌大量的I型IFNs来激活免疫细胞，从而在防御病毒传染中起到重要的作用。尤其其通过强烈激活可呈递抗原的成熟的树突状细胞(maturated DCs，mDCs)来有助于扩增基于T细胞的抗病毒反应。
但是，实际上，与其他树突细胞相比，浆细胞样树突状细胞在体内的分化或作用的研究微乎其微。迫切需要通过调节主管树突状细胞的免疫的特定基因的表达或发现免疫耐受诱导物质来使免疫耐受性始终得到维持或强化的免疫耐受性树突状细胞的制备技术。尤其，尽管已经进行了许多证明上述浆细胞样树突状细胞在各种自身免疫疾病或传染性疾病中起到重要作用的研究，然而尚不清楚用于制备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的系统性且标准化的分化方法。
发明内容
技术问题
本发明的发明人发现对未成熟树突状细胞(dendritic cells)处理Toll样受体激动剂(toll-like receptor agonist，TLR agonist)后诱导分化，或者分化上述未成熟树突状细胞过程中处理Toll样受体激动剂的情况下，免疫耐受性浆细胞样树突状细胞被诱导，在利用其的情况下可有效预防、改善或治疗过敏性免疫疾病，从而实现了本发明。
本发明的一目的在于，提供制备可有效预防、改善或治疗过敏性免疫疾病的组合物的方法。
本发明的再一目的在于，提供通过上述方法制备的，可有效预防、改善或治疗过敏性免疫疾病的组合物。
通过以下对本发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，本发明的另一目及优点将变得更加明确。
问题解决方案
为了实现上述目的，本发明提供包括对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂(toll-like receptor agonist)来制备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法。
并且，本发明提供包含通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物。
并且，本发明提供通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的过敏性免疫疾病的预防或治疗用途。
并且，本发明提供通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的用于制备用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的用途。
并且，本发明提供包含通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的用于预防或改善过敏性免疫疾病的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的用于预防或改善过敏性免疫疾病的食品组合物。
发明效果
本发明通过简单且容易的工序来从未成熟树突状细胞以高产率诱导出具有免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞，从而能够实现大量免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的稳定供给。
并且，在本发明中，如上所述获取的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞可通过抑制过敏原特异性免疫球蛋白和T辅助2型细胞因子的表达，有效预防或治疗多种过敏性免疫疾病包括来源于食物过敏症，且施用于人体时安全。
附图说明
图1为示出根据本发明一实施例的对未成熟树突状细胞的分化诱导用因子(Flt3L-containing media)及Toll样受体激动剂(TLRs agonists)的处理方法的设计图的图。
图2为示出在实施例1中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Pam3)后的被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的分离的图。
图3的(a)部分为示出在实施例1中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，特异诱导到被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的表面表达分子的图。
图3的(b)部分为以曲线图的方式示出在实施例1中根据未成熟树突状细胞与本发明一实施例的数量的比率处理Toll样受体激动剂(Pam3)后的被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的数量的比率的图。
图4为以曲线图的方式示出实施例2中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞与一般浆细胞样树突状细胞中对细胞因子(IFN-α、IFN-β、IL-12p70、IL-10)的表达形态进行比较的结果的图。
图5为以曲线图的方式示出实施例3中根据本发明一实施例处理各种Toll样受体激动剂后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞与一般浆细胞样树突状细胞(non)中对细胞因子IL-10的表达形态进行比较的结果的图。
图6为以曲线图的方式示出根据实施例4的根据本发明一实施例的对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂(Pam3)的时间点对细胞因子(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-10)的表达形态进行比较的结果的图。
图7为以曲线图的方式示出实施例5中根据本发明一实施例处理各种Toll样受体激动剂(Pam3)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞与一般浆细胞样树突状细胞中对MHC complex分子、CD80及CD86的表达形态进行比较的结果的图。
图8为以曲线图的方式示出实施例6中根据本发明一实施例处理各种Toll样受体激动剂(Pam3)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞与一般浆细胞样树突状细胞中对IDO、CCR9及PD-L1的表达形态进行比较的结果的图。
图9的(a)部分为示出实施例7中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞或一般浆细胞样树突状细胞，之后通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖到调节T细胞的结果的图。
图9的(b)部分为示出实施例7中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞或一般浆细胞样树突状细胞，之后测量调节T细胞的增殖率的结果的图。
图10为示出实施例8中野生型树突状细胞(WT)及从TLR2基因敲除小鼠分离的树突状细胞(TLR2-/-)与Rv1411c蛋白的结合程度的图。
图11为以曲线图的方式示出实施例9中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白(0.1μg/ml，0.5μg/ml))后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c(0.1μg/ml)-pDC，Rv1411c(0.5μg/ml)-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞中对细胞因子(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-10)的表达形态进行比较的结果的图。
图12为以曲线图的方式示出实施例10中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中对MHC complex分子、CD80、CD86及免疫耐受诱导分子(IDO、CCR9及PD-L1)的表达形态进行比较的结果的图。
图13为以曲线图的方式示出实施例11中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，混合被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)并培养后，对T细胞的增殖程度进行比较的结果的图。
图14为以曲线图的方式示出实施例11中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，混合被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)并培养后，对IFN-gamma的分泌形态进行确认的结果的图。
图15的(a)部分为示出实施例12中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)，之后通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖到调节T细胞的结果的图。
图15的(b)部分为示出实施例12中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(RVc1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)，之后测量调节T细胞的增殖率的结果的图。
图16为以曲线图的方式示出实施例13中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，将通过诱导的浆细胞样树突状细胞(RV1411c-pDC)分化的T细胞与CD4+、CD25-效应T细胞一同培养后，相对于CD25-效应T细胞与启动的T细胞的比率T细胞增殖能的变化的结果的图。
图17为以曲线图的方式示出实施例14中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(RYv1411c蛋白及Pam3)后，对浆细胞样树突状细胞(TLR agonist)与未处理诱导的浆细胞样树突状细胞(Non)的数量进行比较的结果的图。
图18为示出用于制备实施例15中的蛋黄蛋白诱导的食物过敏症的动物模型的实验设计图。
图19为以曲线图的方式示出在实施例15中对蛋黄蛋白诱导的食物过敏症的动物模型注入根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d i.v.)后，评价全身性过敏性反应症状的结果的图。
图20为以曲线图的方式示出在实施例15中对蛋黄蛋白诱导的食物过敏症的动物模型注入理根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d i.v.)后，测定直肠的体温变化的结果的图。
图21为示出实施例15中对蛋黄蛋白诱导的食物过敏症的动物模型注入根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d i.v.)后，测定腹泻发生率的结果的图。
图22为以曲线图的方式示出在实施例16中对蛋黄蛋白诱导的食物过敏症的动物模型注入根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d)后，测定血中免疫球蛋白E(IgE)及免疫球蛋白G1(IgG1)的结果的图。
图23为示出在实施例17中蛋黄蛋白诱导的食物过敏症的动物模型注入根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d)后，测定血中白细胞介素-4、白细胞介素-5的浓度的结果的图。
然而，在图1至图23中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005。
具体实施方式
最佳实施方式
本发明涉及包括制备下述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的步骤的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法。
在本发明中，制备上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的步骤，可通过对树突状细胞处理Toll样受体激动剂来执行。
在本说明书中，术语“树突状细胞(dendritic cell，DC)”是指通过将抗原吸收到细胞内部来与MHC(major histocompatibility complex)类I复合物或MHC类Ⅱ复合物一同对各种抗原样品呈递到T细胞的专职性抗原呈递细胞(professional antigen presentingcell)。并且，树突状细胞包含免疫原性(immunogenic)及免疫耐受性(tolerogenic)抗原呈递细胞，根据成熟度可分为未成熟树突状细胞(immature dendritic cells；“imDC”)、半成熟树突状细胞(semimature dendritic cells；“smDC”)及成熟树突状细胞(maturedendritic cells；“mDC”)。
在本说明书中，术语“未成熟树突状细胞”在树突状细胞的早熟期发现，不表达作为单核细胞的表面表型的CD14，并且，共同刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86及CD274中的任一种以低于成熟树突状细胞的水平表达。
在本说明书中，术语“半成熟树突状细胞”作为丧失一部分未成熟树突状细胞的特性且具有一部分成熟树突状细胞的表型的特性的树突状细胞，是指部分或不完全地显示成熟的形态及表型性特性的树突状细胞。
在本说明书中，术语“成熟树突状细胞”是指由未成熟树突状细胞成熟形成的细胞。成熟树突状细胞的特征在于，DC-LAMP以及MHC类Ⅱ、CD40、CD54、CD80、CD86及CD274的表达高，且具有在释放抗炎性细胞因子(proinflammatory cytokine)、混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction)增加初始同种异系T细胞(allogeneic T cells)及同种同系T细胞(syngeneic T cells)的增殖和/或生成树突状细胞细胞因子的增加。成熟树突状细胞通常以高水平表达CCR7及CXCR4。
然而，在本发明中，优选地，处理上述Toll样受体激动剂的树突状细胞为未分化的未成熟树突状细胞。其中，上述未成熟树突状细胞可包含初始树突状细胞(naivedendritic cells)，可以从哺乳类的骨髓等分离并获取。
并且，在本发明中，通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的免疫耐受性树突状细胞可以是免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
在本说明书中，术语“浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells)”是指树突状细胞的一个子集(subset)，1958年，由Dr.Lennert与Dr.Remmele初次从人体的淋巴结组织学性地发现浆细胞(plasma cell)的形态并被公开，然而由于其不表达B细胞特定标记(immunoglobulin)，不表达作为T细胞的共同标记的CD3且表达淋系抗原(myeloidlineage antigen)和MHC类Ⅱ，因而由命名为浆细胞样T细胞(Plasmacytoid T cells)改名为血浆单核细胞(plasmacytoid monocyte)。之后，随着确认其具有可以诱导作为树突状细胞的原有性质的同种异系混合淋巴细胞反应(allerogenic mixed lymphocyte reaction，MLR)的能力，再次被命名为浆细胞样树突状细胞，并且也可以简称为“pDC”。
在本说明书中，术语“免疫耐受性”是指对于特定抗原不显示免疫反应的状态以及抑制免疫反应的状态。因此，在本发明中，上述“免疫耐受性浆细胞样树突状细胞”促进IL-10等的抗炎性细胞因子的分泌，抑制IL-12p70及TNF-α等的炎性细胞因子的分泌，并且由于最近被称为免疫耐受诱导分子的吲哚胺-2,3双加氧酶(indoleamine-2,3dioxygenase，IDO)分子及作为免疫耐受诱导细胞的表面分子的CCR9以高水平表达，因而诱导调节T细胞(regulatory T cells)的分化，可抑制效应T细胞(effector T cells)的活性。
在本发明中，可在上述未成熟树突状细胞从开始分化之前到分化期间处理上述Toll样受体激动剂以稳定地大量制备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。其中，上述“开始分化之前”可以包括对未成熟树突状细胞处理分化诱导用因子之前的时间点。并且，上述“分化期间”可以指从对上述未成熟树突状细胞处理分化诱导用因子的时间点到通过上述分化诱导用因子完成分化之前的时间点。优选地，可包括从处理分化诱导用因子的时间点到上述处理后的7天以内的时期，但不限于此。
在本发明中，只要是如上所述仅在未成熟树突状细胞的开始分化之前或分化期间处理，上述Toll样受体激动剂对具体时间点没有特别限制。然而，在本发明中，在未成熟树突状细胞的分化期间处理上述Toll样受体激动剂的情况下，可在从开始分化时间点至7天(168小时)、5天(120小时)或3天(72小时)以内处理，但不限于此。并且，在本发明中，在未成熟树突状细胞的开始分化之前处理上述Toll样受体激动剂的情况下，可在处理上述激动剂的时间点至36小时，优选地，在24小时以内使用分化诱导用因子开始分化未成熟树突状细胞，但并不限于此。
并且，在本发明中，可以处理上述Toll样受体激动剂一次以上，虽然没有特别限制具体处理次数，但是在未成熟树突状细胞的分化期间处理上述Toll样受体激动剂的情况下，可从上述未成熟树突状细胞的开始分化时间点至7日、5日或3日之内处理上述Toll样受体激动剂至少一次。并且，在未成熟树突状细胞的开始分化之前处理上述Toll样受体激动剂的情况下，对上述未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂一次以上后，从任一处理时间点至36小时或24小时之内开始分化上述未成熟树突状细胞，可在其分化期间选择性地追加处理一次以上。
其中，上述“开始分化”可指对未成熟树突状细胞的培养基添加分化诱导用因子或通过对包含分化诱导用因子的培养基接种未成熟树突状细胞并培养的工序，但是只要是其可以使用分化诱导用因子诱导未成熟树突状细胞的分化，则没有特别限制。
在本说明书中，术语“Toll样受体激动剂(toll-like receptor agonist)”作为病原体(pathogen)衍生保存物质，可以是PAMPs(Pathogen associated molecularpatterns)。其中，上述病原体可以是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌或病毒。并且，上述Toll样受体激动剂作为从损伤或死细胞释放的内因性(endogenous)分子，可以是DAMPs(Damage associated molecular patterns)。为了通过TLR信号开始免疫应答并传递信号，DAMPs或PAMPs在细胞的细胞质内收集衔接分子。上述Toll样受体激动剂与片段、变体、类似物、同源(homology)或Toll样受体相结合，可以是用于诱导NF-κB活动的激活等的基于TLR-介导的激活的PAMPs或DAMPs的衍生物。作为上述Toll样受体激动剂的片段、变体、类似物、同源或衍生物与TLR激动剂的氨基酸的至少30～99％相同，用于诱导基于Toll样受体-介导的激活。
在本发明中，虽然没有特别限制对上述未成熟树突状细胞处理的Toll样受体激动剂的种类，但是，优选地，为PAMPs配体，更优选地，为可途径髓样分化因子初次应答基因88(Myeloid differentiation primary response gene 88)信号的种类可从未成熟树突状细胞诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化。
并且，在本发明中，上述Toll样受体激动剂可包含选自由TLR2激动剂、TLR4激动剂，TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂以及TLR13激动剂组成的组中的一种以上，更具体地，可包含下表1所示的配体中的一种以上，但不限于此。只要能够与树突状细胞的Toll样受体相结合且途径髓样分化因子初次应答基因88信号的配体，则均可使用。
并且，在本发明中，在将TLR2激动剂用作上述Toll样受体激动剂的情况下，还可以包含用作其辅助受体(co-receptor)的TLR1激动剂及TLR6激动剂中的一种以上。其中，作为上述TLR1激动剂及TLR6激动剂的具体示例可以是下表1中所示的配体，但只要是用作上述TLR2激动剂的辅助受体的配体，则没有特别限制。
表1
在本发明中，上述Toll样受体激动剂可以来源于微生物、病毒、植物或动物，并且可以是合成的，其起源没有特别限制。
并且，在本发明中，上述未成熟树突状细胞的分化可通过使用分化诱导用因子来执行。其中，优选地，使用FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3，Flt3L)作为上述分化诱导用因子，但是只要是能够将上述未成熟树突状细胞诱导分化成浆细胞样树突状细胞及一般树突状细胞，则没有特别限制。
并且，在本发明中，上述未成熟树突状细胞的分化可通过在包含分化诱导用因子的培养基培养上述未成熟树突状细胞，或在上述未成熟树突状细胞的培养基添加上述分化诱导用因子来执行。
并且，在本发明中，选择性地，上述分化诱导用因子可在分化上述未成熟树突状细胞的过程中另外添加一次以上。
在本说明书中，术语“FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase3，Flt3L)”相当于通过激活造血祖细胞(hematopoietic progenitors)来执行作为细胞因子及生长因子的功能的内因性低分子。
并且，在本发明中，上述未成熟树突状细胞的分化持续时间没有特别限制，可根据所使用的培养基的种类及环境不同，例如，可以执行5天至15天，优选地，可以执行7天至10天，更优选地，可以执行8天至9天。
在本发明中，可通过处理如上所述的Toll样受体激动剂来对从未成熟树突状细胞诱导分化的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞进一步处理Toll样受体激动剂，从而激活上述浆细胞样树突状细胞的免疫耐受性。
在本发明中，如上所述，用于激活完成分化的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的Toll样受体的种类没有特别限制，可以包含选自由TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂及TLR13激动剂组成的组中的一种以上，优选地，可以使用TLR9激动剂。
在本发明中，可通过如上所述的工序将未成熟树突状细胞有效地诱导分化成免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。由此，可利用未成熟树突状细胞，通过简单且容易的工序来实现大量免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的稳定供给。
并且，在本发明中，如上获得的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞抑制炎性细胞因子的表达、促进抗炎性细胞因子的表达、诱导分化成调节T细胞(regulatory T cells)以及抑制效应T细胞(effector T cell)的活性，从而有效抑制免疫反应，进一步地，通过抑制过敏原特异性免疫球蛋白和T辅助2型细胞因子的表达，来科有效预防或治疗多种过敏性免疫疾病包括来源于食物过敏疾病。
在本发明中，上述“过敏性免疫疾病”是指对于一次以上暴露于抗原具有过度免疫反应，例如，由人体免疫系统引起的物质，当在人体中不会引起任何问题的花粉与皮肤接触、摄入体内或由体内新陈代谢和病变引起，指与外部物质反复接触以引起记忆细胞的过度免疫反应的对人体有害的所有疾病。
具体地，在本发明中，上述过敏性免疫疾病可以为选自由过敏性荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘、过敏性皮肤炎、自身免疫性肝炎、过敏性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis)及过敏性口炎(allergic stomatitis)组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
在本发明中，“预防”是指通过给药本发明组合物来抑制或延迟过敏性免疫疾病的进行的所有行为。
在本发明中，“治疗”及“改善”是指通过给药本发明组合物来使过敏性免疫疾病的症状好转或有益改变的所有行为。
在本发明中，上述药学组合物的特征在于，可以为胶囊、片剂、颗粒、注射剂、软膏剂、粉末或饮料形态，上述药学组合物的特征在于，能够以人类为对象。
本发明的药学组合物并不限定于这些，但是根据各个常规的方法可剂型化成如散剂、颗粒剂、胶囊、片剂、水性悬浮液等口服型剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态来使用。本发明的药学组合物可包含药学上可接受的载体。当口服给药药学上可接受的载体时，可使用结合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素、香料等，在使用注射剂的情况下，可混合使用缓冲剂、保存剂、无痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等，在局部给药的情况下，可使用基剂、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明的药学组合物的剂型可通过与如上所述的药学上可接受的载体混合以多种方式制备。例如，当口服给药时，可制备成片剂、糖锭、胶囊、万能药(elixir)、悬浮液、糖浆、晶片等形态，在注射剂的情况下，可制备成单位给药安瓿或多次给药形态。可以以其他、溶液、悬浮液、片剂、胶囊、释放型制剂等来剂型。
另一方面，作为适用于制剂化的载体、赋形剂剂稀释剂的例子，可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等。并且，还可包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
本发明的药学组合物的给药途径并不限定于此，但是包括口腔、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜内、心脏内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠管、局部、舌下或直肠。优选为口服或非口服给药。
在本发明中，“非口服”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、硬膜内、病灶内及颅内注射或注入技术。本发明的药学组合物也可以以栓剂的形式给药，用于直肠给药。
本发明的药学组合物可根据各种因素而进行改变，如所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、餐饮、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合及需要预防或治疗的特定疾病的重症，上述药学组合物的给药量根据患者的状态、体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间而不同，但是可由本领域技术人员适当选择，每天可给药0.0001mg/kg至50mg/kg或0.001mg/kg至50mg/kg。可以每天给药一次，也可以分多次给药。上述给药量不旨在以任何方式限制本发明的范围。本发明的医药组合物可剂型化成以丸剂、锭剂、胶囊、液剂、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液。
本发明的组合物可单独使用，或者可与使用手术、放射治疗、激素治疗、化疗及生物反应调节剂的方法联合使用。
并且，本发明涉及包括向患有过敏性免疫疾病的个体给药药学有效量的本发明的上述药学组合物的步骤过敏性免疫疾病的治疗方法。
并且，本发明涉及包括向患有过敏性免疫疾病的个体给药药学有效量的本发明的上述药学组合物的步骤的过敏性免疫疾病的预防方法。
在本发明的治疗方法或预防方法中，所给药的药学组合物与前述的记载重叠，因此省略以下描述，以避免说明书中描述的过度复杂。
在本发明中，上述药学组合物的给药方法可以是口服或非口服给药，当非口服给药时，可通过腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉内注射、子宫内硬膜注射、脑血管内(intracerebroventricular)注射或胸部内注射来给药。并且，上述组合物在临床给药时可口服给药，并且可以以一般制剂形态给药。
在本发明中，对于上述药学组合物的给药次数没有特别限制，可以是一次以上，更详细地，根据预防和治疗目的可给药一次以上或者有症状时可反复给药。
此时，上述药学有效量是指0.0001mg/kg至50mg/kg或0.001mg/kg至50mg/kg，并不限定于此。上述给药量可根据特定患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、去除率、疾病的重症度等来剂型改变。
在本说明书中，术语“给药”是指以任意适当的方法向个体提供规定的本发明的组合物。
在本说明书中，术语“个体”是指具有通过给药本发明的组合物来使过敏性免疫疾病好转的患病人、猴子、狗、山羊、猪或鼠等所有动物。
在本说明书中，术语“药学上有效的量”是指足以以适用于医学治疗的合理利益或风险率治疗疾病的量，这可以通过本领域熟知的因素和其他医学领域来确定，包括个体的疾病类型、重症度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径及排泄率、治疗时间及同时使用的药物。
并且，本发明涉及包括制备上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的步骤的用于预防或改善过敏性免疫疾病的化妆品组合物的制备方法。
在本发明中，有关对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的方法的详细说明与上述药学组合物的描述重叠，因此省略以下描述，以避免说明书中描述的过度复杂。
在本发明中，化妆品组合物可制备成化妆水、营养霜、营养精华、按摩霜、美容沐浴添加剂、润肤露、身体乳、基础油、婴儿油、婴儿爽身粉、沐浴凝胶、沐浴露、防晒乳液、防晒霜、晒黑霜、润肤露、护肤霜、防紫外线化妆品、洁面乳、脱毛剂{化妆用}、面部和身体乳液、面部和身体霜、皮肤美白霜、护手霜、发露、化妆品霜、茉莉油、沐浴皂、水皂、美容皂、洗发水、手部清洁剂(洗手液)、药用肥皂(非医用)、膏霜、面部清洁、全身清洁剂、头皮清洁剂、护发素、化妆皂、牙齿美白凝胶、牙膏等。为此，本发明的组合物还可包含通常适用于化妆品组合物的制备的溶剂、适当的载体、赋形剂或稀释剂。
对于进一步可包含在本发明的化妆品组合物中的溶剂的种类没有特别限制，例如，可使用水、食盐水、二甲基亚砜(DMSO)或它们的组合，作为载体、赋形剂或稀释剂包括纯净水、油、蜡、脂肪酸、脂肪酸醇、脂肪酸酯、表面活性剂、吸湿剂(humectant)、增稠剂、抗氧化剂、粘度稳定剂、螯合剂、缓冲剂、低级醇等，但并不限定于此。并且，根据需要可包含美白剂、保湿剂、维生素、防晒霜、香水、染料、抗生素、抗菌剂、抗真菌剂。
作为上述油可利用氢化植物油、蓖麻油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、荷荷巴油、鳄梨油等，作为蜡可利用蜜蜡、鲸蜡、加洛巴蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、地蜡、液体石蜡、羊毛脂。
作为脂肪酸可利用硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油酸，作为脂肪酸醇可利用十六醇、辛基月桂醇、油醇、泛醇、羊毛脂醇、十八烷醇、十六烷醇，作为脂肪酸酯可利用肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、硬脂酸丁酯。作为表面活性剂可使用本技术领域公知的阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂及非离子表面活性剂，优选地可使用来源于天然物的表面活性剂。
除此之外，可包含在化妆品领域中公知的吸湿剂、增稠剂、抗氧化剂等，其种类和量在本领域中是众所周知的。
并且，本发明涉及包括制备上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的步骤的用于预防或改善过敏性免疫疾病的食品组合物的制备方法。
在本发明中，有关对通过未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的方法的详细说明与上述药学组合物中的描述重叠，因此省略以下描述，以避免说明书中描述的过度复杂。
本发明的食品组合物可制备成各种食品类，例如，饮料、口香糖、茶、维生素复合物、粉末、颗粒、片剂、胶囊、甜点、年糕、面包等形态。由于本发明的食品组合物由几乎没有毒性及副作用的植物提取物组成，因此即使出于预防目的，它也可以安全地用于长期使用。
当本发明的微小孢体包含在食品组合物时，其量可以以总重量的0.1％至50％的比例加入。
其中，在以饮料形态制备上述食品组合物的情况下，处理以提示的比例含有上述食品组合物之外，没有特别限制，如常规的饮料可包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。即，作为天然碳水化合物可包含单糖如葡萄糖、二糖如果糖、多糖如蔗糖、常规的糖如糊精、环糊精以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。上述调味剂可列举天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘草甜素等)及合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等))等。
此外，本发明的食品组合物可包含各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、风味剂如合成风味剂及天然风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、使用于碳酸饮料的碳酸化剂等。
可单独使用这些成分或者组合使用。这些添加剂的比例并不重要，但是，通常，针对于每100重量份的本发明的组合物，在0.1重量份至约50重量份的范围中进行选择。
本发明的具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。对于本发明所属领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于更具体地说明，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：Toll样受体激动剂对浆细胞样树突状细胞分化调节效果
为了确认在对未成熟树突状细胞的分化期间处理Toll样受体激动剂的情况下，是否诱导分化成免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，根据图1所示的设计图如下进行实验。
具体地，利用骨髓取样注射器取样C57BL/6小鼠的大腿部的骨髓。用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)洗涤取样的骨髓后，利用氯化铵除去除红细胞。将分离的细胞(3×106cell/孔)接种到6-孔板后，添加包含10％的FBS(Fetal bovine serum，小牛血清)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素/链霉素、50μM的巯基乙醇、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的丙酮酸钠及250ng/ml的FLT3L的1ml的RPMI 1640并开始培养基分化。分化开始第三天，以100ng/ml至500ng/ml的浓度处理了Pam3。分化开始5天后，进一步补充上述1ml的上述RPMI 1640，之后培养到第八天。利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，从通过培养获取的细胞分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上(图2)。由于上述Toll样受体激动剂的处理可对浆细胞样树突状细胞的分化产生影响，因而第八天确认在浆细胞样树突状细胞特异诱导的表面表达分子，并将其结果显示在图3的(a)部分。并且，在对浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)处理Toll样受体激动剂的情况下，测量初始未成熟树突状细胞的数量与经过8天后所得浆细胞样树突状细胞的数量的比率，并将其结果显示在图3的(b)部分。然而，为了确认上述Toll样受体激动剂的分化调节效果，将未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图2所示，即使处理Toll样受体激动剂也可以确认诱导分化成浆细胞样树突状细胞，并且确认分化效率也与未处理的情况没有差异。
实施例2：确认分离的浆细胞样树突状细胞的刺激及细胞因子的分泌形态
为了确认上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞的细胞因子分泌形态，将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板后，处理ODN1826(1μg/ml)以产生刺激。经过24小时后，分离所得上清液，通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme Linked Immunosorbentassay)确认细胞因子分泌形态，并将其结果显示在图4。然而，为了Toll样受体激动剂的处理效果，将上述实施例1中在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图4所示，通常，在浆细胞样树突状细胞(pDC)中I型干扰素(IFN-α及IFN-β)和作为代表性的炎性细胞因子的TNF-α及IL-12p70被强烈诱导。但是，在对被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)处理Toll样受体激动剂(0.5μg/ml)的情况下，确认当用ODN1826刺激时，其表达水平骤减。相反地，确认作为免疫抑制性细胞因子的IL-10的表达水平则处理Toll样受体激动剂后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)中显著增加。
由此，根据本发明的通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞具有免疫耐受性，这与一般浆细胞样树突状细胞不同。
实施例3：根据各种Toll样受体激动剂的处理确认浆细胞样树突状细胞中的IL-10 分泌形态
为了确认各种Toll样受体激动剂的免疫耐受性诱导效果，通过与上述实施例1相同的方法诱导浆细胞样树突状细胞的分化，Toll样受体激动剂使用了下述表2中所示配体。培养8天后，利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分理出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板，处理ODN1826(1μg/ml)后，培养24小时。之后，仅分离上清液，通过酶联免疫吸附法确认免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌形态，并将其结果显示在图5。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(non)。
表2
Non TLR2激动剂 TLR3激动剂 TLR4激动剂 TLR7激动剂 TLR9激动剂
未处理 Pam3 Poly I：C LPS 咪喹莫特 CpG-ODN
如图5所示，确认在用ODN1826刺激的各种Toll样受体激动剂中，只有用途径髓样分化因子初次应答基因88信号的TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂及TLR8激动剂处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的IL-10的表达水平显著增加。
由此，确认在处理未成熟树突状细胞的分化期间途径髓样分化因子初次应答基因88的信号的Toll样受体的情况下，免疫耐受性浆细胞样树突状细胞被诱导。
实施例4：根据Toll样受体激动剂的处理时间点确认浆细胞样树突状细胞中的细 胞因子分泌形态
为了确认根据Toll样受体激动剂的处理时间点的免疫耐受性诱导效果，通过与上述实施例1相同的方法诱导浆细胞样树突状细胞的分化，开始分化日(0day treatment)、自开始分化日到经过3天时(3day treatment)处理Toll样受体激动剂。共培养8天后，利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(VarioMACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板，处理ODN1826(1μg/ml)后，培养24小时。之后，仅分离24上清液后，通过酶联免疫吸附法确认细胞因子的分泌形态，并将其结果显示在图6。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(no-treatment，non)。
如图6所示，在开始分化日(0day treatment)或自开始分化日到第三天(3daytreatment)均处理Toll样受体激动剂的情况下，与未处理的情况(no-treatment)相比，I型干扰素(IFN-α及IFN-β)和作为代表性的炎性细胞因子的TNF-α及IL-12p70的表达被抑制，作为抗炎性细胞因子的IL-10的表达水平显著增加。
由此，确认即使在未成熟树突状细胞开始分化时间点同时处理Toll样受体激动剂和作为分化诱导用因子的FLT3L，也与在分化期间处理的情况相同地诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化。
实施例5：确认用处理Toll样受体激动剂处理的浆细胞样树突状细胞的共刺激因 子及MHC分子的表达
在包含浆细胞样树突状细胞的树突状细胞中，当识别到外部抗原时，为了激活T细胞通过MHC分子呈递抗原，并通过表达CD80及CD86等的共刺激因子来促进相互作用。
由此，用ODN1826刺激上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞后，培养24小时，之后确认了上述细胞表面分子的表达水平。首先，为了确认对分析浆细胞样树突状细胞的表面因子表达产生的影响，在4℃的温度下，对作为浆细胞样树突状细胞的特异标记的抗-CD11c(PE-Cy7，BD Biosciences)、抗-PDCA-1(PerCP-eFluor 710，ebioscience)和细胞表面分子处理特异性抗-CD80(v450，BD Biosciences)、抗-CD86(APC，ebioscience)、抗-MHC-I(PE，ebioscience)及抗-MHC-II(APC-eFluor 780，ebioscience)抗体30分钟后，通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20(BD Biosciences)进行了分析。将其结果显示在图7。然而，为了Toll样受体激动剂的处理效果，将未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图7所示，在一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中，用于呈递作为共刺激因子的CD86和外因性抗原的MHC类Ⅱ分子以高水平表达，但是在通过处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的情况下，显示出没有反应或减少反应的特点。另一方面，确认用于呈递作为另一共刺激因子中的一种的CD80和内因性抗原或交叉抗原MHC类I分子由于被Toll样受体激动剂处理，因而以高于与未处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的细胞(pDC)的水平表达。
实施例6：确认对浆细胞样树突状细胞处理Toll样受体激动剂的免疫耐受诱导分 子的表达
通常，树突状细胞通过抗原呈递诱导T细胞反应以激活后天性免疫反应，在一些免疫耐受性树突状细胞的情况下，已报告能够抑制T细胞的反应。据报告，这种免疫反应的抑制最近通过各种免疫耐受诱导分子，例如，PD-L1及IDO来被诱导。并且，据报告，CCR9+pDCs可通过调节T细胞的强烈诱导来诱导各种免疫耐受现象。
因此，在下文中，为了从上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞确认免疫耐受诱导分子的表达，在4℃的温度下，对浆细胞样树突状细胞处理作为特异性标记的抗-CD11c(PE-Cy7，BD Biosciences)及抗-PDCA-1(PerCP-eFluor 710，ebioscience)和作为免疫耐受诱导细胞表面分子的抗-PD-L1(PE，ebioscience)及抗-CCR9(FITC，ebioscience)等的细胞表面因子抗体30分钟。并且，为了测量在细胞内诱导的IDO的表达，在4℃的温度下，固定(fixation)/渗透(permeabilization)(BD Bioscience)30分钟后，染色抗-IDO(eFluor660，ebioscience)，利用流式细胞分析仪LSRFortessa x-20分析表达水平后，将其结果显示在图8。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，将上述实施例1中未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图8所示，在用Toll样受体激动剂处理的浆细胞样树突状细胞的情况下，当用ODN1826刺激时，确认与未处理的浆细胞样树突状细胞相比CCR9及IDO分子的表达量均显著增加，CCR9则在未刺激时也显示高于未处理的浆细胞样树突状细胞的表达形态。
由此，在未成熟树突状细胞的分化时处理Toll样受体激动剂的情况下，具有免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞被诱导分化。
实施例7：确认对浆细胞样树突状细胞处理Toll样受体激动剂的调节T细胞的诱导 能力
据报告，免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(Tolerogenic pDC)诱导分化成调节T细胞(Regulatory T cell，Treg)，并抑制效应T细胞(effector T细胞)的活性或增殖。
因此，在下文中，确认了基于通过处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的调节T细胞(Foxp3+CD4+T cells)的增殖与否。具体地，将从同种异型小鼠分离后用CellTrace(Invitrogen)染色的T细胞与上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)以5：1的比率混合培养5天。然而，作为上述浆细胞样树突状细胞使用用ODN1826刺激(ODN+)的浆细胞样树突状细胞和为刺激(ODN－)的浆细胞样树突状细胞。培养5天后，在4℃的温度下，将抗-CD4(Percp-cy5.5，ebioscience)处理30分钟，在37℃的温度下，将Foxp3/转录因子染色缓冲液(Transcription Factor Staining Buffer)(ebioscience)处理30分钟。之后，用抗-Foxp3(PE，ebioscience)处理后，通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖为调节T细胞，并将其结果显示在图9的(a)部分，计算调节T细胞的增殖率并将其结果显示在图9的(b)部分。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，将用ODN1826刺激(ODN+)或为刺激的一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图9所示，在一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的情况下，不诱导调节T细胞的增殖，当用ODN1826刺激(ODN+)时，反而确认抑制了调节T细胞的增殖。相反地，在用Toll样受体兴奋剂处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的情况下，可确认调节T细胞的增殖在用ODN1826刺激的情况(ODN+)下显著高于未刺激的情况(ODN－)。
由此，确认根据本发明对被诱导分化的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞进一步处理Toll样受体激动剂的情况下，免疫耐受性被激活并且也有效诱导分化为调节T细胞。
实施例8：确认作为Rv1411c蛋白的Toll样受体激动剂的活性
根据现有报告，结核杆菌来源蛋白质能够与多种Toll样受体相结合。因此，在下文中，通过确认从TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠的骨髓中分化的树突状细胞与Rv1411c蛋白的结合，来确认了作为Rv1411c蛋白的Toll样受体激动剂的活性。
具体地，分离小鼠骨髓并去除红细胞后，为了分化树突状细胞使用包含10％的FBS、1％的抗生素及100ng/ml的GM-CSF(granulocyte-macrophage-colony stimulatingfactor)的RPMI1640培养8天。培养8天后，分别对从野生型树突状细胞(WT)和TLR2基因敲除小鼠(TLR2-/-)分离的树突状细胞处理5μg/ml的Rv1411c蛋白后，间歇性地混合2个小时，使得蛋白质容易结合。之后，对标记在Rv1411c蛋白的His分子染色具有抗原-抗体特异性的抗体，通过流式细胞分析仪测量结合程度，并将其结果显示在图10。
如图10所示，确认了在野生型树突状细胞(WT)中，与TLR2敲除树突状细胞(TLR2-/-)相比，增加了与Rv1411c蛋白的结合，但是即便在TLR2敲除树突状细胞(TLR2-/-)中处理了Rv1411c蛋白也是与未处理的实验组相同的结果。
由此，Rv1411c蛋白结合到TLR2受体，并作为TL2激动剂具有活性。
实施例9：确认Rv1411c蛋白的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化诱导能力
通过与上述实施例1相同的工序诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化，使用确认了上述实施例8中的作为Toll样受体激动剂的活性的Rv1411c蛋白(0.1μg/ml，0.5μg/ml)作为Toll样受体激动剂。培养8天后，利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板，用ODN1826(1μg/ml)处理后，培养24天。分离通过培养所得上清液，并将通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme Linked Immunosorbent assay)确认细胞因子分泌形态的结果显示在图11的图表。分离通过培养所得上清液，并通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme LinkedImmunosorbent assay)确认细胞因子分泌形态，将其结果显示在图11的图表。然而，为了确认Rv1411c蛋白的处理效果，将作为未处理Rv1411c蛋白的、用ODN1826刺激(ODN+)或未刺激的(ODN－)一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图11所示，当用Rv1411c蛋白处理浆细胞样树突状细胞(Rv1411c(0.1μg/ml)-pDC，Rv1411c(0.5μg/ml)-pDC)刺激ODN1826时，在一般浆细胞样树突状细胞中强烈诱导的I型干扰素(IFN-α及IFN-β)和作为代表性的炎性细胞因子的TNF-α及IL-12p70的表达以浓度依赖性地方式骤减，作为免疫抑制性细胞因子的IL-10则以浓度依赖性地其表达水平显著增加。
由此，确认用Rv1411c蛋白处理浆细胞样树突状细胞具有免疫耐受性，这与一般浆细胞样树突状细胞不同，免疫耐受性的程度与上述Rv1411c蛋白的处理浓度成正比，因此也增加。
实施例10：确认通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的 共刺激因子、MHC分子及免疫耐受诱导分子的表达
在上述实施例9中用Rv1411c蛋白诱导分化的浆细胞样树突状细胞中，确认了表面分子及酶的表达形态。
首先，为了分析浆细胞样树突状细胞的表面因子表达影响，在4℃的温度下，对浆细胞样树突状细胞处理作为特异性标记的抗-CD11c(PE-Cy7，BD Biosciences)及抗-PDCA-1(PerCP-eFluor 710，ebioscience)和抗-CD80(v450，BD Biosciences)、抗-CD86(APC，ebioscience)、抗-MHC-I(PE，ebioscience)及抗-MHC-II(APC-eFluor 780，ebioscience)、抗-PD-L1(PE，ebioscience)及抗-CCR9(FITC，ebioscience)等的细胞表面因子抗体30分钟。并且，为了确认在细胞内诱导的IDO的表达，在4℃的温度下，固定(fixation)/渗透(permeabilization)(BD Bioscience)30分钟后，处理抗-IDO(eFluor 660，ebioscience)，之后利用流式细胞分析仪LSRFortessa x-20进行分析，并将其结果显示在图12。然而，为了确认Rv1411c蛋白的处理效果，将作为Rv1411c蛋白未处理的、ODN1826刺激(ODN+)或未刺激(ODN－)的一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图12所示，当刺激ODN1826时，在用Rv1411c蛋白未处理的一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中，用于呈递作为共刺激因子的CD86和外因性抗原的MHC类Ⅱ分子以高水平表达，相反，在通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的情况下，显示出没有反应或减少反应的特点。
相反地，在作为用于呈递作为另一共刺激因子中的一种的CD80和内因性抗原或交叉抗原MHC类I分子的情况下，用Rv1411c蛋白出来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)以高于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的水平表达。
并且，在用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的情况下，当用ODN1826刺激(ODN+)时，确认与未刺激的情况(ODN－)相比PD-L1、CCR9及IDO分子的表达量均增加，CCR9和PD-L1则在未刺激时(ODN－)也显示高于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的表达形态。
实施例11：通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的T细胞 的活性的抑制
在免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的生物体内最重要的特点是抑制的T淋巴细胞的活性。因此，为了确认上述实施例9中通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞对T细胞的增殖和活性产生的影响，进行了以下实验。
具体地，通过1X的PMA/Ionomycin(ebioscience)刺激从同种异型小鼠分离并用CellTrace(Invitrogen)染色的T细胞(1.5×105cell/well)。这种PMA/Ionomycin的处理是T淋巴细胞的增殖速度增加，并促进干扰素γ(IFN-gamma)的分泌。当产生这些反应时，混合T细胞和Rv1411c蛋白以使被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的比率成为1：5，并培养3天。3天后，处理抗-CD4(Percp-cy5.5，ebioscience)、抗-CD8(Percp-cy5.5，ebioscience)并在4℃的温度下，染色30分钟。通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20分析T细胞的增殖程度并将其结果显示在图13。并且，在分离通过培养3天所得上清液后，并通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme LinkedImmunosorbent assay)确认细胞因子分泌形态，将其结果显示在图14的图表。然而，为了确认Rv1411c蛋白的处理效果，将作为未处理Rv1411c蛋白的、用ODN1826刺激(ODN+)或未刺激的(ODN－)一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图13所示，虽然通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)和一般浆细胞样树突状细胞(pDC)均诱导T细胞，但是通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)对于CD4+T细胞的增殖诱导能力显著低于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)。
并且，如图14所示，通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)以低于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的水平诱导IFN-gamma的分泌。
实施例12：通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的调节T 细胞的分化的调节
将从同种异型小鼠分离后用CellTrace(Invitrogen)染色的T细胞与上述实施例9中用Rv1411c蛋白处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)培养5天，以使其比率成为10：1、5：1或1：1。然而，作为上述浆细胞样树突状细胞使用用ODN1826刺激的(ODN+)和未刺激的(ODN－)。培养第5天，在4℃的温度下，对细胞处理抗-CD4(Percp-cy5.5，ebioscience)30分钟，在37℃的温度下，将Foxp3/转录因子染色缓冲液(ebioscience)处理30分钟。之后，染色抗-Foxp3(PE，ebioscience)并通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖为调节T细胞，并将其结果显示在图15的(a)部分，计算调节T细胞的增殖率并将其结果显示在图15的(b)部分。
如图15所示，在一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的情况下，不诱导调节T细胞的增殖，当用ODN1826刺激(ODN+)时，反而可以确认抑制了调节T细胞的增殖。相反地，在用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的情况下，可确认调节T细胞的增殖在用ODN1826刺激的情况(ODN+)下显著高于未刺激的情况(ODN－)，并且确认T细胞对浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的比率越增加，调节T细胞的增殖率也越增加。
由此，在根据本发明对被诱导分化的免疫耐受性浆细胞样细胞进一步处理Toll样受体激动剂的情况下，也通过激活免疫耐受性来有效诱导调节T细胞的增殖。
实施例13：基于用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的效应T 细胞的活性抑制
据报告，调节T细胞诱导免疫耐受树突状细胞并抑制其他T细胞的增殖。因此，在下文中，根据上述实施例12确认了作为由Rv1411c蛋白被诱导分化的T细胞的调节T细胞的活性。
首先，分离小鼠的脾脏，去除红细胞后，使用磁性细胞分选系统(MACS)分离CD4+、CD25-效应T细胞后，为了能够识别增殖程度，染色紫色增殖染料(violet proliferationdye)。之后，将分化的T细胞与CD4+、CD25-效应T细胞在由抗CD3e和抗CD28抗体涂敷的孔中一起培养2天。其结果，相对于CD25-效应T细胞对启动T细胞的比率，测量T细胞增殖能力的变化，并以图表的方式在图16中示出。
如图16所示，确认在用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞中，只有由用ODN1826刺激的细胞(Rv1411c-pDC(ODN))诱导的T细胞减少效应T细胞的分化程度。
由此，确认在根据本发明对被诱导分化的免疫耐受性浆细胞样细胞进一步对Toll样受体激动剂处理的情况下，通过激活免疫耐受性来有效抑制效应T细胞的活性。
实施例14：用Toll样受体激动剂处理后被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的获得 产率
利用骨髓取样注射器取样C57BL/6小鼠的大腿部的骨髓。用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)洗涤取样的骨髓后，利用氯化铵除去除红细胞。将分离的细胞(5×105cell/孔)接种到6-孔板后，添加包含10％的FBS(Fetal bovine serum，小牛血清)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素/链霉素、50μM的巯基乙醇、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的丙酮酸钠及250ng/ml的FLT3L的1ml的RPMI 1640并开始培养基分化。分化开始第三天，用Toll样受体激动剂以100ng/ml至500ng/ml的浓度处理了Rv1411c蛋白和Pam3。分化开始5天后，进一步补充上述1ml的上述RPMI1640，之后培养到第八天。利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，从通过培养获取的细胞分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将测量分离的浆细胞样树突状细胞的数量(TLR agonist)的结果表示在图17的图表。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(non)。
如图17所示，确认在未成熟树突状细胞的分化期间处理Toll样受体激动剂的情况(TLR agonist)下，与未处理的情况(Non)相比，被分化诱导的浆细胞样树突状细胞的数量显著增加。
实施例15：处理Toll样受体激动剂后分化诱导的浆细胞样树突状细胞的过敏疾病 治疗效果
1.蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型的制作
为了制作蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型，根据图18所示的设计图，进行如下实验。
具体地，购买4周龄的BALB/c雌性小鼠并在无特定病原体(Specific PathogenFree，SPF)条件下纯化1周后，当5周龄时进行实验。分别在第0天和第7天将10μg的卵清蛋白(OVA)和1mg的氢氧化铝(氢氧化铝，Alum，Sigma-Aldrich Korea LTD)注射到每只小鼠的腹膜腔中100μl，以使食物过敏致敏(sensitization)。从致敏的第14天至第21天，通过每只口服给药4次10mg的蛋黄蛋白进行加强(boosting)。
2.准备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞
准备上述实施例9中处理Rv1411c蛋白来分化诱导的浆细胞样树突状细胞及常规的浆细胞样树突状细胞后，用1μg/ml的OVA肽(OVA323-339及OVA257-264)和1μg/ml的ODN1826(TLR9激动剂)刺激3小时后收集(harvest)。
为了确认通过注入如上活性化的免疫耐受性树突状细胞的食物过敏抑制效果，在致敏第14天，通过上述制备的动物小鼠模型的静脉以1×106细胞/小鼠的量通过静脉注入浆细胞样树突状细胞(i.v.)，阴性对照组是在致敏第14天仅注入磷酸化缓冲水溶液(PBS)。而且，在第一次致敏后第28天，每只小鼠口服给药50mg的OVA来诱导(challenge)过敏反应。
3.评价由蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病东都的过敏症状导致的低体温症及全身过敏反应(anaphylaxis)症状
对于由过敏反应引起的全身性过敏反应症状的评价，用肉眼观察，结果与表3中的标准相同，给出了疾病评分，其结果如图19所示。并且，是否为低体温症通过在诱导过敏反应后使用数字温度计TESTO 925(德国Tes to AG)测量直肠的体温变化1小时来确定体温过低过敏反应，其结果如图20所示，还评估了腹泻的发生率，其结果如图21所示。
表3
疾病分数 过敏性反应症状
0 没有任何症状(自由跳跃)
1 挠或揉鼻子和头周围
2 眼睛和嘴巴周围肿、活力下降、腹泻
3 气喘、呼吸困难、嘴巴和尾巴发绀
4 刺激后没有活力(反应)、抽搐、颤抖
5 死亡
如图19所示，当引发蛋黄蛋白来源食物过敏反应时，在仅处理磷酸化缓冲水溶液(PBS)的阴性对照组的情况下引发过敏性反应，从而可观察到活动量减少且眼睛和嘴巴周围肿胀且和刮擦，以及呼吸困难的现象。但是，在将通过处理Rv1411c蛋白来分化诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d)注入小鼠的情况下，没有显著变化，仅具有挠部分眼睛和嘴巴周围的的现象，与注入常规浆细胞样树突状细胞(pDS)的情况相比，可见其症状得到大大缓解。
如图20所示，当引发蛋黄蛋白来源食物过敏反应时，在仅处理磷酸化缓冲水溶液(PBS)的阴性对照组的情况下，过敏反应导致快速发生低温症状，但是在将通过处理Rv1411c蛋白来分化诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)注入小鼠的情况下，直肠温度下降幅度不大，与上述阴性对照组相比(PBS)，确认低体温症快速恢复。
并且，如图21所示，腹泻的发生率也显示仅给药磷酸化缓冲水溶液(PBS)的所有小鼠中具有腹泻症状，在注入常规浆细胞样树突状细胞(pDC)的情况下也具有80％的腹泻症状，相反，将通过处理Rv1411c蛋白来分化诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d)注入小鼠的情况下，腹泻发生率显著减少至40％左右。
由此，确认根据本发明分化诱导的免疫耐受性浆细胞样细胞具有抑制引发蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病的效果。
实施例16：蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型中免疫耐受性浆细胞样树突状细 胞对血中免疫球蛋白的影响
由免疫球蛋白E和免疫球蛋白G1抗体公知为参与介导T辅助2型的过敏反应的抗体，确认在蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型中免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的注入对血中免疫球蛋白E和免疫球蛋白G1的浓度变化有何影响。
具体地，以与上述实施例15相同的方法，制作蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型后，在注入磷酸化缓冲水溶液(PBS)或在上述实施例9中通过处理Rv1411c蛋白来分化诱导的浆细胞样树突状细胞后，给药50mg的OVA(攻击)。经过1小时后，提取小鼠血液分离血清，并确认血清中OVA-特异性免疫球蛋白E和免疫球蛋白G1的血中浓度，其结果如图22所示。
如图22所示，相对于正常组(Normal)，当用蛋黄蛋白来源食物引发过敏反应(PBS)时，OVA-特异性免疫球蛋白E和免疫球蛋白G1浓度增加，但是，在注入通过处理Rvc1411c蛋白后分化诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的情况下，确认其浓度显著减少。
由此，根据本发明分化诱导的免疫耐受性浆细胞样细胞暴露于蛋黄蛋白抗原，从而使增加的OVA-特异性免疫球蛋白的表达减少，由此抑制食物过敏疾病的引发。
实施例17：蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型中免疫耐受性浆细胞样树突状细 胞对T辅助2型细胞因子的生成的影响。
一般情况下，已知T辅助2型细胞因子的过表达在过敏性反应症状发病中起到重要作用。为此，通过向蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型注入免疫耐受性浆细胞样树突状细胞来评价血清中白细胞介素-4和白细胞介素-5的表达水平变化，并进行了确认过敏抑制效果的实验。
具体地，以与上述实施例15相同的方法，制作蛋黄蛋白诱导食物过敏疾病动物模型后，在注入磷酸化缓冲水溶液(PBS)或在上述实施例9中通过处理Rv1411c蛋白来分化诱导的浆细胞样树突状细胞后，给药50mg的OVA(攻击)。经过1小时后，提取小鼠血液分离血清，并确认血清中OVA-特异性免疫球蛋白E和免疫球蛋白G1的血中浓度，其结果如图23所示。
如图23所示，相对于正常组(Normal)，当引发蛋黄蛋白来源食物过敏反应时(PBS)，作为T辅助2型细胞因子的白细胞介素-4和白细胞介素-5表达水平增加，但是，在将通过处理Rv1411c蛋白来分化诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC 14d)注入小鼠的情况下，其表达水平显著减少。
由此，确认根据本发明分化诱导的免疫耐受性浆细胞样细胞在蛋黄蛋白诱导食物过敏发生时通过抑制T辅助2型细胞因子的的表达来抑制食物过敏疾病的引发。
以上，详细说明了本发明的特定部分，对本发明所属领域普通技术人员显而易见的是，这些具体说明仅仅是优选示例，不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附发明要求保护范围及其等同物限定。

Claims (21)

1.一种用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
包括对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来制备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
通过在上述未成熟树突状细胞开始分化之前或分化期间处理上述Toll样受体激动剂来诱导分化成免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
在上述未成熟树突状细胞从开始分化到完成分化之前处理上述Toll样受体激动剂。
4.根据权利要求2或3所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
上述未成熟树突状细胞的分化通过使用分化诱导用因子来执行。
5.根据权利要求4所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
上述分化诱导用因子为FMS样酪氨酸激酶3配体。
6.根据权利要求4所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
对上述未成熟树突状细胞处理上述分化诱导用因子一次以上。
7.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
对上述未成熟树突状细胞同时处理上述Toll样受体激动剂与上述分化诱导用因子。
8.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
处理上述Toll样受体激动剂一次以上。
9.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂途径髓样分化因子初次应答基因88信号。
10.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂包含选自由TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂及TLR13激动剂组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求10所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂还包含TLR1激动剂及TLR6激动剂中的至少一种。
12.根据权利要求2所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
还包括对被诱导分化的上述免疫耐受性浆细胞样树突状细进一步处理Toll样受体激动剂以激活免疫耐受性的步骤。
13.根据权利要求12所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
用于激活上述免疫耐受性的上述Toll样受体激动剂为TLR9激动剂。
14.根据权利要求1所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，
上述过敏性免疫疾病为选自由过敏性荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘、过敏性皮肤炎、自身免疫性肝炎、过敏性支气管肺曲霉病及过敏性口炎组成的组中的一种以上。
15.一种用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物，其特征在于，
包含通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
16.根据权利要求15所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物，其特征在于，
通过在上述未成熟树突状细胞开始分化之前或分化期间处理上述Toll样受体激动剂来诱导分化成上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
17.根据权利要求15所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂包含选自由TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂及TLR13激动剂组成的组中的一种以上。
18.根据权利要求17所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂还包含TLR1激动剂及TLR6激动剂中的至少一种。
19.根据权利要求15所述的用于预防或治疗过敏性免疫疾病的药学组合物，其特征在于，
上述过敏性免疫疾病为选自由过敏性荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘、过敏性皮肤炎、自身免疫性肝炎、过敏性支气管肺曲霉病及过敏性口炎组成的组中的一种以上。
20.一种用于预防或改善过敏性免疫疾病的化妆品组合物，其特征在于，
包含通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
21.一种用于预防或改善过敏性免疫疾病的食品组合物，其特征在于，
包含通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
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