CN107043750A - 一种dc细胞诱导试剂盒及dc细胞诱导培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，其中，试剂盒包含：试剂A、试剂B、试剂C和试剂D，试剂A是浓度为20ng/ml的GM‑CSF溶液，试剂B是浓度为10ng/ml的IL‑4溶液，试剂C是浓度为500IU/ml的TNF‑a溶液，试剂D为淋巴细胞分离液；诱导培养DC细胞的方法主要包括以下步骤：用试剂D以密度梯度离心法分离并收获PBMC，将PBMC接种于1640培养基中，加入试剂A和试剂B，CO2培养箱中孵育，第2天、第4天补加试剂A和试剂B，第6天补加试剂A、试剂B和试剂C，第8天收集细胞。本发明的有益之处在于：本发明的DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法能够提高DC细胞的增殖速度和活性、增强DC细胞抑瘤和杀瘤作用。

Description

一种DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法
技术领域
本发明涉及一种试剂盒及细胞培养方法，具体涉及一种DC细胞诱导试剂盒及DC细胞诱导培养方法，属于生物技术领域。
背景技术
DC细胞作为有效的专职抗原提呈细胞，在和CIK细胞联合的情况下，可以确保高效的免疫反应。
近些年，免疫细胞疗法由于具有不手术、不化疗、不放疗、针对性强、无毒副作用、见效快、治本等优势得到了医疗界的广泛认可。DC细胞能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应，提高了细胞的增殖速度和杀伤活性，且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。
目前，存在很多种DC细胞诱导试剂盒和诱导培养方法，但这些试剂盒和诱导培养方法的培养质量、数量和效果参差不齐，不稳定，也不够理想。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够提高DC细胞的增殖速度和活性、增强DC细胞抑瘤和杀瘤作用的DC细胞诱导试剂盒，以及利用该DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种DC细胞诱导试剂盒，其特征在于，包含：试剂A、试剂B、试剂C和试剂D，其中，
前述试剂A为GM-CSF溶液，浓度为20ng/ml；
前述试剂B为IL-4溶液，浓度为10ng/ml；
前述试剂C为TNF-a溶液，浓度为500IU/ml；
前述试剂D为淋巴细胞分离液。
一种利用前述的DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：采血，先用D-PBS稀释，然后用试剂D以密度梯度离心法于2000rpm离心20min，分离并收获PBMC；
Step2：将收集的PBMC离心，然后用D-PBS清洗；
Step3：将PBMC接种于1640培养基中，分三个T175培养瓶培养，每瓶50ml，加入试剂A和试剂B，置于6％、37℃的二氧化碳培养箱中孵育，记为第0天；
Step4：第2天，补加45μl试剂A和90μl试剂B；
Step5：第4天，补加45μl试剂A和90μl试剂B；
Step6：第6天，补加45μl试剂A、90μl试剂B和90μl试剂C；
Step7：第8天，收集细胞。
前述的方法，其特征在于，在Step1中，采血50ml，用D-PBS稀释至100ml。
前述的方法，其特征在于，在Step2中，将收集的PBMC于1500rpm离心5min。
前述的方法，其特征在于，在Step3中，接种密度为1×106/ml-2×106/ml。
本发明的有益之处在于：
1、DC细胞诱导试剂盒
将细胞接种到培养瓶后，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-a)对细胞进行刺激，使细胞分泌相关因子，提高了细胞数量和纯度，同时高效，稳定，杀瘤效果强。
2、诱导培养DC细胞的方法
提高了所需表型细胞的百分比，增殖速度快，活性高，DC纯度高，增强了DC免疫刺激功能。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
第一部分：准备DC细胞诱导试剂盒
1、试剂A
试剂A为GM-CSF溶液，浓度为20ng/ml。
配制方法如下：于超净台中取100ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，然后用5ml注射用水溶解，即配制成所需试剂A，-20℃保存。
试剂A发挥的作用是：促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHCⅡ类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能，还可以促进DC的存活。
2、试剂B
试剂B为IL-4溶液，浓度为10ng/ml。
配制方法如下：于超净台中取100ng白介素4(IL-4)，然后用10ml注射用水溶解，即配制成所需试剂B，-20℃保存。
试剂B发挥的作用是：与GM-CSF有协同作用，可以促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能，也可诱导外周血单核细胞分泌相关因子。
3、试剂C
试剂C为TNF-a溶液，浓度为500IU/ml。
试剂C采用反复冻融法获得，具体如下：
(1)手术切除肿瘤标本，在无菌条件下，将坏死组织等去除干净；
(2)用无菌生理盐水洗3次；
(3)用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
(4)用200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
(5)用RPMI1640培养基重悬细胞1×107/ml-2×107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
(6)将冻存管浸入液氮中速冻，10min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10min，反复3-5次；
(7)将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
(8)收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
(9)-80℃保存备用。
试剂C发挥的作用是：通过TNF对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤；提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生，增强ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶；促进细胞增殖和分化。
4、试剂D
试剂D为淋巴细胞分离液。
获得方法如下：于超净台取一瓶淋巴细胞分离液和若干50ml离心管，每管倒入20ml淋巴细胞分离液。
试剂D发挥的作用是：以密度梯度离心法离心，是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂。
第二部分：诱导培养DC细胞
利用前面的DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞的方法包括以下步骤：
Step1：采血50ml，先用D-PBS稀释至100ml，然后用试剂D以密度梯度离心法于2000rpm离心20min，分离并收获PBMC。
Step2：将收集的PBMC于1500rpm离心5min，然后用D-PBS清洗2遍，以获得较高纯度的PBMC。
Step3：将PBMC以1×106/ml-2×106/ml的接种密度接种于150ml1640培养基中，分三个T175培养瓶培养，每瓶50ml，加入试剂A和试剂B，置于6％、37℃的二氧化碳培养箱中孵育，记为第0天。
Step4：第2天，补加45μl试剂A和90μl试剂B，保证DC细胞在生长过程中获得足够的营养成分。
Step5：第4天，补加45μl试剂A和90μl试剂B。
Step6：第6天，补加45μl试剂A、90μl试剂B和90μl试剂C，取样做质检，保证获得无菌的细胞。
Step7：第8天，收集细胞，取样做流式，分析DC细胞表面抗原标记。
第三部分：培养效果
对照组：以仅加入普通的TNF-a 500IU/ml的培养方法作为对照组，其他步骤与实验组一致。
1、DC细胞的增殖速度
成熟的DC细胞是贴壁性细胞，在第8天细胞收集的时候进行细胞计数。
组别 第8天细胞数量
实验组 8.4×107个/ml
对照组 3.7×106个/ml
由此可见，利用前面的DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞能够明显提高DC细胞的增殖速度。
2、DC细胞的活性
DC细胞第8天收获时用0.4％台盼蓝进行细胞活性检测。
组别 第8天细胞活性
实验组 98.5％
对照组 96.7％
由此可见，利用前面的DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞能够明显提高DC细胞的活性。
3、DC细胞的抑瘤和杀瘤能力
DC细胞具有更高的细胞成熟度、可以分泌更多非特异性免疫抗肿瘤机制的细胞因子和分泌更少免疫抑制因子，将DC细胞和CIK细胞共同培养，不仅可显著增强CIK的抗肿瘤活性，还可以提高CIK细胞对肿瘤靶细胞杀伤作用的特异性。
因此，利用前面的DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞能够明显增强DC细胞的抑瘤和杀瘤作用。
在肿瘤免疫中，DC细胞不能直接杀伤肿瘤细胞，但能通过识别肿瘤细胞特异性抗原，将其信号呈递给具杀伤效应的T细胞来达到监测、杀灭肿瘤的功能，能诱导产生大量效应T细胞启动效应T细胞迁移至肿瘤部位，能保持效应T细胞在肿瘤部位的长期存在，同时能抑制肿瘤血管的生成，所针对的适应症也较多。
综上所述，本发明的诱导培养DC细胞的方法不仅可以提高DC细胞的增殖速度和活性，还可以增强DC细胞抑瘤和杀瘤作用。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种DC细胞诱导试剂盒，其特征在于，包含：试剂A、试剂B、试剂C和试剂D，其中，
所述试剂A为GM-CSF溶液，浓度为20ng/ml；
所述试剂B为IL-4溶液，浓度为10ng/ml；
所述试剂C为TNF-a溶液，浓度为500IU/ml；
所述试剂D为淋巴细胞分离液。
2.利用权利要求1所述的DC细胞诱导试剂盒诱导培养DC细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：采血，先用D-PBS稀释，然后用试剂D以密度梯度离心法于2000rpm离心20min，分离并收获PBMC；
Step2：将收集的PBMC离心，然后用D-PBS清洗；
Step3：将PBMC接种于1640培养基中，分三个T175培养瓶培养，每瓶50ml，加入试剂A和试剂B，置于6％、37℃的二氧化碳培养箱中孵育，记为第0天；
Step4：第2天，补加45μl试剂A和90μl试剂B；
Step5：第4天，补加45μl试剂A和90μl试剂B；
Step6：第6天，补加45μl试剂A、90μl试剂B和90μl试剂C；
Step7：第8天，收集细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在Step1中，采血50ml，用D-PBS稀释至100ml。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在Step2中，将收集的PBMC于1500rpm离心5min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在Step3中，接种密度为1×106/ml-2×106/ml。
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