CN1845988B - 肿瘤免疫治疗的方法 - Google Patents

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Abstract

制造对抗原反应性树突细胞的方法，包括获得树突细胞的样品，使细胞接触抗原和至少一种Toll-样受体刺激剂。通过该方法激活的树突细胞提供了治疗肿瘤和产生自体免疫疾病动物模型的手段。

Description

肿瘤免疫治疗的方法
技术领域
本发明涉及产生反应性树突细胞的方法，尤其是涉及反应性树突细胞用于肿瘤疫苗接种的用途，来产生器官衰竭的动物模型和用于体外药物筛选。
背景技术
目前感染和炎症已经成为心血管病1的重要风险因素，西方社会死亡的主要原因。实际上，血清中炎性标记物的升高预示着冠心病2和扩张性心肌病3，4患者的预后。尤其是，扩张性心肌病，年轻患者中心力衰竭的最常见原因5，6，7，已经与感染亲心脏病毒后的自体免疫应答相关联，因为这些患者中的许多人显示了对抗心脏蛋白的自体抗体6，7，8。相似的自体免疫机理涉及感染原生动物Trypanozoma cruzii后的心力衰竭7。通过多个传统标准24来表征自体免疫，包括限定的自体抗原、器官特异性和自体反应性T-细胞和/或可以转移疾病的自体抗体。
动物模型支持微生物感染可以引发对抗心脏组织的自体免疫应答的意见7。在Coxsackie B37和Trypanozoma cruzii 9感染后，限定遗传背景的小鼠产生了持续很久的心肌炎，伴随自体反应性T-细胞。相同的小鼠品系中，用心脏特异性α-肌球蛋白或十六氨基酸免疫，α-肌球蛋白重链抗原决定部位和强烈的佐剂一起诱导T-细胞介导的心肌炎7，10，11。重要地，已经显示正常小鼠的心脏含有大量组织驻留细胞呈递内源心脏特异性肽12。然而，还不知道树突细胞呈递内源自体抗原是否有助于自体免疫心脏疾病和可能的心力衰竭。需要的是允许研究者来研究年轻患者中产生心肌病机理的动物模型，更重要地是，来鉴定干扰该疾病发展化合物的动物模型。
树突细胞在抗原特异性免疫应答13，14，15以及免疫耐受性16，17的诱导中是关键性的参与者。不成熟的树突细胞位于外周组织中，它们在其中通过胞吞作用和macropinocytosis从其环境中主动取样。一旦遇到病原体，它们经历称为树突细胞成熟的发展程序，其包括共刺激活性的诱导、抗原加工、提高的MHC分子表达和至淋巴结的迁移，它们在其中引发天然抗原特异性T细胞13。树突细胞还加工来自碎片和死细胞的内源抗原13，15，16。因此提出如果适当激活，树突细胞可能引发自体反应性T细胞13，17。存在增加的证据：在合适刺激不存在下，垂死细胞和自体组织的加工给予了树突细胞对CD8+T-细胞18和CD4+T-细胞19介导的免疫应答的致耐受性。因此目前的研究聚焦于树突细胞在维持自体耐受性中的作用。一些研究已经表明树突细胞可以在病毒抗原表达的转基因模型中诱导器官特异性炎症20，但是仍然只有激活的树突细胞可以诱导对自体抗原的自体免疫性的间接证据13，21。此外，从未显示用自体蛋白脉冲的树突细胞实际上能够在“天然”小鼠中诱导自体免疫性。树突细胞表达多个Toll-样受体，因此这些细胞关键性地位于适应免疫性和先天免疫性的界面上21。先天免疫系统是宿主防御感染的普遍而古老的形式21。
树突细胞是由遍布组织分布的异种细胞群构成的。由于树突细胞在外周血中的低出现率、淋巴器官的有限可达性和树突细胞分化的终点状态，树突细胞用于研究和更多实践应用的用途受到限制。通过该方法激活所需要的树突细胞数量大约为至少1×106个细胞。需要的是一种需要更少细胞来激活树突细胞的方法，大约5×104个至2×105个细胞。
研究已经显示一定程度上免疫系统能够杀灭肿瘤细胞；然而肿瘤常常占优势。已经提出了治疗癌症的各种免疫治疗方法，但是还没有实现成功地引起对靶肿瘤有效和特异性免疫治疗响应的治疗方法。需要的是对体内肿瘤持续并特异性产生免疫应答的方法，导致肿瘤的根除。
在没有与此不一致的程度上将在此涉及的所有出版物和专利申请全部引入作为参考。
发明内容
公开了激活树突细胞使其变成对选定的抗原反应性的方法。该方法中，将树突细胞暴露于选定的抗原和Toll-样受体(TLR)的刺激剂，TLR激活树突细胞中的TLR途径。
当树突细胞暴露于其的选定抗原是自体抗原或组织特异性抗原时，将激活的树突细胞再次引入其组织携带该抗原的动物中，导致动物中产生自体免疫疾病。这提供了产生自体免疫疾病或组织特异性自体免疫损伤的动物模型的方法。与自体免疫疾病相关的自体抗原的选择使得可以模拟自体免疫疾病，如在此所述的。
当树突细胞暴露于其的选定抗原是肿瘤抗原时，将激活的树突细胞再次引入肿瘤患者中，提供了免疫治疗的新方法，如在此所述的。
根据本发明的一实施方案，提供了制造对抗原反应性的树突细胞的方法，包括：
获得树突细胞的样品；和
使树突细胞接触抗原和接触至少一种Toll-样受体(TLR)刺激剂。
根据本发明的另一实施方案，提供了治疗动物中肿瘤的方法，包括获得肿瘤表达的肿瘤抗原，从动物获得树突细胞的样品，通过上述的方法制得对肿瘤抗原反应性的树突细胞，并将反应性的树突细胞再次引入动物中。
根据本发明的再一实施方案，提供了制造自体免疫疾病动物模型的方法，包括获得与自体免疫疾病相关的抗原，从非人动物获得树突细胞的样品，通过上述方法制得对自体免疫疾病相关抗原反应性的树突细胞，并将反应性的树突细胞再次引入动物中。
根据本发明的另一实施方案，提供了制造器官衰竭动物模型的方法，包括获得器官特异性自体抗原，从非人动物获得树突细胞的样品，通过上述方法制得对自体抗原反应性的树突细胞，并将反应性的树突细胞再次引入动物中。
根据本发明的再一实施方案，提供了如上所述的方法，其中抗原是myhc-α肽。
根据本发明的另一实施方案，提供了针对其调节动物自体免疫疾病发展的能力筛选候选化合物的方法，包括获得与自体免疫疾病相关的自体抗原，从非人动物获得树突细胞的样品，通过权利要求1至12任一项的方法制得对自体抗原反应性的树突细胞，并将反应性的树突细胞再次引入动物中，其中在选自接触自体抗原之前、接触自体抗原的过程中、接触自体抗原之后接触TLR刺激剂之前、接触TLR刺激剂的过程中以及接触TLR刺激剂之后的时间，使树突细胞接触候选化合物，并将动物的自体免疫反应与用制得的对相同自体抗原反应性的并未暴露于化合物的树突细胞处理的动物的自体免疫反应相比较。
附图说明
从以下本发明特定实施方案的详述中将进一步理解本发明，参照附图，其中：
图1显示了0×放大倍数(画面a和b)，140×放大倍数(画面c和d)和560×放大倍数(画面e和f)的小鼠心脏组织切片的显微照相。画面1a和1c显示了正常的心脏组织，而画面1b、1d、1e和1f显示了在响应肌球蛋白重链α(myhc-α)肽残基614至629部分脉冲的激活树突细胞中产生的发炎的心脏组织。
图2，画面a，显示了接种myhc-α或OVA脉冲的激活树突细胞小鼠的CD4+T-细胞的INF-γ和IL-4产生，以pg/ml表示；画面2b显示了接种myhc-α或对照ova-肽(OVA)脉冲的激活树突细胞小鼠中自体IgG抗体的体内产生；画面2c显示了心脏组织的切片，显示了注射nyhc-α引发的CD4+T细胞的SCID小鼠中的心肌炎，但是在注射OVA引发的CD4+T细胞的小鼠中没有心肌炎。
图3显示了表明接种myhc-α脉冲的激活树突细胞小鼠中收缩机能障碍和扩张性心肌病发作的数据。图3a显示了心脏对体重的比例，图3b显示了左心室舒张期末直径(LVEDD)，图3c显示了对照和测试小鼠的超声心电图。图3d显示了纤维鞘收缩速度(VCFC)和图3e显示了收缩分数(FC)。
图4显示了接种myhc-α脉冲的激活树突细胞后，0×放大倍数和140×放大倍数的小鼠心脏组织横截面。图4a和4d显示了将CD40-/-树突细胞接种入CD40+/+宿主中时的心脏组织。图4b和4e显示了将CD40+/+树突细胞接种入CD40-/-宿主中时的心脏组织。图4c和4f显示了将CD40+/+树突细胞接种入CD40+/+宿主中时的心脏组织。
图5显示了接种myhc-α脉冲的树突细胞10天后，560×放大倍数的小鼠心脏组织横截面，树突细胞是用以下物质来激活的：(画面a)LPS/抗CD40；(画面b)dsRNA/抗CD40；(画面C)CpG/抗CD40；和(画面d)PGN/抗CD40。
图6a、6b和6c显示了用LPS/抗CD40刺激12小时后，共刺激分子在CD40+/+(蓝色)和CD40-/-(红色)树突细胞上的表达。FACS柱状图控制于CD11c+CD11b+MHC类II+活细胞(ICAM，B7.1，B7.2)或CD11c+CD11b+活细胞上。
图7显示了通过用所示的Toll-样受体刺激剂(1μg/ml LPS、100μg/ml聚(I：C)(dsRNA)或10μM CpG-ODN)刺激树突细胞12小时细胞因子TNF-α、IL-12p70、IL6和IL-1β的产生，在刺激性的抗CD40抗体(αCD40：5μg/ml)不存在或存在下。数据表示为四个培养孔的平均(±SD)并代表具有相似数据的几个实验中的一个。
图8，画面a，以示意图的形式显示了提出的自体免疫发病机理的模型，其中组织损伤释放由树突细胞捕获和呈递的自体抗原。如果Toll-样受体激活发生，自体反应性T细胞响应上升，其通过CD40-CD40L的相互作用来扩增。
图8b显示了注射2×106凋亡的心肌细胞(i.p.)而没有LPS的对照小鼠的心脏组织没有诱导心肌炎(6只小鼠中为0)。图8c显示了一起注射2×106凋亡的心肌细胞(i.p.)和LPS(在第0、1、2天10μg i.p.)的小鼠心脏组织导致了8只小鼠中7只心脏炎症(箭头)。重要的是，单独接种LPS没有诱导心脏炎症(5只小鼠中为0；未显示)。LPS/心肌细胞对心肌细胞p＜0.0001(Fisher’s精确检验)。图8d显示了i.p.接种LPS和2×106凋亡的心肌细胞(LPS)或只接种了凋亡心肌细胞的对照10天后，抗myhc-αIgG抗体滴度。单独接种心肌细胞没有诱导相应的抗体滴度(对照)。显示了个体小鼠的数据。
发明详述
一实施方案中，本发明提供了刺激树突细胞使其变成对抗原反应性的方法。
如本领域技术人员公知的，“树突细胞”是免疫系统的细胞，其吸收和呈递自体抗原和外源抗原，且在成熟过程中形成树突。
可以通过科学文献中所述的各种方法获得树突细胞。合适的组织来源包括外周血、骨髓和淋巴组织如脾或淋巴结。例如，可以通过Lutz等所述的通过培养从骨髓获得树突细胞40，或通过用树突细胞表面标记例如CD11c+特异性的磁珠富集直接从脾或淋巴结细胞的悬浮液分离。
发现通过Lutz等的方法从小鼠骨髓分离的树突细胞群的大部分(～80％)为CD11c+CD11b+。本发明不受限于该树突细胞的子集，本发明的方法可以应用至任何来源的任何树突细胞群。优选未成熟的树突细胞。
分离的树突细胞可以任选地通过CD11c+阳性选择来进一步富集，例如使用磁珠(MACSTM，Miltenyi Biotech)。对于人的临床使用优选这样更纯的细胞群。
本发明的一实施方案中，使分离的树突细胞接触选定的希望细胞变成反应性的抗原和至少一种Toll-样受体(TLR)刺激剂。
可以使分离的树突细胞接触选定的抗原一段合适的时间，接着使树突细胞接触至少一种Toll-样受体(TLR)刺激剂再一段时间。
对于是短肽而不需要树突细胞加工的抗原，30至60分钟的抗原暴露时间就足够了。对于更复杂的抗原，如整个蛋白质或粗制的细胞制剂，抗原暴露应该约为12至24小时。
通常，1至20μg/ml的抗原浓度是适于抗原暴露的。一些抗体的高含量对树突细胞是毒性的，但是本领域技术人员可以容易地决定最佳抗原浓度或范围。
用于TLR刺激剂激活TLR的时间段可以为1至4小时，优选约1至2小时，尤其如果使用高浓度的TLR刺激剂，如在此所述的。
刺激或激活TLR家族成员的材料是本领域技术人员已知的并描述于科学文献中。本发明方法中任何TLR配体可以用作TLR刺激剂来激活树突细胞。合适的TLR包括，例如，脂多糖(LPS：大肠杆菌0111：B4：Sigma)、聚(I：C)(Amersham)、CpG-ODN或肽聚糖(PGN：金黄色葡萄球菌：Fluka)。
如在此公开的数据所示的，通过本发明方法的树突细胞激活不受限于一种特定TLR的刺激，因为已经成功使用刺激不同TLR的刺激剂。
本发明进一步的实施方案中，使树突细胞同时接触TLR刺激剂和抗CD40抗体。抗CD40抗体可以商业获得。
与单独TLC刺激剂激活相比较，用TLR刺激剂和抗CD40抗体共激活树突细胞同时提高了处理细胞的反应性和寿命。3至5μg/ml的抗CD40抗体浓度获得了良好的结果，但是也可以使用该范围外的浓度。
通过上述方法制备的反应性树突细胞是多个新方法的基础。
例如，如果树突细胞暴露于其的选定抗原是肿瘤抗原，对该抗原反应性的树突细胞可以用于衍生该抗原的肿瘤的免疫治疗中。
根据该实施方案，本发明提供了治疗动物如人肿瘤的方法，通过获得肿瘤表达的肿瘤抗原，从动物获得树突细胞的样品；使树突细胞接触肿瘤抗原一段合适的时间；使树突细胞接触至少一种TLR刺激剂一段合适的时间，以及还任选地接触抗CD40抗体一段合适的时间，如上所述；并将激活的树突细胞再次引入动物中。
最初，从肿瘤获得活组织切片样品使得可以鉴定一种或多种肿瘤表达的抗原。活组织切片样品可以筛选已知的、特征性的肿瘤抗原。如果这些中的一种或多种得到了鉴定，相应的合成抗原蛋白或肽可以用于接触树突细胞。如果没有已知的肿瘤抗原得到鉴定，从肿瘤的活组织切片制得单细胞悬浮液，并通过已知的方法例如辐射或加入化合物使细胞悬浮液凋亡。将凋亡的细胞制剂用于接触患者的树突细胞并将该细胞暴露于肿瘤抗原。
从带有肿瘤的动物获得树突细胞的样品，例如从外周血或骨髓，如上所述。优选，在细胞因子如IL-10的存在下培养树突细胞来抑制成熟并使细胞体外接触合成的肿瘤抗原或凋亡的细胞制剂12至24小时。带有肿瘤的动物可以是人。
如果使用了细胞因子，洗涤树突细胞来除去细胞因子，并接触至少一种TLR刺激剂和任选地抗CD40抗体，如上所述。洗涤处理过的细胞并再次引入带有肿瘤的动物中，例如通过静脉输注或皮下注射。可能需要细胞的重复递送来维持动物对肿瘤的免疫应答。对于人的免疫治疗，根据决定合适剂量的常规方法，通过治疗医师来决定合适的细胞剂量和重复递送的时间选择。
可以通过本发明方法治疗的肿瘤包括但不限于骨髓瘤、肾细胞癌、白血病和淋巴瘤。
本发明的方法还可以用于产生各种自体免疫疾病的动物模型，来帮助理解这些疾病的产生和提供测定候选化合物停止或干扰疾病进展能力的筛选工具，提供疾病治疗的潜在药物化合物的鉴定。
为了建立这样的动物模型，通过在此所述的方法刺激从动物获得的树突细胞来使其变成自体免疫疾病相关自体抗原反应性的，然后再次引入动物中使疾病产生。
例如，为了建立自体免疫心脏病的动物模型，在本发明的方法中，使来自非人动物的树突细胞接触心脏特异性抗原，如在此所述的myhc-α肽，和TLR刺激剂，然后再次引入动物中来产生心肌炎，如在此所述的。
相似地，可以建立其它疾病如哮喘或关节炎的动物模型。例如，构成关节软骨基质的胶原或其它结构蛋白可以用作产生关节炎动物模型的抗原，胰岛素原用作糖尿病模型的抗原，肌球蛋白肽用作自体免疫心肌炎模型的抗原，MOG和其它髓磷脂衍生的肽用于自体免疫脑脊髓炎，以及外源气管抗原用于哮喘。
可以使用各种哺乳动物来建立动物模型，包括小鼠、大鼠和猪。
本发明的另一实施方案中，提供了激活树突细胞来诱导可以用作研究器官衰竭模型的器官特异性自体免疫性的方法。使用如上所述的方法，改为用于脉冲树突细胞的自体抗原是器官特异性的，将激活的树突细胞再次引入动物中后，导致器官衰竭。鼠α-肌球蛋白重链肽(myhc-α614-629)[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH]11，23(myhc-α)用作自体抗原来诱导扩张性心肌病以及随后的心力衰竭。该模型系统可以用于阐明其中器官衰竭具有自体免疫成分的疾病中所涉及的机理，例如糖尿病、关节炎、狼疮，等。
本发明的另一实施方案中，提供了激活树突细胞并将这些细胞用作体外药物筛选试验来鉴定能够影响器官特异性自体免疫发展的化合物的方法。使用如上所述的方法，例如使用自体免疫疾病的动物模型，并进一步包括在抗原脉冲之前、脉冲的过程中、脉冲之后TLR激活之前、TLR激活的过程中或TLR激活之后，将测试化合物应用至树突细胞的步骤。所应用的化合物可以影响靶器官中自体免疫性的发展或进程，抑制或促进。将激活的树突细胞再次引入测试动物中后，进行测定应用的化合物是否已经影响了动物中自体免疫性的发展或进程。
已经显示了接种心肌特异性自体肽脉冲的树突细胞诱导了CD4+T-细胞介导的自体免疫心肌炎。树突细胞介导的心脏炎症进展并恶化成扩张性心肌病，甚至在急性炎症浸润液消退后仍导致心力衰竭。重要地，树突细胞介导的自体免疫性和心脏疾病只在通过Toll-样受体激活树突细胞时发生。此外，疾病的发病机理依赖于CD40的共刺激。因此，先天免疫系统和适应性免疫系统的协调激活使树突细胞变为自体侵袭性。
自体免疫性和心力衰竭
用myhc-α脉冲的树突细胞免疫导致心室扩张、收缩性削弱，并在急性炎症浸润液消退后导致纤维化改变。这些数据与感染后心肌病患者的外植心脏或活体切片不必定显示炎症浸润液的事实一致，甚至在自体抗体存在下5。因此，结果反映出人感染后扩张性心肌病的发病机理。小鼠树突细胞免疫后，产生了对抗myhc-α抗原决定部位以及对抗其它肌球蛋白抗原决定部位的自体抗体。产生了是否这些自体抗体有助于或甚至介导了急性炎症浸润液消退后心力衰竭的问题。例如，对抗心肌细胞表面蛋白的自体抗体介导了缺失负向免疫调节PD-1受体的BALB/c小鼠中的心力衰竭31。或者，心脏功能障碍可能反映出心脏应付导致病理改变和纤维化的组织破坏的无能。
感染和炎症已经成为心血管疾病的重要风险因素1，西方社会死亡的主要原因。这些结果表明在树突细胞上自体抗原呈递与TLR刺激一起足以引发自体免疫心脏病可以解释脓毒病患者的心脏功能障碍32和心肌梗塞后恶化进程和全身炎症响应规模之间的临床关联1，2，3，4。此外，已经提出感染原生动物Trypanozoma cruzii后心力衰竭的自体免疫机理9。我们的实验系统建立了新的体内疾病模型来研究炎症后心力衰竭的病理生理学和发展新的治疗策略。重要地，我们的数据提供了自体免疫心脏疾病与扩张性心肌病以及心力衰竭发展之间的直接因果关联。
先天免疫性、感染和自体免疫性
自体免疫疾病影响高达总人群的10％。除了遗传易感性外，环境触发剂和感染剂已经涉及多种自体免疫疾病的发病机理7，33。然而，大多数自体免疫疾病中，从来没有鉴定过成因的感染剂，且不知道不同的病原体怎样打破免疫耐受性并引发组织特异性自体免疫性。
这些结果表明对诱导组织特异性自体免疫心脏病必需的TLR激活提供了自体免疫性发病机理的分子框架。在心脏损伤和微生物感染的范围内，自体肽脉冲的树突细胞可以通过TLR3作用的病毒RNA来刺激，而细菌可以通过细胞壁产物如肽聚糖、LPS或未甲基化的DNA来诱导TLR2、4和921。此外，亲心脏原生动物T.cruzii的产物最近已经显示可激活树突细胞上的TLR234。因此，自体免疫性不必定需要微生物抗原和自体蛋白之间的抗原模拟33。相反地，与先天免疫系统激活相呼应的组织损伤似乎引发了遗传易感个体中的自体免疫性(图7a)。相反，释放的自体抗原在稳定状态条件下或只存在最小树突细胞刺激时的摄取可以导致自体反应性T-细胞的耐受性和下调17，18，19。
人和实验动物模型中的自体免疫性通常显示复发疾病模式7，33。例如，扩张性心肌病患者通常显示任何原因感染后其心脏功能的快速恶化4。令人好奇地，myhc-α诱导的心肌炎消退后，小鼠的TLR体内激活导致心脏浸润的复发和心脏功能的快速恶化(U.Eriksson & JosefM.Penninger，未公开)。因此，先天免疫系统的非特异性体内刺激可以快速诱导之前引发过动物中的组织特异性炎症。因此，我们提出自体免疫疾病的恶化和复发可能发生在经历TLR体内非特异性刺激的遗传易感人群中。
这些结果表明树突细胞可以诱导快速发作，天然小鼠响应内源抗原的器官特异性自体免疫性。提出的树突细胞诱导的心肌炎的模型提供了诱导自体免疫性和心力衰竭的新实验范例。自体抗原脉冲的树突细胞诱导大量自体免疫性的能力需要扩展至其它系统如哮喘或关节炎。模型系统的使用将帮助选择性作用于树突细胞的自体免疫疾病的新治疗策略的设计和发展以及最佳化基于组织特异性树突细胞的癌症疫苗接种实验方案。由于两者，树突细胞介导的自体免疫性和心脏病只在通过Toll-样受体激活树突细胞时发生，这些结果提供了关于组织损伤和多个感染引发剂怎样诱导自体免疫疾病和慢性心肌病的统一理论。
具体实施方式
为了说明的目的描述了实施例，并不是来限制本发明的范围。
本公开中涉及但没有明确描述的化学、分子生物学、蛋白质和肽生化以及免疫学方法和实施例报道于科学文献中且是本领域技术人员公知的。
为了统计学分析，通过Fisher’s精确检验分析二分数据。Mann-Whitney U测试用于严重程度得分的评价。使用ANOVA和t-测验比较增殖响应和细胞因子水平。
实施例1-自体抗原脉冲的、激活的树突细胞诱导心肌炎
为了测定自体蛋白脉冲的DC是否可以引发内源抗原的自体免疫性，将之前鉴定的心肌特异性α-肌球蛋白肽，残基614至62911，23(myhc-α)用于接种小鼠。所有使用的小鼠是野生型小鼠、缺失B和T-细胞的SCID小鼠，或IL4Rα-/-小鼠，且所有的都是BALB/c背景和从Jackson Laboratories购买的。将小鼠饲养于特定的无病原体条件下。如Lutz等中所述的产生骨髓衍生的树突细胞40。荧光激活细胞分类(FACS)分析显示超过80％的树突细胞是CD11c+CD11b+树突细胞，使用磁珠(MACSTM，Miltenyi Biotech)通过CD11c+阳性选择来进一步富集。用10μg/ml鼠α-肌球蛋白重链肽(myhc-α614-629[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH])脉冲过夜后11，23，用TLR刺激剂激活树突细胞4小时，刺激剂包括1μg/ml的LPS(大肠杆菌0111：B4；Sigma)，100μg/ml的聚(I：C)(Amersham)，10μM的CpG-ODN，或10μgml的PGN(金黄色葡萄球菌；Fluka)，用或不用5μg/ml的抗CD40抗体(克隆3/23，Pharmingen)，或1μg/ml的RANK-L(R&D Biosystems)。为了一些实验，在抗CD40抗体的存在或不存在下，用500U/ml的TNF-α或10ng/ml的IL-1β(两者都来自Pepro Tech)刺激树突细胞。
给BALB/c(H2d单倍体)小鼠注射同源的、myhc-α脉冲的CD11c+CD11b+CD80+CD86+CD8-MHC类II+骨髓衍生的树突细胞，树突细胞用TLR-引发剂LPS和/或刺激性抗CD40抗体激活。给小鼠i.p.注射50,000至200,00个树突细胞/小鼠。对照小鼠接受ova-肽(OVA)脉冲的激活的树突细胞。将小鼠处死并在第一次DC接种后的不同时间点取出心脏。使用0至4的级别对心肌炎评分，其中0表示没有炎症浸润液；1意味着肌细胞之间炎症细胞的小转化灶；2意味着多于100个炎症细胞的较大转化灶；3意味着涉及多于10％的横截面；和4意味着涉及多于30％的横截面。
接种myhc-α或OVA肽脉冲的LPS/抗CD40激活的树突细胞10天后小鼠的心脏切片显示于图1中。显示用OVA脉冲的树突细胞免疫的小鼠中不存在炎症的对照心脏显示于图1a和1c中。图1b和1d中，通过箭头表示接种myhc-α脉冲的树突细胞后的大量炎症。显示了典型的整个心脏的图像和较大的放大倍数(×140)(H&E染色)。为了冰冻心脏切片上的免疫组织化学，使用以下的抗体：抗MHC II(生物素化的，Serotec，MCA46B)、抗CD3(KT3-1.1)、抗CD4(YTS 191)、抗CD8(YTS 169)和抗CD11c(2.5mg/ml，克隆HL3，Pharmingen)。图1e和1f显示了免疫组织化学染色的横截面，说明了由少量CD8+细胞(1e，箭头)和大量CD4+细胞(1f，箭头)构成了浸润液。原始放大倍数×560。
接种非特异性OVA肽脉冲的激活的树突细胞或接种非激活的、myhc-α脉冲的树突细胞都没有诱导心脏炎症(图1a、c，表1)。用抗CD40抗体单独激活树突细胞在诱导心肌炎中也是无效的。此外，使用之前建立的成熟实验方案13，14接种myhc-α脉冲的、LPS和抗CD40激活24小时的树突细胞没有导致心脏炎症(数据未显示)。
用myhc-α脉冲树突细胞后接着用抗CD40和LPS非常短的体外激活4小时给予了树突细胞反应性。这些树突细胞的接种诱导了Balb/c小鼠中的大量心肌炎(图1b、d，表1)。树突细胞免疫后5天开始疾病发作非常迅速并在10天达到峰值。重要的是，甚至单一接种myhc-α脉冲的树突细胞也诱导了疾病，但是与重复接种相比较，发病率较低。此外，用LPS单独激活的myhc-α脉冲的树突细胞还诱导了较低发病率的中度心脏炎症(表1)。这些结果提供了树突细胞可以诱导天然小鼠响应内源抗原的器官特异性炎症的快速发作的第一个实验证据。
表1.myhc-α脉冲的树突细胞引发自体免疫心脏病
接受者 抗原 激活[体外]  树突细胞接种(天)  发病率(第10天)  第10天的严重程度[中值(个体数据)]
野生型 myhc-α LPS/α-CD40  0、2、4  10/10*  3(1，2，2，3，3，3，3，4，4，4)
野生型 myhc-α 无  0、2、4  0/5
Figure 10003_1
  0
野生型 OVA LPS/α-CD40  0、2、4  0/8*  0
野生型 myhc-α LPS/α-CD40  0  3/6  3(0，0，0，3，3，3)
野生型 OVA LPS/α-CD40  0  0/5  0
野生型 myhc-α LPS  0、2、4  4/7  1(0，0，0，1，1，2，2)
Figure 10003_2
野生型 myhc-α α-CD40  0、2、4  0/5  0
野生型 myhc-α LPS/RANK-L  0、2、4  2/5  0(0，0，0，1，2)
*P＜0.0001，
Figure 10003_4
P＜0.0005(Fisher’s精确检验)。
Figure 10003_5
P＜0.0028(Mann-Whitney U测验)。
实施例2-树突细胞免疫诱导了自体免疫性
为了测定树突细胞是否诱导了心肌炎和符合自体免疫性的标准，首先需要测定限定的自体抗原是否存在。使用磁珠从myhc-α脉冲的、LPS/抗CD40抗体激活的树突细胞免疫的小鼠脾中纯化CD4+T-细胞(CD4+T细胞分离试剂盒；Miltenyi Biotech GmbH)。CD4+T-细胞在无血清AIM-V(Gibro)培养基中与照射的(2000rad)同源脾细胞和10μg/ml myhc-α或卵清蛋白培养40小时。使用可购得的QuantikineELISA试剂盒(R&D Biosystems，Minneapolis，U.S.A.)测量细胞因子水平。或者，培养72小时后通过测量[3H]甲基-胸苷的掺入来测定增殖。为了细胞因子测量，将树突细胞以1×106/ml涂布于24孔平板中并用包括1μg/ml LPS、100μg/ml聚(I：C)、10μM CpG-ODN或10μg/ml PGN的各种TRL刺激剂孵育12小时，用或不用5μg/ml的抗CD40。使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Biosystems，Minneapolis)测量细胞因子。为了FACS分析，在用合适的Pharmingen荧光染料标记抗体染色之前，用Pharmingen染色缓冲液中的Fc-阻断(Pharmingen)和1％大鼠血清将树突细胞制剂在4℃预孵育30分钟。
40小时后测量IFN-γ和IL-4，数据显示于图2a中。数值表示为5只单个小鼠的平均(±SD)，其中与注射OVA脉冲树突细胞的小鼠相比较，从注射myhc-α脉冲树突细胞的小鼠分离的CD4+T-细胞，对于IL-4产生**p＜0.0 05，对于IFN-γ产生*p＜0.0001(ANOVA和未配对t-检验)(n.d.＝未检测到)。
树突细胞诱导的心肌炎是抗原特异性的，因为非相关抗原脉冲的树突细胞没有诱导疾病(表1)。此外，其它器官中如骨骼肌、肺或肾脏没有存在浸润液(未显示)，表明树突细胞诱导的炎症是器官特异性的并限制于心脏。免疫组织化学揭示了浸润患病动物心脏的大多数T-细胞是CD4+，仅有少数细胞对CD8+是阳性的(图1e、f)。用myhc-α体外再刺激从注射DC小鼠纯化的CD4+T-细胞导致增殖(未显示)以及INF-γ和IL-4的产生(图2a)。相反，用非特异性OVA肽再刺激的CD4+T-细胞没有增殖且没有产生IL-4，仅有少量的INF-γ。这些数据显示树突细胞体内引发myhc-α特异性的CD4+T-细胞。
为了测定树突细胞诱导的心肌炎是否符合自体免疫性的标准，需要测定能转移疾病的自体抗体是否存在。如所述的11通过ELISA测定对抗心脏特异性myhc-α和kk肽的抗体应答，使用HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(Southern Biotechnology Associates)。在半最大OD405nm测定滴度。接种激活的、myhc-α脉冲的树突细胞10天后检测抗myhc-α和抗-kk IgG的自体抗体，但在接种OVA脉冲的树突细胞后没有检测到。个体小鼠的滴度显示于图2b中。
树突细胞诱导的心肌炎伴随强烈的对抗心脏特异性myhc-α肽的IgG自体抗体应答(图2b)。还检测了对抗心脏特异性肽的自体抗体，该心脏特异性肽称为kk25，与免疫myhc-α肽无关(图2b)，证实树突细胞能够诱导心脏炎症，该事件伴随内源心脏肽自体抗体的产生。重要地，体外再刺激并将myhc-α引发的，而不是OVA引发的CD4+T-细胞转移至同源的、免疫缺失SCID小鼠中导致宿主动物的心肌炎(图2c)。相反，CD8+T-细胞的转移没有诱导疾病(未显示)。此外，IFN-γR-/-和IL-4Rα-/-小鼠接种myhc-α脉冲的野生型树突细胞导致两个品系中强烈的心肌炎(表1)。因此，通过树突细胞诱导的疾病似乎与Th1/Th2极化无关。因此，这个树突细胞诱导心肌炎的模型符合CD4+T-细胞介导的自体免疫疾病的所有标准并提供了诱导自体免疫性的新实验范例。
使用磁珠(MACSTM，Miltenyi Biotech)从myhc-α脉冲的和激活的树突细胞免疫的小鼠脾中分离CD4+和CD8+T-细胞。在5μg/ml抗CD28mAb(Pharmingen)存在下，培养myhc-α脉冲、照射(1500Rad)的同源DC48小时后，将1×107CD4+细胞每只小鼠(＞98％CD4+细胞)i.p.转移进SCID(BALB/c)接受者小鼠中。10天后处死所有接受者小鼠。从用OVA脉冲树突细胞免疫的小鼠分离的CD4+T-细胞转移后，没有观察到SCID小鼠的心肌炎(n＝5)。p＜0.05，Fisher’s精确检验。
实施例3-用myhc-α脉冲的、激活的树突细胞免疫导致收缩功能障碍和扩张性心肌病
从未建立扩张性心肌病和感染后自体免疫心肌炎之间的因果关联。本发明的小鼠模型中，树突细胞接种后5至10天炎症达到峰值并在最后树突细胞接种后约第12天开始消散(结果未显示)。重要的是测定树突细胞诱导的心肌炎是否在炎症浸润消散后将发展为心肌病。
如所述的41进行心电图测定。使用12-MHz探子(Hewlett Packard)通过经胸廓的心电图测定异氟烷麻醉的小鼠。记录射血速度，左心室收缩期末直径(LVESD)，和舒张期末直径(LVEDD)大小并根据以下公式计算收缩分数百分比(FS)：FS(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD。VCFC计算为FS/校正心率的射血时间。
图3a显示免疫后4周注射激活的myhc-α脉冲树突细胞小鼠的心脏/体重比例(mg/g)和心脏的心电图数据，与注射OVA脉冲树突细胞的对照相比较。显示了平均值±SD。心脏/体重比例，其中n＝8每组，*p＜0.005。图3b显示了注射myhc-α脉冲树突细胞小鼠中提高的左心室舒张末内径(LVEDD)，其中n＝8每组，**p＜0.05。图3c显示了myhc-α脉冲树突细胞免疫小鼠的和OVA脉冲树突细胞免疫对照动物的代表性心电图。箭头表示收缩(LVESD)和舒张(LVEDD)之间的距离。注意到myhc-α树突细胞免疫动物中心脏直径的大量扩大，表现出扩张性心肌病。图3d显示了纤维鞘收缩速度(VCFC)的降低(n＝5，**p＜0.05)，而图3e显示了myhc-α脉冲树突细胞免疫小鼠中收缩分数(％FS)的降低(n＝8，*p＜0.005)，作为削弱收缩性读数的函数。
与注射OVA脉冲树突细胞的对照动物相反，注射myhc-α脉冲树突细胞的小鼠中心脏/体重比例渐进性提高(图3a)。这些扩大的心脏没有炎症浸润液，但是显示间质性纤维化(未显示)，其通常可以在心力衰竭中看到。令人感兴趣地，树突细胞免疫后4周小鼠的心电图显示提高的左心室舒张期末直径(LVEDD)和左心室收缩期末直径(LVESD)大小，表现为扩张性心肌病(图3b、c)此外，myhc-α脉冲树突细胞免疫的小鼠产生严重的心脏功能障碍，如通过削弱的纤维鞘收缩速度(VCFC)(图3d)和降低的收缩分数(FS)(图3e)测定的。因此，myhc-α脉冲树突细胞的免疫导致纤维化改变、心室扩张和收缩性削弱。这些数据提供了自体免疫心脏疾病与扩张性心肌病和心力衰竭产生之间直接的因果关联。
实施例4-CD40在树突细胞介导的自体免疫性中的作用
通过CD154-CD4026，27、4-1BB-4-1BB-L28，或RANK-RANK-L29配体-受体相互作用来激活树突细胞对树突细胞成熟和共刺激分子的表达以及细胞因子产生是关键性的。需要测定这些分子相互作用中的哪一个涉及注射的树突细胞启动“自体侵略性”响应的能力。
为了体内CD40-CD40L阻断，将200μg抗CD40L阻断抗体(MR-1)注射进小鼠中30。如所述的28使用TKS-1单克隆抗体[200μg]来阻断4-1BBL-4-1BB相互作用。对照接受了非特异性同型抗体(Pharmingen)。使用250μg/小鼠的人OPG融合蛋白来体内阻断RANK-RANKL相互作用39。每隔一天以200μ1PBS/小鼠将所有阻断剂注射进小鼠中。
在LPS激活过程中将重组RANK-L加入myhc-α脉冲的树突细胞培养物中没有提高心肌炎易感性而超过用LPS单独观察到的(表1)。此外，通过诱饵受体(decoy receptor)OPG体内阻断RNAK-RANK-L相互作用对树突细胞介导疾病的严重程度或发病率没有明显影响(表2和数据未显示)。与RANKL-RANK相似，使用阻断TSK-1抗体28在体外树突细胞培养物中(未显示)或体内(未显示)抑制4-1BB，对疾病发病率或疾病严重程度没有显著影响。
相反，用LPS和刺激抗CD-40抗体体外共刺激myhc-α树突细胞显著地提高了树突细胞诱导的心脏炎症(表1)。已知激活的树突细胞在体内与T-细胞表达CD40L相互作用，我们用CD40L阻断抗体治疗接种树突细胞的小鼠30。体内CD40-CD40L相互作用的阻断几乎完全防止了疾病(表2)。然后通过myhc-α脉冲的CD40-/-树突细胞没有诱导CD40+/+小鼠中心肌炎的事实在遗传上证实了CD40共刺激的作用(表2，图4a，d)。图4a和4d表明将CD40+/+树突细胞接种入野生型接受者小鼠中后心脏组织中心脏炎症的不存在。重要地，将CD40+/+树突细胞接种入CD40-/-小鼠(图4b、e)中引发了心脏炎症，与野生型接受者中的程度相似(图4c、f和表2)。图4b和4e表明将野生型树突细胞接种入CD40-/-接受者中后的心脏炎症(箭头)。图4c和4f表明将野生型树突细胞接种入野生型接受者中后两个心室中的炎症浸润液(箭头)。显示了代表性整个心脏的图像和较大的放大倍数(×140)。H&E染色。接种myhc-α脉冲的LPS/抗-CD40处理的树突细胞10天后从小鼠获得数据。
表2.树突细胞介导的心脏炎症中对CD40的选择性需要
激活[体外] 接受者 树突细胞基因型 处理(体内)  发病率(第10天) 第10天的严重程度[中值(个体数据)]
LPS/α-CD40 野生型 野生型 Sham  7/7* 3(2，2，3，3，3，4，4)
LPS/α-CD40 野生型 野生型 OPG-Fc  7/7 3(1，2，3，3，4，4，4)
LPS/α-CD40 野生型 野生型 抗CD40L  3/8* 0(0，0，0，0，0，1，1，2)
LPS/α-CD40 野生型 CD40-/- 无  1/7
Figure 10003_6
 0(0，0，0，0，0，0，1)
LPS/α-CD40 CD40-/- 野生型 无  5/5
Figure 10003_7
 3(2，2，3，3，4)
*P＜0.0256，
Figure 10003_8
P＜0.0152(Fisher’s精确检验)
实施例5-TLR刺激给予了树突细胞自体侵略性
尽管发现CD40刺激对自体免疫心脏疾病的产生是重要的，当我们用刺激Toll-样受体4(TLR4)的LPS共激活树突细胞时，只引起了心脏炎症。此外，用LPS单独激活myhc-α脉冲的树突细胞可以诱导低发病率的中度心脏炎症(表1)。不同种类的病原体涉及自体免疫性的发病机理，不同的感染引发剂能够通过截然不同的TLR激活先天免疫系统21。因此我们测定了该作用是否对LPS是特异性的或其它TLR的激活是否也足以诱导树突细胞介导的自体免疫性。
用LPS(TLR4)或肽聚糖(其刺激TLR1、TLR2和TLR6)或dsRNA(其刺激TLR3)或CpG(其刺激TLR9)参考文献21刺激myhc-α脉冲的树突细胞导致了严重的心肌炎(图5a-e)。接种myhc-α脉冲树突细胞10天后小鼠的心脏切片显示于图5a至5d中(放大倍数×560)，当用以下物质激活时：LPS/抗CD40(图5a)；dsRNA/抗CD40(图5b)；CpG/抗CD40(图5c)；和PGN/抗CD40(图5d)。个体小鼠的疾病发病率和炎症的严重程度显示于图5中，底部画面。显示了代表性心脏图像(H&E染色)。
由单核细胞，主要是巨噬细胞和CD4+T-细胞、粒性白细胞和一些嗜曙红细胞，构成了炎症浸润液。对于所有测试的TLR，疾病诱导依赖CD40+T细胞，使用过继转移实验(未显示)。因此，TLR可以提供普通信号来给予树突细胞“自体侵略性”。这些发现显示三种分子事件必须与树突细胞介导的自体免疫心肌炎发生一致：遗传上敏感背景中自体蛋白的摄取、通过CD40由宿主自体免疫系统的特异性共刺激，以及最重要的TLR激活。令人感兴趣地，所有测试的TLR对树突细胞的刺激足以引起自体侵略性响应。
实施例6-CD40和TLR通过树突细胞在IL-1β和IL-12产生中的协作
图6a和6b显示了用LPS/抗CD40刺激12小时后，共刺激分子在CD40+/+(6a)和CD40-/-(6b)树突细胞上的表达。FACS直方图控制于CD11c+CD11b+MHC类II+活细胞(ICAM，B7.1，B7.2)或CD11c+CD11b+活细胞。CD40共刺激的疾病促进效果似乎不是由于共刺激分子提高的表达。
如图6c中所示的，用抗CD40加LPS刺激树突细胞CD4+/+或CD40-/-后，激活标记物如MHC类II分子、CD80、CD86和ICAM-1的上调没有不同。此外，在CD40激活不存在或存在下，用各种TLR刺激剂刺激野生型树突细胞后，TNF-α或IL-6产生不存在可观察的差异(图6c)。图6c显示了在刺激抗CD40抗体不存在或存在下(5μg/ml)，用所示的TLR刺激剂(1μg/ml LPS，100μg/ml聚(I：C)，10μM CpG-ODN，或10μg/ml PGN)刺激12小时后，树突细胞中细胞因子产生的水平。数据表示为四个培养孔的平均(±SD)并表示具有相似数据的几个实验中的一个。
相反，只通过CD40或TLR刺激的树突细胞和TLR刺激剂加抗CD40激活的那些树突细胞之间IL-1β和IL-12p70水平显著不同，如图6c中所示的。这些差异不是由于体外培养达24小时树突细胞凋亡的改变(未显示)。因此，CD40和TLR刺激在树突细胞中细胞因子IL-1β和IL-12p70的诱导中协同作用。
为了论述IL-1β和IL-12p70是否对树突细胞介导的炎症心脏疾病是重要的，我们用肽脉冲的、抗CD40和TLR激活的树突细胞免疫了IL-1R1和IL-12β1-受体突变小鼠。所有情况中，发现通过IL-1受体1型和IL12-IL12R系统发出信号是引发自体免疫性需要的(表3)。然而，接种野生型树突细胞诱导了IL-1R1-/-小鼠中的心肌炎和自体侵略性CD4+T细胞，但在IL-12Rβ1-/-小鼠中没有诱导。相反，接种IL-12R1β-/-树突细胞后，野生型接受者产生心肌炎，但在接种IL-1R1-/-树突细胞后没有产生(表3)。因此，诱发CD4+T-细胞介导的心肌炎需要树突细胞上而不是CD4+T-细胞上的IL-1R1发出信号。相反，激活的、抗原脉冲树突细胞上的IL-12信号对这些细胞引发自体免疫性的能力不是必需的。相反，IL-12受体信号对CD4+效应物T-细胞是关键性的，因为从IL-12Rβ1+/+树突细胞免疫的IL-12Rβ1-/-小鼠分离的体外再刺激IL-12Rβ1-/-CD4+T-细胞的过继转移没有在同源SCID小鼠中诱导疾病(未显示)。本发明的新实验系统第一次使选择性地仔细分析体内自体免疫疾病模型中树突细胞对效应物细胞上的细胞因子和/或共刺激分子的必要功能成为可能。
表3.IL-12和IL-1信号在树突细胞诱导的心脏疾病中的作用
  接受者   树突细胞基因型   树突细胞接种   发病率(第10天)   第10天的严重程度[中值(个体数据)]
  野生型   野生型   第0、2、4天   6/6*   2(2，2，2，2，3，3)
  IL-12Rβ1-/-   野生型   第0、2、4天   1/8*
Figure 10003_9
   0(0，0，0，0，0，0，1)
  野生型   IL-12Rβ1-/-   第0、2、4天   6/8
Figure 10003_10
   2(0，0，2，2，2，3，2，3)
  IL-1R1-/-   野生型   第0、2、4天   5/5
Figure 10003_11
   2(1，2，2，3，2)
  野生型   IL-1R1-/-   第0、2、4天   0/5   0
*P＜0.005，
Figure 10003_13
P＜0.05，P＜0.01(Fisher’s精确检验)
实施例7-组织损伤与先天免疫系统激活一起足以诱导体内心脏炎症
除了遗传敏感性，环境和感染引发剂已经涉及动物模型和人中多个自体免疫疾病的发病机理7，33。然而，没有确定地鉴定出这样的感染引发剂并且从未阐明借此不同病原体引发自体免疫性的机理。上述的结果表明自体抗原脉冲的CD通过CD40和TLR的刺激给予了这些抗原呈递细胞自体侵略性。由于所有测试的TLR的激活足以产生树突细胞诱导的自体免疫心脏疾病，且不受理论限制，假设组织损伤连同非特异性炎症引发剂应该导致体内自体免疫性。图7a中图示的所提出的自体免疫发病机理的模型中，组织损伤释放了由树突细胞捕获和呈递的自体抗原。如果Toll-样受体激活发生，自体反应性T-细胞应答升高，其通过CD40-CD40L相互作用来扩增。
为了测试该假设，给小鼠注射不同数量的成年鼠中纯化的凋亡心肌细胞，用/或不用100μg/小鼠抗CD40以及10μg LPS/小鼠，连续三天。通过UVA(10J/m2)照射或将10μmol/L H2O2加入培养孔中来诱导心肌细胞凋亡。
然后将凋亡的心肌细胞注射进同源Balb/c小鼠中，接着进行TLR的体内刺激。接种2×106个凋亡的心肌细胞(i.p.)自身而没用LPS没有导致任何疾病(6只小鼠中0只)，如图7b中所示的。然而，仅i.p.接种2×106个凋亡的心肌细胞，接着用LPS体内激活TLR4，导致心脏中炎症转移灶，如图7c中所示的。一起接种2×106个凋亡的心肌细胞(i.p.)和LPS(第0、1、2天10μg i.p.)导致8只小鼠中7只心脏炎症(图7c中的箭头)。重要的是，单独接种LPS没有诱导心脏炎症(5只小鼠中0只；未显示)，与只有心肌细胞的相比较，对于LPS和心肌细胞p＜0.0001(Fisher’s精确检验)。此外，i.p.接种UV-照射或H2O2处理的心肌细胞，接着用LPS体内激活TLR4足以诱导心脏炎症。重要地，该心脏炎症伴随对抗心脏特异性myhc-α肽的IgG自体抗体的产生，如图7d中所示的。图7d显示了i.p.接种LPS和2×106个凋亡的心肌细胞(LPS)10天后抗myhc-αIgG自体抗体滴度。单独接种心肌细胞没有诱导相应的抗体滴度(对照)。显示了个体小鼠的数据。相反，在TLR激活不存在下，凋亡的心肌细胞的对照接种没有诱导心脏自体抗体。应该注意到体内LPS或CpG接种，或CD40加LPS单独接种没有导致心肌炎(未显示)。这些结果显示损伤心肌细胞的全身释放结合先天免疫系统的非特异性激活足以诱导心脏炎症。
本发明不受限于在此所述实施方案的特征，但是包括权利要求范围内的所有改变和改进。
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Claims (18)

1.制造对抗原反应性树突细胞的方法，包括：
获得树突细胞的样品；和
使树突细胞与抗原、抗CD40抗体和至少一种To11-样受体TLR刺激剂接触。
2.权利要求1的方法，其中使树突细胞与抗原接触一段合适的时间，接着使树突细胞与至少一种TLR刺激剂接触一段合适的时间。
3.权利要求1的方法，其中从动物的组织获得树突细胞，所述组织选自外周血、骨髓、脾和淋巴结。
4.权利要求1的方法，其中所述TLR刺激剂选自脂多糖、聚肌胞苷酸、CpG-ODN和肽聚糖。
5.权利要求1的方法，其中使树突细胞与抗原接触30分钟至24小时。
6.权利要求5的方法，其中使树突细胞与TLR刺激剂接触至多四小时。
7.权利要求6的方法，其中使树突细胞与TLR刺激剂接触至多两小时。
8.权利要求1的方法，其中树突细胞是CD11C+、CD11b+。
9.权利要求8的方法，其中树突细胞是CD11c+。
10.权利要求1的方法，其中使树突细胞与浓度1至20μg/ml的抗原接触。
11.权利要求1的方法，其中抗CD40抗体的浓度为3至5μg/ml。
12.权利要求1至11任一项的方法，其中抗原是自体抗原或肿瘤抗原。
13.权利要求1至11任一项的方法，其中树突细胞来自人、小鼠、大鼠或猪。
14.权利要求1至11任一项的方法，其中所述抗原是肿瘤表达的肿瘤抗原，在与抗原接触之前，在细胞因子的存在下培养树突细胞。
15.权利要求14的方法，其中细胞因子是IL-10。
16.权利要求1至11任一项的方法，其中抗原是胶原或软骨基质蛋白，树突细胞是非人动物的树突细胞。
17.权利要求1至11任一项的方法，其中抗原是心脏特异性抗原，树突细胞是非人动物的树突细胞。
18.权利要求17的方法，其中抗原是myhc-α肽。
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