JP6292657B2 - 樹状細胞活性化剤 - Google Patents
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Description
1.ヒメマツタケ水不溶性抽出物を有効成分として含有する樹状細胞活性化剤。
2.多糖−タンパク質複合体を含有する、上記1記載の樹状細胞活性化剤。
3.多糖−タンパク質複合体がβ1,6-グルカン-タンパク質複合体である、上記2記載の樹状細胞活性化剤。
4.以下のステップ:
(a)ヒメマツタケの子実体から、30〜85℃において85%のエタノールによる抽出操作を行い、
(b)ステップ(a)の残渣から85〜100℃の熱水による抽出を行い、
(c)ステップ(b)の残渣を、25〜35℃にて5%NaOHで抽出し、
(d)ステップ(c)で抽出された液相を酢酸溶液でpH5-6に中和し、
(e)ステップ(d)で得られた液相にエタノール沈殿を行う、
を含む抽出方法によって得られる沈殿物中に含まれる、上記1〜3のいずれか記載の樹状細胞活性化剤。
5.樹状細胞をin vitroにおいて上記1〜4のいずれか記載の樹状細胞活性化剤と接触させることを含む、樹状細胞の活性化方法。
6.上記1〜4のいずれか記載の樹状細胞活性化剤を含有するワクチンアジュバント。
本発明で使用するヒメマツタケ(Agaricus blazei Murrill)は、ハラタケ属のキノコであり、別名カワリハラタケともいう。その担子菌はブラジル国サンパウロ州ピエダーテ市郊外で採取されたものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研菌第4731号として寄託されていたが、現在では、例えば岩出菌学研究所から岩出101株として容易に入手可能である。
本発明で使用するヒメマツタケの子実体抽出物は、水不溶性多糖−タンパク質複合体であり、本明細書においてはFIII2画分と称する場合もある。ヒメマツタケからのFIII2画分の調製については既に報告されており、例えばT. Mizuno等、“Agric. Biol. Chem.”1990年, 第54巻 第11号 第2897-2905頁、H. Kawagishi等、“Carbohydrate Polymers”1990年、第12巻 第393-403頁、及びH. Kawagishi等、“Carbohydrate Research”1989年、第186巻 第267-273頁等に記載されている。
1.熱水を用いた抽出によっては抽出されず、従って天然の状態では水不溶性である。
2.多糖−タンパク質複合体であり、複合体中の多糖とタンパク質との重量比は約30:70〜80:20、好ましくは45:55〜55:45であり得る。
3.Toyopearl HW55S(東ソー株式会社製)を用い、スタンダードとしてデキストラン(Pharmacia社製)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで測定して、およそ1-5×104の分子量を有する。
4.NMR解析によって多糖部分はほぼ純粋に(1→6)β-D-グルコピラナンであった。
5.タンパク質部分はAsx、Glx、Ala、LeuおよびProに富んでいた。
樹状細胞は、生体内の種々の組織に存在することが確認されているが、骨髄の造血幹細胞に由来する造血骨髄前駆細胞から分化・誘導される。樹状細胞には、いくつかの種類(骨髄細胞、形質細胞様樹状細胞、ランゲルハンス細胞等)に分類され、これらは全て骨髄中や、臍帯血中のCD34+造血幹細胞から作られる。in vitroで樹状細胞を操作するためには、特に限定するものではないが、例えば骨髄、脾臓、血液中の前駆細胞を顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の存在下で培養することによって取得することができる。あるいはまた、胸腺等の前駆細胞を特定のサイトカインの存在下で培養することによって取得することもできる。樹状細胞の同定は、その特殊な形状と、CDllc、MHCクラスII等の特定の表面マーカーの存在によって行うことができる。
未成熟な樹状細胞は、強力な貪食作用・弱い抗原提示・MHC分子の低発現等の特徴を有し、また細胞接着分子や共刺激分子の発現が低いため、T細胞の活性化能はあまり強くない。しかしながら、抗原等を貪食した後に樹状細胞は活性化され、MHC、CD80、CD86、CD40等の表面マーカーが高発現になる。成熟樹状細胞は最も強力な抗原提示細胞として獲得免疫応答を誘導するとともに様々なサイトカイン産生を通じて自然免疫応答も活性化する。
IL-12は、樹状細胞から分泌されるサイトカインの1種であり、ナイーブヘルパーT細胞(Th0細胞)を、Th1細胞に分化させ、IFN-γ産生を誘導することが知られている。IL-12の分泌量の増大は、例えばELISA法によって検出することができる。
0.2〜8mg/kg体重、好ましくは1日当たり0.4〜4mg/kg体重の用量で使用可能である。投与の回数、頻度等は治療・予防が予期される疾患により、また投与対象者の体調等によって適宜調製し得る。
ヒメマツタケからの本発明の水不溶性抽出物の調製
本発明において使用可能な水不溶性抽出物の取得方法の一例を図1に示す。
ヒメマツタケ(岩出101株)の乾燥子実体100gから、80℃において180分間、85%のエタノールによる抽出操作を行った。抽出されずに残った残渣(307g)から90℃の熱水による抽出(180分間)を行った。再度抽出されずに残った残渣(258g)を今度は30℃にて24時間、5%NaOHで抽出し、上清に酢酸溶液を添加してpH5-6にし、3容量のエチルアルコールを添加して沈殿物を得(12.8g)、以下の実験に使用した。以下、便宜上、FIII2画分という。
樹状細胞の調製
8週齢の雌C57BL/6マウスを、ネンブタール麻酔下に犠死させた後、大腿骨および腓骨より骨髄細胞を採取した。溶血、洗浄の後、2.0×106個に調整し、これを2,000U のGM-CSF (Peprotec社, Frankfurt, Germany)を添加した10mlのDC培養液(RPMI 1,640+10% FBS+0.000375% 2-ME+1% ペニシリン)にて、5%CO2存在下に37℃で培養した。培養3日目に、2,000UのGM-CSFを添加した10mlの培養液を加えた。培養6日目に90%以上の細胞が樹状細胞(CDllc MHCクラスII)の表現型を示した。これらの樹状細胞を以下の実験に用いた。
樹状細胞を1.2×106cells/mlに調整の後、実施例1で得られた本発明の抽出物(乾燥重量)(1、2.5、5.0、10、または25μg/ml)、あるいはレンチナン(10または25μg/ml :シイタケ由来,味の素(株))を添加し、5% CO2存在下に37℃で48時間培養した。培養後、細胞と培養上清に分離した。
樹状細胞における表面マーカー発現に対する影響
実施例2で得られた樹状細胞について、以下の成熟化細胞表面マーカー:CD40、CD80、CD86、およびMHCクラスII分子の発現をフローサイトメトリー解析によって検出したところ、以下のような顕著な活性化結果が示された。結果は平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity:MFI)について対照サンプル(いずれの活性化剤も添加しなかった場合)の数値を100とした場合の相対強度(%)で示す。尚、図面中、本発明の抽出物をFIII2、レンチナンをLNTNとし、添加量(μg/ml)を付記して各サンプルの記載とする。
図2に示す結果から明らかなように、本発明の抽出物を添加した場合、対照と比較して、2.5μg/mlで30%以上、25μg/mlで80%以上の活性化効果が示された。10μg/mlレンチナンを添加した場合と比較して、本発明の抽出物の添加では、2.5μg/ml以上の濃度で有意差がみられ、著しく活性化していることが判明した。
図3に示す結果から明らかなように、本発明の抽出物を添加した場合、対照と比較して、5μg/mlで100%以上の活性化、25μg/mlでは10倍近い活性化効果が示された。レンチナンを添加した場合と比較して、本発明の抽出物の添加では、2.5μg/ml以上の濃度で有意差がみられ、著しく活性化していることが判明した。
図4に示す結果から明らかなように、本発明の抽出物を添加した場合、対照と比較して、10μg/mlで10倍を超える活性化、25μg/mlでは20倍近い活性化効果が示された。レンチナンを添加した場合と比較して、本発明の抽出物の添加では、1μg/ml以上の濃度で有意差がみられ、著しく活性化していることが判明した。
図5に示す結果から明らかなように、本発明の抽出物を添加した場合、対照と比較して、10μg/mlで3倍を超える活性化、25μg/mlで4倍を超える活性化効果が示された。10μg/mlレンチナンを添加した場合と比較して、本発明の抽出物の添加では、5μg/ml以上の濃度で有意差がみられ、著しく活性化していることが判明した。
樹状細胞からのサイトカイン分泌に対する影響
樹状細胞から分泌された以下のサイトカイン:TNF-α、IL-10、IL-12、およびIL-6について、ELISAによって濃度を測定したところ、以下のような結果が得られた。結果は対照サンプルの数値を100とした場合の相対濃度(%)で示す。
図6に示す結果から明らかなように、10μg/mlの本発明の抽出物の添加によって、10μg/mlのレンチナンの添加と比較して3倍以上の分泌量の増大がみられ、レンチナンよりも有意な樹状細胞活性化効果が認められた。
図7に示す結果から明らかなように、本発明の抽出物を添加した場合、対照と比較して、10μg/mlの本発明の抽出物の添加によって10倍を超える活性化効果が示された。5.0μg/mlの本発明の抽出物の添加によって、10μg/mlのレンチナンの添加と比較して有意差がでており、10μg/mlでは、同量のレンチナンを添加した場合の6倍以上の活性化効果がみられた。
図8に示す結果から明らかなように、10μg/mlの本発明の抽出物を添加した場合、同量のレンチナンの添加と比較して5倍以上の分泌量の増大がみられ、レンチナンよりも有意に高い活性化効果がみられた。
図9に示す結果から明らかなように、10μg/mlの本発明の抽出物の添加によって、対照および同量のレンチナンを添加した場合と比較して10倍以上の分泌量の増大がみられ、レンチナンよりも高い樹状細胞活性化効果が認められた。
CD4陽性T細胞におけるサイトカイン発現に対する影響
実施例2で得られた樹状細胞を、OT-IIマウスの脾臓から取り出したCD4陽性T細胞と共培養した後、T細胞成分を細胞内染色によるフローサイトメトリー分析にて測定し、IL-17の発現を検出したところ、図10に示す結果から明らかなように、25μg/mlの本発明の抽出物を添加した場合、同濃度のレンチナンを添加した場合と比較してT細胞内でのサイトカインの発現を有意に活性化していることが判明した。結果は平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity:MFI)について対照サンプルの数値を100とした場合の相対強度(%)で示す。
CD4陽性T細胞からのサイトカイン分泌に対する影響
実施例5で得られた共培養上清について、サイトカインIL-17およびIFN-γの濃度をELISA法にて測定したところ、以下のような結果が得られた。結果は対照サンプルの数値を100とした場合の相対濃度(%)で示す。
図11の結果から明らかなように、10、25μg/mlの本発明の抽出物を添加した場合、同濃度のレンチナンを添加した場合と比較して分泌量が増大しており、T細胞が有意に活性化されていることが判明した。これによって、樹状細胞、好中球などの免疫細胞が有意に活性化していることが認められた。
図12の結果から明らかなように、10、25μg/mlの本発明の抽出物を添加した場合、同濃度のレンチナンを添加した場合と比較して分泌量が増大しており、T細胞が有意に活性化されていることが判明した。
Claims (6)
- ヒメマツタケ水不溶性抽出物を有効成分として含有する樹状細胞活性化剤であって、in vitroにおいて樹状細胞1×10 6 個に対して乾燥重量で1〜100μgの範囲の水不溶性抽出物を使用する、上記樹状細胞活性化剤。
- ヒメマツタケ水不溶性抽出物が多糖−タンパク質複合体を含有する、請求項1記載の樹状細胞活性化剤。
- 多糖−タンパク質複合体がβ1,6-グルカン-タンパク質複合体である、請求項2記載の樹状細胞活性化剤。
- 以下のステップ:
(a)ヒメマツタケの子実体から、30〜85℃において85%のエタノールによる抽出操作を行い、
(b)ステップ(a)の残渣から85〜100℃の熱水による抽出を行い、
(c)ステップ(b)の残渣を、25〜35℃にて5%NaOHで抽出し、
(d)ステップ(c)で抽出された液相を酢酸溶液でpH5-6に中和し、
(e)ステップ(d)で得られた液相にエタノール沈殿を行う、
を含む抽出方法によって得られる沈殿物中に含まれる、請求項1〜3のいずれか1項記載の樹状細胞活性化剤。 - 樹状細胞をin vitroにおいて請求項1〜4のいずれか1項記載の樹状細胞活性化剤と接触させることを含む、樹状細胞の活性化方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の樹状細胞活性化剤を含有する、樹状細胞ワクチンのためのアジュバント。
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