CN109486763A - 外周血来源的树突状细胞培养方法 - Google Patents

外周血来源的树突状细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法，所述方法包括如下步骤：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM‑V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM‑CSF 40～60ng/mL、IL‑4 40～60ng/mL；所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF‑α7～13ng/mL以及PEG‑2 0.8～1.2μg/mL。本发明通过优化培养流程，筛选和优化诱导成熟因子组分，大大提高了成熟DC细胞的比例，提高了细胞质量，还能降低培养成本。

Description

外周血来源的树突状细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。
大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为未成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。处于各种非淋巴组织中的未成熟DC细胞摄取抗原后，到达淋巴结、脾脏，此后DC细胞摄取抗原加工的能力减弱直至消失，而致敏T淋巴细胞、启动免疫反应的能力增强，成为成熟DC细胞。
在体外培养淋巴细胞的过程中，为了最大程度活化T细胞，需要加入成熟的DC细胞以致敏T细胞。DC细胞的体外培养，通常以外周血单个核细胞作为前体细胞诱导未成熟的DC的细胞。DC细胞促成熟过程非常复杂，涉及到多种因子的共同作用，诸如GM-CSF、TNF、IL-6、IL-4、IL-1β、PGE2、polyI:C、CD40L等等。
成熟的DC细胞高表达MHC-I、MHC-Ⅱ类分子，以及CD80、CD86、CD40和ICAM-1等免疫分子，能够与T淋巴细胞之间的黏附分子及配体相互作用，从而激活T淋巴细胞。但DC细胞诱导成熟过程复杂，现诱导技术成熟DC细胞比例较低，因而不能有效活化T淋巴细胞。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新颖的外周血来源的树突状细胞培养方法，该方法操作简单，培养得到树突状细胞(Dendritic cells，DCs)质量较好，可用于树突状细胞的大量制备，使该制备方法更利于推广和应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法，包括如下步骤：
1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；
2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；
其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2％自体血浆、GM-CSF 40～60ng/mL、IL-4 40～60ng/mL；
所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α7～13ng/mL以及PEG-20.8～1.2μg/mL。
本发明通过两步培养，能更好地诱导DC细胞成熟，所得到的DC细胞质量高，完全超出临床使用标准。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过优化培养流程，筛选和优化诱导成熟因子组分，大大提高了成熟DC细胞的比例，提高了细胞质量，还能降低培养成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对本发明一个实施例培养得到的树突状细胞表面标志物进行检测的结果。
具体实施方式
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。
具体的，本发明涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法，包括如下步骤：
1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；
2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；
其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF 40～60ng/mL、IL-4 40～60ng/mL；
所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α7～13ng/mL以及PEG-20.8～1.2μg/mL。
在一些实施方式中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.9～1.1v/v％自体血浆、GM-CSF 45～55ng/mL、IL-4 45～55ng/mL。
在一些实施方式中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：1.0v/v％自体血浆、GM-CSF 50ng/mL、IL-4 50ng/mL。
在一些实施方式中，所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α8～12ng/mL以及PEG-2 0.9～1.1μg/mL。
在一些实施方式中，所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α10ng/mL以及PEG-2 1.0μg/mL。
在一些实施方式中，所述方法涉及到的细胞培养条件均在30至45℃之间和在1至10％的CO2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的CO2之间。
在一些实施方式中，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×107/20ml。
在一些实施方式中，PBMC细胞的接种密度还可以选择为5×107/20ml。
在一些实施方式中，以所述贴壁培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，所述贴壁培养所用的培养基的添加量为15～25ml，还可以选择20ml。
在一些实施方式中，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2v/v％自体血浆的AIM-V培养基。
在一些实施方式中，所述贴壁培养所用的培养基为包含1.0v/v％自体血浆的AIM-V培养基。
在一些实施方式中，以步骤1)培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，步骤1)培养所用的培养基的添加量为25～35ml，还可以选择30ml。
在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为4d～6d，也可以选择5d。
在一些实施方式中，在培养的第2d～4d时(或3d时)，补加培养基A。
在一些实施方式中，以步骤1)培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，补加培养基A的量为15～25ml，还可以选择20ml。
在一些实施方式中，在将所述离体未成熟树突状细胞从培养基A转移到培养基B中时，将培养基A中的细胞收集到离心管中，离心后去上清，用培养基B重悬沉淀并转移到新培养瓶中；
在一些实施方式中，所述离心的条件为1300～1500rpm离心3min～7min；
在一些实施方式中，所述将培养基A中的细胞收集到离心管中的过程包括：
a).先将含有游离细胞的培养基A收集到离心管中；
b).将培养瓶中加入缓冲液，置于2℃～6℃的温度中5min～15min后拍打培养瓶，收集缓冲液；
任选的，重复步骤b)一次或多次。
在一些实施方式中，在步骤2)中，培养时所用的培养瓶预先经过自体血浆包被。
血浆包被可抑制单核细胞向巨噬细胞分化，自体血浆为DC细胞原先的生长环境一致，是促进单核细胞向DC细胞分化的理想基质。
在一些实施方式中，所述包被的方法包括：
以瓶底培养面积为75cm2计，加入6ml～8ml自体血浆包被8h～16h。
在一些实施方式中，所述包被的方法包括：
以瓶底培养面积为75cm2计，加入7ml自体血浆包被12h。
在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为2d。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1.外周血DC细胞培养基
1)DC培养基：AIM-V培养基(含0.8％自体血浆)，GM-CSF浓度60ng/mL，IL-4浓度40ng/mL。
2)DC成熟培养基：AIM-V培养基(含0.8％自体血浆)，GM-CSF浓度60ng/mL，IL-4浓度40ng/mL，TNF-α浓度7ng/mL，PGE-2浓度1.2μg/mL。
2.外周血DC细胞方法
1)培养第0天，取1个T175培养瓶，将得到的PBMC细胞加到培养瓶中，每瓶细胞数4×107，加入AIM-V培养基15mL，加400uL自体血浆，培养箱贴壁培养2h。
2)培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mL AIM-V培养基洗培养瓶，洗2次。加入配好的DC培养基30mL，培养箱培养。
3)第2天，取出培养瓶，拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮。补加DC培养基20mL，培养箱培养。
4)第4天取1个新的T75培养瓶，加入7mL自体血浆，置于培养箱中包被过夜。
5)第5天，取出DC培养瓶，拍打培养瓶，使细胞悬浮，将细胞液收集到50mL离心管内。此时观察有大量细胞贴壁，向培养瓶中加15mL PBS，置于4℃15min。取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮。将PBS倒出，再加入15mL PBS，置于4℃5min。5min后，取出培养瓶，拍打，细胞基本漂浮，将PBS倒入50mL离心管，离心，1400rpm，5min，离心后，倒去上清。取出第4天包被的T75培养瓶，倒去包被液。将细胞转移到T75培养瓶内，加入20mL成熟培养基。
6)第7天，收获细胞，计数，流式表型检测。
实施例2
1.外周血DC细胞培养基
1)DC培养基：AIM-V培养基(含1.2％自体血浆)，GM-CSF浓度40ng/mL，IL-4浓度60ng/mL。
2)DC成熟培养基：AIM-V培养基(含1.2％自体血浆)，GM-CSF浓度40ng/mL，IL-4浓度60ng/mL，TNF-α浓度13ng/mL，PGE-2浓度0.8μg/mL。
2.外周血DC细胞方法
1)培养第0天，取1个T175培养瓶，将得到的PBMC细胞加到培养瓶中，每瓶细胞数6×107，加入AIM-V培养基25mL，加600uL自体血浆，培养箱贴壁培养2h。
2)培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mL AIM-V培养基洗培养瓶，洗2次。加入配好的DC培养基30mL，培养箱培养。
3)第3天，取出培养瓶，拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮。补加DC培养基20mL，培养箱培养。
4)第5天取1个新的T75培养瓶，加入7mL自体血浆，置于培养箱中包被过夜。
5)第6天，取出DC培养瓶，拍打培养瓶，使细胞悬浮，将细胞液收集到50mL离心管内。此时观察有大量细胞贴壁，向培养瓶中加15mL PBS，置于4℃15min。取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮。将PBS倒出，再加入15mL PBS，置于4℃5min。5min后，取出培养瓶，拍打，细胞基本漂浮，将PBS倒入50mL离心管，离心，1400rpm，5min，离心后，倒去上清。取出第4天包被的T75培养瓶，倒去包被液。将细胞转移到T75培养瓶内，加入20mL成熟培养基。
6)第7天，收获细胞，计数，流式表型检测。
实施例3
1.外周血DC细胞培养基
1)DC培养基：AIM-V培养基(含1％自体血浆)，GM-CSF浓度50ng/mL，IL-4浓度50ng/mL。
2)DC成熟培养基：AIM-V培养基(含1％自体血浆)，GM-CSF浓度50ng/mL，IL-4浓度50ng/mL，TNF-α浓度10ng/mL，PGE-2浓度1μg/mL。
2.外周血DC细胞方法
1)培养第0天，取1个T175培养瓶，将得到的PBMC细胞加到培养瓶中，每瓶细胞数5×107，加入AIM-V培养基20mL，加400uL自体血浆，培养箱贴壁培养2h。
2)培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mL AIM-V培养基洗培养瓶，洗3次。加入配好的DC培养基30mL，培养箱培养。
3)第3天，取出培养瓶，拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮。补加DC培养基20mL，培养箱培养。
4)第4天取1个新的T75培养瓶，加入7mL自体血浆，置于培养箱中包被过夜。
5)第5天，取出DC培养瓶，拍打培养瓶，使细胞悬浮，将细胞液收集到50mL离心管内。此时观察有大量细胞贴壁，向培养瓶中加15mL PBS，置于4℃15min。取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮。将PBS倒出，再加入15mL PBS，置于4℃5min。5min后，取出培养瓶，拍打，细胞基本漂浮，将PBS倒入50mL离心管，离心，1400rpm，5min，离心后，倒去上清。取出第4天包被的T75培养瓶，倒去包被液。将细胞转移到T75培养瓶内，加入20mL成熟培养基。
6)第6天，收获细胞，计数，流式表型检测。
流式细胞术检测该实施例DC细胞表面CD11c，CD40，CD80，HLA-DR等标志物的表达，结果如图1所示，培养的DC细胞质量极高，完全超出临床使用标准。
比较例1
同实施例3，区别仅在于：
1)DC培养基：AIM-V培养基(含1％自体血浆)，GM-CSF浓度50ng/mL，IL-4浓度50ng/mL。
2)DC成熟培养基：AIM-V培养基(含1％自体血浆)，GM-CSF浓度50ng/mL，IL-4浓度50ng/mL，TNF-α浓度10ng/mL。
比较例2
同实施例3，区别仅在于：
1)DC培养基：AIM-V培养基(含1％自体血浆)，GM-CSF浓度150ng/mL，IL-4浓度50ng/mL。
2)DC成熟培养基：AIM-V培养基(含1％自体血浆)，GM-CSF浓度150ng/mL，IL-4浓度30ng/mL，TNF-α浓度5ng/mL，谷氨酰胺4mmol/L。
实验例
1.统计实施例3和比较例1～2所采用的培养方法培养得到的细胞数，结果如下表所示：
得率
实施例3 3.2×10<sup>7</sup> 64％
比较例1 2.1×10<sup>7</sup> 47％
对比例2 1.5×10<sup>7</sup> 25％
从上表可知，不同培养基成分的选择对得率的大小起着关键作用。
2.细胞表型分析：。
采用流式细胞术检测各组的表面表征物，并进行比较：
从上表可知，本发明所提供的方法，其成熟DC细胞占比最高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；
2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；
其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF 40～60ng/mL、IL-4 40～60ng/mL；
所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α7～13ng/mL以及PEG-2 0.8～1.2μg/mL。
2.根据权利要求1所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×107/20ml。
3.根据权利要求2所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2v/v％自体血浆的AIM-V培养基。
4.根据权利要求1～3任一项所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，步骤1)的培养时间为4d～6d。
5.根据权利要求4所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，在培养的第2d～4d时，补加培养基A。
6.根据权利要求4所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，在将所述离体未成熟树突状细胞从培养基A转移到培养基B中时，将培养基A中的细胞收集到离心管中，离心后去上清，用培养基B重悬并转移到新培养瓶中；
优选的，所述离心的条件为1300～1500rpm离心3min～7min。
7.根据权利要求6所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，所述将培养基A中的细胞收集到离心管中的过程包括：
a).先将含有游离细胞的培养基A收集到离心管中；
b).将培养瓶中加入缓冲液，置于2℃～6℃的温度中5min～15min后拍打培养瓶，收集缓冲液；
任选的，重复步骤b)一次或多次。
8.根据权利要求1所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，在步骤2)中，培养时所用的培养瓶预先经过自体血浆包被。
9.根据权利要求8所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，所述包被的方法包括：
以瓶底培养面积为75cm2计，加入6ml～8ml自体血浆包被8h～16h。
10.根据权利要求8或9所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，步骤2)的培养时间为1d～3d。
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