JP7054418B2 - T細胞を製造する組成物及び方法 - Google Patents
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Description
[0001]本願は、2017年11月8日に出願された、米国仮出願第62/583,229号;2017年11月20日に出願された、米国仮出願第62/588,590号;2018年1月17日に出願された、米国仮出願第62/618,445号;及び2018年9月27日に出願された、米国仮出願第62/737,625号の利益を主張するものであり、これら出願はその全体が本明細書に援用される。
.005%、0.01%、又は0.05%である。一部の態様では、生物学的試料から拡大又は誘導されたCD8+T細胞を含む、免疫細胞の集団であって、生物学的試料から拡大又は誘導されたCD8+T細胞が、少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞を含む、免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み;少なくとも1つの抗原特異的T細胞の量、濃度、又は百分率は、生物学的試料中の抗原特異的CD8+T細胞、全CD8+T細胞、又は全T細胞の量、濃度、又は百分率の少なくとも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、又は1000倍である医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するCD8+T細胞を含む免疫細胞の集団であって、CD8+T細胞が、少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞を含む、免疫細胞の集団と;薬学的に許容される賦形剤とを含み;少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞は、生物学的試料から、少なくとも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、又は1000倍に拡大又は誘導された抗原特異的CD4+T細胞を含む医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するCD8+T細胞を含む免疫細胞の集団であって、CD8+T細胞が、少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞を含む、免疫細胞の集団と;薬学的に許容される賦形剤とを含み;少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞は、生物学的試料から、少なくとも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、又は1000倍に拡大又は誘導された抗原特異的CD8+T細胞を含む医薬組成物が提示される。
[0017]一部の実施形態では、生物学的試料は、末梢血単核細胞(PBMC)を含む。
[0021]一部の態様では、治療に使用する医薬の製造のために、本明細書に記載の組成物を使用する方法が提示される。
[0031]一部の実施形態では、APCは、FLT3L-刺激APCである。一部の実施形態では、APC調製物のうちの少なくとも1つは、FLT3L-刺激APCを含む。一部の実施形態では、APC調製物のうちの少なくとも2つは、FLT3L-刺激APCを含む。一部の実施形態では、APC調製物のうちの少なくとも3つは、FLT3L-刺激APCを含む。一部の実施形態では、APC調製物の各々は、FLT3L-刺激APCを含む。
[0040]一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は28日間未満である。一部の実施形態では、インキュベートすることは、APC調製物のうちの第1のAPC調製物を、T細胞と共に7日を超える期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、APC又はAPC調製物のうちの1つ以上を、少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子を含む第1の培地と共に第1の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子は、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、APC調製物のうちの1つ以上を、少なくとも1つのペプチドと共に第2の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、APC又はAPC調製物のうちの1つ以上を、1以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第2の培地と共に第3の期間インキュベートし、これにより、成熟APCを得ることを含む。一部の実施形態では、1以上のサイトカイン又は増殖因子は、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、第3の期間の後で、かつ、第4の期間の開始の前に、第2の培地の1以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む。
[0042]一部の実施形態では、生物学的試料は、対象から新たに得られるか、又は凍結試料である。
[0044]一部の実施形態では、方法は、CD14及び/又はCD25を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、CD14及び/又はCD25細胞を枯渇させた試料を得ることを含む。
[0046]一部の実施形態では、方法は、少なくとも1つのペプチドを、CD14及び/又はCD25細胞を枯渇させた試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、第1のペプチドロードされた成熟APC試料を得ることを含む。
援用
[0066]本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が援用されることが具体的かつ個別に指し示された場合と同程度に、全ての目的で、それらの全体が本明細書に援用される。例えば、本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、刊行物中で記載されている、キット、組成物、及び方法であって、本明細書で記載される方法、キット、及び組成物との関連で使用されうるキット、組成物、及び方法について記載及び開示することを目的として、それらの全体が本明細書に援用される。本明細書で論じられる文献は、それらの開示が本願の出願日以前であったことだけのために提示される。本明細書のいかなる内容も、本明細書で記載された発明者らが、先行発明のために、又は他の任意の理由で、このような開示に先行する資格があることの容認とはみなさないものとする。
定義
[0126]本明細書で使用される用語は、特定の場合について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることが意図されるものではない。本明細書で使用される単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、及び「その」とは、文脈によりそうでないことが明らかに指し示されない限りにおいて、複数形もまた含むことが意図される。さらに、「~を含むこと」、「~を含む」、「~を有すること」、「~を有する」、「~を伴う」という用語、又はこれらの変化形が、詳細な説明及び/又は特許請求の範囲において使用される限りにおいて、このような用語は、「~を含むこと」という用語と同様に包含的であることが意図される。
[0131]「ネオ抗原」とは、タンパク質内の腫瘍特異的変化から生じる腫瘍抗原のクラスを表す。ネオ抗原は、例えば、タンパク質配列の置換、フレームシフト突然変異、融合ポリペプチド、インフレームの欠失、挿入、及び内因性レトロウイルスポリペプチドの発現から生じる腫瘍抗原を包含するがこれらに限定されない。
[0141]「免疫細胞」とは、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血細胞由来であり、B細胞及びT細胞などのリンパ球;ナチュラルキラー細胞;単球、マクロファージ、好中球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球などの骨髄細胞を含む。
T細胞療法の概観及びこの製造
[0167]ex vivoにおける、T細胞(例えば、自家T細胞)の、制御された誘導又は拡大による、抗原特異的T細胞の作出は、高度に特異的かつ有益なT細胞療法(例えば、養子T細胞療法)をもたらしうる。本開示は、T細胞製造法、並びにがん及び他の状態、疾患、及び障害を伴う対象を処置するために使用されうる治療用T細胞組成物を提示する。目的は、好適な表現型及び機能を伴う、抗原特異的T細胞を拡大及び誘導することである。本開示は、抗原特異的T細胞療法(例えば、個別T細胞療法又は個別化T細胞療法)のために使用されうるT細胞を製造するための組成物及び方法を提示する。本明細書で提示されるT細胞組成物は、個別化抗原特異的T細胞療法でありうる。
T細胞組成物
[0169]本明細書では、免疫細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)が提示される。組成物は、T細胞受容体(TCR)を含む、少なくとも1つの抗原特異的T細胞を含みうる。組成物は、少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む、少なくとも1つの抗原特異的T細胞を含みうる。
製造法
[0206]本明細書では、抗原特異的T細胞を製造するための方法が提示される。本明細書では、治療用T細胞組成物など、T細胞組成物を調製する方法が提示される。例えば、方法は、抗原特異的T細胞を拡大又は誘導することを含みうる。T細胞を調製すること(例えば、誘導又は拡大すること)は、T細胞を製造することを表す場合もあり、任意の種類のT細胞(例えば、CD4+T細胞及びCD8+T細胞)を単離、刺激、培養、誘導、及び/又は拡大する手順を広く包含する。本明細書の第1の態様では、少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を調製する方法であって、APCを、CD14及び/又はCD25を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む方法が提示される。
[0232]一部の実施形態では、生物学的試料は、末梢血単核細胞(PBMC)を含む。一部の実施形態では、方法における抗原特異的T細胞の百分率は、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的T細胞の百分率は、T細胞又は全免疫細胞のうちの約0.1%~約5%、約5%~10%、約10%~15%、約15%~20%、約20%~25%、約25%~30%、約30%~35%、約35%~約40%、約40%~約45%、約45%~約50%、約50%~約55%、約55%~約60%、約60%~65%、又は約65%~約70%である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的CD8+T細胞の百分率は、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的ナイーブCD8+T細胞の百分率は、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的メモリーCD8+T細胞の百分率は、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的CD4+T細胞の百分率は、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的CD4+T細胞の百分率は、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的T細胞の百分率は、最大で約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的CD8+T細胞の百分率は、最大で約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的ナイーブCD8+T細胞の百分率は、最大で約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的メモリーCD8+T細胞の百分率は、最大で約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的CD4+T細胞の百分率は、最大で約0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。
[0235]一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、28日間未満である。一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、20~27日間である。一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、又は39日間である。
[0241]一部の実施形態では、方法は、APC調製物のうちの1つ以上を、少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子を含む第1の培地と共に第1の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、第1の期間は、少なくとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、又は17、又は18日間である。一部の実施形態では、第1の期間は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18日間以下である。一部の実施形態では、第1の期間は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、又は9日間である。一部の実施形態では、第1の期間は、3、4、5、6、7、8、9、又は10日間以下である。一部の実施形態では、少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子は、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの任意の組合せを含む。
[0245]一部の実施形態では、方法はex vivoにおいて実施される。
抗原提示細胞(APC)及び調製法
[0259]一部の実施形態では、方法は、T細胞を、抗原提示細胞(APC)により誘導又は刺激又は拡大することを含む。APCは、T細胞に接触させる前に、抗原ペプチドを、あらかじめロードされうる。一部の実施形態では、抗原特異的T細胞を拡大又は誘導する方法は、T細胞を含む免疫細胞の集団を、APCにより刺激することを含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、CD14及び/又はCD25を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、APCは、FLT3L-刺激APCである。一部の実施形態では、APCは、1以上のAPC調製物を含む。一部の実施形態では、1以上のAPC調製物のうちの少なくとも1つは、FLT3L-刺激APCを含む。一部の実施形態では、1以上のAPC調製物は、3つ以下のAPC調製物を含む。一部の実施形態では、1以上のAPC調製物は、1以上の別個の期間内に、逐次的に、免疫細胞と共にインキュベートされる。
T細胞
[0290]T細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす。T細胞は、CD4+T細胞(ヘルパーT細胞)と、CD8+T細胞(細胞傷害性T細胞)とを含む。CD4+T細胞は、B細胞の成熟、並びに細胞傷害性T細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球の一助となりうる。CD4+T細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面上で発現されるMHCクラスII分子により、ペプチド抗原と共に提示されると活性化される。活性化されると、T細胞は、急速に分裂し、活性免疫応答を調節するサイトカインを分泌しうる。CD8+T細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊することが可能であり、また、移植片拒絶にも関与している。CD8+T細胞は、ほぼあらゆる体細胞の表面上に存在するMHCクラスIと会合する抗原への結合により、それらの標的を認識しうる。大半のT細胞は、T細胞受容体(TCR)を有する。T細胞が、多様な疾患(例えば、がん)又は感染性生物と関連する抗原を認識する能力は、α鎖及びβ鎖又はγ鎖及びδ鎖の両方から構成される、そのTCRにより付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、TCRの多様性を発生させるための、固有の機構を用いるDNAによりコードされる。このマルチサブユニットの免疫認識受容体は、CD3複合体と会合することが可能であり、抗原提示細胞(APC)の表面上で、MHCクラスI及びIIのタンパク質により提示されたペプチドに結合する。T細胞の活性化における第1のシグナルは、T細胞受容体の、別の細胞上のMHCにより提示される短鎖ペプチドへの結合によりもたらされうる。これは、このペプチドに特異的なTCRを伴うT細胞だけが活性化されることを確実にする。B細胞及びマクロファージも、重要なAPCでありうるが、パートナー細胞は、通例、ナイーブ応答の場合、プロフェッショナルの抗原提示細胞、通例、樹状細胞などの抗原提示細胞である。APC上の抗原性ペプチドへの、TCRの結合は、T細胞の活性化において、中心的なイベントであって、T細胞と、APCとの間の接点である、免疫学的シナプスにおいて生じるイベントでありうる。
抗原
[0300]本開示は、免疫原性抗原に特異的なT細胞を製造するための方法に関する。本開示はまた、APCにより刺激された抗原特異的T細胞を含む組成物にも関する。一部の実施形態では、1以上の抗原ペプチドはAPCへロードされ、次いで、ペプチドをロードされたAPCは、T細胞を刺激して、抗原特異的T細胞を作製するのに使用される。一部の実施形態では、抗原は、ネオ抗原である。一部の実施形態では、ペプチドローディングのために使用されるAPCは、樹状細胞である。
[0331]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、合成により、組換えDNA技術により、又は化学合成により調製される場合もあり、天然腫瘍又は病原性生物など、天然供給源から単離される場合もある。エピトープは、個別に合成される場合もあり、ペプチド内で、直接的に、又は間接的に接続される場合もある。本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質、及びこれらの断片を実質的に含有しないが、一部の実施形態では、ペプチドは、天然の断片又は粒子へと接続されるように、合成によりコンジュゲートされうる。
医薬組成物
[0335]医薬組成物は、活性薬剤の、薬学的に使用されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤及び補助剤を含む、1以上の生理学的に許容される担体を使用して製剤化されうる。適正な製剤は、選び出された投与経路に依存しうる。周知の技法、キャリア、及び賦形剤のうちのいずれかは、適宜、かつ、当該技術分野で理解される通りに使用されうる。
[0349]一部の実施形態では、抗原のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、このようなポリペプチド又はポリヌクレオチドを含有する抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)として提示されうる。他の実施形態では、このような抗原提示細胞は、患者における使用のためのT細胞を刺激するのに使用される。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。関連する実施形態では、樹状細胞は、ネオ抗原のペプチド又は核酸によりパルスされた、自家樹状細胞である。ネオ抗原ペプチドは、適切なT細胞応答をもたらす、任意の適切なペプチドでありうる。一部の実施形態では、T細胞は、CTLである。一部の実施形態では、T細胞は、HTLである。したがって、本開示の1つの実施形態は、本明細書で記載される、1以上のネオ抗原のポリペプチド又はポリヌクレオチドでパルスされるか、又はこれらをロードされた、少なくとも1つの抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を含有する免疫原性組成物である。一部の実施形態では、このようなAPCは、自家(例えば、自家樹状細胞)である。代替的に、患者から単離された末梢血単核細胞(PBMC)は、ex vivoにおいて、ネオ抗原のペプチド又はポリヌクレオチドをロードされうる。関連する実施形態では、このようなAPC又はPBMCは、患者へと、注入し戻される。ポリヌクレオチドは、樹状細胞への形質導入を生じることが可能であり、これにより、ネオ抗原ペプチドの提示、及び免疫の誘導を結果としてもたらす、任意の適切なポリヌクレオチドでありうる。一部の実施形態では、このような抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞)又は末梢血単核細胞(PBMC)は、T細胞(例えば、自家T細胞)を刺激するのに使用される。関連する実施形態では、T細胞は、CTLである。他の関連する実施形態では、T細胞は、HTLである。一部の実施形態では、T細胞は、CD8+T細胞である。一部の実施形態では、T細胞は、CD4+T細胞である。次いで、このようなT細胞は、患者へと注入される。一部の実施形態では、CTLは、患者へと注入される。一部の実施形態では、HTLは、患者へと注入される。一部の実施形態では、CTL及びHTLのいずれも、患者へと注入される。いずれかの治療剤の投与は、同時に実施される場合もあり、任意の順序で、逐次的に実施される場合もある。
[0362]医薬組成物は、リポソーム又はマイクロスフェア(又はマイクロ粒子)により投与されうる。患者への投与のためのリポソーム及びマイクロスフェアを調製するための方法は、当業者に周知である。本質的に、材料は、水溶液中に溶解させ、要求される場合、界面活性剤と共に、適切なリン脂質及び脂質を添加され、必要に応じて、材料は、透析又は超音波処理する。
[0377]免疫原性医薬組成物は、滅菌でありうる。免疫原性医薬組成物は、例えば、投与1回当たり<1EU(標準的な尺度である、内毒素単位)を含有する、非発熱物質性であってもよく、投与1回当たり<0.1EUでありうる。組成物は、グルテン非含有でありうる。
処置方法
[0390]本明細書ではまた、疾患、障害、又は状態を伴う対象を処置する方法も提示される。処置方法は、本明細書で開示される組成物又は医薬組成物を、疾患、障害、又は状態を伴う対象へと投与することを含みうる。
[0393]本明細書の他の一部の態様では、治療に使用する医薬の製造のための、組成物又は医薬組成物の使用が提示される。一部の実施形態では、処置方法は、対象へ、免疫原性ネオ抗原ペプチドを特異的に認識する有効量のT細胞を投与することを含む。一部の実施形態では、処置方法は、対象へ、T細胞内で発現されるTCRなど、免疫原性ネオ抗原ペプチドを特異的に認識する有効量のTCRを投与することを含む。
キット
[0406]本明細書で記載される方法及び組成物は、投与のための指示書と併せて、キット形態で提供されうる。典型的に、キットは、容器内の、単位剤形の、所望されるネオ抗原による治療用組成物と、投与のための指示書とを含みうる。さらなる治療剤、例えば、サイトカイン、リンホカイン、チェックポイント阻害剤、抗体もまた、キット内に組み入れられうる。これらもまた所望でありうる、他のキット構成要素は、例えば、滅菌シリンジ、追加投与量、及び他の所望の賦形剤を含む。
実施形態の項目
[1] (a)少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団、及び(b)薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であって、集団内のCD14及び/又はCD25を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のCD14及び/又はCD25を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる、前記医薬組成物。
[2] 生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含む組成物であって、集団内のCD14及びCD25を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のCD14及びCD25を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない、前記組成物。
[3] (a)生物学的試料に由来するT細胞を含む免疫細胞の集団、ここで、T細胞は、APC-刺激T細胞である少なくとも1つの抗原特異的T細胞を含み、かつ、少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含み、APCは、FLT3L-刺激APCである;及び(b)薬学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物。
[4] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのAPC-刺激T細胞を含む、項目[1]に記載の組成物。
[5] 集団内のCD14及び/又はCD25を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のCD14及び/又はCD25を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない、項目[1]、[3]、及び[4]のいずれか1項に記載の組成物。
[6] 集団内のCD14及び/又はCD25を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のCD14及び/又はCD25を発現する免疫細胞の量より相対的に多い、項目[1]、[3]、及び[4]のいずれか1項に記載の組成物。
[7] 生物学的試料が対象に由来する、項目[1]~[6]のいずれか1項に記載の組成物。
[8] 対象がヒトである、項目[7]に記載の組成物。
[9] 対象が疾患又は障害を有する、項目[7]又は[8]に記載の組成物。
[10] 疾患又は障害ががんである、項目[9]に記載の組成物。
[11] がんが、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択される、項目[10]に記載の組成物。
[12] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD4+T細胞を含む、項目[1]~[11]のいずれか1項に記載の組成物。
[13] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD8+T細胞を含む、項目[1]~[12]のいずれか1項に記載の組成物。
[14] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD4エンリッチT細胞を含む、項目[1]~[13]のいずれか1項に記載の組成物。
[15] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD8エンリッチT細胞を含む、項目[1]~[14]のいずれか1項に記載の組成物。
[16] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、メモリーT細胞を含む、項目[1]~[15]のいずれか1項に記載の組成物。
[17] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、ナイーブT細胞を含む、項目[1]~[16]のいずれか1項に記載の組成物。
[18] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、メモリーCD4+T細胞を含む、項目[1]~[17]のいずれか1項に記載の組成物。
[19] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、ナイーブCD4+T細胞を含む、項目[1]~[18]のいずれか1項に記載の組成物。
[20] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、メモリーCD8+T細胞を含む、項目[1]~[19]のいずれか1項に記載の組成物。
[21] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、ナイーブCD8+T細胞を含む、項目[1]~[20]のいずれか1項に記載の組成物。
[22] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、(A)点突然変異、(B)スプライス部位突然変異、(C)フレームシフト突然変異、(D)リードスルー突然変異、(E)遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む、項目[1]~[21]のいずれか1項に記載の組成物。
[23] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で対象のHLAタンパク質に結合する、項目[1]~[22]のいずれか1項に記載の組成物。
[24] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM、又は10nM未満のKD又はIC50で対象のHLAタンパク質に結合する、項目[1]~[23]のいずれか1項に記載の組成物。
[25] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列の各々が、対象により発現されるHLA対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する、項目[1]~[24]のいずれか1項に記載の組成物。
[26] TCRが、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM、又は10nM未満のKD又はIC50でペプチド-HLA複合体に結合する、項目[1]~[25]のいずれか1項に記載の組成物。
[27] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列の各々が、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む、項目[1]~[26]のいずれか1項に記載の組成物。
[28] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列の各々が、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる、項目[1]~[27]のいずれか1項に記載の組成物。
[29] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上が、少なくとも8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18;19;20;21;22;23;24;25;26;27;28;29;30;40;50;60;70;80;90;100;150;200;250;300;350;400;450;500;600;700;800;900;1,000;1,500;2,000;2,500;3,000;4,000;5,000;7,500;又は10,000天然アミノ酸の長さを有する、項目[1]~[28]のいずれか1項に記載の組成物。
[30] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上が、クラスIのHLA対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、8~12天然アミノ酸の長さを有する、項目[1]~[29]のいずれか1項に記載の組成物。
[31] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上が、クラスIIのHLA対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、16~25天然アミノ酸の長さを有する、項目[1]~[30]のいずれか1項に記載の組成物。
[32] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、複数の抗原ペプチド配列を含む、項目[1]~[31]のいずれか1項に記載の組成物。
[33] 複数の抗原ペプチド配列が、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、又は500の抗原ペプチド配列を含む、項目[32]に記載の組成物。
[34] APCが、1以上のAPC調製物である、項目[1]~[33]に記載の組成物。
[35] APCが成熟APCである、項目[3]~[34]のいずれか1項に記載の組成物。
[36] APCが、少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上を含む1以上の抗原ペプチドをロードされたAPCを含む、項目[3]~[35]のいずれか1項に記載の組成物。
[37] APCが、自家APC、同種APC、又は人工APCである、項目[3]~[36]のいずれか1項に記載の組成物。
[38] APCが樹状細胞(DC)を含む、項目[3]~[37]のいずれか1項に記載の組成物。
[39] APCが、CD14+単球に由来するか、又はCD14エンリッチAPCであるか、又はCD141エンリッチAPCである、項目[4]~[38]のいずれか1項に記載の組成物。
[40] CD14+単球が、末梢血単核細胞(PBMC)を含む対象に由来する生物学的試料からエンリッチされる、項目[39]に記載の組成物。
[41] CD14+単球が、1以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、項目[39]又は[40]に記載の組成物。
[42] 1以上のサイトカイン又は増殖因子が、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの組合せを含む、項目[41]に記載の組成物。
[43] CD14+単球が、PBMCを含む第2の生物学的試料に由来する、項目[39]~[42]のいずれか1項に記載の組成物。
[44] 第2の生物学的試料が同じ対象に由来する、項目[43]に記載の組成物。
[45] 生物学的試料が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、項目[1]~[44]のいずれか1項に記載の組成物。
[46] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、IL-7、IL-15、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO)阻害剤、抗PD-1抗体、IL-12、又はこれらの組合せを含む培地中で刺激される、項目[1]及び[3]~[45]のいずれか1項に記載の組成物。
[47] IDO阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、1-メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目[46]に記載の組成物。
[48] 組成物中の少なくとも1つの抗原特異的T細胞の百分率が、全T細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%である、項目[1]~[47]のいずれか1項に記載の組成物。
[49] 組成物中の少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%である、項目[1]~[48]のいずれか1項に記載の組成物。
[50] 組成物中の少なくとも1つの抗原特異的CD4+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%である、項目[1]~[49]のいずれか1項に記載の組成物。
[51] 生物学的試料中の少なくとも1つの抗原特異的T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約0.00001%、0.00005%、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、又は0.5%である、項目[1]~[50]のいずれか1項に記載の組成物。
[52] 生物学的試料中の少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約0.00001%、0.00005%、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、又は0.5%である、項目[1]~[51]のいずれか1項に記載の組成物。
[53] 生物学的試料中の少なくとも1つの抗原特異的CD4+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約0.00001%、0.00005%、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、又は0.5%である、項目[1]~[52]のいずれか1項に記載の組成物。
[54] 抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、過剰発現抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである、項目[1]~[53]のいずれか1項に記載の組成物。
[55] 組成物中の少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞の数が、少なくとも約1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、又は5×108個である、項目[1]~[54]のいずれか1項に記載の組成物。
[56] 組成物中の少なくとも1つの抗原特異的CD4+T細胞の数が、少なくとも約1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、又は5×108個である、項目[1]~[54]のいずれか1項に記載の組成物。
[57] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、複数の抗原特異的T細胞を含む、項目[1]~[56]のいずれか1項に記載の組成物。
[58] 集団内のCD19及び/又はCD16を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のCD19及び/又はCD16を発現する免疫細胞の量より少ない、項目[1]~[57]のいずれか1項に記載の組成物。
[59] 項目[1]又は[3]~[58]のいずれか1項に記載の組成物を、疾患又は障害を有する対象へ投与することを含む、処置方法。
[60] 治療に使用する医薬の製造のための、項目[1]又は[3]~[58]のいずれか1項に記載の組成物の使用。
[61] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を調製する方法であって、APCを、CD14及び/又はCD25を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む、前記方法。
[62] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を調製する方法であって、FMS様チロシンキナーゼ3受容体リガンド(FLT3L)-刺激APCを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む、前記方法。
[63] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を含む医薬組成物を調製する方法であって、(a)FMS様チロシンキナーゼ3受容体リガンド(FLT3L)を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第1の期間インキュベートし;そして(b)その後、生物学的試料の少なくとも1つのT細胞を、APCと共にインキュベートすることを含む、前記方法。
[64] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、1以上のAPC調製物のうちの第1のAPC調製物とインキュベートしてから、28日間未満の1以上の別個の期間、該免疫細胞の集団を、1以上のAPC調製物と共にインキュベートすることを含み、少なくとも1つの抗原特異的メモリーT細胞が拡大されるか、又は少なくとも1つの抗原特異的ナイーブT細胞が誘導される、前記方法。
[65] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列に特異的なT細胞受容体(TCR)を含む少なくとも1つの抗原特異的T細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、3つ以下のAPC調製物と共に3以下の別個の期間インキュベートすることを含み、少なくとも1つの抗原特異的メモリーT細胞が拡大されるか、又は少なくとも1つの抗原特異的ナイーブT細胞が誘導される、前記方法。
[66] 免疫細胞の集団が、CD14及び/又はCD25を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する、項目[62]~[65]のいずれか1項に記載の方法。
[67] 生物学的試料が、CD19を発現する細胞をさらに枯渇させられる、項目[61]又は[66]に記載の方法。
[68] APCが、FLT3L-刺激APCである、項目[61]又は[63]に記載の方法。
[69] 免疫細胞の集団をインキュベートすることが、IL-7、IL-15、又はこれらの組合せを含有する培地中で実施される、項目[64]~[67]のいずれか1項に記載の方法。
[70] 培地が、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO)阻害剤、抗PD-1抗体、IL-12、又はこれらの組合せをさらに含む、項目[69]に記載の方法。
[71] IDO阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、1-メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目[70]に記載の方法。
[72] APC調製物のうちの少なくとも1つが、FLT3L-刺激APCを含む、項目[64]~[71]のいずれか1項に記載の方法。
[73] APC調製物のうちの少なくとも2つが、FLT3L-刺激APCを含む、項目[64]~[71]のいずれか1項に記載の方法。
[74] APC調製物のうちの少なくとも3つが、FLT3L-刺激APCを含む、項目[64]~[71]のいずれか1項に記載の方法。
[75] APC調製物の各々が、FLT3L-刺激APCを含む、項目[64]~[71]のいずれか1項に記載の方法。
[76] APCが、1以上のAPC調製物を含む、項目[61]~[63]のいずれか1項に記載の方法。
[77] 1以上のAPC調製物が、3つ以下のAPC調製物を含む、項目[61]~[76]のいずれか1項に記載の方法。
[78] 1以上のAPC調製物が、1以上の別個の期間内に、逐次的に、免疫細胞と共にインキュベートされる、項目[64]~[77]のいずれか1項に記載の方法。
[79] 1以上のAPC調製物のうちの少なくとも1つが、生物学的試料に由来するAPCである、項目[61]~[78]のいずれか1項に記載の方法。
[80] 免疫細胞の集団が、APC、又は1つ以上のAPC調製物のうちの少なくとも1つを含む、項目[61]~[79]のいずれか1項に記載の方法。
[81] 免疫細胞の集団がAPCを含まず、免疫細胞の集団が1以上のAPC調製物のうちの1つを含まない、項目[61]~[79]のいずれか1項に記載の方法。
[82] FLT3L及び少なくとも1つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含み、ここで、FLT3Lは、免疫細胞の集団と共に第1の期間インキュベートされ、少なくとも1つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第1のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも1つのT細胞及び少なくとも1つのAPCを含む、項目[61]~[81]のいずれか1項に記載の方法。
[83] FLT3L及び少なくとも1つのペプチドを、少なくとも1つのAPCと共にインキュベートし、ここで、FLT3Lは、少なくとも1つのAPCと共に第2の期間インキュベートされ、少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つのAPCと共に第2のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第1のペプチドロードされた成熟APC試料を得;そして、第1のペプチドロードされた成熟APC試料を、第1の刺激されたT細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[82]に記載の方法。
[84] FLT3L及び少なくとも1つのペプチドを、少なくとも1つのAPCと共にインキュベートし、ここで、FLT3Lは、少なくとも1つのAPCと共に第3の期間インキュベートされ、少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つのAPCと共に第3のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第2のペプチドロードされた成熟APC試料を得;そして、第2のペプチドロードされた成熟APC試料を、第2の刺激されたT細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[83]に記載の方法。
[85] 生物学的試料が対象に由来する、項目[61]~[84]のいずれか1項に記載の方法。
[86] 対象がヒトである、項目[85]に記載の方法。
[87] 対象が疾患又は障害を有する、項目[85]又は[86]に記載の方法。
[88] 疾患又は障害ががんである、項目[87]に記載の方法。
[89] がんが、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択される、項目[88]に記載の方法。
[90] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD4+T細胞を含む、項目[61]~[89]のいずれか1項に記載の方法。
[91] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD8+T細胞を含む、項目[61]~[90]のいずれか1項に記載の方法。
[92] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD4エンリッチT細胞を含む、項目[61]~[91]のいずれか1項に記載の方法。
[93] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのCD8エンリッチT細胞を含む、項目[61]~[92]のいずれか1項に記載の方法。
[94] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのメモリーT細胞を含む、項目[61]~[93]のいずれか1項に記載の方法。
[95] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのナイーブT細胞を含む、項目[61]~[94]のいずれか1項に記載の方法。
[96] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのメモリーCD4+T細胞を含む、項目[61]~[95]のいずれか1項に記載の方法。
[97] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのナイーブCD4+T細胞を含む、項目[61]~[96]のいずれか1項に記載の方法。
[98] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのメモリーCD8+T細胞を含む、項目[61]~[97]のいずれか1項に記載の方法。
[99] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、少なくとも1つのナイーブCD8+T細胞を含む、項目[61]~[98]のいずれか1項に記載の方法。
[100] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、(A)点突然変異、(B)スプライス部位突然変異、(C)フレームシフト突然変異、(D)リードスルー突然変異、(E)遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む、項目[61]~[99]のいずれか1項に記載の方法。
[101] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、点突然変異を含み、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で対象のHLAタンパク質に結合する、項目[61]~[100]のいずれか1項に記載の方法。
[102] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM、又は10nM未満のIC50で対象のHLAタンパク質に結合する、項目[61]~[101]のいずれか1項に記載の方法。
[103] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列の各々が、対象により発現されるHLA対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する、項目[61]~[102]のいずれか1項に記載の方法。
[104] TCRが、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM、又は10nM未満のKDでペプチド-HLA複合体に結合する、項目[61]~[103]のいずれか1項に記載の方法。
[105] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列の各々が、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む、項目[61]~[104]のいずれか1項に記載の方法。
[106] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列の各々が、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる、項目[61]~[105]のいずれか1項に記載の方法。
[107] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上が、少なくとも8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18;19;20;21;22;23;24;25;26;27;28;29;30;40;50;60;70;80;90;100;150;200;250;300;350;400;450;500;600;700;800;900;1,000;1,500;2,000;2,500;3,000;4,000;5,000;7,500;又は10,000天然アミノ酸の長さを有する、項目[61]~[106]のいずれか1項に記載の方法。
[108] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上が、クラスIのHLA対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、8~12天然アミノ酸の長さを有する、項目[61]~[107]のいずれか1項に記載の方法。
[109] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上が、クラスIIのHLA対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、16~25天然アミノ酸の長さを有する、項目[61]~[108]のいずれか1項に記載の方法。
[110] 少なくとも1つの抗原ペプチド配列が、複数の抗原ペプチド配列を含む、項目[61]~[109]のいずれか1項に記載の方法。
[111] 複数の抗原ペプチド配列が、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、又は500の抗原ペプチド配列を含む、項目[110]に記載の方法。
[112] APC又はAPC調製物のAPCが、少なくとも1つの抗原ペプチド配列のうちの1つ以上を含む1以上の抗原ペプチドをロードされたAPCを含む、項目[61]~[111]のいずれか1項に記載の方法。
[113] APC又はAPC調製物のAPCが、自家APC又は同種APCである、項目[61]~[112]のいずれか1項に記載の方法。
[114] APC又はAPC調製物のAPCが、樹状細胞(DC)を含む、項目[61]~[113]のいずれか1項に記載の方法。
[115] DCがCD141+DCである、項目[114]に記載の方法。
[116] CD14及び/又はCD25を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることを含む、項目[61]~[114]のいずれか1項に記載の方法。
[117] CD19を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることをさらに含む、項目[116]に記載の方法。
[118] CD14又はCD25又はCD19を発現する細胞を枯渇させることが、CD14又はCD25又はCD19に結合する薬剤を、APC又はAPC調製物のAPCへと結合させることを含む、項目[116]又は[116]に記載の方法。
[119] CD14又はCD25又はCD19に結合する薬剤が、ビオチン化される、項目[118]に記載の方法。
[120] CD14又はCD25又はCD19を発現する細胞を枯渇させることが、固体支持体上の抗ビオチン試薬を、CD14又はCD25又はCD19に結合する薬剤へ結合させることをさらに含む、項目[118]又は[119]に記載の方法。
[121] CD14又はCD25又はCD19に結合する薬剤が、固体支持体へ接合される、項目[118]~[120]のいずれか1項に記載の方法。
[122] 項目[61]~[63]若しくは[66]~[121]のいずれか1項に記載のAPC、又は項目[64]~[121]のいずれか1項に記載のAPC調製物のAPCが、CD14+単球に由来するか、又はCD14エンリッチAPCであるか、又はCD141エンリッチAPCである、項目[61]~[121]のいずれか1項に記載の方法。
[123] 項目[61]~[63]若しくは[66]~[122]のいずれか1項に記載のAPC、又は項目[64]~[122]のいずれか1項に記載のAPC調製物のAPCが、生物学的試料からエンリッチされる、項目[61]~[122]のいずれか1項に記載の方法。
[124] 項目[61]~[63]若しくは[66]~[123]のいずれか1項に記載のAPC、又は項目[64]~[123]のいずれか1項に記載のAPC調製物のAPCが、1以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、項目[61]~[123]のいずれか1項に記載の方法。
[125] 1以上のサイトカイン又は増殖因子が、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの組合せを含む、項目[124]に記載の方法。
[126] 項目[61]~[63]若しくは[66]~[125]のいずれか1項に記載のAPC、又は項目[64]~[125]のいずれか1項に記載のAPC調製物のAPCが、第2の生物学的試料に由来する、項目[61]~[125]のいずれか1項に記載の方法。
[127] 第2の生物学的試料が同じ対象に由来する、項目[126]に記載の方法。
[128] 生物学的試料が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、項目[61]~[127]のいずれか1項に記載の方法。
[129] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%である、項目[61]~[128]のいずれか1項に記載の方法。
[130] 少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%である、項目[61]~[129]のいずれか1項に記載の方法。
[131] 少なくとも1つの抗原特異的CD4+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%である、項目[61]~[130]のいずれか1項に記載の方法。
[132] 生物学的試料中の少なくとも1つの抗原特異的T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約0.00001%、0.00005%、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、又は0.5%である、項目[61]~[131]のいずれか1項に記載の方法。
[133] 生物学的試料中の少なくとも1つの抗原特異的CD8+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約0.00001%、0.00005%、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、又は0.5%である、項目[61]~[132]のいずれか1項に記載の方法。
[134] 生物学的試料中の少なくとも1つの抗原特異的CD4+T細胞の百分率が、全CD4+T細胞、全CD8+T細胞、全T細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約0.00001%、0.00005%、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、又は0.5%である、項目[61]~[133]のいずれか1項に記載の方法。
[135] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞のうちの1つ以上を、対象へ投与することをさらに含む、項目[61]~[134]のいずれか1項に記載の方法。
[136] 別個の期間の合計期間が28日間未満である、項目[61]~[135]のいずれか1項に記載の方法。
[137] インキュベートすることが、APC調製物のうちの第1のAPC調製物を、T細胞と共に7日を超える期間インキュベートすることを含む、項目[61]~[136]のいずれか1項に記載の方法。
[138] インキュベートすることが、APC調製物のうちの第1のAPC調製物を、T細胞と共に7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20日を超える期間インキュベートすることを含む、項目[61]~[137]のいずれか1項に記載の方法。
[139] 生物学的試料が、対象から新たに得られるか又は凍結試料である、項目[61]~[138]のいずれか1項に記載の方法。
[140] APC又は1つ以上のAPC調製物を、少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子を含む第1の培地と共に第1の期間インキュベートすることを含む、項目[61]~[139]のいずれか1項に記載の方法。
[141] 少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子が、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの任意の組合せを含む、項目[140]に記載の方法。
[142] 1つ以上のAPC調製物を、少なくとも1つのペプチドと共に第2の期間インキュベートすることを含む、項目[140]又は[141]に記載の方法。
[143] 項目[61]~[63]若しくは[66]~[142]のいずれか1項に記載のAPC、又は項目[64]~[142]のいずれか1項に記載のAPC調製物のうちの1つ以上を、1以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第2の培地と共に第3の期間インキュベートし、これにより、成熟APCを得ることを含む、項目[140]~[142]のいずれか1項に記載の方法。
[144] 1以上のサイトカイン又は増殖因子が、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、poly I:C、又はこれらの組合せを含む、項目[143]に記載の方法。
[145] 第3の期間の後で、かつ、第4の期間の開始の前に、第2の培地の1以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む、項目[143]又は[144]に記載の方法。
[146] APC調製物のAPCが、1以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、項目[61]~[145]のいずれか1項に記載の方法。
[147] 抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである、項目[61]~[146]のいずれか1項に記載の方法。
[148] 方法が、ex vivoにおいて実施される、項目[61]~[147]のいずれか1項に記載の方法。
[149] 少なくとも1つの抗原特異的T細胞が、複数の抗原特異的T細胞を含む、項目[61]~[148]のいずれか1項に記載の方法。
[150] 少なくとも1つのAPCと、少なくとも1つのPBMC又は少なくとも1つのT細胞とを含む対象に由来する生物学的試料を得ることを含む、項目[61]~[149]のいずれか1項に記載の方法。
[151] CD14及び/又はCD25及び/又はCD19を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を得ることを含む、項目[61]~[150]のいずれか1項に記載の方法。
[152] CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を、FLT3Lと共に第1の期間インキュベートすることを含む、項目[61]~[151]のいずれか1項に記載の方法。
[153] 少なくとも1つのペプチドを、CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、第1のペプチドロードされた成熟APC試料を得ることを含む、項目[61]~[152]のいずれか1項に記載の方法。
[154] 第1のペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共に第3の期間インキュベートし、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[153]のいずれか1項に記載の方法。
[155] 第1のペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共にインキュベートすることが、IL-7、IL-15、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目[154]に記載の方法。
[156] 第1のペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共にインキュベートすることが、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO)阻害剤、抗PD-1抗体、IL-12、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目[155]に記載の方法。
[157] IDO阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、1-メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目[156]に記載の方法。
[158] 第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[157]のいずれか1項に記載の方法。
[159] 第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のうちの第2のペプチドロードされたAPC試料と共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[157]のいずれか1項に記載の方法。
[160] 第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[157]のいずれか1項に記載の方法。
[161] 第1の刺激されたT細胞試料のT細胞をインキュベートすることが、IL-7、IL-15、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目[158]~[160]のいずれか1項に記載の方法。
[162] 第1の刺激されたT細胞試料のT細胞をインキュベートすることが、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO)阻害剤、抗PD-1抗体、IL-12、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目[161]に記載の方法。
[163] IDO阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、1-メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目[162]に記載の方法。
[164] 第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[163]のいずれか1項に記載の方法。
[165] 第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のうちの第3のペプチドロードされたAPC試料と共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[163]のいずれか1項に記載の方法。
[166] 第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得ることを含む、項目[61]~[163]のいずれか1項に記載の方法。
[167] 第2の刺激されたT細胞試料のT細胞をインキュベートすることが、IL-7、IL-15、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目[164]~[166]のいずれか1項に記載の方法。
[168] 第2の刺激されたT細胞試料のT細胞をインキュベートすることが、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO)阻害剤、抗PD-1抗体、IL-12、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目[167]に記載の方法。
[169] IDO阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、1-メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目[168]に記載の方法。
[170] 1以上の別個の期間、3以下の別個の期間、第1の期間、第2の期間、第3の期間、第4の期間、又は第5の期間が、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも13時間、少なくとも14時間、少なくとも15時間、少なくとも16時間、少なくとも17時間、少なくとも18時間、少なくとも19時間、少なくとも20時間、少なくとも21時間、少なくとも22時間、少なくとも23時間、少なくとも24時間、少なくとも25時間、少なくとも26時間、少なくとも27時間、少なくとも28時間、少なくとも29時間、少なくとも30時間、少なくとも31時間、少なくとも32時間、少なくとも33時間、少なくとも34時間、少なくとも35時間、少なくとも36時間、少なくとも37時間、少なくとも38時間、少なくとも39時間、又は少なくとも40時間である、項目[61]~[169]のいずれか1項に記載の方法。
[171] 1以上の別個の期間、3以下の別個の期間、第1の期間、第2の期間、第3の期間、第4の期間、又は第5の期間が、1~4時間、1~3時間、1~2時間、4~40時間、7~40時間、4~35時間、4~32時間、7~35時間、又は7~32時間である、項目[61]~[170]のいずれか1項に記載の方法。
[172] 第1、第2、又は第3の刺激されたT細胞試料の少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む、項目[61]~[171]のいずれか1項に記載の方法。
[173] (a)少なくとも1つの抗原提示細胞(APC)を含む対象に由来する生物学的試料を得;(b)CD14を発現する細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、CD14+細胞エンリッチ試料を得;(c)CD14+細胞エンリッチ試料を、少なくとも1つのサイトカイン又は増殖因子と共に第1の期間インキュベートし;(d)少なくとも1つのペプチドを、(c)のCD14+細胞エンリッチ試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたAPC試料を得;(e)ペプチドロードされたAPC試料を、1以上のサイトカイン又は増殖因子と共に第3の期間インキュベートし、これにより、成熟APC試料を得;(f)成熟APC試料のAPCを、T細胞を含む、CD14及び/又はCD25、及び/又はCD19を枯渇させた試料と共に第4の期間インキュベートし;(g)T細胞を、成熟APC試料のAPCと共に第5の期間インキュベートし;(h)T細胞を、成熟APC試料のAPCと共に第6の期間インキュベートし;そして(i)T細胞のうちの少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
[174] (a)少なくとも1つのAPC及び少なくとも1つのT細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得;(b)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を得;(c)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を、FLT3Lと共に第1の期間インキュベートし;(d)少なくとも1つのペプチドを、(c)のCD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたAPC試料を得;(e)ペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共に第3の期間インキュベートし、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得;(f)第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、成熟APC試料のAPCと共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得;(g)任意選択で、第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、成熟APC試料のAPCと共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得;(h)第1、第2、又は第3の刺激されたT細胞試料の少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
[175] (a)少なくとも1つのAPC及び少なくとも1つのT細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得;(b)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を得;(c)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を、FLT3Lと共に第1の期間インキュベートし;(d)少なくとも1つのペプチドを、(c)のCD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたAPC試料を得;(e)ペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共に第3の期間インキュベートし、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得;(f)任意選択で、第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得;(g)任意選択で、第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得;(h)第1、第2、又は第3の刺激されたT細胞試料の少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
[176] (a)少なくとも1つのAPC及び少なくとも1つのT細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得;(b)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を得;(c)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を、FLT3Lと共に第1の期間インキュベートし;(d)少なくとも1つのペプチドを、(c)のCD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、第1のペプチドロードされたAPC試料を得;(e)第1のペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共に第3の期間インキュベートし、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得;(f)任意選択で、第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のうちの第2のペプチドロードされたAPC試料と共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得;(g)任意選択で、第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のうちの第3のペプチドロードされたAPC試料と共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得;(h)第1、第2、又は第3の刺激されたT細胞試料の少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
[177] (a)少なくとも1つのAPC及び少なくとも1つのT細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得;(b)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を得;(c)CD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料を、FLT3Lと共に第1の期間インキュベートし;(d)少なくとも1つのペプチドを、(c)のCD14及び/又はCD25及び/又はCD19細胞を枯渇させた試料と共に第2の期間インキュベートし、これにより、第1のペプチドロードされたAPC試料を得;(e)第1のペプチドロードされたAPC試料を、少なくとも1つのT細胞と共に第3の期間インキュベートし、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得;(f)任意選択で、第1の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第4の期間インキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得;(g)任意選択で、第2の刺激されたT細胞試料のT細胞を、FLT3L、及び成熟APC試料のFLT3L-刺激APCと共に第5の期間インキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得;(h)第1、第2、又は第3の刺激されたT細胞試料の少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
[178] (a)FLT3L及び少なくとも1つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートし、ここで、FLT3Lは、免疫細胞の集団と共に第1の期間インキュベートされ、少なくとも1つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第1のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第1の刺激されたT細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも1つのT細胞及び少なくとも1つのAPCとを含み;(b)任意選択で、FLT3L及び少なくとも1つのペプチドを、少なくとも1つのAPCと共にインキュベートし、ここで、FLT3Lは、少なくとも1つのAPCと共に第2の期間インキュベートされ、少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つのAPCと共に第2のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第1のペプチドロードされた成熟APC試料を得;そして、第1のペプチドロードされた成熟APC試料を、第1の刺激されたT細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第2の刺激されたT細胞試料を得;(c)任意選択で、FLT3L及び少なくとも1つのペプチドを、少なくとも1つのAPCと共にインキュベートし、ここで、FLT3Lは、少なくとも1つのAPCと共に第3の期間インキュベートされ、少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つのAPCと共に第3のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第2のペプチドロードされた成熟APC試料を得;そして、第2のペプチドロードされた成熟APC試料を、第2の刺激されたT細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第3の刺激されたT細胞試料を得;そして(d)第1の刺激されたT細胞試料、第2の刺激されたT細胞試料、又は第3の刺激されたT細胞試料のうちの少なくとも1つのT細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
[179] (a)刺激された免疫細胞試料の少なくとも1つの免疫細胞の1以上の細胞マーカーの発現を決定し、そして(b)刺激された免疫細胞試料の少なくとも1つの免疫細胞の、ペプチド-MHC複合体への結合を決定する、ことを含み;発現の決定及び結合の決定が同時に実施される、前記方法。
[180] 刺激された免疫細胞試料が、ペプチド-MHC複合体を含むAPCにより刺激された免疫細胞の集団を含む、項目[179]に記載の方法。
[181] 免疫細胞の集団が、生物学的試料に由来する、項目[179]又は[180]に記載の方法。
[182] (a)生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ペプチド-MHC複合体を含むAPCと共にインキュベートし、これにより、刺激された免疫細胞試料を得;(b)刺激された免疫細胞試料の少なくとも1つの免疫細胞の1以上の細胞マーカーの発現を決定し;及び(c)刺激された免疫細胞試料の少なくとも1つの免疫細胞の、ペプチド-MHC複合体への結合を決定する、ことを含み;発現の決定及び結合の決定が同時に実施される、前記方法。
[183] 1以上の細胞マーカーが、TNF-α、IFN-γ、LAMP-1、4-1BB、IL-2、IL-17A、グランザイムB、PD-1、CD25、CD69、TIM3、LAG3、CTLA-4、CD62L、CD45RA、CD45RO、FoxP3、又はこれらの任意の組合せを含む、項目[179]~[182]のいずれか1項に記載の方法。
[184] 刺激された免疫細胞試料の少なくとも1つの免疫細胞の、ペプチド-MHC複合体への結合を決定することが、刺激された免疫細胞試料の少なくとも1つの免疫細胞の、ペプチド-MHC複合体のペプチド及びMHCを含むMHC4量体への結合の決定を含む、項目[179]~[183]のいずれか1項に記載の方法。
[185] MHCが、クラスI MHC又はクラスII MHCである、項目[179]~[184]のいずれか1項に記載の方法。
[186] ペプチド-MHC複合体が、1以上の標識を含む、項目[179]~[185]のいずれか1項に記載の方法。
[187] 生物学的試料に由来する免疫細胞の集団が、1以上の生物学的試料に由来する免疫細胞の集団をそれぞれ含む2つ以上の試料を含む、項目[179]~[186]のいずれか1項に記載の方法。
[188] 2つ以上の試料が、2つ以上の試料標識により標識される、項目[187]に記載の方法。
[189] 発現の決定及び結合の決定が、蛍光活性化細胞分取(FACS)を含む、項目[179]~[188]のいずれか1項に記載の方法。
[190] 発現の決定及び結合の決定が、単一細胞解析を含む、項目[179]~[189]のいずれか1項に記載の方法。
[191] 発現の決定及び結合の決定が、1以上の細胞マーカーを発現し、かつ、ペプチド-MHC複合体に結合する、免疫細胞の百分率を決定することを含む、項目[179]~[190]のいずれか1項に記載の方法。
[192] 標識がフルオロフォアを含む、項目[186]又は[187]に記載の方法。
[193] 免疫細胞の集団が、項目[1]~[58]のいずれか1項に記載の組成物の免疫細胞の集団を代表する免疫細胞の集団を含む、項目[179]~[192]のいずれか1項に記載の方法。
実施例の概要:
[0411]下記の実施例1及び2は、T細胞製造プロトコールの例(プロトコール1及びプロトコール2)である。例示的プロトコールの概略を図1A及び図1Bに示す。実施例21~23は、APCを調製するためのステップと、これらの2つのプロトコールとを描示する。実施例12及び14~16、並びに表2~5は、プロトコール1及び2から得られた結果をまとめる。実施例13は、プロトコールの被験パラメータについて記載する。
[0414]本実施例は、図1に例示されるT細胞製造プロトコール1についての例を提示する。
DC培地(Cellgenix)
CD14マイクロビーズ、ヒト、Miltenyi:#130-050-201
サイトカイン及び/又は増殖因子
T細胞培地(AIM V+RPMI 1640 glutamax+血清+PenStrep)
ペプチド原液:ペプチド1つ当たり1mMずつ(HIV A02:5つ~10のペプチド、HIV B07:5つ~10のペプチド、DOM:4つ~8つのペプチド、PIN:6つ~12のペプチド)
[0416]ステップ1:DC調製のための単球の単離
1. PBMCの概数を計算して、各ドナーについて予測されるDC収量に基づき、融解させる。
2. PBMCを融解させ、DC培地中に、1mL当たり約1×106~1×108個の細胞を再懸濁させる。
3. ベンゾナーゼ(1:1000希釈率)を添加し、キャップを緩めたインキュベータ内に入れる。
4. 製造元のプロトコールに従い、CD14+単球エンリッチメントを実施する。
5. エンリッチした細胞を、6ウェルプレート内の、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、及びpolyI:Cから選択される1以上のサイトカイン及び/又は増殖因子を伴うDC培地中、ウェル1つ当たり1×105~1×107個で播種する。
1. DCを計数し、実験条件に従い、15mLの試験管に細胞を分割し;条件1つ当たりの細胞1~100万個とする。
2. 1200rpmで5分間スピンし、50~400μLのDC培地中に再懸濁させる。ペプチドを添加し、キャップを緩めたインキュベータ内に0.5~3時間入れる。ペプチド1つ当たり1mMの濃度のペプチドプールについて、体積を計算した。A02(5つのペプチド)及びB07(5つのペプチド)の、ある体積の、各個別のプールを、ウェルごとに、ペプチド1つ当たり0.001~100μMの最終濃度で添加した。
3. 0.5~3時間後、成熟ミックスを含有する200μL~1.5mLのDC培地を添加し、細胞を24ウェルプレートへ移す。
1. 全ての培地をDCプレートのウェルから注意深く除去し、各ウェルを、24ウェル深型ウェルブロックの個別のウェルへ移す。
2. 各ウェルを0.5~3mLのT細胞培地で洗浄し、深型ウェルブロック内でDC培地と組み合わせる。
3. 100μL~2mLのT細胞培地を、各ウェルへ添加する。
4. DCを、1200rpmで5分間スピンダウンする。
5. 全ての上清を除去し、DCを100μL~2mLのT細胞培地中に再懸濁させ、適正なウェルへと移し戻す。
6. PBMCをT細胞培地中で融解させ、IL-7及びIL-15を伴うT細胞培地中、1mL当たりの細胞0.5×106~4×106個で再懸濁させる。
7. 0.5~3mLの調製されたPBMCを、各ウェルへと添加する。
培地が黄色である場合、グルコースメーターで点検する。グルコースが高濃度を維持する場合、ウェルの培養物にIL-7及びIL-15を供給する。グルコースが低濃度である場合、細胞を6ウェルプレート(ウェル1つ当たり4mLずつ)へと拡大し、IL-15及びIL-7を補充する。グルコースが極めて低濃度である場合、6ウェルプレート内のウェル1つ当たり6mLへと拡大する。
1~4日ごとに培養物に供給し、グルコース濃度が低下する場合は新鮮なIL-15/IL-7を追加し、培養物の体積を必要に応じて拡大する。
T細胞を計数し、ペプチドをロードしたDCの新たなバッチ上でステップ3から繰り返す。残りの細胞を解析のために凍結させる。
1~5日ごとに培養物に供給する。
[0423]ステップ8:再刺激
T細胞を計数し、ペプチドをロードしたDCの新たなバッチ上でステップ3から繰り返す。残りの細胞を解析のために凍結させる。
1~5日ごとに培養物に供給する。
[0425]ステップ10
T細胞を計数し、解析のために凍結させる。
[0426]このプロトコールは、実施例1で記載したプロトコールに対する代替物でありうる。
[0428]材料:
AIM V培地(インビトロジェン)
培地1(RPMI 1640 glutamax+血清+PenStrep)
培地2(AIM V+RPMI 1640 glutamax+血清+PenStrep)
[0429]手順:
[0430]ステップ1:培地2に、1以上のサイトカインを伴う24ウェルプレートの各ウェル内に、PBMC400万個を播種する。1以上のサイトカインは、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、及びpolyI:Cから選択される。
1. それぞれのウェル内で、短鎖については0.001~100μMの最終濃度、長鎖については0.001~100μMの最終濃度で、目的の原液ペプチドプール(ペプチドなしの条件を除く)を作り、混合する。
2. 0.5~3時間インキュベートする。
3. 原液成熟カクテルを作り、インキュベーションの後で各ウェルへと添加し、混合する。成熟カクテルは、GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、及びpolyI:Cから選択される1以上のサイトカインを含有する。
[0433]ステップ4:培地のうちの50~90%を、IL-7及びIL-15を補充した、新鮮な培地1で、各々、0.005~500ng/mLの最終濃度へと、注意深く置きかえる。
[0437]ステップ1~ステップ6の培養ステップにおいて、ペプチドをロードされたDCを、プロトコール1の「ステップ1」及び「ステップ2」における手順に従い、並列的に調製することができる。
実施例3 CD8 + T細胞の誘導
[0441]ヒトドナーに由来するPBMC試料を使用して、プロトコール1又はプロトコール2に従い、抗原特異的T細胞の誘導を実施した。CD8+メモリーT細胞及びCD8+ナイーブT細胞の誘導を、異なるプロトコールを使用して、T細胞を製造した後で解析した。細胞試料は、解析のための異なる時点において、採取することができる。pMHC多量体を使用して、誘導培養物中の、抗原特異的CD8+T細胞の画分をモニタリングし、コンビナトリアルコーディングを使用することにより、複数のT細胞応答を、並列的に検出するのに使用した。図2は、プロトコール1(prot.1)及びプロトコール2(prot.2)を使用して、長鎖ペプチド又は短鎖ペプチドにより誘導された、抗原特異的CD8+メモリーT細胞の画分を示す、例示的な結果を描示する。「バルク」とは、誘導のために使用される、T細胞を含有する試料が、全PBMCであることを指し示す。「Treg-」とは、誘導のために使用される、T細胞を含有する試料が、CD25を発現する細胞を枯渇させたPBMCであることを指し示す。図3は、短期の刺激又は誘導(本実施例における培養の長さは、刺激の開始から計算する)の後で、フローサイトメトリーにより解析される、GAS7ペプチドに対して応答した、抗原特異的CD8+ナイーブT細胞の画分を示す、T細胞応答アッセイの例示的な結果を描示する。抗原特異的メモリーT細胞、及びナイーブPIN特異的T細胞の画分の増大は、短期の刺激の後で観察することができる。
[0442]CD8+T細胞の誘導を、異なるプロトコールを使用して、T細胞を製造した後で解析した。誘導されたT細胞を、試験ウェル内の、異なる抗原ペプチドと共にインキュベートし、ペプチドに対して応答したT細胞の画分を、フローサイトメトリーにより解析した。pMHC多量体を使用して、誘導培養物中の、抗原特異的CD8+T細胞の画分をモニタリングし、コンビナトリアルコーディングを使用することにより、複数のT細胞応答を、並列的に検出するのに使用した。ヒット率を使用して、T細胞が、抗原ペプチドに対して、どのくらい応答性であるのかについて描示することができる。ヒット率は、試験ウェルの総数で除した、陽性応答試験ウェルの数として規定される。実験は、2連で行い、ヒット率は、2連ウェル内で確認した。図4は、プロトコール1(prot.1)及びプロトコール2(prot.2)を使用する誘導の後で、HIV短鎖ペプチド、PIN(previously identified neoantigen)短鎖ペプチド、又はPIN長鎖ペプチドにより誘導された、CD8+T細胞の画分を示す結果の例を描示する。「全PBMC」とは、誘導のために使用される、T細胞を含有する試料が、全PBMCであることを指し示す。「CD25-PBMC」とは、誘導のために使用される、T細胞を含有する試料が、CD25+細胞を枯渇させたPBMCであることを指し示す。短期的誘導及び長期的誘導の両方が示される。図6は、2例のヒトドナーに由来するPBMC試料を使用して、長期誘導されたCD8+T細胞の画分を示す、例示的な結果を描示する。
[0443]PIN(previously identified neoantigen)に対するCD4+T細胞応答は、ex vivoにおける誘導プロトコールを使用して誘導することができる。本実施例では、CD4+T細胞応答は、IFNγ産生を、抗原特異的にモニタリングすることにより同定した。図10は、このようなフローサイトメトリー解析の代表例を示す。最後に、突然変異体ペプチド及び非野生型ペプチドに対する、CD4+T細胞応答の特異性を、突然変異体ペプチド又は野生型ペプチドを伴う刺激で誘導されたT細胞集団により示した(図11)。
[0444]ナイーブCD8+T細胞の誘導は、プロトコール1又はプロトコール2を使用する、T細胞の製造の後で、フローサイトメトリーにより解析した。PBMC試料は、ヒトドナー1又はヒトドナー2に由来し、全PBMC又はCD25枯渇PBMCであった。細胞試料を、図1におけるプロトコールに従い、短期又は長期にわたる誘導の後で解析した。誘導されたCD8+T細胞のナイーブCD8+応答を、異なるペプチドに対して解析し、図12~23にプロットした。
[0445]実施例1におけるT細胞製造プロトコールを使用して、ナイーブコンパートメントからのCD8+T細胞応答を成功裏に誘導することができる。図7は、2ラウンドの刺激の後に、健常ドナーにおける突然変異エピトープに対して発生させた、2つのCD8+T細胞応答についての、代表的なフロープロットを示す。さらに、メモリーコンパートメントからのCD8+T細胞応答も、高数まで拡大することができる。図8Aに示される代表例では、最大で3ラウンドにわたる刺激の後、全CD8+T細胞のうちの、およそ50%は、免疫優性エピトープである、CMV pp65、EBV YVL、EBV BMLF1、及びMart-1に特異的であった。誘導されたCD8+メモリー応答は、ペプチドリコールアッセイにおいて、多機能性を裏付ける(脱顆粒及びサイトカインの放出、図8B)。
[0446]図5Aは、プロトコール2を使用して、図に表示される条件下において誘導された、CD8+ナイーブT細胞のME-1応答についての、例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。図5Bは、図に表示される条件下において誘導された、CD8+ナイーブT細胞のME-1応答についての、フローサイトメトリー解析の例を描示する。CD8+T細胞のうちの12.6%が、長期にわたる誘導の後で、ME-1に特異的であることを観察した。
[0447]細胞傷害作用アッセイを使用して、誘導されたT細胞培養物が、発現する腫瘍株を死滅させうるのかどうかについて評価した。本実施例では、生存腫瘍細胞上及び死滅腫瘍細胞上の、活性カスパーゼ3の発現を測定して、早期の細胞死及び死滅腫瘍細胞を定量した。図9では、誘導されたCD8+メモリー応答は、発現する腫瘍標的を死滅させることが可能であった。
実施例1で作製したCD8+T細胞系は、表現型の発現、サイトカインプロファイル、及び自家標的細胞に対する、特異的細胞傷害活性について特徴づけられうる。表現型の発現を解析するために、各培養物のT細胞1×104~1×106個を、0.1~10%FBS及び0.1%のアジドナトリウムを含有するPBS(FBS-PBS)中で洗浄し、希釈率を1:100とする、蛍光色素で標識した抗体(CD45RA及びCD62L)を含有するFBS-PBS中に再懸濁させることができる。氷上におけるインキュベーションの後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析のために固定する。選択されたCD8+T細胞培養物が、CD62Lを発現するが、CD45RAを発現しない場合、多様なペプチドに対するそれらの反応性に関わらず、これは、選択されたT細胞培養物が、CD8+メモリーT細胞サブセットに属することを指し示しうる。
[0448]CD8+T細胞培養物のサイトカインプロファイルを解析することができる。T細胞培養物には、まず、抗原ペプチドでパルスされた自家APCによりチャレンジする。サイトカインプロファイルは、ELISAキット(ファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して、定量的に決定する。マイクロ滴定プレート(96ウェル、NUNC Maxisorp)を、4℃で、ウェル1つ当たり0.2~4μgのヒトサイトカイン(IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ)に対する、精製されたマウス捕捉モノクローナル抗体(ファーミンジェン)により、一晩コーティングする。プレートを洗浄し、非特異的結合部位を、10%(w/v)ウシ胎仔血清(FBS)で0.5~3時間飽和させ、その後洗浄した。上清及びサイトカイン標準物質を、PBSで希釈し、2連のウェルに添加する。プレートを、37℃で、1~3時間インキュベートし、その後、PBS-Tにより洗浄する。マッチさせたビオチン化検出抗体を、各ウェルへと添加し、室温で、1~3時間インキュベートする。洗浄の後、アビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、0.5~3時間インキュベートする。3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB、シグマ)を、発色のための基質として使用する。光学濃度は、ELISAリーダー(バイオ・ラッド ラボラトリーズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用して、450nmで測定し、サイトカイン濃度は、2重の8点検量線を使用して、マイクロプレート用コンピュータソフトウェア(バイオ・ラッド)により定量する。
[0449]プロトコールのパラメータを検査するための例示的実験は、プロトコール1を、患者試料中、小スケールで検査することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、CD4+T細胞及びCD8+T細胞の機能性を検査すること、抗原特異的細胞を分取すること、及び単一細胞RNAseqにより特徴付けることを含む、以前のバッチ内で作出されたT細胞生成物を特徴付けることでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、DC調製時に、poly-ICLC/抗CD40Lの添加について検査し、T細胞のエンリッチメントを定量することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、誘導されたCD8+ナイーブT細胞応答の機能性について検査することであって、殺滅アッセイにおいて、抗原特異的細胞傷害作用について評価すること、より広範なフローパネルにより、ペプチドリコールアッセイを実施して、分化及び枯渇を測定すること、ヒットのサブセットについて、感度(ペプチド滴定)及び特異度(WT対突然変異体;プールデコンボリューション)を決定すること、及びCD8+についてエンリッチして、抗原特異的CD4+T細胞に由来する、バイスタンダー効果の可能性を除去することを含む、検査することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、機能性を精査すること、ヒットのサブセットについて、感度(ペプチド滴定)及び特異度(WT対突然変異体;プールデコンボリューション)を決定すること、分化及び枯渇についてのフローパネルによるリコールアッセイを実施して、表現型を、よりよく理解することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、抗原特異的T細胞(CD8+メモリー、CD8+ナイーブ、CD4+ナイーブ)を分取し、単一細胞RNAseqによりプロファイリングすることであって、異なる誘導の表現型を比較すること、異なるコンパートメントからの誘導の表現型を比較すること、反応速度を検討することを含む、プロファイリングすることでありうる。
[0450]下記の表2は、CD14-/CD25-枯渇が、CD8+ナイーブのヒット率を増大させ、一貫したCD4+のヒット率を有しうることを裏付ける、プロトコール1によるT細胞調製法からの結果を示す。
[0451]下記の表3A及び3Bは、本明細書で記載される、プロトコール1及びプロトコール2によるT細胞調製法の両方からの結果を示す。2例の被験ヒトドナーにおいて、CD8+ナイーブの誘導は、CD25を発現する細胞の枯渇、又はCD25及びCD14を発現する細胞の枯渇を使用した場合に、CD14を発現する細胞の枯渇を使用する場合と比較して、著明に改善された。CD8+ナイーブの誘導はまた、FLT3L刺激を使用した場合にも、著明に改善された。
[0452]条件つきリガンドの、UV媒介性切断は、時間依存性でありうる。下記に記載した設定で、ペプチド切断は、1分後に検出することができ、およそ15分後に、本質的に完了しうる。条件つきリガンドの、目的のペプチドとの、最適の交換を確実にするには、通常、30~60分間のインキュベーション時間を使用することができる。ニトロフェニル部分及び反応生成物のいずれも、長波長のUV光を吸収しうるので、タンパク質濃度は、UV媒介性切断の速度に影響を及ぼしうる。加えて、経路長も、反応速度に影響しうる。UV曝露時に形成される、空の、ペプチド受容性MHC分子は、目的のMHCリガンドの存在下で、UV媒介性切断を実施することにより、レスキューすることができる。大半の実験では、MHCに対して、100倍モル過剰量のペプチドを使用する。UV誘導性ペプチド交換は、25μg/mLの、UV感受性MHCクラスI複合体を使用して、規定通りに実施する。しかし、ペプチド交換反応は、最大で100~200μg/mLのMHCクラスI濃度により実施することもできる。
96ウェルプレート(カタログ番号:651201;V sharp 96ウェルポリプロピレンマイクロプレート、Greiner Bio-one)
2×8W、366nm、長波UV型UVランプ(カタログ番号:022.9115、CAMAG)又は2×15W、365nm、blacklight blue tubesを伴うUvitec tube light(カタログ番号:LI215BLB;寸法:L×W×H=505×140×117mm)を装着された、366nm UVランプ用CAMAG UV Cabinet 3(モデル:022.9070、CAMAG)
マイクロ滴定プレート用の回転子を伴う遠心分離機
[0454]手順:
[0455]1. 96ウェルプレート内の各ウェルへと、以下の試薬を添加する。
[0457]3. プレートを、3,300gで、5分間スピンする。後段の適用のために、100μLの上清を(プレートを、ペレットの移入を回避する角度に保つ)、新たな96ウェルプレートへと移す。
[0458]MHCクラスI複合体を、フルオロフォアで標識したストレプトアビジンと共に複合体化させて、T細胞解析のための、MHCクラスI4量体を形成することができる。一般に使用されるフルオロフォアは、アロフィコシアニン及びフィコエリトリンを含み、下記では、これらのコンジュゲートを伴う、MHC多量体の形成について記載する。しかし、T細胞を検出するための、MHC多量体を調製するのに、ストレプトアビジンでコーティングした量子ドットもまた、使用することができる。
1mg/mLのPE-ストレプトアビジン溶液(カタログ番号:S866、モレキュラープローブ)又は1mg/mLのAPCストレプトアビジン溶液(カタログ番号:S868、モレキュラープローブ)
ウェル1つ当たり100μL中に、25μg/mLのpMHCを含有する、交換されるMHCクラスI複合体を伴うマイクロ滴定プレート。これは、ウェル1つ当たり、2.5μg又は0.05ナノモルのMHCクラスIに対応する。
[0461]1. PBS中に27μg/mLのストレプトアビジン-PE、又はPBS中に14.6μg/mLのストレプトアビジン-APCの希釈液を作出し、MHCクラスIの各ウェルに、100μLずつを調製する。
実施例18 MHC多量体のコンビナトリアルコーディング
[0463]UV媒介性MHCペプチド交換
[0464]1. ビオチン化p×MHC複合体の原液を、氷上で融解させる。
[0469]6. 3,300g、室温で5分間、プレートを遠心分離する。
[0476]10. D-ビオチン及びNaN3を、25μMのD-ビオチン及び0.02%(wt/vol)のNaN3の最終濃度まで添加する。20倍の原液(0.4%(wt/vol)のNaN3を伴う500μMのD-ビオチン)2.5μLを、各ウェルへと添加することにより、これを行うが;MHC多量体を、Qdot585へとコンジュゲートさせるためには、3.5μLを、各ウェルへと添加する。ウェルを混合し、氷上において、20分間インキュベートする。
MHC多量体によるT細胞染色
[0479]13. 27色全ての組合せについて、MHC多量体を混合して、使用準備のできた1例ずつの試料を得、これを、4℃、3,300gで、5分間遠心分離し、上清を移す。各T細胞染色のために、合計で、54μLの上清が要求される(すなわち、ミックス中に存在する、各個別のpMHC複合体について、2μLずつ)。
[0483]17. プレートを、上下逆にして軽く叩くことにより、緩衝液を廃棄する(細胞は、ウェルの底部に、ペレットとして残される)。
[0485]19. 37℃で、15分間インキュベートする。
[0486]20. プレートを、氷上へと移動させ、5倍濃度の原液からの抗体ミックス20μLを添加する。
[0488]22. 氷上で30分間インキュベートする。
[0490]24. プレートを、上下逆にして軽く叩くことにより、上清を廃棄する。
[0491]25. FACS緩衝液200μLで、2回洗浄する(490g、4℃で、5分間ずつ、2回遠心分離し、各スピンの後で、プレートを、上下逆にして軽く叩いて、上清を除去する)。
単色補正(compensation)対照
[0493]27. 100μLのFACS緩衝液と、1滴の陰性補正ビーズとを、11本のFACS試験管へと添加する(番号:1~11)。
[0496]30. 試験管1~8を、氷上で20分間インキュベートする。
[0498]32. 1μLの近赤外線死細胞染料を、試験管12(ステップ28による)へと添加し;暗所内、室温で30分間、混合及びインキュベートする。
ゲーティング戦略
[0503]37. まず、リンパ球にゲートをかけ、その後、単一細胞(FSC-α、FSC-W)、生細胞、ダンプチャネル陰性細胞、及びCD8+細胞にゲートをかける。
[0505]39. 8つのMHC多量体陽性のゲートを反転させ、各MHC多量体チャネルについて、CD8+及びMHC多量体陰性細胞を選択する、8つのゲートを得る。
[0508]42. ステップ41による、28のゲート全てを接続する(例えば、ゲート1又はゲート2又は・・・又はゲート28)。
[0511]45. 全ての可能な2色コードを伴い、ステップ44においてゲートをかけられたイベントを示す、28のドットプロットを作成する。これらのプロットは、全てのMHC多量体について陰性であるか、又は2つのMHC多量体について陽性であるCD8+細胞だけを示し;全てのバックグラウンドイベントは、ゲートから外す。
[0513]細胞のバーコード化を使用して、フローサイトメトリーにより、マルチプレックスの表現型解析及び機能解析を実施することができる。ホスホフローは、FCBによる標識付けを含む、わずかな改変により実施することができる。ホルムアルデヒドによる固定の後、試料を、表示濃度のAlexa Fluor又はPacific Blueのスクシンイミジルエステルを含有する、100%、20~25℃のメタノール(典型的に、細胞106個当たり500μL)中に再懸濁させると、各試料は、異なる濃度の蛍光色素を受け取る。場合によって、試料を、メタノール中に再懸濁させ、次いで、DMSO中に溶解させた(典型的に、1:50の希釈率で)FCBフルオロフォアを添加する。これは、96ウェルプレートによる実験に必要な、DMSO中の、FCB染色マトリックスの、あらかじめの調製及び保管を可能とするように行うことができる。20~25℃で、15分間にわたる標識付けの後、細胞を、染色培地(0.5%のBSAと、0.02%のアジドナトリウムとを含有する、リン酸緩衝生理食塩液(pH7.0))で、2回洗浄する。4℃以下で標識付けすることは、極めて低度の標識付け強度をもたらし、FCB染色レベルの上昇を伴わずに、試料の、メタノール染色溶液中、-80℃における保管を可能とする。
[0515]PINペプチドを使用して、プロトコール1及び2を実行した。抗原特異的CD4+ナイーブの誘導を評価した。結果は、下記の表4に見ることができる。
[0516]T細胞の誘導#1
[0520]T細胞の誘導#1
[0524]タンパク質をコードする遺伝子配列を変更する体細胞突然変異に由来するがん細胞内で生じるネオ抗原は、免疫療法のための魅力的標的として出現しつつある。ネオ抗原は、健常組織と対照的に、腫瘍細胞上で、固有に発現され、免疫系により、外来抗原として認識されて、免疫原性を増大させることがある。養子細胞療法における使用のための、ネオ抗原反応性T細胞生成物を作出する、ex vivoにおける、複数のラウンドのT細胞刺激を介して、患者特異的ネオ抗原に対する、メモリーCD4+及びCD8+T細胞応答並びにデノボCD4+及びCD8+T細胞応答を惹起するための、T細胞製造工程を開発した。刺激されたT細胞生成物の詳細な特徴付けを使用して、これらの工程が利用する、多くの潜在的な変数について調べることができる。
[0535]材料:
[0536] AIM V培地(インビトロジェン)
[0537]ヒトFLT3L、前臨床グレード、CellGenix製、#1415-050;50ng/μL原液
[0538]TNF-α、前臨床グレード、CellGenix製、#1406-050;10ng/μL原液
[0539]IL-1β、前臨床グレード、CellGenix製、#1411-050;10ng/μL原液
[0540]PGE1又はアルプロスタジル:チェコ共和国、Cayman製;0.5μg/μL原液
[0541]R10培地:RPMI 1640 glutamax+10%ヒト血清+1%PenStrep
[0542]20/80培地:18%AIM V+72%RPMI 1640 glutamax+10%ヒト血清+1%PenStrep
[0543]IL7;5ng/μL原液
[0544]IL15;5ng/μL原液
[0545]手順:
[0546]ステップ1:2mLのAIM V培地中にFLT3Lを伴う、24ウェルプレートの各ウェルに、500万個のPBMC(又は目的の細胞)を播種する。
[0548]1. それぞれのウェル内で、目的のペプチドプール(ペプチドなしの条件を除く)を、PBMC(又は目的の細胞)と混合する。
[0550]3. インキュベーションの後で、成熟カクテル(TNF-α、IL-1β、PGE1、及びIL-7を含む)を、各ウェルへと添加(mix)する。
[0552]ステップ4:培地を、IL7+IL15を補充した、新鮮なRPMI+10%HS培地で置きかえる。
[0554]ステップ6:2mLのAIM V培地中にFLT3Lを伴う、未使用の6ウェルプレートの各ウェルに、500万個のPBMC(又は目的の細胞)を播種する。
[0556]1. それぞれのウェル内で、目的のペプチドプール(ペプチドなしの条件を除く)を、PBMC(又は目的の細胞)と混合する。
[0558]3. インキュベーションの後で、成熟カクテルを、各ウェルへと添加(mix)する。
[0560]1. 第1の刺激FLT3L培養物を計数し、500万個の培養細胞を、未使用の再刺激プレートへと添加する。
[0562]ステップ9:3mlの培地を除去し、IL7+IL15を補充した、6mlのRPMI+10%HS培地を添加する。
[0564]ステップ11:必要な場合、再刺激を繰り返す。
[0565]T細胞製造プロトコール3を使用して、T細胞を調製し、刺激されたT細胞を解析した。試料は、2例の、黒色腫を有する患者から得た。実施例24で記載した、同様のアッセイを使用して、T細胞を解析した。図34は、2例の、黒色腫を有する患者から誘導された、CD8+T細胞応答を定量化する、pMHC多量体プロットを示す。本明細書で使用されるNEO-STIMは、T細胞製造プロトコールを指す。図35は、1つ、2つ、3つ、又は4つの機能の組合せにより示される、黒色腫を伴う患者において誘導された、メモリー応答及びデノボ応答についての、多機能プロファイルのデータを示す。1以上の機能は、IFNγ、TNFα、CD107a、及び4-1BBから選択される、1以上の因子の産生である。図36は、黒色腫を伴う患者において、突然変異ペプチド及び野生型ペプチドに対して誘導される、メモリー応答及びデノボ応答の特異性を示す。図37A及び37B及び37Cは、CD8+CD107a+T細胞(上パネル)の頻度により定量される、黒色腫を伴う患者において誘導されるメモリー応答及びデノボ応答についての、細胞傷害プロファイルを示す。図37A及び37B及び37Cの下パネルは、aCAS3+腫瘍細胞の頻度により定量される、これらのT細胞応答による、標的細胞の殺滅を示す。図38Aは、黒色腫患者における、ネオ抗原特異的CD4+T細胞応答の同定を示す。図38Bは、図38Aで同定された、これらのCD4+T細胞応答の、突然変異ペプチド及び野生型ペプチドに対する特異性を示す。図38Cは、1つ、2つ、3つ、又は4つの機能の組合せにより示される、これらのCD4+T細胞応答についての、多機能プロファイルを示す。1以上の機能は、IFNγ、TNFα、CD107a、及び4-1BBから選択される、1以上の因子の産生である。
[0566]T細胞は、T細胞製造プロトコール1を使用して、又は、代替物として、プロトコール2を使用して調製した。実施例24で記載した、同様のアッセイを使用して、刺激されたT細胞を解析した。図39は、1つ、2つ、又は3つの機能(例えば、1以上の機能は、IFNγ、TNFα、及びCD107aから選択される、1以上の因子の産生である)の組合せにより示される、エパカドスタットの添加を伴うか、又は伴わずに、2例の健常ドナー(例えば、HD66及びHD63)において誘導された、メモリー応答の機能性を示す。図40は、エパカドスタットの添加を伴うか、又は伴わずに、6回の反復誘導において誘導されたデノボCD8+T細胞応答(4例の健常ドナーで平均した「ヒット率」)のパーセントを示す。図41Aは、PD-1遮断抗体の添加を伴うか、又は伴わずに、本明細書で提示されるT細胞製造プロトコールによる誘導の後における、ドナーHD55からの抗原特異的細胞の絶対数を示す。図41Bは、PD-1遮断抗体の添加を伴うか、又は伴わずに、本明細書で提示されるT細胞製造プロトコールによる誘導の後における、ドナーHD67からの抗原特異的細胞の絶対数を示す。図42Aは、IL-12の添加を伴うか、又は伴わない、デノボCD8+T細胞応答のうちの、pMHC+CD8+T細胞の画分を示す。図42Bは、IL-12の添加を伴うか、又は伴わない、デノボCD8+T細胞応答のうちの、CD8+T細胞の百分率を示す。
[0567]バイオインフォマティクスエンジンを使用して、患者特異的ネオ抗原を予測した。予測されるネオ抗原をカバーする合成長鎖ペプチドを、刺激プロトコールにおける免疫原として使用して、免疫原性能について評価した。刺激プロトコールは、これらのネオ抗原をコードするペプチドを、患者由来APCへと供給し、次いで、これを、患者由来T細胞と共に共培養して、ネオ抗原特異的T細胞をプライミングすることを伴う。
Claims (16)
- 自家療法として使用するのに好適な腫瘍抗原特異的T細胞をex vivoにおいて調製する方法であって:
(a) がんを有するヒト対象からの生物学的試料に由来する、抗原提示細胞(APC)及びT細胞を含む免疫細胞の集団から、CD14+細胞及びCD25+細胞を枯渇させ、それにより、APC及びT細胞の第1の集団を含むCD14/CD25を枯渇させた免疫細胞の集団を形成し、
(b) CD14/CD25を枯渇させた免疫細胞の集団を、以下の(i)及び(ii):
(i) FMS様チロシンキナーゼ3受容体リガンド(FLT3L);及び
(ii) (A)ヒト対象のがん細胞より発現された、少なくとも2つの腫瘍抗原エピトープ配列を含むポリペプチド、ここで、少なくとも2つの腫瘍抗原エピトープ配列のそれぞれは、突然変異を含有し、かつ対応の野生型エピトープ配列よりも強い親和性で前記対象より発現されるMHCタンパク質へ結合する、又は(B) 前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
の存在下で第1の期間インキュベートし、それにより、刺激されたT細胞の集団を形成し、そして
(c) 刺激されたT細胞の集団を拡大し、それにより、拡大されたT細胞の集団を形成する、
ことを含み、
ここで、刺激されたT細胞の集団を拡大することは、ナイーブCD8+T細胞又はナイーブCD4+T細胞に由来するT細胞を拡大することを含み、拡大されたT細胞の集団は、(i)少なくとも1×106個の全CD8+T細胞、(ii)少なくとも1×106個の全CD4+T細胞、及び(iii)以下:
(A) (i)少なくとも2つの腫瘍抗原エピトープ配列のうちの第1の腫瘍抗原エピトープ配列、及び(ii)ヒト対象のがん細胞又はAPCより発現されたMHCタンパク質、を含む第1の複合体;並びに
(B) (i)少なくとも2つの腫瘍抗原エピトープ配列のうちの第2の腫瘍抗原エピトープ配列、及び(ii)ヒト対象のがん細胞又はAPCより発現されたMHCタンパク質、を含む第2の複合体、
に特異的なT細胞を含み、そして
拡大されたT細胞の集団の中で、第1の複合体又は第2の複合体に特異的なCD8+T細胞の少なくとも0.1%は、ナイーブCD8+T細胞に由来し、拡大されたT細胞の集団の中で、第1の複合体又は第2の複合体に特異的なCD4+T細胞の少なくとも0.1%は、ナイーブCD4+T細胞に由来する、前記方法。 - (b)及び(c)の工程を28日未満実施する、請求項1に記載の方法。
- 拡大されたT細胞の集団におけるCD8+T細胞の全量の中で第1の複合体又は第2の複合体に特異的なCD8+T細胞の画分が、生物学的試料におけるCD8+T細胞の全量の中で第1の複合体又は第2の複合体に特異的なCD8+T細胞の画分よりも少なくとも2倍多い、請求項1に記載の方法。
- 拡大されたT細胞の集団におけるCD4+T細胞の全量の中で第1の複合体又は第2の複合体に特異的なCD4+T細胞の画分が、生物学的試料におけるCD4+T細胞の全量の中で第1の複合体又は第2の複合体に特異的なCD4+T細胞の画分よりも少なくとも2倍多い、請求項1に記載の方法。
- 拡大させることが、
(A)刺激されたT細胞の集団を成熟APCの第2の集団に接触させ、ここで、成熟APCの第2の集団は、(i)FLT3Lと共にインキュベートされており、(ii)少なくとも2つの腫瘍抗原エピトープ配列を提示する;そして
(B)刺激されたT細胞の集団を第2の期間拡大し、それにより、拡大されたT細胞の集団を形成する、
ことを含む、請求項1に記載の方法。 - 成熟APCの第2の集団が、刺激されたT細胞の集団を成熟APCの第2の集団に接触させる前に、FLT3Lと共に少なくとも1日インキュベートされている、請求項5に記載の方法。
- 拡大させることが、
(C)前記拡大されたT細胞の集団を成熟APCの第3の集団に接触させ、ここで、成熟APCの第3の集団は、(i)FLT3Lと共にインキュベートされており、(ii)少なくとも2つの腫瘍抗原エピトープ配列を提示する;そして
(D)前記拡大されたT細胞の集団を第3の期間拡大させ、それにより、(c)のT細胞の拡大された集団を形成する、
ことををさらに含む、請求項5に記載の方法。 - 成熟APCの第3の集団が、拡大されたT細胞の集団を成熟APCの第3の集団に接触させる前に、FLT3Lと共に少なくとも1日インキュベートされている、請求項7に記載の方法。
- 生物学的試料が、末梢血試料、白血球除去試料、又はアフェレーシス試料である、請求項1に記載の方法。
- 拡大されたT細胞の集団を回収し、拡大されたT細胞の集団を凍結保存するか、又は拡大されたT細胞の集団を含有する医薬組成物を調製する、ことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- インキュベートすることが、FLT3L、及び前記ポリペプチドをコードするRNAの存在下で、CD14/CD25を枯渇させた免疫細胞の集団をインキュベートすることを含む、請求項1に記載の方法。
- ポリペプチドの長さが8~50アミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- ポリペプチドが少なくとも3つの腫瘍抗原エピトープ配列を含み、それぞれががんを有するヒト対象のがん細胞より発現される、請求項1に記載の方法。
- 免疫細胞の集団からCD14+細胞及びCD25+細胞を枯渇させることが、免疫細胞の集団を、CD14結合剤及びCD25結合剤に接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 枯渇させることが、免疫細胞の集団からCD19+細胞を枯渇させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 拡大されたT細胞の集団及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を調製する方法であって、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法によって、自家療法として使用するのに好適な腫瘍抗原特異的T細胞をex vivoにおいて調製することを含む、前記方法。
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