CN114214277B - 一种诱导dc细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法，包括：复合诱导剂和激活剂；其中，复合诱导剂包括：GM‑CSF溶液、IL‑4溶液、IL‑1β溶液和8种角蛋白的混合溶液；激活剂包括：antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液。本发明还提供一种利用该试剂盒诱导培养DC细胞的方法。该试剂盒可提高DC细胞特异性表达，增强细胞培养上清液中相关细胞因子的表达，缩短细胞培养时间，提高DC细胞诱导成熟速率和细胞活性，增强T细胞对肺癌细胞的杀伤活性。

Description

一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法。
背景技术
近年来，细胞生物免疫疗法成为治疗肿瘤的一种重要的辅助手段。其中，较为突出的是DC-CIK细胞治疗。树突状细胞(Dendritic cells，DC)是迄今发现的抗原递呈功效最强的细胞，在机体抗肿瘤免疫应答中，处于核心地位。研究发现，DC细胞的作用主要表现在能明显引诱静止T淋巴细胞增殖和应答，并促进细胞毒性T细胞生成；细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）是将外周血淋巴细胞在体外用多种细胞因子刺激诱导产生的一种异质细胞，DC与CIK细胞联合应用，有逆转调节性T细胞免疫抑制效应中的作用，可降低肿瘤患者CIK细胞中CD4+、CD25+细胞的数目及功能，进而加强抗瘤效应。
临床研究表明，大多数肿瘤患者存在DC细胞数量减少及功能缺陷的特点，DC细胞与肿瘤的发生、发展、转移及浸润密切相关，基于DC细胞的免疫治疗在抗肿瘤及预防肿瘤复发上具有良好的应用前景。对DC细胞诱导培养的研究发现，多种成分可影响DC细胞的增殖与成熟。目前，针对DC细胞诱导培养的试剂和方法种类较多，但诱导出的DC细胞表达水平相对不高，数量不稳定，同时诱导培养周期较长。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法，以解决现有DC细胞诱导培养的试剂和方法的培养质量不高、数量不稳定以及培养周期较长的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种诱导DC细胞培养的试剂盒，包括：复合诱导剂和激活剂；其中，复合诱导剂包括：GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液；激活剂包括：antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液。
本发明的有益效果为：本发明的诱导DC细胞的培养试剂盒能显著提高DC细胞的诱导培养成熟速率及DC细胞表面标志物的表达，培养的DC细胞与T细胞混合培养后，可增强细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）对肿瘤细胞的杀伤效果。
本发明的诱导DC细胞的培养试剂盒，GM-CSF主要作用于DC细胞，刺激单核细胞向DC细胞分化；IL-4与GM-CSF协同作用促进单核细胞的定向分化，上调DC细胞MHC- I 的表达；IL-1β与GM-CSF 协同作于DC细胞，促进单核细胞向DC细胞分化；8种角蛋白来源于人血浆，8种角蛋白混合起到了维持DC细胞形态，参与DC细胞迁移，稳定DC细胞基本生理功能的作用，另外还协助DC细胞分泌免疫调控因子，从而参与细胞调控及细胞信号传导。antiCD44蛋白溶液是一种抗CD44抗体，CD44是肿瘤干细胞膜表面标志物；antiCD44与肿瘤多肽抗原联合致敏DC细胞，可特异性、高效地增强DC细胞对肿瘤细胞的识别能力。8种角蛋白的联用可以快速生成大量DC细胞，通过antiCD44蛋白联合肿瘤多肽抗原共同致敏DC细胞后，刺激DC细胞快速成熟，提高抗原提呈效率，从而显著提高DC细胞的诱导培养成熟速率。成熟DC细胞具有高效的T细胞刺激能力，通过特异性高水平表达趋化因子，产生大量的粘附分子，更易与T细胞表面的特征性标志TCR配接，高水平的共刺激分子，降低了活化阈值，更易于激活T细胞形成细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），进而增强CTL对肿瘤细胞的杀伤效果。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，8种角蛋白分别为：8种角蛋白分别为：II型细胞骨架1（Keratin, type IIcytoskeletal 1）、I型细胞骨架16（Keratin, type I cytoskeletal 16）、I型细胞骨架14（Keratin, type I cytoskeletal 14）、I型细胞骨架19（Keratin, type I cytoskeletal19）、II型细胞骨架79（Keratin, type II cytoskeletal 79）、II型细胞骨架75（Keratin,type II cytoskeletal 5）、II型细胞骨架5（Keratin, type II cytoskeletal 5）和II型细胞骨架2（Keratin, type II cytoskeletal 2）。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：I型和II型细胞骨架蛋白有利于维持DC细胞增殖过程中的形态结构及内部结构的有序性，促进DC细胞之间信号转导、能量传递。
进一步，激活剂与复合诱导剂的体积比为1-3：2。
进一步，GM-CSF溶液的浓度为200-500ng/ml，IL-4溶液的浓度为1000-3000IU/ml，IL-1β溶液的浓度为3000-8000IU/ml，8种角蛋白的混合溶液的浓度为300-700ng/ml；其中，复合诱导剂中GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液的体积比为3-5：0.8-1.2：0.8-1.2：1。
进一步，GM-CSF溶液的浓度为400ng/ml，IL-4溶液的浓度为1800IU/ml，IL-1β溶液的浓度为5500IU/ml，8种角蛋白的混合溶液的浓度为650ng/ml；其中，复合诱导剂中GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液的体积比为4：1：1：1。
进一步，antiCD44蛋白溶液的浓度为500-800ng/ml，肿瘤多肽抗原溶液的浓度为10-30ug/ml；其中，激活剂中antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液的体积比为1：1.8-2.2。
进一步，antiCD44蛋白溶液的浓度为700ng/ml，肿瘤多肽抗原溶液的浓度为25ug/ml；其中，激活剂中antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液的体积比为1：2。
本发明还提供一种采用上述诱导DC细胞培养的试剂盒诱导培养DC细胞的方法，包括以下步骤：
（1）在DC细胞中加入含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基、复合诱导剂和灭活血浆，于4-6%CO2和35-38℃条件下培养；
（2）第2天，补充加入激活剂，于4-6%CO2和35-38℃条件下继续培养；
（3）第3天，收集DC成熟细胞。
进一步，步骤（1）中DC细胞和步骤（2）中灭活血浆通过以下方法制得：
（1.1）采集血液样本，离心后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆灭活，然后于3-5℃条件下离心，再除去下层沉淀，得到灭活血浆；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释后，加入Ficoll淋巴细胞分离液，进行离心，取中间层得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液离心后，弃上清液，将细胞沉淀用生理盐水清洗，得到PBMC（外周血单个核细胞）；
（1.4）将PBMC接种于含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基中，于4-6%CO2和35-38℃条件下培养0.8-1.2h，得到的贴壁细胞即为DC细胞。
进一步，步骤（1.1）中将上层血浆于50-60℃水浴放置25-35min，完成灭活过程。
进一步，步骤（1.1）中离心为2800-3200rpm离心8-12min。
进一步，步骤（1.2）中离心为1800-2200rpm离心12-20min。
进一步，步骤（1.3）中清洗为先将细胞沉淀用生理盐水清洗，然后离心，弃上清液，重复上述操作2-3次。
进一步，步骤（1.3）中离心为1200-1700rpm离心3-7min。
进一步，步骤（1.4）中PBMC接种密度为1-4×106/ml。
进一步，步骤（1）中含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基、复合诱导剂和灭活血浆的体积比为45-48：1.5-2.5：2-3。
进一步，含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基、复合诱导剂和灭活血浆的体积比为46.5：2：2.5。
本发明具有以下有益效果：本发明的诱导DC细胞成熟的试剂盒，可提高DC细胞特异性表达，增强细胞培养上清液中相关细胞因子的表达；缩短细胞培养时间，提高DC细胞诱导成熟速率和细胞活性，增强T细胞对肺癌细胞的杀伤活性。本发明对比常规DC细胞培养方式优势为可快速高效促进DC细胞成熟，将DC细胞120小时成熟时间缩短至72小时。另外，区别于常规的DC培养方式，本发明在激活DC细胞的特异性识别肿瘤细胞的同时，加入antiCD44 能显著提升DC细胞对靶细胞的杀伤能力和识别能力，有效防止肿瘤细胞逃逸。
附图说明
图1为实施例1得到的DC成熟细胞表面标志物表达水平；
图2为对比例1得到的DC成熟细胞表面标志物表达水平；
图3为实施例1和对比例1得到的DC成熟细胞分泌的IL-12含量比较；
图4为实施例1和对比例1得到的DC成熟细胞活化的T细胞对肺癌细胞A549的杀伤活性比较。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法，包括以下步骤：
（1）分离PBMC
（1.1）采集50ml血液样本，转移到50ml无菌离心管中，于3000rpm离心10min后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆56℃水浴灭活30min，然后于4℃条件下，3000rpm离心10min，再除去下层沉淀，得到灭活血浆，放4℃冰箱保存备用；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释至50ml，上下轻轻混匀，然后准备2个均含5mlFicoll淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管，再将血细胞与生理盐水混合物平均加入至2个分离管中，2000rpm离心15min后，液体分层，取白色云雾状层液体，并汇集到新的50ml离心管中，得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液1500rpm离心5min后，弃上清液；在细胞沉淀中加入40ml生理盐水，进行清洗，1500rpm离心5min后，弃上清液，重复清洗3次，得到PBMC；
（2）分离DC细胞和T淋巴细胞
将PBMC接种于20ml含10vt%血清的RPMI 1640培养基中，PBMC接种密度为2.5×106/ml，全部转移到T75瓶中，于5%CO2和37℃条件下培养1h，得到的贴壁细胞即为DC细胞，得到的悬浮细胞即为T淋巴细胞；
（3）DC细胞诱导分化
（3.1）将悬浮细胞转移到新的T75瓶中培养，在DC细胞中加入46.5ml含10vt%血清的RPMI 1640培养基、2ml复合诱导剂和2.5ml灭活血浆，于5%CO2和37℃条件下培养；其中，复合诱导剂包括：400ng/ml的GM-CSF溶液、1800U/ml的IL-4溶液、5500IU/ml的IL-1β溶液和650ng/ml的8种角蛋白的混合溶液；GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液的体积比为4：1：1：1；
（3.2）第2天，补充加入2ml激活剂，于5%CO2和37℃条件下继续培养；其中，激活剂包括：700ng/ml的antiCD44蛋白溶液和25ug/ml的肿瘤多肽抗原溶液；antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液的体积比为1：2；
（3.3）第3天，收集DC成熟细胞。
实施例2：
一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法，包括以下步骤：
（1）分离PBMC
（1.1）采集50ml血液样本，转移到50ml无菌离心管中，于2800rpm离心12min后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆50℃水浴灭活35min，然后于3℃条件下，2800rpm离心12min，再除去下层沉淀，得到灭活血浆，放3℃冰箱保存备用；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释至50ml，上下轻轻混匀，然后准备2个均含5mlFicoll淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管，再将血细胞与生理盐水混合物平均加入至2个分离管中，1800rpm离心20min后，液体分层，取白色云雾状层液体，并汇集到新的50ml离心管中，得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液1200rpm离心7min后，弃上清液；在细胞沉淀中加入40ml生理盐水，进行清洗，1200rpm离心7min后，弃上清液，重复清洗2次，得到PBMC；
（2）分离DC细胞和T淋巴细胞
将PBMC接种于20ml含5vt%血清的RPMI 1640培养基中，PBMC接种密度为2×106/ml，全部转移到T75瓶中，于4%CO2和35℃条件下培养1.2h，得到的贴壁细胞即为DC细胞，得到的悬浮细胞即为T淋巴细胞；
（3）DC细胞诱导分化
（3.1）将悬浮细胞转移到新的T75瓶中培养，在DC细胞中加入45ml含5vt%血清的RPMI 1640培养基、2.5ml复合诱导剂和2.5ml灭活血浆，于4%CO2和35℃条件下培养；其中，复合诱导剂包括：200ng/ml的GM-CSF溶液、1000IU/ml的IL-4溶液、3000IU/ml的IL-1β溶液和300ng/ml的8种角蛋白的混合溶液；GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液的体积比为3：1.2：0.9：1；
（3.2）第2天，补充加入3ml激活剂，于4%CO2和35℃条件下继续培养；其中，激活剂包括：500ng/ml的antiCD44蛋白溶液和10ug/ml的肿瘤多肽抗原溶液；antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液的体积比为1：1.8；
（3.3）第3天，收集DC成熟细胞。
实施例3：
一种诱导DC细胞培养的试剂盒及其诱导培养方法，包括以下步骤：
（1）分离PBMC
（1.1）采集50ml血液样本，转移到50ml无菌离心管中，于3000rpm离心10min后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆60℃水浴灭活25min，然后于5℃条件下，3200rpm离心8min，再除去下层沉淀，得到灭活血浆，放5℃冰箱保存备用；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释至50ml，上下轻轻混匀，然后准备2个均含5mlFicoll淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管，再将血细胞与生理盐水混合物平均加入至2个分离管中，2200rpm离心12min后，液体分层，取白色云雾状层液体，并汇集到新的50ml离心管中，得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液1700rpm离心3min后，弃上清液；在细胞沉淀中加入40ml生理盐水，进行清洗，1700rpm离心3min后，弃上清液，重复清洗3次，得到PBMC；
（2）分离DC细胞和T淋巴细胞
将PBMC接种于20ml含20vt%血清的RPMI 1640培养基中，PBMC接种密度为3×106/ml，全部转移到T75瓶中，于6%CO2和38℃条件下培养0.8h，得到的贴壁细胞即为DC细胞，得到的悬浮细胞即为T淋巴细胞；
（3）DC细胞诱导分化
（3.1）将悬浮细胞转移到新的T75瓶中培养，在DC细胞中加入48ml含20vt%血清的RPMI 1640培养基、1.5ml复合诱导剂和2.5ml灭活血浆，于6%CO2和38℃条件下培养；其中，复合诱导剂包括：500ng/ml的GM-CSF溶液、3000IU/ml的IL-4溶液、8000IU/ml的IL-1β溶液和700ng/ml的8种角蛋白的混合溶液；GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液的体积比为5：0.8：1：1；
（3.2）第2天，补充加入2ml激活剂，于6%CO2和38℃条件下继续培养；其中，激活剂包括：800ng/ml的antiCD44蛋白溶液和30ug/ml的肿瘤多肽抗原溶液；antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液的体积比为1：2.2；
（3.3）第3天，收集DC成熟细胞。
对比例1
一种DC细胞诱导培养试剂盒及其诱导培养方法，包括以下步骤：
（1）分离PBMC
（1.1）采集50ml血液样本，转移到50ml无菌离心管中，于3000rpm离心10min后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆56℃水浴灭活30min，然后于4℃条件下，3000rpm离心10min，再除去下层沉淀，得到灭活血浆，放4℃冰箱保存备用；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释至50ml，上下轻轻混匀，然后准备2个均含5mlFicoll淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管，再将血细胞与生理盐水混合物平均加入至2个分离管中，2000rpm离心15min后，液体分层，取白色云雾状层液体，并汇集到新的50ml离心管中，得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液1500rpm离心5min后，弃上清液；在细胞沉淀中加入40ml生理盐水，进行清洗，1500rpm离心5min后，弃上清液，重复清洗3次，得到PBMC；
（2）分离DC细胞和T淋巴细胞
将PBMC接种于20ml含10vt%血清的RPMI 1640培养基中，PBMC接种密度为2.5×106/ml，全部转移到T75瓶中，于5%CO2和37℃条件下培养1h，得到的贴壁细胞即为DC细胞，得到的悬浮细胞即为T淋巴细胞；
（3）DC细胞诱导分化
（3.1）将悬浮细胞转移到新的T75瓶中培养，在DC细胞中加入50ml 500IU/ml的TNF-α，于5%CO2和37℃条件下培养；
（3.2）第2天，补充加入2ml 500IU/ml的TNF-α，于5%CO2和37℃条件下继续培养；
（3.3）第3天，收集DC成熟细胞。
对比例2
一种DC细胞诱导培养试剂盒及其诱导培养方法，包括以下步骤：
（1）分离PBMC
（1.1）采集50ml血液样本，转移到50ml无菌离心管中，于3000rpm离心10min后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆56℃水浴灭活30min，然后于4℃条件下，3000rpm离心10min，再除去下层沉淀，得到灭活血浆，放4℃冰箱保存备用；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释至50ml，上下轻轻混匀，然后准备2个均含5mlFicoll淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管，再将血细胞与生理盐水混合物平均加入至2个分离管中，2000rpm离心15min后，液体分层，取白色云雾状层液体，并汇集到新的50ml离心管中，得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液1500rpm离心5min后，弃上清液；在细胞沉淀中加入40ml生理盐水，进行清洗，1500rpm离心5min后，弃上清液，重复清洗3次，得到PBMC；
（2）分离DC细胞和T淋巴细胞
将PBMC接种于20ml含10vt%血清的RPMI 1640培养基中，PBMC接种密度为2.5×106/ml，全部转移到T75瓶中，于5%CO2和37℃条件下培养1h，得到的贴壁细胞即为DC细胞，得到的悬浮细胞即为T淋巴细胞；
（3）DC细胞诱导分化
（3.1）将悬浮细胞转移到新的T75瓶中培养，在DC细胞中加入46.5ml含10vt%血清的RPMI 1640培养基、2ml复合诱导剂和2.5ml灭活血浆，于5%CO2和37℃条件下培养；其中，复合诱导剂包括：400ng/ml的GM-CSF溶液、1800U/ml的IL-4溶液和5500IU/ml的IL-1β溶液；GM-CSF溶液、IL-4溶液和IL-1β溶液的体积比为4：1：1；
（3.2）第2天，补充加入2ml激活剂，于5%CO2和37℃条件下继续培养；其中，激活剂为25ug/ml的肿瘤多肽抗原溶液；
（3.3）第3天，收集DC成熟细胞。
试验例
实施例1-3得到的DC成熟细胞的效果参数基本一致，下面以实施例1具体说明：
一、DC成熟细胞表面标志物流式分析
采用流式检测方法，将实施例1和对比例1得到的DC成熟细胞的表面标志物CD11c、CD83和CD86进行鉴定，结果见图1-2，由图1-2可知，实施例1得到的DC成熟细胞表面标志物CD11c、CD83和CD86的表达显著高于对比例1得到的DC成熟细胞表面标志物CD11c、CD83和CD86的表达，说明本发明试剂盒诱导的DC成熟细胞阳性表达率更高。
二、DC细胞分泌因子（IL-12）检测
分别收集实施例1和对比例1诱导培养的DC细胞第3天的培养上清液，采用白介素12(IL-12)ELISA检测试剂盒，对培养上清液中成熟DC细胞分泌的IL-12进行检测，具体操作根据ELISA检测说明书进行，结果见图3，由图3可知，实施例1诱导培养的成熟DC细胞分泌的IL-12含量显著高于对比例1诱导培养的成熟DC细胞分泌的IL-12含量，说明本发明试剂盒可有效促进DC细胞成熟及相关细胞因子IL-12的表达。
三、DC成熟细胞的数量及活性
DC细胞为悬浮细胞，分别收集实施例1和对比例1-2诱导培养第3天的悬浮细胞，分别采用细胞计数仪和0.4%台盼蓝染色方法，对收集的成熟DC细胞进行计数，并计算细胞活性，结果见表1，由表1可知，用本发明的试剂盒可在短时间内显著提高DC成熟细胞数量，同时，细胞活性也有所提高。
表1 DC成熟细胞数量及活性比较
组别 DC成熟细胞数量 DC成熟细胞活性
实施例1 2.4×10<sup>7</sup> 个/ml 98.8%
对比例1 1.6×10<sup>6</sup> 个/ml 96.3%
对比例2 1.7×10<sup>6</sup> 个/ml 96.4%
四、DC成熟细胞所呈递的T细胞对癌细胞的杀伤活性（CTL对肺癌细胞的杀伤活性）
分别将实施例1和对比例1中的T淋巴细胞和DC成熟细胞按照1：5进行共培养，强化T淋巴细胞向CTL诱导分化，分别加入5vt%的血清、终浓度为50ng/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的抗CD3单克隆抗体和50ng/ml抗CD28单克隆抗体，培养3天后，补充添加5vt%的血清和含上述添加因子的GT-T551无血清培养基，继续培养3天，分别得到具有靶向杀伤肿瘤的高活性CTL细胞。
肺癌细胞A549以1×105/孔的密度接种于Transwell6孔板，正常培养24h后，以相同密度分别将上述实施例1和对比例1得到的CTL细胞配入Transwell6孔板，其中，单纯培养的肺癌细胞A549为阴性对照组（A组），以实施例1得到的CTL细胞配入Transwell6孔板的为实验组（B组），以对比例1得到的CTL细胞配入Transwell6孔板的为阳性对照组（C组），分别于共培养24h、48h和72h后取出6孔板，用胰蛋白酶消化，将细胞置于96孔板（3000/孔），加入CCK-8溶液（10μL/孔），继续培养1h，用酶标仪测定450nm波长处的吸光度，比较实施例1和对比例1的两种试剂盒诱导的DC成熟细胞所呈递的T细胞对癌细胞的杀伤活性。结果见图4，由图4可知，本发明的诱导DC细胞培养的试剂盒诱导培养的DC细胞活化的T细胞，与肺癌细胞A549，在共培养24h、48h和72h后，癌细胞生长速度受抑制，且呈时间依赖性，A549抑制生长率均显著低于阴性对照组A和阳性对照组C。说明采用本发明试剂盒诱导培养的DC成熟细胞可显著增强CTL的杀瘤活性。
综上所述，本发明的诱导DC细胞培养的试剂盒可提高DC细胞特异性表达，增强细胞培养上清液中相关细胞因子的表达，缩短细胞培养时间，提高DC细胞诱导成熟速率和细胞活性，增强T细胞对肺癌细胞的杀伤活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：复合诱导剂和激活剂；其中，所述复合诱导剂由以下组分组成：GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液；所述激活剂由以下组分组成：antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液；
8种角蛋白分别为：II型细胞骨架1、I型细胞骨架16、I型细胞骨架14、I型细胞骨架19、II型细胞骨架79、II型细胞骨架75、II型细胞骨架5和II型细胞骨架2；
诱导DC细胞培养的试剂盒诱导培养DC细胞的方法，包括以下步骤：
（1）在DC细胞中加入含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基、所述复合诱导剂和灭活血浆，于4-6%CO2和35-38℃条件下培养；
（2）第2天，补充加入所述激活剂，于4-6%CO2和35-38℃条件下继续培养；
（3）第3天，收集DC成熟细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，激活剂与复合诱导剂的体积比为（1-3）：2。
3.根据权利要求1或2所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，GM-CSF溶液的浓度为200-500ng/ml，IL-4溶液的浓度为1000-3000IU/ml，IL-1β溶液的浓度为3000-8000IU/ml，8种角蛋白的混合溶液的浓度为300-700ng/ml；其中，复合诱导剂中GM-CSF溶液、IL-4溶液、IL-1β溶液和8种角蛋白的混合溶液的体积比为（3-5）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：1。
4.根据权利要求1或2所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，antiCD44蛋白溶液的浓度为500-800ng/ml，肿瘤多肽抗原溶液的浓度为10-30ug/ml；其中，激活剂中antiCD44蛋白溶液和肿瘤多肽抗原溶液的体积比为1：（1.8-2.2）。
5.根据权利要求1所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，步骤（1）中DC细胞和灭活血浆通过以下方法制得：
（1.1）采集血液样本，离心后，分离得到上层血浆和下层血细胞，先将上层血浆灭活，然后于3-5℃条件下离心，再除去下层沉淀，得到灭活血浆；
（1.2）将下层血细胞用生理盐水稀释后，加入Ficoll淋巴细胞分离液，进行离心，取中间层得到PBMC悬液；
（1.3）将PBMC悬液离心后，弃上清液，将细胞沉淀用生理盐水清洗，得到PBMC；
（1.4）将PBMC接种于含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基中，于4-6%CO2和35-38℃条件下培养0.8-1.2h，得到的贴壁细胞即为DC细胞。
6.根据权利要求5所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，步骤（1.1）中将上层血浆于50-60℃水浴放置25-35min，完成灭活过程。
7.根据权利要求5所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，步骤（1.4）中PBMC接种密度为1-4×106/ml。
8.根据权利要求1所述的诱导DC细胞培养的试剂盒，其特征在于，步骤（1）中含5-20vt%血清的RPMI 1640培养基、复合诱导剂和灭活血浆的体积比为（45-48）：（1.5-2.5）：（2-3）。
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