CN103923880B - 一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的ctl制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法。所述CTL制备方法，包括以下步骤：（a）免疫磁珠阴性分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞；（b）将混合细胞置于装有无血清培养基中培养，获得悬浮细胞和贴壁细胞，（c）贴壁细胞中加入GM-CSF及IL-4，培养5天；第6天，加入肿瘤细胞全抗原，第7天加入TNF-α和IL-27；（d）将悬浮细胞移至经抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，加入IFN-γ，第2天加入IL-2、IL-12、IL-27，培养至第8天，得到CIK细胞；（e）将CIK细胞与成熟DC细胞混合，加入IL-12、IL-7、抗CD28单克隆抗体培养；第3天，加入抗CTLA-4单克隆抗体，再培养4天。本发明所述方法提高体外CTL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性，抑制外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

Description

一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法

技术领域

本发明属于细胞的培养领域，具体地，涉及一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法。

背景技术

目前，肿瘤已成为威胁人类生命和健康的首要敌人，其发病率也在逐年上升，《世界癌症报告》显示全球癌症病例由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人；每年死于癌症的人数不断增加，由820万人增加至1300万人，到2030年新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。癌症是中国居民死亡的主要原因之一，根据我国肿瘤发病情况登记年报显示，每年新发肿瘤病例约为350万例，全国每分钟有6人被诊断为癌症，约有250万人死于癌症。预计，到2020年，新发病例将达到390万，因恶性肿瘤而死亡的人数将达294万。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方式，能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效低。肿瘤细胞免疫治疗作为一种全新的肿瘤全身治疗方式，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大治疗肿瘤的新技术。

目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞（树突状细胞）、CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）、DC-CIK细胞和CTL细胞，其中CTL（细胞毒性T淋巴细胞）因具有肿瘤特异性，能直接靶向作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高等特点，而成为目前临床研究的热点。肿瘤细胞免疫治疗在临床上取得了不错的疗效，特别是，2010年美国FDA批准了Dendreon公司的前列腺癌疫苗Provenge（商品名：sipuleucel-T）的上市申请，成为第一支通过FDA批准的DC疫苗，也是近20年以来肿瘤生物治疗领域的重大突破，推动了肿瘤细胞免疫治疗在临床治疗恶性肿瘤中的应用。然而，经体外扩增回输到病人体内的有效的效应细胞数量较少，能有效作用于肿瘤靶细胞的效率较低，因而限制了肿瘤治疗的效果，不能显著的提高肿瘤患者尤其是晚期患者的生存期。另一方面，肿瘤患者的免疫应答能力很弱，CD4⁺CD25⁺调节性T淋巴细胞（Treg）也抑制对肿瘤的免疫应答反应，因此肿瘤患者的免疫系统不能对肿瘤起到有效的杀伤作用，即产生机体对肿瘤耐受。同时，肿瘤微环境通过多种途径促使Treg细胞的数量增加，即释放趋化因子CCL22，将胸腺、骨髓、淋巴结以及外周血中自然产生的Treg趋化至肿瘤局部；产生的VEGF（血管内皮生长因子）、TGF-β1（转化生长因子-β1）、IL-10（白细胞介素-10）能诱导Treg的产生及对胸腺来源的天然Treg具有扩增作用；并且抑制性分子TGF-β、COX-2（环氧化酶-2）、CD70、Galectin-1（半乳糖凝集素-1）、IDO（吲哚胺2,3-双加氧酶）能使CD4⁺CD25⁺Treg转化为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg，导致肿瘤患者的自身免疫系统不能辨认和清除体内的肿瘤细胞，加剧肿瘤的免疫耐受，使肿瘤无限制生长。由于肿瘤的免疫耐受，使得回输的效应细胞不能在体内引起有效的抗肿瘤免疫应答反应，影响了效应细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

天然Treg是一个具有免疫调节作用的T淋巴细胞亚群，约占CD4⁺T细胞的5%-10%，起着维持机体自身免疫耐受的作用。越来越多的数据表明，各种肿瘤患者体内的Treg数量比正常人明显增多，因此肿瘤患者机体处于一个高度免疫耐受的状态。所以，体外采集肿瘤病人外周血单核细胞（PBMC）时，Treg细胞比例高，同时在诱导扩增效应细胞所用的IL-2也能诱导Treg细胞增殖，且能分泌大量IL-10，由此抑制效应细胞的增殖、降低其细胞杀伤活性。

因此，如何提高效应细胞的增殖效率及靶向杀伤肿瘤细胞的活性，打破肿瘤免疫耐受，抑制培养过程中Treg细胞的转化数量，提高细胞免疫治疗的疗效是目前肿瘤细胞免疫治疗技术亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种体外CTL细胞的制备方法，该方法能够显著提高体外CTL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性，抑制肿瘤患者外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：提供一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法，包括以下步骤：

（a）去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞：采集并分离外周血单个核细胞，通过免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺以及CD14⁺的混合细胞；

（b）分离T淋巴细胞和DC细胞：将得到的混合细胞置于无血清培养基中，在37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中静置孵育，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC细胞），

（c）成熟DC细胞的制备：将T淋巴细胞转移至新的培养瓶中；贴壁的DC细胞中加入含有GM-CSF及IL-4的无血清培养基，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中扩增培养5天；第6天，加入肿瘤细胞全抗原，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入TNF-α和IL-27，得到成熟的DC细胞；

（d）CIK的制备：将T淋巴细胞转移至经抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在无血清培养基中加入IFN-γ，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养；第2天在培养基中加入IL-2、IL-12、IL-27，培养至第8天，得到CIK细胞；

（e）CTL细胞的制备：将上述（d）步骤得到的CIK细胞与（c）步骤得到的成熟DC细胞，在含有IL-12、IL-7、抗CD28单克隆抗体的无血清培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入抗CTLA-4单克隆抗体，继续培养4天即可得到CTL细胞。

其中，所述（b）分离T淋巴细胞和DC细胞步骤中，所述无血清培养基可以为20-40ml的无血清AIM-Ⅴ培养基，进一步优选20ml。

其中，所述（c）成熟DC细胞的制备步骤中，GM-CSF为50ng/ml、IL-4为25ng/ml、所述无血清培养基为20ml的无血清AIM-Ⅴ培养基、肿瘤细胞全抗原为50μg/ml、TNF-α为30ng/ml、IL-27为10-30ng/ml。进一步优选所述IL-27为20ng/ml。

其中，所述（d）CIK的制备步骤中，抗CD3单克隆抗体为50ng/ml、重组人纤维连接蛋白为1μg/ml、所述无血清培养基为20-40ml无血清AIM-Ⅴ培养基、IFN-γ为1000U/ml、IL-2为20ng/ml、IL-12为5-15ng/ml、IL-27为5-20ng/ml。进一步优选所述IL-12为10ng/ml，优选所述IL-27为10ng/ml。其中，在无血清培养基中加入IFN-γ用以增强CIK细胞毒活性。

其中，所述（e）CTL细胞的制备步骤中，CIK细胞和成熟DC细胞混合比例可以为10：1、IL-12为5ng/ml、IL-7为5-15ng/ml、抗CD28单克隆抗体为50ng/ml、所述无血清培养基为20ml无血清AIM-Ⅴ培养基、CTLA-4单克隆抗体为50ng/ml-1μg/ml。进一步优选所述IL-7为10ng/ml，优选所述CTLA-4单克隆抗体为100ng/ml。

本发明所述的方法能够制备得到高效增殖力、靶向杀伤肿瘤的高活性CTL细胞，同时显著地抑制外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化。

在所述（a）去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞步骤中，本发明中采用免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，抑制了外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化。免疫磁珠分离法是基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单克隆抗体相结合，在外磁场作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面标记抗原的细胞由于不能与磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，因此不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠分离法有阳性分选法和阴性分选法，阳性分选法的磁珠所结合的细胞是需要分离获得的细胞，而阴性分离法的磁珠所结合的细胞为不需要细胞。本发明利用免疫磁珠阴性分选法将PBMC中的Treg细胞去除，从而可提高PBMC诱导分化功能性高CTL的有效细胞比例，将PBMC向Treg转化降至最低，PBMC中剩下的细胞则进行后续的CTL诱导扩增培养。

在所述（c）成熟DC细胞的制备步骤中，使用IL-27和TNF-α组合培养液促进人PBMC来源树突状细胞的分化成熟；抑制所述外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化。本发明中“成熟的DC细胞”及“促进树突状细胞的分化成熟”中的“成熟”指的是DC细胞经肿瘤细胞抗原刺激后经过分化,从而获得启动对肿瘤细胞产生适应性免疫应答的能力。

在所述（d）CIK的制备步骤中，本发明利用抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白，联合细胞因子IL-2、IL-12和IL-27扩增培养CIK，一方面增强CIK的免疫功能，另一方面抑制PBMC向Treg细胞转化和增殖。

IL-12主要由DC细胞和T细胞产生，可促进CD4⁺Th0细胞分化为Th1细胞，促进IFN-γ、TNF-α和IL-2合成；可抑制Th2细胞合成IL-4、IL-5和IL-10。IL-27除了可诱导初始CD4⁺T细胞分化为Th1，抑制外周T细胞转化为Treg细胞以外，还能与T细胞表面的IL-27受体结合，通过激活P-STAT1/STAT3信号通路，促进初始CD4⁺T细胞分化成熟，进一步活化为CD8⁺T细胞。因此，本发明在培养DC细胞时，利用IL-27促进单个核细胞来源树突状细胞的分化成熟。

在所述的（e）CTL细胞的制备步骤中，将所述成熟DC细胞与所述CIK细胞混合培养诱导扩增CTL，利用IL-12、IL-7和抗CD28单克隆抗体组合来诱导CTL的分化、增殖，同时抑制PBMC向Treg细胞转化和增殖。IL-7可促进CTL的增殖、分化及杀伤活性；而诱导T淋巴细胞活化、增殖为效应细胞有赖于双信号，TCR/CD3识别抗原肽提供第一信号，第二信号是由抗原提呈细胞（APC）上的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体结合产生。CD28是T淋巴细胞表面重要的协同刺激分子受体，与APC细胞表面的B7分子结合，为T细胞的活化提供第二信号，促进效应T细胞大量增殖，同时可以诱导IL-2、IFN-γ的生成及CTL的分化。T细胞活化同时也会诱导其细胞表面的CTLA-4高表达，同CD28竞争性地与B7分子结合，对T细胞活化发挥负调节作用，进而引起IL-2合成和分泌的减少，使得效应T细胞增殖减少。因此，本发明在诱导CTL分化的第三天，采用抗CTLA-4单克隆抗体在CTL增殖过程中进行免疫调节，利用其与活化的T淋巴细胞表面的CTLA-4分子结合，从而阻断CTLA-4的免疫抑制作用，提高CTL分化和增殖效率，增强其靶向杀伤肿瘤细胞的活性。

其中，所述外周血单个核细胞的采集及分离，包括以下步骤：

采集外周血，在2500转/分钟的条件下离心10min，将上层血浆吸出备用；加入质量百分数为0.9%注射用生理盐水至血细胞中，混匀，稀释血细胞；将稀释的外周血加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者体积比为1：1；离心30min，将呈白雾状的单个核细胞层吸出，移入另一离心管中；用质量百分数为0.9%注射用生理盐水稀释，离心5min，洗涤3次离心后得到PBMC。

综上，本发明的有益效果是：提高体外CTL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性，抑制肿瘤患者外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

本发明中提到的各英文缩写分别为：

CTL：细胞毒性T淋巴细胞；

DC：树突状细胞；

CIK：细胞因子诱导的杀伤细胞；

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；

PBMC：外周血单个核细胞；

IL-4：白细胞介素-4；

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；

IL-27：白细胞介素-27；

IFN-γ：干扰素-γ；

IL-2：白细胞介素-2；

IL-12：白细胞介素-12；

IL-27：白细胞介素-27；

IL-7：白细胞介素-7；

CTLA-4：胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4；

TCR：T细胞抗原受体；

MTT：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐。

实施例1：CTL细胞的制备

1、PBMC的制备

采集肿瘤患者外周血50ml，2500rpm（转/分钟），离心10min，将上层血浆吸出备用。加入质量百分数为0.9%注射用生理盐水至血细胞中，混匀，稀释血细胞。将稀释的外周血缓慢加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者体积比为1：1。600g，离心30min，将呈白雾状的单个核细胞层轻轻吸出，移入另一离心管中。用质量百分数为0.9%注射用生理盐水稀释，400g，离心5min，洗涤3次低速离心后得到PBMC。

2、MiniMACS免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞

用MACS（Magnetic-activatedcellsorting，磁珠分离系统）缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5×10⁸/ml。在单细胞悬液中加入生物素标记的抗人CD25，于冰上孵育30分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，于冰上再孵育30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞后所得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺的混合细胞。

3、分离DC细胞和T淋巴细胞：

将得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺混合细胞，分装到有20ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中，37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC），将悬浮细胞转移至新的培养瓶中。

4、成熟DC细胞的制备：

贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mlGM-CSF、25ng/mlIL-4的无血清AIM-Ⅴ培养基20ml，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中扩增培养5天。第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤细胞全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mlTNF-α和20ng/mlIL-27，第8天获得到成熟的DC细胞。

其中自体肿瘤细胞全抗原的制备方法：取新鲜肿瘤组织1cm³，剪除周边组织后，用生理盐水洗涤5遍，剪碎，研磨后经75μm细胞滤网过滤制备成单细胞，反复冻融后获得肿瘤细胞裂解物。

5、CIK细胞的制备：

首先，将悬浮的T细胞转移至经50ng/ml抗CD3单克隆抗体和1μg/ml重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在20ml无血清AIM-Ⅴ培养基中加入1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养。第2天在培养基中加入20ng/mlIL-2、10ng/mlIL-12、10ng/mlIL-27。以后根据培养液颜色半量补充IL-2、IL-12和IL-27培养基，培养至第8天，得到CIK细胞。

6、靶向杀伤肿瘤的高活性CTL的制备：

将前述的CIK细胞与成熟DC细胞按照10：1的比例混合，在含有5ng/mlIL-12、10ng/mlIL-7、抗CD28单克隆抗体50ng/ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入抗CTLA-4单克隆抗体100ng/ml，继续培养4天即可得到高效增殖力，靶向杀伤肿瘤的高活性CTL细胞。

实施例1制得的CTL细胞的生物学特性

1、CTL细胞活力、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测

取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活力可达到97%。另取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入检测用的鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测。本发明制备的CTL细胞总量为（4.2±0.7）×10⁹，扩增80倍，流式细胞仪分析表明CTL纯度可达到70%，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率为（90.8±3.74）%，其中CD3⁺CD8⁺细胞可达到（67.4±2.53）%，而CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例为（1.87±0.53）%，显著低于直接从患者体内测取的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占外周血CD4⁺T细胞比例（9.48±1.74）%，含量大幅下降，本发明的方法显著性地抑制肿瘤患者外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

2、CTL对肝癌细胞特异性杀伤作用的检测

CTL细胞按效靶比例10：1、20：1、40：1加入来自于肝癌患者的肝癌细胞或HepG2肝癌细胞株接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算CTL对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性（%）＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

按照上述方法进行测试，结果显示本发明制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比20：1时，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为（76.3±9.3）%；CTL细胞对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为（72.9±8.7）%；

效靶比为10：1，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为（60.4±7.6）%，CTL对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为（58.7±6.9）%；

效靶比为40：1，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为（72.8±8.4）%，CTL对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为（69.6±9.2）%。

结果显示本发明制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比20：1时，CTL的特异性杀伤活性明显最高。本发明所述方法制得的CTL细胞按效靶比例为20：1应用于肿瘤细胞免疫治疗，CTL细胞的特异性杀伤活性最佳。

实施例2

1、PBMC的制备

采集肿瘤患者外周血50ml，2500rpm，离心10min，将上层血浆吸出备用。加入质量百分数为0.9%注射用生理盐水至血细胞中，混匀，稀释血细胞。将稀释的外周血缓慢加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者体积比为1：1。600g，离心30min，将呈白雾状的单个核细胞层轻轻吸出，移入另一离心管中。用质量百分数为0.9%注射用生理盐水稀释，400g，离心5min，洗涤3次低速离心后得到PBMC。

2、MiniMACS免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞

用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5×10⁸/ml。在单细胞悬液中加入生物素标记的抗人CD25，于冰上孵育30分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，于冰上再孵育30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞后所得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺的混合细胞。

3、分离DC细胞和T淋巴细胞：

将得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺混合细胞，分装到有40ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中，37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC），将悬浮细胞转移至新的培养瓶中。

4、成熟DC细胞的制备：

贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mlGM-CSF、25ng/mlIL-4无血清AIM-Ⅴ培养基20ml，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中扩增培养5天。第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤细胞全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mlTNF-α和10ng/mlIL-27，第8天获得到成熟的DC细胞。

其中自体肿瘤细胞全抗原的制备方法与实施例1相同。

5、CIK细胞的制备：

首先，将悬浮的T细胞转移至经50ng/ml抗CD3单克隆抗体和1μg/ml重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在40ml无血清AIM-Ⅴ培养基中加入1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养。第2天在培养基中加入20ng/mlIL-2、5ng/mlIL-12、5ng/mlIL-27。以后根据培养液颜色半量补充IL-2、IL-12和IL-27培养基，培养至第8天，得到CIK细胞。

6、靶向杀伤肿瘤的高活性CTL的制备：

将前述的CIK细胞与成熟DC细胞按照10：1的比例混合，在含有5ng/mlIL-12、5ng/mlIL-7、抗CD28单克隆抗体50ng/ml的20ml无血清AIM-Ⅴ培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入抗CTLA-4单克隆抗体50ng/ml，继续培养4天即可得到高效增殖力，靶向杀伤肿瘤的高活性CTL细胞。

实施例2制得的CTL细胞的生物学特性

1、CTL细胞活力、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测

取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活力可达到95%。另取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入检测用的鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测。本发明制备的CTL细胞总量为(3.9±0.5)×10⁹，扩增74倍，流式细胞仪分析表明CTL纯度可达到60%，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率为(86.7±3.69)%，其中CD3⁺CD8⁺细胞可达到(60.5±2.94)%，而CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例为(2.14±0.67)%，显著低于直接从患者体内测取的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占外周血CD4⁺T细胞比例（9.48±1.74）%，含量大幅下降，本发明的方法显著性地抑制肿瘤患者外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

2、CTL对肝癌细胞特异性杀伤作用的检测

CTL细胞按效靶比例20：1入来自于肝癌患者的肝癌细胞或HepG2肝癌细胞株接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算CTL对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性（%）＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比20：1时，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为(72.6±8.8)%；CTL细胞对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为(68.4±7.1)%。

实施例3

1、PBMC的制备以及2、MiniMACS免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞采用与实施例1相同的方法；

3、分离DC细胞和T淋巴细胞：

将得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺混合细胞，分装到有30ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中，37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC），将悬浮细胞转移至新的培养瓶中。

4、成熟DC细胞的制备：

贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mlGM-CSF、25ng/mlIL-4的无血清AIM-Ⅴ培养基20ml，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中扩增培养5天。第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤细胞全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mlTNF-α和30ng/mlIL-27，第8天获得到成熟的DC细胞。

其中自体肿瘤细胞全抗原的制备方法与实施例1相同。

5、CIK细胞的制备：

首先，将悬浮的T细胞转移至经50ng/ml抗CD3单克隆抗体和1μg/ml重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在30ml无血清AIM-Ⅴ培养基中加入1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养。第2天在培养基中加入20ng/mlIL-2、15ng/mlIL-12、20ng/mlIL-27。以后根据培养液颜色半量补充IL-2、IL-12和IL-27培养基，培养至第8天，得到CIK细胞。

6、靶向杀伤肿瘤的高活性CTL的制备：

将前述的CIK细胞与成熟DC细胞按照10：1的比例混合，在含有5ng/mlIL-12、15ng/mlIL-7、抗CD28单克隆抗体50ng/ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入抗CTLA-4单克隆抗体1μg/ml，继续培养4天即可得到高效增殖力，靶向杀伤肿瘤的高活性CTL细胞。

实施例3制得的CTL细胞的生物学特性

1、CTL细胞活力、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测

取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活力可达到95%。另取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入检测用的鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测。本发明制备的CTL细胞总量为(4.0±0.7)×10⁹，扩增76倍，流式细胞仪分析表明CTL纯度可达到65%，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率为（88.7±3.69）%，其中CD3⁺CD8⁺细胞可达到（62.7±2.51）%，而CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例为（1.95±0.49）%，显著低于直接从患者体内测取的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占外周血CD4⁺T细胞比例（9.48±1.74）%，含量大幅下降，本发明的方法显著性地抑制肿瘤患者外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

2、CTL对肝癌细胞特异性杀伤作用的检测

CTL细胞按效靶比例20：1入来自于肝癌患者的肝癌细胞或HepG2肝癌细胞株接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算CTL对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性（%）＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比20：1时，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为（74.8±8.7）%；CTL细胞对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为（70.8±7.9）%。

为突出对比本发明所述CTL制备方法能够显著改善体外CTL细胞增殖效率、靶向杀伤肿瘤细胞的活性，抑制PBMC向CD4⁺CD25⁺Treg细胞的转化，针对所述实施例1列出了以下两组对比例。

对比例1

1、采用与实施例1相同的方法制备PBMC。

2、MiniMACS免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞

用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5×10⁸/ml。在单细胞悬液中加入生物素标记的抗人CD25，于冰上孵育30分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，于冰上再孵育30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞后所得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺的混合细胞。

3、分离DC细胞和T淋巴细胞：

将得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺混合细胞，分装到有20ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中，37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC细胞），将悬浮细胞转移至新的培养瓶中。

4、成熟DC细胞的制备：

贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mlGM-CSF、25ng/mlIL-4的无血清AIM-Ⅴ培养基20ml，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中扩增培养5天。第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤细胞全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mlTNF-α和20ng/mlIL-27，第8天获得到成熟的DC细胞。

其中自体肿瘤细胞全抗原的制备方法与实施例1相同。

5、CIK细胞的制备：

首先，将悬浮的T细胞转移至经50ng/ml抗CD3单克隆抗体包被的培养瓶中，并在20ml无血清AIM-Ⅴ培养基中加入1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养。第2天在培养基中加入20ng/mlIL-2、10ng/mlIL-12、10ng/mlIL-27。以后根据培养液颜色半量补充IL-2、IL-12和IL-27培养基，培养至第8天，得到CIK细胞。

6、CTL的制备：

将前述的CIK细胞与成熟DC细胞按照10：1的比例混合，在含有5ng/mlIL-12、10ng/mlIL-7的无血清AIM-Ⅴ培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入10ng/mlIL-2，继续培养4天即可得到CTL细胞。

对比例1制得的CTL细胞的生物学特性

1、CTL细胞活力、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测

取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，该方法制备的细胞活力可达到95%。另取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入检测用的鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测。该方法制备的CTL细胞总量为（2.1±0.5）×10⁹，扩增40倍，流式细胞仪分析表明CTL纯度可达到38%，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率为（50.7±2.33）%，其中CD3⁺CD8⁺细胞可达到（37.8±2.14）%，而CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例为（5.27±1.53）%。

2、CTL对肝癌细胞特异性杀伤作用的检测

CTL细胞按效靶比例20：1加入来自于肝癌患者的肝癌细胞或HepG2肝癌细胞株接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算CTL对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性（%）＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

按照上述方法进行测试，结果显示该方法制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比20：1时，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为（59.2±7.4）%；CTL细胞对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为（56.6±7.5）%。

对比例2

1、采用与实施例1相同的方法制备PBMC。

2、MiniMACS免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞

用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5×10⁸/ml。在单细胞悬液中加入生物素标记的抗人CD25，于冰上孵育30分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，于冰上再孵育30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞后所得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺的混合细胞。

3、分离DC细胞和T淋巴细胞：

将得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺混合细胞，分装到有20ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中，37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC），将悬浮细胞转移至新的培养瓶中。

4、成熟DC细胞的制备：

贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mlGM-CSF、25ng/mlIL-4的无血清AIM-Ⅴ培养基20ml，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中扩增培养5天。第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤细胞全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mlTNF-α，第8天获得到成熟的DC细胞。

其中自体肿瘤细胞全抗原的制备方法与实施例1相同。

5、CIK细胞的制备：

首先，将悬浮的T细胞转移至经50ng/ml抗CD3单克隆抗体和1μg/ml重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在20ml无血清AIM-Ⅴ培养基中加入1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养。第2天在培养基中加入50ng/mlIL-2。以后根据培养液颜色半量补充IL-2培养基，培养至第8天，得到CIK细胞。

6、CTL的制备：

将前述的CIK细胞与成熟DC细胞按照10：1的比例混合，在含有50ng/mlIL-2、抗CD28单克隆抗体50ng/ml的无血清AIM-Ⅴ培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入抗CTLA-4单克隆抗体100ng/ml，继续培养4天即可得到CTL细胞。

对比例2制得的CTL细胞的生物学特性

1、CTL细胞活力、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测

取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，该方法制备的细胞活力可达到95%。另取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入检测用的鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测。该方法制备的CTL细胞总量为（2.6±0.7）×10⁹，扩增50倍，流式细胞仪分析表明CTL纯度可达到42%，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率为（55.6±2.76）%，其中CD3⁺CD8⁺细胞可达到（40.3±2.57）%，而CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例为（4.71±1.35）%。

2、CTL对肝癌细胞特异性杀伤作用的检测

CTL细胞按效靶比例20：1加入来自于肝癌患者的肝癌细胞或HepG2肝癌细胞株接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5%CO₂的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算CTL对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性（%）＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

按照上述方法进行测试，结果显示该方法制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比20：1时，CTL对肝癌患者的肝癌细胞杀伤活性为（65.7±8.1）%；CTL细胞对HepG2肝癌细胞株杀伤活性为（60.5±7.9）%。

从实施例1与对比例1-2相对比，可以看出，本发明所述的CTL制备方法，通过：①在CIK的制备步骤中使用抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白共同包被的培养瓶培养悬浮细胞，在CTL的制备步骤中分别添加抗CD28单克隆抗体及抗CTLA-4单克隆抗体；②在成熟DC细胞的制备步骤中使用IL-27和TNF-α组合培养液，在CIK制备步骤中添加IL-12、IL-27，在CTL制备步骤中添加IL-12、IL-7；以上两种方式的结合使用，使得本发明制备得到的CTL扩增倍数，CTL纯度，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率明显得到提高，CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例得到明显降低，效靶比为20：1时CTL的特异性杀伤活性得到提高；尤其是实施例中的CTL的扩增倍数是对比例中CTL的扩增倍数的1.6倍以上，CTL纯度是对比例中CTL纯度的1.6倍以上，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率是对比例中CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率的1.6倍以上，对比例1-2制得的CTL中的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例是实施例1中CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例的两倍以上，P<0.05，具有显著性，可见本发明所述方法能显著抑制外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

采用与实施例1对比实验相同的方式对实施例2-3作对比实验，在此不再具体列出，同样能得到上述有益效果，即：CTL的扩增倍数是对比例中CTL的扩增倍数的1.6倍以上，CTL纯度是对比例中CTL纯度的1.6倍以上，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率是对比例中CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、CD56⁺的T细胞总比率的1.6倍以上，对比例制得的CTL中的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例是实施例中CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例的两倍以上，P<0.05，具有显著性，能显著抑制外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

如上所述，可较好的实现本发明。

Claims (5)

1.一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法，包括以下步骤：

（a）去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞：采集并分离外周血单个核细胞，通过免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺以及CD14⁺的混合细胞；

（b）分离T淋巴细胞和DC细胞：将得到的混合细胞置于无血清培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中静置孵育，获得T淋巴细胞和DC细胞，

（c）成熟DC细胞的制备：将T淋巴细胞转移至新的培养瓶中；贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mLGM-CSF及25ng/mLIL-4的无血清培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中扩增培养5天；第6天，加入肿瘤细胞全抗原，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mLTNF-α和10-30ng/mLIL-27，得到成熟的DC细胞；

（d）CIK的制备：将T淋巴细胞转移至经50ng/mL抗CD3单克隆抗体和1μg/mL重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在无血清培养基中加入1000U/mLIFN-γ，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；第2天在培养基中加入20ng/mLIL-2、5-15ng/mLIL-12、5-20ng/mLIL-27，培养至第8天，得到CIK细胞；

（e）CTL细胞的制备：将上述（d）步骤得到的CIK细胞与（c）步骤得到的成熟DC细胞，在含有5ng/mLIL-12、5-15ng/mLIL-7、50ng/mL抗CD28单克隆抗体的无血清培养基中混合培养，且所述CIK细胞和所述成熟DC细胞的混合比例为10：1；混合培养的第3天，在培养基中加入50ng/mL-1μg/mL抗CTLA-4单克隆抗体，继续培养4天即可得到CTL细胞。

2.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（b）分离T淋巴细胞和DC细胞步骤中，所述无血清培养基为20-40mL的无血清AIM-Ⅴ培养基。

3.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（c）成熟DC细胞的制备步骤中，肿瘤细胞全抗原为50μg/mL、IL-27为20ng/mL。

4.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（d）CIK的制备步骤中，所述无血清培养基为20-40mL无血清AIM-Ⅴ培养基、IL-12为10ng/mL、IL-27为10ng/mL。

5.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（e）CTL细胞的制备步骤中，IL-7为10ng/mL、所述无血清培养基为20mL无血清AIM-Ⅴ培养基、CTLA-4单克隆抗体为100ng/mL。