KR20230008254A - T 세포 제조 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
제어된 생체외 유도 또는 확장에 의한 항원 특이적 T 세포의 생성은 매우 특이적이고 유익한 T 세포 요법을 제공할 수 있다. 본 개시내용은 암 및 다른 병태, 질환 및 장애의 개인맞춤형 항원 특이적 T 세포 요법으로 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있는 T 세포 제조 방법 및 치료용 T 세포 조성물을 제공한다.
Description
본 출원은 2017년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 제62/583,229호; 2017년 11월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/588,590호; 2018년 1월 17일에 출원된 미국 가출원 제62/618,445호; 및 2018년 9월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/737,625호의 이익을 주장하며, 이들 출원은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
종양 백신은 전형적으로 종양 세포를 인식하고 용해시키는 항원 특이적 세포독성 T 세포(CTL)를 유도하기 위해 함께 작용하는 종양 항원 및 면역자극 분자(예컨대, 보조제, 사이토카인 또는 TLR 리간드)로 구성된다. 이러한 백신은 공유 조직 제한 종양 항원 또는 전체 종양 세포 제제 형태의 공유 및 환자 특이적 항원의 혼합물을 함유한다. 공유 조직 제한 종양 항원은 이상적으로 많은 개체에 걸쳐 종양에서 선택적 발현을 갖는 면역원성 단백질이고, 일반적으로 합성 펩타이드 또는 재조합 단백질로서 환자에게 전달된다. 대조적으로, 전체 종양 세포 제제는 자가 방사선 조사된 세포, 세포 용해물, 세포 융합, 열 충격 단백질 제제 또는 총 mRNA로서 환자에게 전달된다. 전체 종양 세포는 자가 환자로부터 단리되므로, 세포는 환자 특이적 종양 항원뿐만 아니라 공유 종양 항원을 포함할 수 있다. 마지막으로, 백신에 거의 사용되지 않았던 제3 부류의 종양 항원인 신생항원(neoantigen)이 있으며, 이는 아미노산 서열 변경을 초래하는 종양 특이적 돌연변이(환자 특이적이거나 공유될 수 있음)를 갖는 단백질로 구성된다. 이러한 돌연변이된 단백질은 (a) 돌연변이 및 그의 상응하는 단백질이 종양에만 존재하기 때문에 종양 세포에 고유하고; (b) 중추 관용(central tolerance)을 피하므로 면역원성일 가능성이 높으며; (c) 예컨대, 체액 및 세포 면역 모두에 의한 면역 인식을 위한 우수한 표적을 제공한다.
입양 면역요법 또는 입양 세포 요법(ACT)은 유전자 변형된 T 림프구를 질환의 요법을 위한 대상체에게 전달하는 것이다. 입양 면역요법은 암, 감염 질환, 자가면역 질환, 염증 질환, 및 면역결핍을 포함하는 다양한 질환을 치료하기 위한 잠재력을 아직 달성하지 못하였다. 그러나, 전부는 아니지만 대부분의 입양 면역요법 전략은 T 세포의 임상적으로 효과적인 치료 용량을 생성하기 위해 T 세포 활성화 및 확장 단계가 필요하다. 살아있는 세포 배양 및 환자 간 가변성의 내재하는 복잡성으로 인해, 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 치료 용량을 생성하는 현재의 기술은 번거로운 T 세포 제조 공정에 의해 여전히 제한된다. 기존의 T 세포 제조 공정은 쉽게 확장될 수 없거나, 반복될 수 없거나, 신뢰될 수 없거나, 효율적이지 않으며, 종종 효과기 면역 세포 기능이 소진 및 소실되기 쉬울 수 있는 열등한 T 세포 생성물을 생산한다. 현재까지, 조작된 T 세포 입양 면역요법은 제한된 성공만을 달성하였고, 일상적으로 가변적인 임상 활성을 보인다. 따라서, 이러한 요법은 광범위한 임상 용도에 적합하지 않다. 따라서, 유리한 표현형 및 기능을 갖는 항원 특이적 T 세포의 확장 및 유도를 위한 조성물 및 방법의 개발이 여전히 요구된다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 비례적으로 상이한 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 상이한 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율과 상이한 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도가 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도와 상이한 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적은 것인 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 적은 것인 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율보다 적은 것인 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도가 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도보다 적은 것인 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하고 항원 제시 세포(APC)로 자극된 T 세포인 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하고, APC는 FLT3L로 자극된 APC인 것인 면역 세포의 집단; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이고; 생물학적 샘플은 하나 이상의 항원 특이적 T 세포를 포함하며, 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 항원 특이적 T 세포는 상기 생물학적 샘플 중의 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 면역 세포의 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 또는 0.05%인 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 확장되거나 유도된 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, 생물학적 샘플로부터의 확장되거나 유도된 T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 양, 농도 또는 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 항원 특이적 T 세포 또는 총 T 세포의 양, 농도 또는 백분율보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000이 더 큰 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 생물학적 샘플로부터 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000배 확장되거나 유도된, 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 CD4+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD4+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이고; 생물학적 샘플은 하나 이상의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하며, 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 상기 생물학적 샘플 중의 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 면역 세포의 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 또는 0.05%인 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 생물학적 샘플로부터의 CD4+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD4+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고; 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 총 CD4+ T 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이며; 생물학적 샘플은 하나 이상의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 상기 생물학적 샘플 중의 총 CD4+ T 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 또는 0.05%이다. 일부 양태에서, CD4+ 생물학적 샘플로부터 확장되거나 유도된 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, 생물학적 샘플로부터 확장되거나 유도된 CD4+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 양, 농도 또는 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 항원 특이적 CD4+ T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 T 세포의 양, 농도 또는 백분율보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000이 더 큰 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 CD4+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD4+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000배 확장되거나 유도된, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, CD25 발현 세포 또는 CD25 및 CD14 발현 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 CD4+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD4+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높게 확장되거나 유도된, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 CD8+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD8+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이고; 생물학적 샘플은 하나 이상의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하며, 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 상기 생물학적 샘플 중의 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 면역 세포의 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 또는 0.05%인 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 CD8+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD8+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 총 CD8+ T 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이고; 생물학적 샘플은 하나 이상의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하며, 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 상기 생물학적 샘플 중의 총 CD8+ T 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 또는 0.05%인 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, CD8+ 생물학적 샘플로부터 확장되거나 유도된 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD8+ 생물학적 샘플로부터 확장되거나 유도된 T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 양, 농도 또는 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 항원 특이적 CD8+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 또는 총 T 세포의 양, 농도 또는 백분율보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 큰 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 CD8+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD8+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것인 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000배 확장되거나 유도된, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 CD8+ T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, CD8+ T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900배 확장되거나 유도된, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 약학 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 APC 자극된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 많다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율보다 적다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 백분율보다 많다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도는 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도보다 적다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도는 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 농도보다 많다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 나이브(naive) T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 기억 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 확장된 기억 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 유도된 나이브 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 기억 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 확장된 기억 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 유도된 나이브 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 IL-7, IL-15, 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 자극된다. 일부 구현예에서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루(read-through) 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 펩타이드-HLA 복합체에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 적어도 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,500; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 7,500; 또는 10,000개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 I HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 8-12개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 II HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 16-25개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 복수의 항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 펩타이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원, 종양 관련 항원, 과발현된 항원, 바이러스 항원, 부조직적합 항원 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 APC 제제이다. 일부 구현예에서, APC는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 자가 APC, 동종이계(allogenic) APC, 또는 인공 APC이다. 일부 구현예에서, APC는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC는 CD14 농축된 APC이다. 일부 구현예에서, APC는 CD141 농축된 APC이다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 농축된다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플 중의 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플 중의 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고; 상기 집단 중의 CD19 및/또는 CD16을 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD19 및/또는 CD16을 발현하는 면역 세포의 양과 상이하다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고; 상기 집단 중의 CD19 및/또는 CD16을 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD19 및/또는 CD16을 발현하는 면역 세포의 양보다 적다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 요법에 사용하기 위한 의약의 제조를 위하여 본원에 기재된 조성물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 APC를 CD25 또는 CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 APC를 CD14를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 배양하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포의 양보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높은, 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포의 양을 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 APC를 CD25 또는 CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포는 APC를 CD14를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 배양하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포의 양보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높은, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포의 양을 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 APC를 CD25 또는 CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 APC를 CD14를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 배양하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포의 양보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높은, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포의 양을 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 CD19 발현 세포가 추가로 고갈된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 CD19 발현 세포가 추가로 고갈된다. 일부 구현예에서, APC는 FLT3L로 자극된 APC이다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단을 인큐베이션하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합을 함유하는 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배지는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합이다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는, FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하지 않고; 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포의 양보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높은, 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포의 양을 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 제1 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포는, FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하지 않고; 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포의 양보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높은, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD4+ T 세포의 양을 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 APC와 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포는, FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하지 않고; 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포의 양보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500배 더 높은, 확장되거나 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포의 양을 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 APC를 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제의 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나, 또는 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 별개의 기간 동안 3개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나 또는 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 CD14 및/또는 CD25 발현 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터 유래된다.
일부 구현예에서, APC는 FLT3L로 자극된 APC이다. 일부 구현예에서, APC 제제 중 적어도 하나는 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제 중 적어도 2개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제 중 적어도 3개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제 각각은 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다.
일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 APC 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제는 3개 이하의 APC 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제는 하나 이상의 별개의 기간 내에 순차적으로 면역 세포와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 점 돌연변이를 포함하고 상응하는 야생형 펩타이드보다 더 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 펩타이드-HLA 복합체에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 적어도 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,500; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 7,500; 또는 10,000개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 I HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 8-12개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 II HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 16-25개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 복수의 항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 펩타이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원, 종양 관련 항원, 바이러스 항원, 부조직적합 항원 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계는 CD14 및/또는 CD25 결합제를 APC 또는 APC 제제의 APC에 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25 결합제는 바이오티닐화된다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계는 고체 지지체 상의 항-바이오틴 시약을 CD14 및/또는 CD25 결합제와 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25 결합제는 고체 지지체에 부착된다.
일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 자가 APC 또는 동종이계 APC이다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 생물학적 샘플로부터 농축된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 별개의 기간의 총 기간은 28일 미만이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션하는 것은 APC 제제의 제1 APC 제제를 7일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제를 적어도 하나의 펩타이드와 함께 제2 기간 동안 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 성숙 APC를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제3 기간 후 및 제4 기간의 시작 전에 제2 배지의 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 생체외에서 수행된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 새롭게 수득되거나 동결된 샘플이다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 CD14 및/또는 CD25 세포 고갈 샘플을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 펩타이드를 CD14 및/또는 CD25 세포 고갈 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 성숙 APC 펩타이드가 로딩된 샘플을 적어도 하나의 PBMC와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩타이드 로딩 샘플과 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드가 로딩된 샘플과 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 인큐베이션하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 인큐베이션하는 것은 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 인큐베이션하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 인큐베이션하는 것은 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행된다.
일 양태에서, 대상체로부터 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14를 발현하는 세포를 농축시켜, CD14+ 세포 농축 샘플을 수득하는 단계; CD14+ 세포 농축 샘플을 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩타이드를 CD14+ 세포 농축 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; APC 펩타이드 로딩 샘플을 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계; 성숙 APC 샘플의 APC를 PBMC를 포함하는 CD14 및/또는 CD25 고갈된 샘플과 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하는 단계; PBMC를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하는 단계; PBMC를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제6 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 PBMC의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 PBMC와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 제1, 제2 또는 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 PBMC와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 및 제1, 제2 또는 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원이 제공된다.
일 양태에서, 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 PBMC와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩타이드 로딩 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드 로딩 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 및 제1, 제2 또는 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원이 제공된다.
일 양태에서, 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 PBMC와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; 제1, 제2 또는 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 동시에 수행되는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 자극된 면역 세포 샘플은 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC로 자극된 면역 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 유래된다.
일 양태에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC와 함께 인큐베이션하여, 자극된 면역 세포 샘플을 수득하는 단계; 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 동시에 수행되는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 탈과립 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 세포-표면 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 것은 펩타이드-MHC 복합체의 펩타이드 및 MHC를 포함하는 MHC 사량체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC는 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC이다. 일부 구현예에서, 펩타이드-MHC 복합체는 하나 이상의 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단은 각각 하나 이상의 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 2개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 샘플은 2개 이상의 샘플 표지로 표지된다. 일부 구현예에서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 단일 세포 분석을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 하나 이상의 세포 마커를 발현하고 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 면역 세포의 백분율을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 형광단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 본원에 기재된 조성물의 면역 세포의 집단을 대표하는 면역 세포의 집단을 포함한다.
본 발명의 양태 또는 구현예가 마쿠시 그룹 또는 다른 대안의 그룹의 측면에서 설명되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 그룹을 포함할 뿐만 아니라 개별적으로 그룹의 각 구성원 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위그룹, 및 또한 하나 이상의 그룹 구성원이 없는 주요 그룹을 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 하나 이상의 임의의 그룹 구성원의 명시적 배제를 고려한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 예를 들어, 본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 본원에 기재된 방법, 키트, 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 기재된 키트, 조성물, 및 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 본원에 논의된 문서는 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본원에 기재된 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도 1A는 항원 특이적 T 세포 제조 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 1B는 항원 특이적 T 세포 제조 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 2는 긴 펩타이드 또는 짧은 펩타이드에 의해 유도된 항원 특이적 CD8+ 기억 T 세포의 분율을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다. "벌크(bulk)"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 전체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)라는 것을 나타낸다. "Treg-"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 CD25 발현 세포가 고갈된 PBMC라는 것을 나타낸다.
도 3은 GAS7 펩타이드로 유도된 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포의 분율을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 4는 HIV 짧은 펩타이드, 짧은 이전에 확인된 신생항원(PIN), 또는 긴 PIN의 펩타이드 풀(pool)에 대한 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다. "전체 PBMC"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 전체 PBMC임을 나타낸다. "CD25- PBMC"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 CD25+ 세포가 고갈된다는 것을 나타낸다.
도 5A는 지시된 조건 하에 단일의 이전에 확인된 신생항원(PIN)에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 5B는 지시된 조건 하에 단일의 이전에 확인된 신생항원(PIN)에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석를 도시한다.
도 6은 2명의 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용하여 표시된 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다.
도 7은 자극 전 및 최대 3회의 자극 후 건강한 공여자에서 표시된 돌연변이된 에피토프에 대한 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석의 플롯을 도시한다.
도 8A는 바이러스 항원에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응의 결과를 나타내는 예시적인 막대 그래프를 도시한다. 최대 3회의 자극 후, 모든 CD8+ T 세포의 대략 50%는 표시된 바이러스 에피토프(CMV pp65, EBV YVL, EBV BMLF1 및 Mart-1)에 특이적이었다.
도 8B는 로딩된 바이러스 항원 유무 하에 APC와 함께 인큐베이션된 펩타이드 로딩된 항원 제시 세포에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포의 리콜 어세이의 예시적인 결과를 도시한다. 표시된 사이토카인을 방출하는 2개의 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 분율이 차트에 도시되어 있다.
도 9는 유도된 T 세포 배양물이 항원 발현 종양주를 사멸시킬 수 있는지 평가하는 데 사용된 세포독성 어세이의 예시적인 결과를 도시한다. 총 종양 세포에 대한 생존 및 사멸 카스파제 3 양성 종양 세포의 분율이 나타나 있다. 카스파제 3 양성 생존 종양 세포는 조기 세포 사멸을 겪는 세포를 나타낸다.
도 10은 로딩된 PIN 유무 하에 APC와 함께 인큐베이션된 펩타이드 로딩된 항원 제시 세포에 대한 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다. IFNγ를 방출하는 CD4+ T 세포의 백분율이 나타나 있다.
도 11은 돌연변이체 펩타이드 또는 야생형 펩타이드로 재자극된 후 IFNγ를 방출하는 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율의 예시적인 결과를 도시한다.
도 12는 짧은 HIV5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 13은 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 ME1 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 분율을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 14는 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV3 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 15는 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 긴 CSNK1A1 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 16은 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 긴 CSNK1A1 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 17은 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 GAS7 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 18은 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 ACTN4 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 19A는 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 ACTN4 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 유도가 나타나 있다.
도 19B는 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV3 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 장기 유도가 나타나 있다.
도 20은 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다. B단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 21은 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV3 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 유도가 나타나 있다.
도 22는 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 PRDX5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 매우 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 23은 CD25+세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 24는 기억 T 세포의 확장 및 나이브 T 세포의 유도를 포함하는 치료용 T 세포 조성물을 생성하기 위한 방법의 예의 개략도를 도시한다.
도 25는 T 세포 및/또는 T 세포 반응의 기능성, 표현형 및/또는 기능을 시험하는 방법의 예를 도시한다
도 26은 T 세포 및/또는 T 세포 반응의 기능성, 표현형 및/또는 기능을 시험하는 리콜 어세이의 예를 도시한다.
도 27A는 리콜 어세이에서, 개별적으로 또는 혼합물로서 취득된, 표지된 샘플에 의해 멀티플렉스된 샘플을 디콘볼루션(deconvolution)하는 능력을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 독특하게 표지된 샘플은 다른 바코드에 대한 교차오염을 최소화하거나 교차오염 없이 분해되었다.
도 27B는 리콜 어세이에서 9개의 독특하게 표지된 샘플의 혼합물의 다량체 염색에 의한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 검출을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 28A는 로딩되지 않은 DC 및 신생항원 로딩된 DC로 리콜된 6개의 독특하게 바코딩된 샘플을 사용한 리콜 분석의 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 28B는 리콜 반응 어세이에서 표시된 농도의 펩타이드가 로딩된 DC와 함께 인큐베이션된 기능의 수를 갖는 CD4+ T 세포의 퍼센트의 예시적인 막대 그래프를 도시한다. 드 노보 CD4+ T 세포 반응을 함유하는 2개의 유도된 배양물의 샘플을 바코팅(barcoding) 없이 단독으로 분석하거나 또는 관련없는 샘플과 혼합하였다. 바코딩은 검출가능한 기능성을 변경하지 않았다. 세포로부터 유발된 기능의 수 및 반응의 크기는 샘플 바코딩으로 유의하게 변하지 않았다.
도 29A는 바이러스 항원에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응의 결과를 나타내는 예시적인 막대 그래프를 도시한다. CMV pp65, MART-1 및 EBV BRLF1 및 BMLF1 에피토프에 대한 CD8+ 기억 반응은 출발하는 건강한 공여자 물질에서 CD8+ T 세포의 0.23%에서 > 60%로 증가될 수 있다.
도 29B는 바이러스 항원에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응 후 바이러스 항원이 로딩되거나 로딩되지 않은 DC로 리콜된 리콜 어세이의 예시적인 결과를 도시한다. 표시된 사이토카인을 방출하는 2개의 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 분율이 차트에 도시되어 있다.
도 30A는 동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화에 의한 적중 확인의 예시적인 결과를 도시한다. 나타낸 예에서, HIV-음성 건강한 공여자에서의 나이브 표적인 10개의 HIV 유래의 에피토프를 표적화하는 4개의 리플리케이트 배양물에서 유도가 수행되었다. 항원 특이적 반응은 다양한 크기의 반응으로 4/4 생물학적 리플리케이트에서 검출되었다.
도 30B는 동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화에 의한 풀 디콘볼루션의 예시적인 결과를 도시한다. 각각의 시험된 리플리케이트에서 다수의 반응이 검출되었고, 동일한 2개의 에피토프(HIV #5 및 HIV #7)는 각각의 경우에 가장 높은 크기의 반응을 생성하였다.
도 30C는 동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화에 의한 민감성 결정의 예시적인 결과를 도시한다. 풀 디콘볼루션 어세이에서 각각의 반응에 대해 유사한 크기가 관찰되었다. HIV #5, HIV #6 및 HIV #4에 대한 반응은 각각 0.45μM, 0.43μM 및 9.1μM의 EC50을 입증하였다.
도 31은 항원 특이적 T 세포 제조 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 32는 T 세포 유도 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 33은 수지상 세포 생성 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 34는 환자 특이적 에피토프 SRSF1E>K, ARAP1Y>H & PKDREJG>R를 표적화하는 흑색종 환자, 환자 특이적 에피토프(AASDHneoORF) 및 7개의 모델 신생항원 ACTN4K>N, CSNK1A1S>L, DHX40neoORF, GLI3P>L QARSR>W, FAM178BP>L 및 RPS26P>L을 표적화하는 흑색종 환자로부터의 백혈구성분채집술(leukapheresis) 물질에서 유도된 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 예시적인 pMHC 다량체 플롯을 도시한다. 제1 및 제2행의 제1 패널 플롯은 기억 반응을 나타내고, 나머지 플롯은 드 노보 반응을 나타낸다.
도 35는 펩타이드 자극 전후에 SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H의 pMHC 다량체 플롯의 예시적인 데이터(좌측 패널)를 도시하며, 파이 차트는 pMHC 다량체+ CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상에 게이팅된 신생항원 로딩된 DC로 재챌린징시 신생항원 특이적 T 세포의 기능성을 도시한다. 흑색종 환자에서 유도된 CD8+ 기억, CD8+ 드 노보 및 CD4+ 드 노보 반응의 다기능적 프로파일은 1, 2, 또는 3개의 기능의 조합(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα, CD107a 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)에 의해 표시된다.
도 36은 돌연변이된 펩타이드 및 야생형 펩타이드에 대한 흑색종 환자에서 유도된 기억 및 드 노보 반응의 특이성을 도시한다. SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H 특이적 T 세포 반응은 상이한 농도(X 축: 0 μM, 0.05 μM, 0.2 μM, 0.8 μM, 및 3.2 μM)에서 돌연변이 또는 야생형 신생항원 펩타이드가 로딩된 DC로 챌린징되었고, 샘플에서 총 CD8+ T 세포의 IFN-γ+ 및/또는 TNFα+ 및/또는 CD107a+가 측정되었으며(Y 축); 두 반응은 0 μM 농도까지 유의한 차이를 나타내며 야생형 신생항원 펩타이드에 반응하지 않는다. 통계 분석: 조정된 p 값에 대한 FDR, P 값s: * ≤ 0.05, *** ≤ 0.001, **** ≤ 0.0001.
도 37A는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 흑색종 환자에서 유도된 기억 반응의 세포독성 프로파일을 도시한다. 그것은 또한 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 도시한다. 돌연변이 또는 야생형 신생항원 형질도입된 종양 세포로 재챌린징함으로써 유도된 CD8+ T 세포 반응의 세포독성 능력을 평가하였다. 형질도입되지 않은 종양 세포(모 A375 주) 또는 200aa 작제물로 형질도입된 종양 세포가 사용되었다. 작제물은 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하였고, 돌연변이는 중앙에 있다. CD8+ T 세포 상의 CD107a 및 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절은 공배양시에 측정되었다. 표적 비율: 3.3:1(SRSF1E>K).
도 37B는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 흑색종 환자에서 유도된 기억 반응의 세포독성 프로파일의 또 다른 예를 도시한다. 그것은 또한 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 도시한다. 돌연변이 또는 야생형 신생항원 형질도입된 종양 세포로 재챌린징함으로써 유도된 CD8+ T 세포 반응의 세포독성 능력을 평가하였다. 형질도입되지 않은 종양 세포(모 A375 주) 또는 200aa 작제물로 형질도입된 종양 세포가 사용되었다. 작제물은 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하였고, 돌연변이는 중앙에 있다. CD8+ T 세포 상의 CD107a 및 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절은 공배양시에 측정되었다. 빨간색 원은 pMHC+ 분율을 강조한다. 효과기: 표적 비율: 5:1(SRSF1E>K). 통계 분석: 비쌍 T 검정, P 값 ** ≤ 0.01, **** ≤ 0.0001.
도 37C는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 흑색종 환자에서 유도된 드 노보 반응의 세포독성 프로파일을 도시한다. 그것은 또한 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 도시한다. 돌연변이 또는 야생형 신생항원 형질도입된 종양 세포로 재챌린징함으로써 유도된 CD8+ T 세포 반응의 세포독성 능력을 평가하였다. 형질도입되지 않은 종양 세포(모 A375 주) 또는 200aa 작제물로 형질도입된 종양 세포가 사용되었다. 작제물은 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하였고, 돌연변이는 중앙에 있다. CD8+ T 세포 상의 CD107a 및 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절은 공배양시에 측정되었다. 빨간색 원은 pMHC+ 분율을 강조한다. 효과기: 표적 비율: 0.66:1(ARAP1Y>H). 통계 분석: 비쌍 T 검정, P 값 ** ≤ 0.01, **** ≤ 0.0001.
도 38A는 흑색종 환자에서 신생항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 확인을 도시한다. 반응은 돌연변이체 신생항원 펩타이드 로딩된 DC(0.8 μM)로 재챌린징될 때 IFN-γ & TNFα(Y 축)의 생성에 기초하여 확인된다. MKRN1S>L, CREBBPS>L, 및 TPCN1K>E는 양성 반응으로서 확인되었다.
도 38B는 표시된 돌연변이된 펩타이드 및 야생형 펩타이드에 대한 도 38A에 도시된 CD4+ T 세포 반응의 특이성을 도시한다. 확인 연구에서, 도 38A에 나타낸 CD4 T 세포 반응은 상이한 농도(X 축- 0 μM, 0.05 μM, 0.2 μM, 0.8 μM 및 3.2 μM)의 돌연변이 및 야생형 신생항원 펩타이드로 챌린징되었고, 샘플에서 총 CD4+의 IFNγ+ 및/또는 TNFα+(Y 축)가 측정되었다. CD4+ T 세포 반응 중 2개(MKRN1S>L 및 CREEBPS>L)는 0 μM 농도까지 유의한 차이를 나타내고 야생형 신생항원 펩타이드에 반응하지 않지만, TPCN1K>E 반응은 돌연변이 및 야생형 신생항원 펩타이드 모두에 반응성이었다. 통계 분석: 조정된 p 값에 대한 FDR, P 값 <0.05);
도 38C는 1, 2, 3, 또는 4개의 기능의 조합(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα, CD107a 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)에 의해 나타낸 바와 같이, 이들 CD4+ T 세포 반응의 다기능성 프로파일을 도시한다. 돌연변이 신생항원 펩타이드 로딩된 DC(0.8 μm)로 재챌린징함으로써 확인된 CD4+ T 세포 반응의 다기능성이 평가되었다. 파이 차트의 백분율은 백분율 기능적 CD4+ T 세포(1, 2 및/또는 3개의 기능)를 나타낸다. 환자에서 유도된 자극 후 CD4+ T 세포 반응으로부터 생성된 대표적인 데이터가 도시되어 있다.
도 39는 1, 2 또는 3개의 기능의 조합(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα 및 CD107a로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)에 의해 나타낸 바와 같이, 에파카도스타트가 첨가되거나 첨가되지 않은 2명의 건강한 공여자(예컨대, HD66 및 HD63)에서 유도된 기억 반응의 기능성을 도시한다.
도 40은 에파카도스타트가 첨가되거나 첨가되지 않은 6개의 리플리케이트 유도에서 퍼센트 유도된 드 노보 CD8+ T 세포 반응('적중률', 4명의 건강한 공여자에 걸친 평균)을 도시한다.
도 41A는 PD-1 블로킹 항체가 첨가되거나 첨가되지 않은, 본원에 제공된 T 세포 제조 프로토콜로 유도 후 공여자 HD55로부터의 항원 특이적 세포의 절대 수를 도시한다.
도 41B는 PD-1 블로킹 항체가 첨가되거나 첨가되지 않은, 본원에 제공된 T 세포 제조 프로토콜로 유도 후 공여자 HD67로부터의 항원 특이적 세포의 절대 수를 도시한다.
도 42A는 IL-12가 첨가되거나 첨가되지 않은 드 노보 CD8+ T 세포 반응의 pMHC+ CD8+ T 세포의 분율을 도시한다.
도 42B는 IL-12가 첨가되거나 첨가되지 않은 드 노보 CD8+ T 세포 반응 내에서 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다.
도 43은 본원에 기재된 방법의 예를 도시한다. 환자 특이적 신생항원은 바이오인포매틱스 엔진을 사용하여 예측되며, 예측된 신생항원을 커버하는 합성된 긴 펩타이드는 면역원성 능력을 평가하기 위한 면역원으로서 사용된다. 자극 프로토콜은 이들 신생항원 코딩 펩타이드를 환자 유래의 APC에 공급한 다음, 이를 환자 유래의 T 세포와 공배양하여 신생항원 특이적 T 세포를 프라이밍하는 것을 포함한다.
도 1B는 항원 특이적 T 세포 제조 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 2는 긴 펩타이드 또는 짧은 펩타이드에 의해 유도된 항원 특이적 CD8+ 기억 T 세포의 분율을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다. "벌크(bulk)"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 전체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)라는 것을 나타낸다. "Treg-"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 CD25 발현 세포가 고갈된 PBMC라는 것을 나타낸다.
도 3은 GAS7 펩타이드로 유도된 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포의 분율을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 4는 HIV 짧은 펩타이드, 짧은 이전에 확인된 신생항원(PIN), 또는 긴 PIN의 펩타이드 풀(pool)에 대한 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다. "전체 PBMC"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 전체 PBMC임을 나타낸다. "CD25- PBMC"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 CD25+ 세포가 고갈된다는 것을 나타낸다.
도 5A는 지시된 조건 하에 단일의 이전에 확인된 신생항원(PIN)에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 5B는 지시된 조건 하에 단일의 이전에 확인된 신생항원(PIN)에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석를 도시한다.
도 6은 2명의 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용하여 표시된 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다.
도 7은 자극 전 및 최대 3회의 자극 후 건강한 공여자에서 표시된 돌연변이된 에피토프에 대한 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석의 플롯을 도시한다.
도 8A는 바이러스 항원에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응의 결과를 나타내는 예시적인 막대 그래프를 도시한다. 최대 3회의 자극 후, 모든 CD8+ T 세포의 대략 50%는 표시된 바이러스 에피토프(CMV pp65, EBV YVL, EBV BMLF1 및 Mart-1)에 특이적이었다.
도 8B는 로딩된 바이러스 항원 유무 하에 APC와 함께 인큐베이션된 펩타이드 로딩된 항원 제시 세포에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포의 리콜 어세이의 예시적인 결과를 도시한다. 표시된 사이토카인을 방출하는 2개의 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 분율이 차트에 도시되어 있다.
도 9는 유도된 T 세포 배양물이 항원 발현 종양주를 사멸시킬 수 있는지 평가하는 데 사용된 세포독성 어세이의 예시적인 결과를 도시한다. 총 종양 세포에 대한 생존 및 사멸 카스파제 3 양성 종양 세포의 분율이 나타나 있다. 카스파제 3 양성 생존 종양 세포는 조기 세포 사멸을 겪는 세포를 나타낸다.
도 10은 로딩된 PIN 유무 하에 APC와 함께 인큐베이션된 펩타이드 로딩된 항원 제시 세포에 대한 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다. IFNγ를 방출하는 CD4+ T 세포의 백분율이 나타나 있다.
도 11은 돌연변이체 펩타이드 또는 야생형 펩타이드로 재자극된 후 IFNγ를 방출하는 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율의 예시적인 결과를 도시한다.
도 12는 짧은 HIV5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 13은 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 ME1 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 분율을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 14는 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV3 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 15는 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 긴 CSNK1A1 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 16은 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 긴 CSNK1A1 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 17은 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 GAS7 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 18은 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 ACTN4 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 19A는 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 ACTN4 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 유도가 나타나 있다.
도 19B는 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV3 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 장기 유도가 나타나 있다.
도 20은 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다. B단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 21은 인간 공여자로부터의 전체 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV3 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 유도가 나타나 있다.
도 22는 CD25+ 세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 PRDX5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 매우 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 23은 CD25+세포가 고갈된 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 짧은 HIV5 펩타이드에 대한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포 반응을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다.
도 24는 기억 T 세포의 확장 및 나이브 T 세포의 유도를 포함하는 치료용 T 세포 조성물을 생성하기 위한 방법의 예의 개략도를 도시한다.
도 25는 T 세포 및/또는 T 세포 반응의 기능성, 표현형 및/또는 기능을 시험하는 방법의 예를 도시한다
도 26은 T 세포 및/또는 T 세포 반응의 기능성, 표현형 및/또는 기능을 시험하는 리콜 어세이의 예를 도시한다.
도 27A는 리콜 어세이에서, 개별적으로 또는 혼합물로서 취득된, 표지된 샘플에 의해 멀티플렉스된 샘플을 디콘볼루션(deconvolution)하는 능력을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 독특하게 표지된 샘플은 다른 바코드에 대한 교차오염을 최소화하거나 교차오염 없이 분해되었다.
도 27B는 리콜 어세이에서 9개의 독특하게 표지된 샘플의 혼합물의 다량체 염색에 의한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 검출을 나타내는 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 28A는 로딩되지 않은 DC 및 신생항원 로딩된 DC로 리콜된 6개의 독특하게 바코딩된 샘플을 사용한 리콜 분석의 예시적인 유세포 분석을 도시한다.
도 28B는 리콜 반응 어세이에서 표시된 농도의 펩타이드가 로딩된 DC와 함께 인큐베이션된 기능의 수를 갖는 CD4+ T 세포의 퍼센트의 예시적인 막대 그래프를 도시한다. 드 노보 CD4+ T 세포 반응을 함유하는 2개의 유도된 배양물의 샘플을 바코팅(barcoding) 없이 단독으로 분석하거나 또는 관련없는 샘플과 혼합하였다. 바코딩은 검출가능한 기능성을 변경하지 않았다. 세포로부터 유발된 기능의 수 및 반응의 크기는 샘플 바코딩으로 유의하게 변하지 않았다.
도 29A는 바이러스 항원에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응의 결과를 나타내는 예시적인 막대 그래프를 도시한다. CMV pp65, MART-1 및 EBV BRLF1 및 BMLF1 에피토프에 대한 CD8+ 기억 반응은 출발하는 건강한 공여자 물질에서 CD8+ T 세포의 0.23%에서 > 60%로 증가될 수 있다.
도 29B는 바이러스 항원에 대한 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응 후 바이러스 항원이 로딩되거나 로딩되지 않은 DC로 리콜된 리콜 어세이의 예시적인 결과를 도시한다. 표시된 사이토카인을 방출하는 2개의 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 분율이 차트에 도시되어 있다.
도 30A는 동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화에 의한 적중 확인의 예시적인 결과를 도시한다. 나타낸 예에서, HIV-음성 건강한 공여자에서의 나이브 표적인 10개의 HIV 유래의 에피토프를 표적화하는 4개의 리플리케이트 배양물에서 유도가 수행되었다. 항원 특이적 반응은 다양한 크기의 반응으로 4/4 생물학적 리플리케이트에서 검출되었다.
도 30B는 동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화에 의한 풀 디콘볼루션의 예시적인 결과를 도시한다. 각각의 시험된 리플리케이트에서 다수의 반응이 검출되었고, 동일한 2개의 에피토프(HIV #5 및 HIV #7)는 각각의 경우에 가장 높은 크기의 반응을 생성하였다.
도 30C는 동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화에 의한 민감성 결정의 예시적인 결과를 도시한다. 풀 디콘볼루션 어세이에서 각각의 반응에 대해 유사한 크기가 관찰되었다. HIV #5, HIV #6 및 HIV #4에 대한 반응은 각각 0.45μM, 0.43μM 및 9.1μM의 EC50을 입증하였다.
도 31은 항원 특이적 T 세포 제조 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 32는 T 세포 유도 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 33은 수지상 세포 생성 프로토콜의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 34는 환자 특이적 에피토프 SRSF1E>K, ARAP1Y>H & PKDREJG>R를 표적화하는 흑색종 환자, 환자 특이적 에피토프(AASDHneoORF) 및 7개의 모델 신생항원 ACTN4K>N, CSNK1A1S>L, DHX40neoORF, GLI3P>L QARSR>W, FAM178BP>L 및 RPS26P>L을 표적화하는 흑색종 환자로부터의 백혈구성분채집술(leukapheresis) 물질에서 유도된 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 예시적인 pMHC 다량체 플롯을 도시한다. 제1 및 제2행의 제1 패널 플롯은 기억 반응을 나타내고, 나머지 플롯은 드 노보 반응을 나타낸다.
도 35는 펩타이드 자극 전후에 SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H의 pMHC 다량체 플롯의 예시적인 데이터(좌측 패널)를 도시하며, 파이 차트는 pMHC 다량체+ CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상에 게이팅된 신생항원 로딩된 DC로 재챌린징시 신생항원 특이적 T 세포의 기능성을 도시한다. 흑색종 환자에서 유도된 CD8+ 기억, CD8+ 드 노보 및 CD4+ 드 노보 반응의 다기능적 프로파일은 1, 2, 또는 3개의 기능의 조합(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα, CD107a 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)에 의해 표시된다.
도 36은 돌연변이된 펩타이드 및 야생형 펩타이드에 대한 흑색종 환자에서 유도된 기억 및 드 노보 반응의 특이성을 도시한다. SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H 특이적 T 세포 반응은 상이한 농도(X 축: 0 μM, 0.05 μM, 0.2 μM, 0.8 μM, 및 3.2 μM)에서 돌연변이 또는 야생형 신생항원 펩타이드가 로딩된 DC로 챌린징되었고, 샘플에서 총 CD8+ T 세포의 IFN-γ+ 및/또는 TNFα+ 및/또는 CD107a+가 측정되었으며(Y 축); 두 반응은 0 μM 농도까지 유의한 차이를 나타내며 야생형 신생항원 펩타이드에 반응하지 않는다. 통계 분석: 조정된 p 값에 대한 FDR, P 값s: * ≤ 0.05, *** ≤ 0.001, **** ≤ 0.0001.
도 37A는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 흑색종 환자에서 유도된 기억 반응의 세포독성 프로파일을 도시한다. 그것은 또한 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 도시한다. 돌연변이 또는 야생형 신생항원 형질도입된 종양 세포로 재챌린징함으로써 유도된 CD8+ T 세포 반응의 세포독성 능력을 평가하였다. 형질도입되지 않은 종양 세포(모 A375 주) 또는 200aa 작제물로 형질도입된 종양 세포가 사용되었다. 작제물은 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하였고, 돌연변이는 중앙에 있다. CD8+ T 세포 상의 CD107a 및 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절은 공배양시에 측정되었다. 표적 비율: 3.3:1(SRSF1E>K).
도 37B는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 흑색종 환자에서 유도된 기억 반응의 세포독성 프로파일의 또 다른 예를 도시한다. 그것은 또한 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 도시한다. 돌연변이 또는 야생형 신생항원 형질도입된 종양 세포로 재챌린징함으로써 유도된 CD8+ T 세포 반응의 세포독성 능력을 평가하였다. 형질도입되지 않은 종양 세포(모 A375 주) 또는 200aa 작제물로 형질도입된 종양 세포가 사용되었다. 작제물은 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하였고, 돌연변이는 중앙에 있다. CD8+ T 세포 상의 CD107a 및 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절은 공배양시에 측정되었다. 빨간색 원은 pMHC+ 분율을 강조한다. 효과기: 표적 비율: 5:1(SRSF1E>K). 통계 분석: 비쌍 T 검정, P 값 ** ≤ 0.01, **** ≤ 0.0001.
도 37C는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 흑색종 환자에서 유도된 드 노보 반응의 세포독성 프로파일을 도시한다. 그것은 또한 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같이 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 도시한다. 돌연변이 또는 야생형 신생항원 형질도입된 종양 세포로 재챌린징함으로써 유도된 CD8+ T 세포 반응의 세포독성 능력을 평가하였다. 형질도입되지 않은 종양 세포(모 A375 주) 또는 200aa 작제물로 형질도입된 종양 세포가 사용되었다. 작제물은 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하였고, 돌연변이는 중앙에 있다. CD8+ T 세포 상의 CD107a 및 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절은 공배양시에 측정되었다. 빨간색 원은 pMHC+ 분율을 강조한다. 효과기: 표적 비율: 0.66:1(ARAP1Y>H). 통계 분석: 비쌍 T 검정, P 값 ** ≤ 0.01, **** ≤ 0.0001.
도 38A는 흑색종 환자에서 신생항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 확인을 도시한다. 반응은 돌연변이체 신생항원 펩타이드 로딩된 DC(0.8 μM)로 재챌린징될 때 IFN-γ & TNFα(Y 축)의 생성에 기초하여 확인된다. MKRN1S>L, CREBBPS>L, 및 TPCN1K>E는 양성 반응으로서 확인되었다.
도 38B는 표시된 돌연변이된 펩타이드 및 야생형 펩타이드에 대한 도 38A에 도시된 CD4+ T 세포 반응의 특이성을 도시한다. 확인 연구에서, 도 38A에 나타낸 CD4 T 세포 반응은 상이한 농도(X 축- 0 μM, 0.05 μM, 0.2 μM, 0.8 μM 및 3.2 μM)의 돌연변이 및 야생형 신생항원 펩타이드로 챌린징되었고, 샘플에서 총 CD4+의 IFNγ+ 및/또는 TNFα+(Y 축)가 측정되었다. CD4+ T 세포 반응 중 2개(MKRN1S>L 및 CREEBPS>L)는 0 μM 농도까지 유의한 차이를 나타내고 야생형 신생항원 펩타이드에 반응하지 않지만, TPCN1K>E 반응은 돌연변이 및 야생형 신생항원 펩타이드 모두에 반응성이었다. 통계 분석: 조정된 p 값에 대한 FDR, P 값 <0.05);
도 38C는 1, 2, 3, 또는 4개의 기능의 조합(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα, CD107a 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)에 의해 나타낸 바와 같이, 이들 CD4+ T 세포 반응의 다기능성 프로파일을 도시한다. 돌연변이 신생항원 펩타이드 로딩된 DC(0.8 μm)로 재챌린징함으로써 확인된 CD4+ T 세포 반응의 다기능성이 평가되었다. 파이 차트의 백분율은 백분율 기능적 CD4+ T 세포(1, 2 및/또는 3개의 기능)를 나타낸다. 환자에서 유도된 자극 후 CD4+ T 세포 반응으로부터 생성된 대표적인 데이터가 도시되어 있다.
도 39는 1, 2 또는 3개의 기능의 조합(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα 및 CD107a로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)에 의해 나타낸 바와 같이, 에파카도스타트가 첨가되거나 첨가되지 않은 2명의 건강한 공여자(예컨대, HD66 및 HD63)에서 유도된 기억 반응의 기능성을 도시한다.
도 40은 에파카도스타트가 첨가되거나 첨가되지 않은 6개의 리플리케이트 유도에서 퍼센트 유도된 드 노보 CD8+ T 세포 반응('적중률', 4명의 건강한 공여자에 걸친 평균)을 도시한다.
도 41A는 PD-1 블로킹 항체가 첨가되거나 첨가되지 않은, 본원에 제공된 T 세포 제조 프로토콜로 유도 후 공여자 HD55로부터의 항원 특이적 세포의 절대 수를 도시한다.
도 41B는 PD-1 블로킹 항체가 첨가되거나 첨가되지 않은, 본원에 제공된 T 세포 제조 프로토콜로 유도 후 공여자 HD67로부터의 항원 특이적 세포의 절대 수를 도시한다.
도 42A는 IL-12가 첨가되거나 첨가되지 않은 드 노보 CD8+ T 세포 반응의 pMHC+ CD8+ T 세포의 분율을 도시한다.
도 42B는 IL-12가 첨가되거나 첨가되지 않은 드 노보 CD8+ T 세포 반응 내에서 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다.
도 43은 본원에 기재된 방법의 예를 도시한다. 환자 특이적 신생항원은 바이오인포매틱스 엔진을 사용하여 예측되며, 예측된 신생항원을 커버하는 합성된 긴 펩타이드는 면역원성 능력을 평가하기 위한 면역원으로서 사용된다. 자극 프로토콜은 이들 신생항원 코딩 펩타이드를 환자 유래의 APC에 공급한 다음, 이를 환자 유래의 T 세포와 공배양하여 신생항원 특이적 T 세포를 프라이밍하는 것을 포함한다.
개체의 종양에 고유한 돌연변이 사건으로부터 발생하는 신생항원의 발견에 기초한 신규한 면역치료제 및 이의 용도가 본원에 기재된다. 따라서, 본원에 기재된 본 개시내용은 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 항원 특이적 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 생성하기 위한 방법 및 프로토콜을 제공한다.
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 경우를 설명하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는(including)", "포함하다(includes)", "갖는(having)", "갖다(has)", "갖는(with)", 또는 이의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포함되는 것으로 의도된다.
"포함하다(comprises)", "포함된(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 그것에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예컨대, 이들은 "포함하다(includes)", "포함된(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "본질적으로 구성되다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 그들에 부여된 의미를 가지며, 예컨대, 이들은 명시적으로 언급되지 않은 요소를 허용하지만, 종래 기술에서 발견되는 요소 또는 발명의 기본 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 배제한다. 본원의 어느 것도 보증으로서 의도되지 않는다.
본원의 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 A 및 B 모두; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 바와 같이 용어 "및/또는"은 하기 구현예 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있고, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 일부 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술에서의 실시당 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어는 값의 1 자릿수 이내, 5배 이내, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용 가능한 오류 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.
본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 많은 용어 및 문구가 아래에 정의된다.
"신생항원(neoantigen)"은 단백질에서의 종양 특이적 변화로부터 발생하는 종양 항원의 부류를 지칭한다. 신생항원은, 비제한적으로, 예를 들어, 단백질 서열에서의 치환, 프레임 시프트 돌연변이, 융합 폴리펩타이드, 인-프레임 결실, 삽입, 및 내인성 레트로바이러스 폴리펩타이드의 발현으로부터 발생하는 종양 항원을 포함한다.
"신생에피토프(neoepitope)"는 비질환 세포, 예컨대, 비암성 세포 또는 생식계열 세포와 같이 참조에 존재하지 않지만, 질환 세포, 예컨대, 암 세포에서 발견되는 에피토프를 지칭한다. 이것은 상응하는 에피토프가 정상적인 비질환 세포 또는 생식계열 세포에서 발견되지만, 질환 세포, 예컨대, 암 세포에서의 하나 이상의 돌연변이로 인해, 에피토프의 서열이 신생에피토프를 초래하도록 변경되는 상황을 포함한다.
"참조"는 병에 걸린 표본으로부터 본 개시내용의 방법에서 수득된 결과를 상관 및/또는 비교하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, "참조"는 하나 이상의 정상 표본, 특히 하나의 개체 또는 하나 이상의 상이한 개체(예컨대, 건강한 개체), 예컨대 동일한 종의 개체로부터 수득된 질환에 의해 영향을 받지 않는 표본에 기초하여 수득될 수 있다. "참조"는 충분히 많은 수의 정상 표본을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.
"돌연변이"는 참조 핵산과 비교하여 핵산 서열의 변화 또는 차이(예컨대, 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실)를 지칭한다. "체세포 돌연변이"는 생식 세포(정자 및 난자)를 제외한 신체의 임의의 세포에서 발생할 수 있고 어린이에게 전달되지 않는다. 이들 변이는 암 또는 다른 질환을 유발할 수 있다(하지만, 항상 그런 것은 아님). 일부 구현예에서, 돌연변이는 비동의어 돌연변이이다. "비동의어 돌연변이(non-synonymous mutation)"는 번역 생성물에서 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화를 초래하는 돌연변이(예컨대, 뉴클레오타이드 치환)을 지칭한다. "프레임시프트"는 돌연변이가 유전자의 코돈 주기성("리딩 프레임"으로도 공지됨)의 정상 단계를 파괴하여 비천연 단백질 서열의 번역을 초래할 때 발생한다. 유전자에서의 상이한 돌연변이가 동일한 변경된 리딩 프레임을 달성할 수 있다.
용어 "친화성"은 결합 쌍의 2개의 구성원(예컨대, 인간 백혈구 항원(HLA)-결합 펩타이드 및 클래스 I 또는 II HLA, 또는 펩타이드-HLA 복합체 및 T 세포 수용체(TCR)) 사이의 결합 강도의 측정값을 지칭한다. KD는 결합 쌍의 2개의 구성원 사이의 해리 상수를 지칭하며 몰농도의 단위를 갖는다. KA는 결합 쌍의 2개의 구성원 사이의 친화성 상수를 지칭하며, 해리 상수의 반대이다. 친화성은 상업적으로 이용가능한 Biacore SPR 단위를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. Koff는 결합 쌍의 2개의 구성원의 오프-레이트 상수(예컨대, HLA-결합 펩타이드 및 클래스 I 또는 II HLA, 또는 펩타이드-HLA 복합체 및 TCR의 오프-레이트 상수)를 지칭한다. Kon은 결합 쌍의 2개의 구성원의 온-레이트 상수(예컨대, HLA-결합 펩타이드 및 클래스 I 또는 II HLA, 또는 펩타이드-HLA 복합체 및 TCR의 온-레이트 상수)를 지칭한다.
본 개시 전반에 걸쳐, "결합 데이터" 결과는 "IC50"의 측면에서 표현될 수 있다. 친화성은 또한 억제 농도 50(IC50), 또는 결합 쌍의 제1 구성원(예컨대, 펩타이드)의 50%가 교체되는 농도로서 표현될 수 있다. 마찬가지로, ln(IC50)은 IC50의 자연 로그를 지칭한다. 예를 들어, IC50은 표지된 참조 펩타이드의 결합의 50% 억제가 관찰되는 결합 어세이에서의 시험된 펩타이드의 농도일 수 있다. 어세이이 수행되는 조건(예컨대, 제한적인 HLA 단백질 농도 및/또는 표지된 참조 펩타이드 농도)을 고려할 때, 이들 값은 KD 값에 근접할 수 있다. 결합을 측정하기 위한 어세이는 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, PCT 공개 WO 제94/20127호 및 WO 제94/03205호, 및 다른 공개, 예컨대 문헌[Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995); and Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994)]에 상세히 기재되어 있다. 대안적으로, 결합은 참조 표준 펩타이드에 의한 결합과 비교하여 표현될 수 있다. 결합은 또한 생존 세포(예컨대, Ceppellini et al., Nature 339:392(1989); Christnick et al., Nature 352:67(1991); Busch et al., Int. Immunol. 2:443(1990); Hill et al., J. Immunol. 147:189(1991); del Guercio et al., J. Immunol. 154:685(1995)), 세제 용해물을 사용하는 무세포 시스템(예컨대, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069(1991)), 고정화된 정제된 MHC(예컨대, Hill et al., J. Immunol. 152, 2890(1994); Marshall et al., J. Immunol. 152:4946(1994)), ELISA 시스템(예컨대, Reay et al., EMBO J. 11:2829(1992)), 표면 플라즈몬 공명(예컨대, Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425(1993)); 고 플럭스 가용성 상 어세이(Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353(1994)), 및 클래스 I MHC 안정화 또는 어셈블리의 측정(예컨대, Ljunggren et al., Nature 346:476(1990); Schumacher et al., Cell 62:563(1990); Townsend et al., Cell 62:285(1990); Parker et al., J. Immunol. 149:1896(1992))을 사용하는 것을 포함하는 다른 어세이 시스템을 사용하여 결정될 수 있다.
에피토프를 논의하는 데 사용될 때 용어 "유래된"은 "제조된"에 대한 동의어이다. 유래된 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 그것은 당업계의 표준 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 합성 에피토프는 인공 아미노산 잔기 "아미노산 모방체," 예컨대 자연발생 L 아미노산 잔기의 D 이성질체 또는 비자연 아미노산 잔기, 예컨대 사이클로헥실알라닌을 포함할 수 있다. 유래된 또는 제조된 에피토프는 천연 에피토프의 유사체일 수 있다. 용어 "로부터 유래된"은 기원 또는 공급원을 지칭하며, 자연발생, 재조합, 정제되지 않은, 정제된 또는 분화된 분자 또는 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포는 T 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 확장되거나 유도된 항원 특이적 T 세포는 생물학적 샘플에서 항원 특이적 T 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 성숙 APC(예컨대, 전문 APC)는 성숙되지 않은 APC(예컨대, 미성숙한 APC)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, APC는 단핵구(예컨대, CD14+ 단핵구)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 단핵구(예컨대, CD14+ 단핵구)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, APC는 골수 세포로부터 유래될 수 있다.
"에피토프"는 또 다른 분자(예컨대, 면역글로불린, T 세포 수용체, HLA 분자, 또는 키메라 항원 수용체)에 의해 인식되는 부위를 함께 형성하는 분자의 집합적인 특징(예컨대, 펩타이드의 전하 및 1차, 2차 및 3차 구조)이다. 예를 들어, 에피토프는 특정 면역글로불린에 의한 인식에 관여하는 아미노산 잔기의 세트; 주조직적합 복합체(MHC) 수용체; 또는 T 세포의 문맥에서, T 세포 수용체 단백질 및/또는 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 잔기일 수 있다. 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리에 의해 제조될 수 있거나, 또는 이들은 당업계의 표준 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 합성 에피토프는 인공 아미노산 잔기, 아미노산 모방체(예컨대, 자연발생 L 아미노산 잔기 또는 비자연발생 아미노산 잔기의 D 이성질체)를 포함할 수 있다. 본 개시 전반에 걸쳐, 에피토프는 일부 경우에 펩타이드 또는 펩타이드 에피토프로 지칭될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드의 길이에 제한이 있다. 본원에 기재된 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩타이드가 천연 서열과 100% 동일성을 갖는 영역(즉, 연속된 일련의 아미노산 잔기)을 포함하는 경우 길이 제한된 구현예가 발생한다. 예컨대, 전체 천연 분자에 대한 판독으로부터 에피토프의 정의를 피하기 위해, 천연 펩타이드 서열과 100% 동일성을 갖는 임의의 영역의 길이에 제한이 있다. 따라서, 본원에 기재된 에피토프 및 천연 펩타이드 서열과 100% 동일성을 갖는 영역의 경우, 천연 서열과 100% 동일성을 갖는 영역은 일반적으로 600개 이하의 아미노산 잔기, 500개 이하의 아미노산 잔기, 400개 이하의 아미노산 잔기, 250개 이하의 아미노산 잔기, 100개 이하의 아미노산 잔기, 85개 이하의 아미노산 잔기, 75개 이하의 아미노산 잔기, 65개 이하의 아미노산 잔기, 및 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 "에피토프"는 5개 아미노산 잔기까지 임의의 증분으로, 천연 펩타이드 서열과 100% 동일성을 갖는 51개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 영역을 갖는 펩타이드로 구성된다.
"T 세포 에피토프"는 펩타이드-MHC(pMHC) 복합체 형태의 MHC 분자에 의해 결합된 펩타이드 서열을 지칭한다. 펩타이드-MHC 복합체는 T 세포(예컨대, 세포독성 T-림프구 또는 T-헬퍼 세포)의 TCR에 의해 인식되고 결합될 수 있다.
"T 세포"는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 용어 T 세포는 또한 T 헬퍼 1 유형 T 세포 및 T 헬퍼 2 유형 T 세포를 포함한다.
"면역 세포"는 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 지칭한다. 면역 세포는 조혈 기원이며, 림프구, 예컨대 B 세포 및 T 세포; 자연 살해 세포; 골수 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구를 포함한다.
"면역원성" 펩타이드 또는 "면역원성" 에피토프 또는 "면역원성" 펩타이드 에피토프는 HLA 분자에 결합하고 세포 매개 또는 체액 반응, 예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응, 헬퍼 T 림프구(HTL) 반응 및/또는 B 림프구 반응을 유도하는 펩타이드이다. 본원에 기재된 면역원성 펩타이드는 HLA 분자에 결합할 수 있고 이후 펩타이드에 대한 세포 매개 또는 체액 반응(예컨대, CTL(세포독성) 반응, 또는 HTL 반응)을 유도할 수 있다.
"보호 면역 반응" 또는 "치료 면역 반응"은 병원성 항원(예컨대, 종양 항원)으로부터 유래된 항원에 대한 CTL 및/또는 HTL 반응을 지칭하며, 이는 어떤 식으로든 질환 증상, 부작용 또는 진행을 예방하거나 적어도 부분적으로 정지시킨다. 면역 반응은 또한 헬퍼 T 세포의 자극에 의해 촉진된 항체 반응을 포함할 수 있다.
"T 세포 수용체"("TCR")는, 천연 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 생산되었든 간에, 주조직적합 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 T 림프구(T 세포)의 표면에서 발견되는 분자를 지칭한다. 다양한 질환(예컨대, 암) 또는 감염성 유기체와 관련된 항원을 인식하는 T 세포의 능력은 알파(α) 사슬 및 베타(β) 사슬 또는 감마(γ) 및 델타(δ) 사슬 모두로 구성된 그의 TCR에 의해 부여된다. 이들 사슬을 구성하는 단백질은 TCR의 엄청난 다양성을 생성하기 위한 독특한 메커니즘을 사용하는 DNA에 의해 코딩된다. 이러한 다중-서브유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합하고 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에 MHC 클래스 I 및 II 단백질에 의해 제시된 펩타이드에 결합한다. APC 상의 펩타이드에 대한 TCR의 결합은 T 세포 활성화에서 중요한 사건이다.
본원에 사용된 바와 같이, "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역글로불린 항원 결합 도메인(예컨대, 면역글로불린 가변 도메인) 및 T 세포 수용체(TCR) 불변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, TCR 폴리펩타이드의 "불변 도메인"은 막-근위 TCR 불변 도메인, TCR 막관통 도메인 및/또는 TCR 세포질 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 TCRβ 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 단량체이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 TCRβ 또는 TCRα 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인(예컨대, κ 또는 λ 가변 도메인)을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이량체이다.
"주조직적합 복합체" 또는 "MHC"는 생리적 면역 반응을 담당하는 세포 상호작용을 제어하는 역할을 하는 유전자의 클러스터이다. 용어 "주조직적합 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자와 같은 MHC 분자의 임의의 클래스를 포함할 수 있고, 모든 척추동물에서 발생하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. 인간에서, MHC 복합체는 또한 인간 백혈구 항원(HLA) 복합체로 알려져 있다. 따라서, "인간 백혈구 항원" 또는 "HLA"는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 단백질을 지칭한다(예컨대, Stites, et al., Immunology, 8TH Ed., Lange Publishing, Los Altos, Calif.(1994). MHC 및 HLA 복합체의 상세한 설명을 위해, 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd Ed., Raven Press, New York(1993)]을 참고한다.
게놈에서의 주조직적합 복합체는 세포 표면 상에서 발현된 유전자 생성물이 내인성 및/또는 외래 항원에 결합하고 이를 제시하는데 중요하고 따라서 면역 과정을 조절하는데 중요한 유전적 영역을 포함한다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구 및 항원 제시 세포 또는 병에 걸린 세포 사이의 신호전달에 중요하다. MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드에 결합하고 T-세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고, 자기-항원(세포 자체로부터의 펩타이드 단편) 및 비자기-항원(예컨대, 침입 미생물의 단편) 모두를 T-세포에 디스플레이할 수 있다. MHC 결합 펩타이드는 단백질 항원의 단백질 분해 절단으로부터 비롯될 수 있고 잠재적인 림프구 에피토프(예컨대, T 세포 에피토프 및 B 세포 에피토프)를 나타낼 수 있다. MHC는 펩타이드를 세포 표면으로 수송하고 그곳에서 이들을 특이적 세포, 예컨대 세포독성 T-림프구, T-헬퍼 세포, 또는 B 세포에 제시할 수 있다. MHC 영역은 3개의 하위그룹인 클래스 I, 클래스 II, 및 클래스 III으로 나뉠 수 있다. MHC 클래스 I 단백질은 α-사슬 및 β2-마이크로글로불린(염색체 15에 의해 코딩된 MHC의 일부가 아님)을 함유할 수 있다. 이들은 항원 단편을 세포독성 T-세포에 제시할 수 있다. MHC 클래스 II 단백질은 α- 및 β-사슬을 함유할 수 있고, 이들은 항원 단편을 T-헬퍼 세포에 제시할 수 있다. MHC 클래스 III 영역은 보체 구성요소 및 사이토카인과 같은 다른 면역 구성요소를 코딩할 수 있다. MHC는 다유전자성(몇 가지 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 유전자가 있음) 및 다형성(각 유전자의 다수의 대립유전자가 있음)일 수 있다.
"항원 가공" 또는 "가공"은 폴리펩타이드 또는 항원을 상기 폴리펩타이드 또는 항원의 단편인 가공 생성물로 분해하는 것(예컨대, 폴리펩타이드의 펩타이드로의 분해) 및 세포, 예를 들어, 항원 제시 세포에 의해 특이적 T 세포에게 제시하기 위해 하나 이상의 이들 단편을 MHC 분자와 회합시키는 것(예컨대, 결합을 통해)을 지칭한다.
"항원 제시 세포"(APC)는 그의 세포 표면 상에 MHC 분자와 관련된 단백질 항원의 펩타이드 단편을 제시하는 세포를 지칭한다. 용어는 전문 항원 제시 세포(예컨대, B 림프구, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포) 뿐만 아니라 다른 항원 제시 세포(예컨대, 케라티노사이트, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포, 희돌기교세포)를 포함한다.
"수용체"는 리간드에 결합할 수 있는 생물학적 분자 또는 분자 그룹을 지칭한다. 수용체는 세포, 세포 형성 또는 유기체에서 정보를 전달하는 역할을 할 수 있다. 수용체는 적어도 하나의 수용체 단위를 포함하고, 예를 들어, 각각의 수용체 단위는 단백질 분자로 구성될 수 있다. 수용체는 리간드의 구조를 보완하는 구조를 가지며 결합 파트너로서 리간드와 복합체화될 수 있다. 정보는 특히 세포의 표면 상에서 리간드의 착물화 후 수용체의 입체형태 변화에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 수용체는 특히 리간드, 특히 적합한 길이의 펩타이드 또는 펩타이드 단편과 수용체/리간드 복합체를 형성할 수 있는 MHC 클래스 I 및 II의 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "리간드"는 수용체의 구조에 상보적인 구조를 갖고 이 수용체와 복합체를 형성할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 리간드는 그의 아미노산 서열에서 적합한 길이 및 적합한 결합 모티프를 갖는 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 의미하는 것으로 이해되어야 되며, 이로써 펩타이드 또는 펩타이드 단편은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 단백질과 같은 MHC 단백질과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, "수용체/리간드 복합체"는 또한 펩타이드- 또는 펩타이드 단편-제시 MHC 분자, 예컨대 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자를 포함하는, "수용체/펩타이드 복합체" 또는 "수용체/펩타이드 단편 복합체"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"천연" 또는 "야생형" 서열은 자연에서 발견되는 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "자연발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고, 자연에서의 공급원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연발생이다.
용어 "펩타이드" 및 "펩타이드 에피토프"는, 전형적으로 인접한 아미노산 잔기의 α-아미노 및 카르복실기 사이의 펩타이드 결합에 의해, 서로 연결된 일련의 잔기를 나타내기 위해 본 명세서에서 "올리고펩타이드"와 상호교환적으로 사용된다. "합성 펩타이드"는 비천연 공급원으로부터 수득된, 예컨대, 인공인 펩타이드를 지칭한다. 이러한 펩타이드는 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술과 같은 방법을 사용하여 생산될 수 있다. "합성 펩타이드"는 "융합 단백질"을 포함한다.
용어 "모티프"는 정의된 길이의 아미노산 서열, 예를 들어, 클래스 I HLA 모티프에 대해 약 15개 미만의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 13개 미만의 아미노산 잔기 길이, 예를 들어, 약 8 내지 약 13개의 아미노산 잔기(예컨대, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개) 및 클래스 II HLA 모티프에 대해 약 6 내지 약 25개의 아미노산 잔기(예컨대, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개)의 펩타이드의 펩타이드에서 잔기의 패턴을 지칭하며, 이는 특정 HLA 분자에 의해 인식된다. 모티프는 전형적으로 주어진 인간 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 각각의 HLA 단백질에 대해 상이하다. 이들 모티프는 1차 및 2차 앵커 잔기의 이들의 패턴이 상이하다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 모티프는 7, 8 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 잔기 길이의 펩타이드를 식별한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 모티프는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 아미노산 잔기 길이의 펩타이드를 식별한다. "교차 반응성 결합" 펩타이드는 결합 쌍 구성원의 클래스의 하나 초과의 구성원에 결합하는 펩타이드(예컨대, 클래스 I HLA 분자 및 클래스 II HLA 분자 모두에 의해 결합된 펩타이드)를 지칭한다.
용어 "잔기"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방체에 의해 펩타이드 또는 단백질 내로 도입되거나, 또는 핵산(DNA 또는 RNA)에 의해 코딩된 아미노산 잔기 또는 아미노산 모방체 잔기를 지칭한다. 펩타이드 또는 단백질을 기술하기 위해 사용된 명명법은 종래의 관행을 따른다. 아미노기는 각 아미노산 잔기의 좌측(아미노- 또는 N-말단)에 제시되고 카르복실기는 우측(카르복시- 또는 C-말단)에 제시된다. 아미노산 잔기 위치가 펩타이드 에피토프에서 언급될 때, 이들은 아미노에서 카르복실 방향으로 번호가 매겨지며, 첫 번째 위치는 에피토프의 아미노 말단에 위치한 잔기이거나, 또는 그것이 일부일 수 있는 펩타이드 또는 단백질이다. 본 발명의 선택된 특정 구현예를 나타내는 식에서, 아미노- 및 카르복실-말단기는, 명시적으로 표시되지 않았음에도 불구하고, 달리 명시되지 않는 한, 생리학적 pH 값에서 추정될 형태이다. 아미노산 구조 식에서, 각각의 잔기는 일반적으로 표준 3문자 또는 단일 문자 지정에 의해 표시된다. 아미노산 잔기의 L-형태는 대문자 단일 글자 또는 3문자 기호의 대문자 첫 번째 글자에 의해 표시되며, D-형태를 갖는 아미노산 잔기에 대한 D-형태는 소문자 단일 글자 또는 소문자 3문자 기호에 의해 표시된다. 그러나, 3문자 기호 또는 전체 이름이 대문자 없이 사용되는 경우, 이들은 L 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 글리신은 비대칭 탄소 원자를 갖지 않으며 간단히 "Gly" 또는 "G"로 지칭된다. 본원에 제시된 펩타이드의 아미노산 서열은 일반적으로 표준 단일 문자 기호를 사용하여 지정된다(A, 알라닌; C, 시스테인; D, 아스파트산; E, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H, 히스티딘; I, 이소류신; K, 리신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; 및 Y, 티로신).
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되어 있으며, 이는 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존적 치환이다. 펩타이드 기능을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다.
"약학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 비독성, 불활성, 및/또는 생리학적으로 양립가능한 조성물 또는 조성물의 구성요소를 지칭한다. "약학적 부형제" 또는 "부형제"는 보조제, 담체, pH-조절 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제, 보존제 등과 같은 물질을 포함한다. "약학적 부형제"는 약학적으로 허용 가능한 부형제이다.
본 개시내용에 따르면, 용어 "백신"은 투여시에 암 세포와 같은 병원체 또는 병에 걸린 세포를 인식하고 공격하는 면역 반응, 예를 들어, 세포 또는 체액 면역 반응을 유도하는 약학적 제제(약학 조성물) 또는 생성물에 관한 것이다. 백신은 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 용어 "개별화 암 백신" 또는 "개인맞춤형 암 백신" "개인형 암 백신"은 특정 암 환자와 관련되며, 암 백신이 개별 암 환자의 요구 또는 특수 상황에 맞춰 조정된다는 것을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA, 예를 들어, mRNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 시험관내에서 전사된 mRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 투여되는 폴리뉴클레오타이드는 mRNA이다.
용어 "단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 물질을 일반적으로 수반하는 구성요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서, 본원에 기재된 단리된 펩타이드는 일반적으로 이들의 원위치(in situ) 환경에서 펩타이드와 관련된 물질의 일부 또는 모두를 함유하지 않는다. 예를 들어, "단리된" 에피토프는 에피토프가 유래된 단백질의 전체 서열을 포함하지 않는 에피토프일 수 있다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연발생 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 "단리된다". 단리된 RNA 분자는 본원에 기재된 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함하고, 합성적으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉, 오염물이 없음), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"는 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않으면서 최대 대응성을 위해 비교되고 정렬될 때(필요한 경우, 갭 도입), 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열 또는 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 수득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업계에 널리 알려져 있다. 이들은, 비제한적으로, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, 및 이의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 최대 대응성을 위해 비교 및 정렬될 때, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 구현예에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 동일성은 적어도 약 10개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40-60개의 잔기, 적어도 약 60-80개의 잔기 길이 또는 이들 사이의 임의의 정수 값인 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 구현예에서, 동일성은 60-80개의 잔기보다 더 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-100개의 잔기에 걸쳐 존재하며, 일부 구현예에서 서열은 펩타이드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 코딩 영역과 같이, 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
용어 "대상체"는 특정 치료의 수용자가 될, 비제한적으로, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하는, 임의의 동물(예컨대, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "치료적 효과"는 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 치료제의 양을 지칭한다. 약물의 치료적 유효량은 치료 효과를 가지며, 따라서 질환 또는 장애의 발달을 예방하고; 질환 또는 장애의 발달을 늦추고; 질환 또는 장애의 진행을 늦추고; 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감하고; 이환율 및 사망률을 감소시키고; 삶의 질을 개선하고; 또는 이러한 효과의 조합을 달성할 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하는 것" 또는 "완화시키는" 또는 "완회시키는 것"은 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애의 증상을 치유하고, 늦추고, 줄이고/거나 이의 진행을 중지시키는 치료적 조치 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 예방하거나 늦추는 예방 조치 모두를 지칭한다. 따라서 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 장애가 있는 사람들; 장애를 갖기 쉬운 사람들; 및 장애가 예방되는 사람들을 포함한다.
세포 샘플(예컨대, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플)을 기술하기 위해 사용될 때 용어 "고갈된"은 세포의 하위집단이 제거되거나 고갈된 세포 샘플을 지칭한다. 예를 들어, CD25 발현 세포가 고갈된 면역 세포 샘플은 CD25 발현 세포가 제거되거나 고갈된 면역 세포 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 결합제는 샘플로부터 하나 이상의 세포 또는 세포 유형을 제거하거나 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CD14+ 세포는, 예컨대 CD14에 결합하는 항체를 사용하여, PBMC 샘플로부터 고갈되거나 제거될 수 있다.
"자극"은 자극 분자와 그의 동족 리간드와의 결합에 의해 유도되어 신호 전달 사건을 매개하는 반응을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 자극은 T 세포의 TCR이 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 자극은 PBMC가 펩타이드 로딩된 APC와 함께 배양되는 프로토콜 1 또는 프로토콜 2 내의 단계를 지칭할 수 있다.
용어 "농축된"은 대상 종의 농도가 농축 없이 최종 생성물에서 종의 자연발생 수준보다 실질적으로 더 높도록 대상 종이 부분적으로 정제된 조성물 또는 분획을 지칭한다. 용어 "유도된 세포"는 세포의 단백질 발현, 유전자 발현, 분화 상태, 모양, 형태학, 생존력 등에 영향을 미치는 유도 화합물, 세포, 또는 세포의 집단으로 처리된 세포를 지칭한다.
T 세포 요법 및 이의 제조의 개요
T 세포(예컨대, 자가 T 세포)의 제어된 생체외 유도 또는 확장에 의해 항원 특이적 T 세포를 생성하는 것은 매우 특이적이고 유익한 T 세포 요법(예컨대, 입양 T 세포 요법)을 제공할 수 있다. 본 개시내용은 암 및 다른 병태, 질환 및 장애를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있는 T 세포 제조 방법 및 치료용 T 세포 조성물을 제공한다. 목적은 유리한 표현형 및 기능을 갖는 항원 특이적 T 세포를 확장시키고 유도하는 것이다. 본 개시내용은 항원 특이적 T 세포 요법(예컨대, 개인형 또는 개인맞춤형 T 세포 요법)에 사용될 수 있는 T 세포의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 제공된 T 세포 조성물은 개인형 항원 특이적 T 세포 요법일 수 있다.
T 세포를 자극시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 T 세포를 확장시키거나 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 기억 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 나이브 T 세포를 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 CD8+ 기억 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포를 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 CD4+ 기억 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 항원 특이적 CD4+ 나이브 T 세포를 유도하는 데 사용될 수 있다. 항원 특이적 T 세포를 포함하는 치료용 조성물이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 치료용 조성물은 항원 특이적 기억 T 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료용 조성물은 항원 특이적 나이브 T 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 치료용 조성물을 사용하는 사용 방법 또는 치료 방법이 또한 본원에 제공된다.
T 세포 조성물
면역 세포의 집단을 포함하는 조성물(예컨대, 약학 조성물)이 본원에 제공된다. 조성물은 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함할 수 있다. 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 항원 펩타이드가 미리 로딩된 APC와 같은 APC에 의해 자극된 T 세포를 포함한다. 조성물은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 포함할 수 있고, T 세포는 APC 자극된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 사이토카인, 성장 인자 또는 리간드, 예컨대 APC 또는 T 세포의 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드와 함께 인큐베이션된 면역 세포의 집단을 포함한다. 이러한 사이토카인, 성장 인자 및 리간드의 비제한적인 예는, 비제한적으로, GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 폴리I:C를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 APC 또는 APC 제제와 함께 인큐베이션된 면역 세포의 집단을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 사이토카인, 성장 인자 및/또는 리간드 자극된 APC 또는 사이토카인, 성장 인자 및/또는 리간드 자극된 APC 제제와 함께 인큐베이션된 면역 세포의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 사이토카인 자극된 APC 또는 사이토카인 자극된 APC 제제와 함께 인큐베이션된 면역 세포의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 성장 인자 자극된 APC 또는 성장 인자 자극된 APC 제제와 함께 인큐베이션된 면역 세포의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 리간드 자극된 APC 또는 리간드 자극된 APC 제제와 함께 인큐베이션된 면역 세포의 집단을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, APC는 자가 APC, 동종이계 APC, 또는 인공 APC이다. 일부 구현예에서, APC는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC는 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 말초 혈액, 또는 제대혈로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다. 예를 들어, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 단리되거나, 농축되거나, 또는 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된다.
일부 구현예에서, CD14+ APC의 단리된 집단은 농축되거나 실질적으로 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, CD14+ APC의 단리된 집단은 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 균질하다. 일부 구현예에서, CD14+ APC의 단리된 집단은 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 균질하다. APC, 예컨대 CD14+ APC는, 예를 들어, 단핵구성 수지상 전구체로부터의 배양에서 유래된 APC뿐만 아니라 예를 들어, 말초 혈액, 제대혈, 피부, 비장, 골수, 흉선, 및 림프절과 같은 조직에 존재하는 내인성으로 유래된 APC를 포함할 수 있다.
CD14+ APC 및 CD14+ APC가 실질적으로 농축된 세포 집단은 또한 본 발명에 의해 제공되는 방법에 의해 단리될 수 있다. 방법은 일반적으로 APC 전구체를 포함하는 세포의 집단의 수득, APC 전구체의 미성숙한 또는 성숙한 APC로의 분화를 포함하고, 또한 분화된 미성숙한 또는 성숙한 APC의 집단으로부터 CD14+ APC의 단리를 포함할 수 있다.
APC 전구체 세포는 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. APC 전구체는, 예를 들어, 밀도 구배 분리, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 면역학적 세포 분리 기술, 예컨대 패닝(panning), 보체 용해(complement lysis), 로제팅(rosetting), 자기 세포 분리 기술, 나일론 울 분리, 및 이러한 방법의 조합에 의해 단리될 수 있다. APC를 면역 선택하는 방법은, 예를 들어, APC 전구체와 관련된 세포 표면 마커에 대한 항체, 예컨대 기질에 커플링된 항-CD34 및/또는 항-CD14 항체를 사용하는 것을 포함한다.
APC 전구체의 농축된 집단이 또한 수득될 수 있다. 이러한 농축된 전구체 집단을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, APC 전구체의 농축된 집단은 기질에 부착하는 세포의 선택적 제거에 의해 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 예컨대, 골수 또는 말초 혈액과 같은 조직 공급원을 사용하여, 부착성 단핵구는 상업적으로 처리된 플라스틱 기질(예컨대, 비드 또는 자성 비드)을 사용하여 세포 제제로부터 제거되어 비부착성 APC 전구체가 농축된 집단을 수득할 수 있다.
단핵구 APC 전구체는 또한 APC 전구체-부착 기질을 사용하여 조직 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 백혈구성분채집술에 의해 단리된 말초 혈액 백혈구 높은 표면적 대 부피 비율을 갖는 단핵구성 APC 전구체-부착 기질과 접촉되고, 부착성 단핵구성 APC 전구체가 분리된다. 추가의 구현예에서, 커플링된 기질은, 예를 들어, 마이크로비드, 마이크로캐리어 비드, 펠렛, 과립, 분말, 모세관, 미세융모 막 등과 같은 높은 표면-대-부피 비율을 갖는 미립자 또는 섬유질 기질일 수 있다. 또한, 미립자 또는 섬유질 기질은 유리, 폴리스티렌, 플라스틱, 유리 코팅된 폴리스티렌 마이크로비드 등일 수 있다.
APC 전구체는 또한 분화 및/또는 확장을 위해 시험관내에서 배양될 수 있다. APC 전구체의 분화/확장 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 확장은 APC(예컨대, 수지상 세포) 분화/증식을 유도하는 적어도 하나의 사이토카인의 존재하에 전구체를 배양함으로써 달성될 수 있다. 전형적으로, 이들 사이토카인은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)이다. 또한, 다른 제제가 배양에서 비-APC 세포 유형의 증식 및/또는 성숙을 억제하여, APC 전구체의 집단을 추가로 농축하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 제제는, 예컨대, IL-13, IL-4, 또는 IL-15 등과 같은 사이토카인을 포함한다.
APC 전구체의 단리된 집단은 미성숙한 또는 성숙한 APC를 수득하기 위해 배양 및 분화된다. 적합한 조직 배양 배지는, 예를 들어, 비제한적으로, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® 등을 포함한다. 조직 배양 배지는 전형적으로 APC 표현형으로의 전구체의 분화를 촉진하기 위해 아미노산, 비타민, 2가 양이온, 및 사이토카인이 보충된다. 전형적으로, 분화 촉진 사이토카인은 GM-CSF 및/또는 IL-4이다.
또한, APC 표현형으로의 확장, 분화, 및 성숙 동안 APC 전구체의 배양은 CD14+ APC의 발달을 촉진하기 위해 혈장을 포함할 수 있다. 전형적인 혈장 농도는 약 5%이다. 또한, 예를 들어, APC 전구체가 기질에의 부착에 의해 단리되는 경우, 배양 초기에 CD14+ 표현형을 촉진하기 위해 부착 단계 동안 배양 배지에 혈장이 포함될 수 있다. 부착 동안 전형적인 혈장 농도는 약 1% 이상이다.
단핵구성 APC 전구체는 임의의 적합한 시간 동안 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 전구체가 미성숙한 APC로 분화하기 위한 적합한 배양 시간은 약 1 내지 약 10일, 예컨대, 약 4 내지 약 7일일 수 있다. 전구체로부터 미성숙한 APC의 분화는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 세포 표면 마커(예컨대, CD11c+, CD83low, CD86-/low, HLA-DR+)의 존재 또는 부재에 의해 모니터링될 수 있다. 미성숙한 APC는 또한 미성숙한 APC를 추가적인 분화 또는 항원 흡수, 가공 및 제시를 위한 상태로 유지하기 위해 적절한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 미성숙한 APC는 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 유지될 수 있다.
APC 전구체로부터의 분화 후, CD14+ 세포는 단리되어 CD14+ APC의 단리된 집단을 수득할 수 있다. 전형적으로, 성숙되기 전에 CD14+ APC가 농축되거나 실질적으로 농축된 APC로부터 단리되는 경우, 단리된 집단은 미성숙한 CD14+ APC가 농축되거나 실질적으로 농축될 것이다. 일반적으로, CD14+ APC의 단리는 CD14+ 세포가 단리될 세포 집단을 CD14 특이적 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 예시적인 구현예에서, CD14 발현 세포는 형광 분자(예컨대, FITC 또는 PE)에 직접 접합된 CD14 특이적 프로브를 사용하여 또는 CD14에 특이적인 비표지된 항체 및 제1 항체에 특이적인 표지된 제2 항체를 이용하여 FACS에 의해 검출된다. CD14+ 세포는 또한 FACS 분류에 의해 CD14low 및 CD14- 세포로부터 분리될 수 있다. CD14high 양성에 대한 게이팅은, 예컨대, PBMC 유래된 단핵구 상에서의 CD14 염색과 관련하여 결정될 수 있다. 전형적으로, CD14 특이적 결합제는, 예를 들어, 항-CD14 항체(예컨대, 단클론 또는 이의 항원 결합 단편)이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 많은 항-CD14 항체는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 다수는 상업적으로 구입할 수 있다.
또 다른 구현예에서, CD14 특이적 프로브는 기질에 커플링되고 CD14+ 세포는 친화성 선택에 의해 단리된다. CD14+ 세포를 포함하는 세포의 집단은 커플링된 기질에 노출되고, CD14+ 세포는 특이적으로 부착된다. 이후, 비-부착성 CD14- 세포는 기질로부터 세척된 다음, 부착성 세포가 용리되어 CD14+ APC가 실질적으로 농축된 단리된 세포 집단을 수득한다. CD14 특이적 프로브는, 예를 들어, 항-CD14 항체일 수 있다. 기질은, 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 조직 배양 플레이트 또는 비드(예컨대, 유리 또는 자성 비드)일 수 있다. 표면 마커에 특이적인 기질 커플링된 항체를 사용한 세포 집단의 친화성 단리 방법은 일반적으로 공지되어 있다.
배양 동안, 미성숙한 APC(CD14- 미성숙한 APC의 단리된 집단 또는 단리 전의 총 미성숙한 APC)는 선택적으로 미리 결정된 항원에 노출될 수 있다. 적합한 미리 결정된 항원은 T-세포 조절이 요구되는 임의의 항원을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 미성숙한 APC는 암 면역요법 및/또는 종양 성장 억제를 위해 전립선 특이적 막 항원(PSMA)의 존재 하에 배양된다. 다른 항원은, 예를 들어, 박테리아 세포, 바이러스, 부분적으로 정제된 또는 정제된 박테리아 또는 바이러스 항원, 종양 세포, 종양 특이적 또는 종양 관련 항원(예컨대, 종양 세포 용해물, 종양 세포 막 제제, 종양으로부터 단리된 항원, 융합 단백질, 리포좀 등), 그의 표면 상에 항원을 발현하는 재조합 세포, 자가항원, 및 임의의 다른 항원을 포함할 수 있다. 임의의 항원은 또한 펩타이드 또는 재조합으로 생산된 단백질 또는 이의 부분으로서 제시될 수 있다. 항원과 접촉 후, 세포는 항원 흡수 및 가공을 허용하고 항원 특이적 APC의 집단을 확장시키는 것 등을 위해 임의의 적합 시간 동안 배양될 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 미성숙한 APC는 미성숙한 APC를 MHC 분자의 문맥에서 항원을 제시하는 성숙한 APC로의 성숙을 촉진하기 위해 항원 흡수 후에 배양될 수 있다. APC 성숙 방법은 공지되어 있다. 이러한 성숙은, 예를 들어, 공지된 성숙 인자, 예컨대 사이토카인(예컨대, TNF-α, IL-1β, 또는 CD40 리간드), 박테리아 생성물(예컨대, LPS 또는 BCG) 등의 존재하에 배양에 의해 수행될 수 있다. 미성숙한 APC의 성숙한 APC로의 성숙은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 세포 표면 마커의 존재 또는 부재(예컨대, CD83, CD86, 및 MHC 분자의 상향조절)의 존재 또는 부재를 측정하거나 또는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 성숙한 APC 특이적 mRNA 또는 단백질의 발현을 시험함으로써, 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 미성숙한 APC는 세포 집단을 확장시키고/거나 미성숙한 APC를 추가적인 분화 또는 항원 흡수를 위한 상태로 유지시키기 위해 적절한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 미성숙한 APC는 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 모니터링되고/거나 확장될 수 있다. 또한, 미성숙한 APC는, 예를 들어, 미성숙한 APC 성숙을 억제하기 위해 항-염증성 사이토카인(예컨대, IL-10 및 TGF-β)과 같은 항-염증성 분자의 존재하에 배양될 수 있다.
또 다른 양태에서, CD14+ APC의 단리된 집단은 성숙한 APC가 농축된다. CD14+ 성숙한 APC의 단리된 집단은 상기 기재된 바와 같은 성숙 인자(예컨대, 박테리아 생성물, 및/또는 향염증성 사이토카인)의 존재하에 CD14+ 미성숙한 APC를 배양하여 성숙을 유도함으로서 수득될 수 있다. 선택적으로, CD14+ 및 CD14- 미성숙한 APC의 혼합된 집단(APC 전구체로부터 분화됨)은 배양되어 성숙, 상기 기재된 바와 같이 모니터링된 성숙 단계, 및, 성숙한 APC 농축의 적절한 단계에, 상기 기재된 바와 같이 분리된 CD14+ 세포를 유도하여 CD14+ 성숙한 APC가 농축되거나 실질적으로 농축된 단리된 집단을 수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, APC는, 예컨대, 전립선 암 항원에 노출 전 또는 노출 후에 동결보존에 의해 보존될 수 있다. 사용될 수 있는 동결보존제는 비제한적으로 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, i-시노시톨, D-락토스, 콜린 클로라이드, 아미노산, 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트, 및 무기 염을 포함한다. 제어된 느린 냉각 속도가 중요할 수 있다. 상이한 동결방지제 및 상이한 세포 유형은 전형적으로 상이한 최적 냉각 속도를 갖는다. 물이 얼음으로 바뀌는 융합 단계의 열은 전형적으로 최소이어야 한다. 냉각 절차는, 예컨대, 프로그램가능한 동결 장치 또는 메탄올 배쓰 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 프로그램가능한 동결 장치는 최적의 냉각 속도를 결정하고 표준 재현가능한 냉각을 용이하게 한다. 프로그램가능한 제어된 속도 동결기, 예컨대 크라이오메드(Cryomed) 또는 플라나(Planar)는 동결 요법을 원하는 냉각 속도 곡선으로 조정하게 한다.
철저한 동결 후, APC는 장기 극저온 저장 용기로 신속하게 이송될 수 있다. 전형적인 구현예에서, 샘플은 액체 질소(-196℃) 또는 그의 증기(-165℃)에서 극저온으로 저장될 수 있다. 특히 골수 또는 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포의 조작, 동결보존, 및 장기 저장을 위한 고려사항 및 절차는 본 발명의 APC에 대체로 적용가능하다.
동결된 세포는 바람직하게는 신속하게 해동되고(예컨대, 37-41℃로 유지된 수조에서), 해동시 즉시 냉각된다. 해동시 세포 응집을 방지하기 위해 세포를 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 응집을 방지하기 위해, 비제한적으로 동결 전 및/또는 후에 DNAse, 저분자량 덱스트란 및 시트레이트, 하이드록시에틸 전분 등을 첨가하는 것을 포함하는 다양한 절차가 사용될 수 있다. 동결방지제는, 인간에게 독성인 경우, 해동된 APC의 치료적 사용 전에 제거되어야 한다. 동결방지제를 제거하는 한 가지 방법은 유의하지 않은 농도로 희석하는 것이다. 동결된 APC가 해동되고 회수되면, 이들은 비동결된 APC와 관련하여 본원에 기재된 바와 같이 T 세포를 활성화하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 유형의 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 단백질, 예컨대 하나 이상의 세포 표면 수용체를 발현하는 하나 이상의 유형의 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하고, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25 발현 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 비례적으로 상이하다. 예를 들어, 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함할 수 있고, 상기 집단 중의 CD14 발현 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 발현 면역 세포의 양과 비례적으로 상이하다. 예를 들어, 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함할 수 있고, 상기 집단 중의 CD25 발현 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 비례적으로 상이하다. 예를 들어, 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함할 수 있고, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25 발현 면역 세포의 양은 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 비례적으로 상이하다. 예를 들어, 조성물은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함할 수 있고, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적다.
일부 구현예에서, 조성물은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 포함하고, T 세포는 APC 자극된 T 세포를 포함하며, APC는 FLT3L로 자극된 APC이다. 예를 들어, 조성물은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 포함하고, T 세포는 APC 자극된 T 세포 및 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 포함하고, APC는 FLT3L로 자극된 APC이다. 일부 구현예에서, 조성물은 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 포함하고, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하고 APC 자극된 T 세포인 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하고, APC는 FLT3L로 자극된 APC이며, 상기 집단 중의 항원 특이적 T 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 항원 특이적 T 세포의 양보다 비례적으로 많다. 일부 구현예에서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 복수의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다. 예를 들어, 조성물에서의 복수의 항원 특이적 T 세포는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012개의 항원 특이적 T 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 복수의 T 세포 수용체(TCR)는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개의 상이한 TCR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 복수의 T 세포 수용체(TCR)는 복수의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개의 상이한 TCR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 항원 펩타이드 서열은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개의 상이한 항원 펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 약학 조성물은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포 각각은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 약학 조성물은 면역 세포의 집단을 포함하고, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25 발현 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25 발현 면역 세포의 양보다 적다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고; 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 비례적으로 상이하다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하고, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하고 APC 자극된 T 세포인 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하며, APC는 FLT3L로 자극된 APC인 것인 면역 세포의 집단; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 APC 자극된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 많다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 CD4+ T 세포를 포함하고, CD4+ T 세포 중 항원 특이적 T 세포의 백분율은 적어도 약 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 나이브 CD8+ T 세포를 포함하고, 나이브 CD8+ T 세포 중 항원 특이적 T 세포의 백분율은 적어도 약 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 기억 CD8+ T 세포를 포함하고, 기억 CD8+ T 세포 중 항원 특이적 T 세포의 백분율은 적어도 약 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 APC 자극된 T 세포 및 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 포함하고, APC는 FLT3L로 자극된 APC인 것인 면역 세포의 집단; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 복수의 신생항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 면역 세포의 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고; T 세포 중 항원 특이적 T 세포의 백분율은 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%이다.
일부 구현예에서, 신생항원 특이적 T 세포는 APC 자극된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25 발현 면역 세포의 백분율이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및/또는 CD25 발현 면역 세포의 백분율보다 낮다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 신생항원 특이적 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 신생항원 특이적 T 세포는 CD4 농축된 T 세포 및/또는 CD8 농축된 T 세포를 포함한다. 예를 들어, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포는 PBMC를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 단리되거나, 농축되거나, 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 신생항원 특이적 T 세포는 나이브 CD4+ 및/또는 나이브 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 나이브 T 세포는 L-셀렉틴(CD62L)의 표면 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 나이브 T 세포는 활성화 마커 CD25, CD44 또는 CD69 중 하나 이상의 부재를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 나이브 T 세포는 기억 CD45RO 이소형의 부재를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 나이브 T 세포는 하위유닛 IL-7 수용체-α인 CD127, 및 공통-γ 사슬인 CD132로 구성되는 기능적 IL-7 수용체의 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이 및 암 신생항원 펩타이드는 500 nM 미만의 IC50 및 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합하고, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열 각각은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 발현된 유전자에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 8-50개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열은 복수의 신생항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 신생항원 펩타이드 서열은 2-50, 3-50, 4-50, 5-50, 6-50, 7-50, 8-50, 9-50, 또는 10-50개의 신생항원 펩타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 APC 제제이다. 일부 구현예에서, APC는 적어도 하나의 신생항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 신생항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 자가 APC 또는 동종이계 APC이다.
일부 구현예에서, APC는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 농축된다. 예를 들어, CD14+는 PBMC를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 단리되거나, 농축되거나, 또는 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 신생항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물에서 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물에서 항원 특이적 나이브 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물에서 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물에서 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
제조 방법
항원 특이적 T 세포 제조 방법이 본원에 제공된다. T 세포 조성물, 예컨대 치료용 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 방법은 항원 특이적 T 세포를 확장시키거나 유도하는 단계를 포함할 수 있다. T 세포를 제조하는 것(예컨대, 유도하거나 확장시키는 것)은 또한 T 세포를 제조하는 것을 지칭할 수 있고, 광범위하게는 임의의 유형의 T 세포(예컨대, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)를 단리, 자극, 배양, 유도, 및/또는 확장시키는 절차를 포함한다. 제1 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 APC를 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
제2 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
제3 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 제1 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
제4 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법을 제공하는 방법으로서, 이 방법은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제의 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나, 또는 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법이 본원에 제공된다.
제5 양태에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 별개의 기간 동안 3개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 별개의 기간 동안 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하여, T 세포가 항원 특이적 T 세포가 되도록 자극시키는 단계로서, 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 별개의 기간 동안 3개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하여, T 세포가 항원 특이적 T 세포가 되도록 자극시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 2개 이하의 별개의 기간 동안 2개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하여, T 세포가 항원 특이적 T 세포가 되도록 자극시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 (a) 대상체로부터 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14를 발현하는 세포를 농축시켜, CD14+ 세포 농축 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14+ 세포 농축 샘플을 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14+ 농축된 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계; (f) 성숙 APC 샘플의 APC를 제4 기간 동안 PBMC를 포함하는 CD14 및/또는 CD25 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하는 단계; (g) PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계; (h) PBMC를 제6 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (i) PBMC의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14 및/또는 CD25 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14 및/또는 CD25 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 PBMC와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; (f) 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; (g) 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; (h) 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 APC를 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제의 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나, 또는 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 별개의 기간 동안 3개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나 또는 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 면역 세포의 집단(예컨대, PBMC)을 APC에 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 면역 세포의 집단(예컨대, PBMC)을 하나의 기간 동안 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 CD14 발현 세포가 고갈된 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 CD25 발현 세포가 고갈된 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 CD14 발현 세포 및 CD25 발현 세포가 고갈된 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 제1 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 면역 세포의 집단을 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 면역 세포의 집단을 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 면역 세포의 집단을 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계(예컨대, 일 기간 동안); 및 그 후 생물학적 샘플의 T 세포를 APC에 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제에 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 별개의 기간 동안 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)로부터의 면역 세포의 집단을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 별개의 기간 동안 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 별개의 기간은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제의 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 계산된 28일 미만이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 면역 세포의 집단을 하나의 기간 동안 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 면역 세포의 집단은 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플로부터 유래된 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 면역 세포의 집단을 하나의 기간 동안 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 면역 세포의 집단은 CD14 및/또는 CD25 발현 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터 유래된 것인 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나의 기간 동안 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법은 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 그 후 생물학적 샘플의 T 세포를 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 별개의 기간 동안 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하여, 항원 특이적 T 세포를 유도하거나 확장시키는 단계로서, 하나 이상의 별개의 기간은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제의 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 계산된 28일 미만인 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 별개의 기간 동안 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계는 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합을 함유하는 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배지는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, IDO 억제제는 항원 특이적 CD8+ 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, IDO 억제제는 기억 CD8+ T 세포 반응의 기능적 프로파일을 유지할 수 있다. PD-1 항체는 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응의 절대 수를 증가시킬 수 있다. PD-1 항체는 이러한 항체로 처리된 세포의 증식 속도를 증가시킬 수 있다. IL-12의 첨가는 항원 특이적 세포의 증가 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도의 증가를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 별개의 기간 동안 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하여, 항원 특이적 T 세포를 확장시키거나 유도하는 단계로서, 항원 특이적 T 세포, 항원 특이적 CD4+ T 세포, 또는 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 면역 세포, 또는 총 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 별개의 기간 동안 3개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하여, T 세포가 항원 특이적 T 세포가 되도록 자극시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 CD14 및/또는 CD25 발현 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC는 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC이다. 일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 APC 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제는 3개 이하의 APC 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, APC 제제는 하나 이상의 별개의 기간 내에서 순차적으로 면역 세포와 함께 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 예를 들어, 대상체는 환자 또는 공여자일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 CD4 농축된 T 세포 및/또는 CD8 농축된 T 세포를 포함한다. 예를 들어, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포는 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플로부터 단리되거나, 농축되거나, 또는 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD4+ 및/또는 나이브 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 기억 CD4+ 및/또는 기억 CD8+ T 세포이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이 및 암 항원 펩타이드는 500 nM 미만의 IC50 및 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합하고, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 발현된 유전자에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 8-50개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 복수의 항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 펩타이드 서열은 2-50, 3-50, 4-50, 5-50, 6-50, 7-50, 8-50, 9-50, 또는 10-50개의 항원 펩타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, APC는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 자가 APC 또는 동종이계 APC이다. 일부 구현예에서, APC는 수지상 세포(DC)를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 발현 세포를 고갈시키는 단게를 포함한다. 일부 구현예에서, CD14+ 세포를 고갈시키는 것은 CD14 결합제를 APC에 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC는 생물학적 샘플로부터 농축된다. 예를 들어, APC는 PBMC를 포함하는 대상체로부터 단리되거나, 농축되거나, 또는 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 IL-4, GM-CSF, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, APC는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 약 0.1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 10%, 약 10% 내지 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 60%, 약 60% 내지 65%, 또는 약 65% 내지 약 70%이다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 나이브 CD8+ T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 방법에서 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 나이브 CD8+ T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 기억 CD8+ T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 최대 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다.
일부 구현예에서, 방법은 T 세포를 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합으로 자극시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 IDO 억제제, PD-1 항체 또는 IL-12의 존재하에 T 세포를 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합으로 자극시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 항원 특이적 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기간 중 제1 기간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9일이다.
일부 구현예에서, 별개의 기간의 총 기간은 28일 미만이다. 일부 구현예에서, 별개의 기간의 총 기간은 20-27일이다. 일부 구현예에서, 별개의 기간의 총 기간은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39일이다.
일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제1 APC 제제를 7일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제1 APC 제제를 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제1 APC 제제를 7-20, 8-20, 9-20, 10-20, 11-20, 또는 12-20일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제1 APC 제제를 약 10-15일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제2 APC 제제를 5-9일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제2 APC 제제를 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제3 APC 제제를 5-9일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제3 APC 제제를 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 APC 제제의 제1 APC 제제를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계, APC 제제의 제2 APC 제제를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계, 및 APC 제제의 제3 APC 제제를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22일 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 새롭게 수득되거나 동결된 샘플이다.
일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제를 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17, 또는 18일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18일 이하이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이하이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제를 제2 기간 동안 적어도 하나의 펩타이드와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 기간은 1시간 이하이다.
일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제를 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF(과립구 대식세포 콜로니-자극 인자), IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848(resiquimod), LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, CpG, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18일 이하이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17일이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 2, 3, 4, 또는 5일 이하이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 1, 2, 3, 또는 4일이다.
일부 구현예에서, 방법은 제3 기간 후 및 제4 기간 시작 전에 제2 배지의 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 생체외에서 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포를 제조하는 방법은 대상체로부터 APC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14+ 세포를 농축시켜, CD14+ 농축된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 CD14+ 농축된 샘플을 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 CD14+ 농축된 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 성숙 APC 샘플의 APC를 제4 기간 동안 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제3 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PBMC를 제6 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PBMC의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 다른 구현예에서, T 세포를 제조하는 방법은 대상체로부터 APC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14+ 세포를 농축시켜, CD14+ 농축된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 CD14+ 농축된 샘플을 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 CD14+ 농축된 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 배지와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 성숙 APC 샘플의 APC를 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 PBMC 및 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PBMC를 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PBMC를 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PBMC의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 (a) 대상체로부터 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14를 발현하는 세포를 농축시켜, CD14+ 세포 농축 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14+ 세포 농축 샘플을 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14+ 세포 농축 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계; (f) 성숙 APC 샘플의 APC를 제4 기간 동안 PBMC를 포함하는 CD14 및/또는 CD25 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하는 단계; (g) PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계; (h) PBMC를 제6 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (i) PBMC의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제2 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제4 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제5 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다.
일부 구현예에서, 방법은 (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 PBMC와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; (f) 제1 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; (g) 선택적으로, 제2 자극 PBMC 샘플의 PBMC를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 PBMC 샘플을 수득하는 단계; (h) 제1, 제2, 또는 제3 자극 PBMC 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제2 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제4 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제5 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다.
일부 다른 구현예에서, T 세포를 제조하는 방법은 (a) 대상체로부터 APC 및 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플을 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계; (c) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (d) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계; (e) 성숙 APC 샘플을 제3 기간 후 제4 기간 동안 인간 혈청과 함께 인큐베이션하는 단계; (f) 생물학적 샘플을 제5 기간 동안 하나 이상의 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (g) 생물학적 샘플의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자는 FLT3L을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 5시간, 적어도 8시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 적어도 22시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 적어도 5일이다. 일부 구현예에서, 제2 기간은 적어도 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 또는 3시간이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 10시간, 적어도 12시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 적어도 22시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 적어도 5일이다. 일부 구현예에서, 제4 기간은 약 2, 3, 또는 4일이다. 일부 구현예에서, 제5 기간은 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제2 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제4 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 제5 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다.
유도된 또는 확장된 T 세포는 다양한 유형의 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 CD8+ T 세포를 포함한다.
다양한 항원 펩타이드는 T 세포를 유도하거나 확장시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 (A) 점 돌연변이, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 점 돌연변이를 포함하고 상응하는 야생형 펩타이드보다 더 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 IC50 또는 KD로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 펩타이드는 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 유도되거나 확장된 항원 특이적 T 세포의 TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 IC50 또는 KD로 펩타이드-HLA 복합체에 결합한다. 일부 구현예에서, TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM의 IC50 또는 KD로 펩타이드-HLA 복합체에 결합한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 적어도 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,500; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 7,500; 또는 10,000개 이상의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 클래스 I HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 8-12개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 클래스 II HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 16-25 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 복수의 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 펩타이드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 이상의 항원 펩타이드를 포함한다.
다양한 구현예에서, APC는 T 세포를 자극/유도하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 자가 APC 또는 동종이계 APC이다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 CD14 및/또는 CD25 결합제를 APC 또는 APC 제제의 APC에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25 결합제는 바이오티닐화된다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 고체 지지체 상의 항-바이오틴 시약을 CD14 및/또는 CD25 결합제에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 및/또는 CD25 결합제는 고체 지지체에 부착된다. 일부 구현예에서, CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 CD19 결합제를 APC 또는 APC 제제의 APC에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 결합제는 바이오티닐화된다. 일부 구현예에서, CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 고체 지지체 상의 항-바이오틴 시약을 CD19 결합제에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 결합제는 고체 지지체에 부착된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APCCD141 농축된 APC 또는 CD141 농축된 수지상 세포이다.
일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 생물학적 샘플로부터 농축된다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, APC 또는 APC 제제의 APC는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 새롭게 수득되거나 동결된 샘플이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.00001%, 0.00002%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1%이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1%이다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 별개의 기간의 총 기간은 28일 미만이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션하는 것은 APC 제제의 APC 제제를 7일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션하는 것은 APC 제제의 제1, 제2, 제3 또는 제4 APC 제제를 7일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제를 제2 기간 동안 적어도 하나의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 또는 하나 이상의 APC를 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제3 기간 후 및 제4 기간의 시작 전에 제2 배지의 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 기간은 적어도 또는 최대 또는 약 30, 40, 또는 50분; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일이다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원, 종양 관련 항원, 바이러스 항원, 부조직적합 항원 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 방법은 생체 외에서 수행된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함한다.
항원 제시 세포(APC) 및 제조 방법
일부 구현예에서, 방법은 T 세포를 항원 제시 세포(APC)로 유도 또는 자극 또는 확장시키는 단계를 포함한다. APC는 T 세포와 접촉하기 전에 항원 펩타이드가 미리 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포를 확장 또는 유도하는 방법은 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 APC로 자극시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단의 집단은 CD14 및/또는 CD25 발현 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, APC는 FLT3L로 자극된 APC이다. 일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 APC 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나는 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 APC 제제는 3개 이하의 APC 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 APC 제제는 하나 이상의 별개의 기간 내에서 순차적으로 면역 세포와 함께 인큐베이션된다.
항원 제시 세포(APC)는 이들의 세포 표면 상에 MHC 분자와 회합된 단백질 항원의 펩타이드 단편을 제시한다. 제시된 펩타이드는 APC의 세포 표면 상에서 펩타이드-MHC 복합체(pMHC)로서 MHC 분자와 회합된다. 펩타이드-MHC 복합체의 가공 및 제시는 단백질의 프로테아제 매개 소화; 항원 가공과 관련된 수송체(TAP)에 의해 매개된 소포체(ER) 내로의 펩타이드 수송; 새롭게 합성된 MHC 분자를 사용한 펩타이드-MHC I 분자의 형성; 및 펩타이드-MHC 분자의 세포 표면으로의 수송을 포함하는 일련의 순차적 단계를 포함할 수 있다.
일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, pMHC와 상호작용하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 세포는 TCR-pMHC의 형성시에 활성화되거나, 자극되거나, 유도되거나 또는 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 제시 세포의 MHC(예컨대, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC)는 펩타이드가 로딩될 수 있고 제시될 펩타이드 서열을 포함하는 항원 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(예컨대, RNA)을 APC 내로 도입함으로써 APC에 의해 제시될 수 있다.
생물학적 관점에서, 체세포 돌연변이가 면역 반응을 생성하기 위해서는, 몇 가지 기준이 만족될 필요가 있다: 돌연변이를 함유하는 대립유전자는 세포에 의해 발현되어야 하고, 돌연변이는 단백질 코딩 영역에 있어야 하고 비동의어적(nonsynonymous)이어야 하며, 번역된 단백질은 프로테아좀 또는 다른 세포 단백질 분해 경로에 의해 절단되어야 하고, 돌연변이를 함유하는 에피토프는 MHC 복합체에 의해 제시되어야 하며, 제시된 에피토프는 TCR에 의해 인식되어야 하고, 마지막으로, TCR-pMHC 복합체는 T 세포를 활성화시키는 신호전달 캐스케이드를 개시해야 한다.
단핵구는 혈류 내에서 순환한 다음 조직 내로 이동할 수 있고, 여기서 이들은 대식세포 및 수지상 세포로 분화될 수 있다. 전통적인 단핵구는 전형적으로 CD14 세포 표면 수용체의 높은 수준의 발현을 특징으로 한다. 단핵구 및 B 세포는 유능한 APC일 수 있지만, 이들의 항원 제시 능력은 이전에 감작된 T 세포의 재활성화에 제한되는 것처럼 보인다. 이들 세포 유형은 기능적으로 나이브하거나 프라이밍되지 않은 T 세포 집단을 직접 활성화시키지 못할 수 있다. 전문 항원 제시 세포는 식균작용(phagocytosis) 또는 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)에 의해 항원을 내재화한 다음, 이들의 막 상의 MHC 분자에 결합된 항원의 단편을 디스플레이하는데 매우 효율적이다. T 세포는 항원 제시 세포의 막 상의 항원-MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용한다. 이후, 항원 제시 세포에 의해 추가의 공동 자극 신호가 생성되어, T 세포를 활성화시킨다. 공동 자극 분자의 발현은 전문 항원 제시 세포의 전형적인 특징이다.
전문 항원 제시 세포는 식균작용 또는 수용체 매개 세포내이입에 의해 항원을 내재화한 다음, 이들의 막 상의 MHC 분자에 결합된 항원의 단편을 디스플레이하는데 매우 효율적이다. T 세포는 APC의 막 상의 항원-MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용할 수 있다. 이후, APC에 의해 추가의 공동 자극 신호가 생성되어, T 세포를 활성화시킨다. 공동 자극 분자의 발현은 전문 항원 제시 세포의 본질적인 특징일 수 있다. 전문 APC의 예는, 비제한적으로, 수지상 세포(DC), 대식세포, 및 B-세포를 포함할 수 있다. 전문 APC는 높은 수준의 MHC 클래스 II, ICAM-1 및 B7-2를 발현할 수 있다.
전문 항원 제시 세포의 주요 유형 중 하나는 가장 광범위한 항원 제시를 갖는 수지상 세포이다. 전문 항원 제시 세포의 다른 주요 유형은 대식세포, B-세포, 및 특정 활성화된 상피 세포를 포함한다. 수지상 세포는 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로를 통해 T 세포에게 항원(예컨대, 말초 조직 내에 포획된 항원)을 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포는 나이브 및 이전에 프라이밍된 T 세포(예컨대, 기억 T 세포)를 활성화시킬 수 있다. 수지상 세포(DC)는 MHC 클래스 I 및 II 항원 제시 경로를 통해 T 세포에 말초 조직 내에 포획된 항원을 제시하는 백혈구 집단일 수 있다. 수지상 세포는 면역 반응의 강력한 유도제일 수 있으며, 이들 세포의 활성화는 항종양 면역의 유도에 중요한 단계일 수 있다. 수지상 세포는 면역 반응의 강력한 유도제이며 이들 세포의 활성화는 항종양 면역의 유도에 중요한 단계일 수 있다.
수지상 세포는 "미성숙한" 및 "성숙한" 세포로 분류될 수 있으며, 이는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로서 사용될 수 있다. 그러나, 이 명명법은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 미성숙한 수지상 세포는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있는 항원 흡수 및 가공을 위한 높은 능력을 갖는 항원 제시 세포로서 특성화될 수 있다. 성숙한 표현형은 전형적으로 이들 마커의 더 낮은 발현을 특징으로 할 수 있지만, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(예컨대, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예컨대, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현을 특징으로 할 수 있다. 성숙한 수지상 세포는 CD11b+, CD11c+, HLA-DR+, CD80+, CD86+, CD54+, CD3-, CD19-, CD14-, CD141+(BDCA-3), 및/또는 CD1a+일 수 있다. 수지상 세포 성숙은 이러한 항원 제시 수지상 세포가 T 세포 프라이밍을 야기하는 수지상 세포 활성화의 상태로 지칭될 수 있지만, 미성숙한 수지상 세포에 의한 제시는 관용(tolerance)을 초래한다. 수지상 세포 성숙은 선천성 수용체(예컨대, 박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 향염증성 사이토카인(예컨대, TNF, 인터루킨, 및 인터페론), CD40L에 의한 수지상 세포 표면 상의 CD40의 결찰, 및 세포 사멸을 겪는 세포로부터 방출된 물질에 의해 검출되는 미생물 특징을 갖는 생체분자에 의해 야기될 수 있다. 수지상 세포 성숙을 유도할 수 있는 사이토카인의 추가적인 비제한적인 예는 IL-4, GM-CSF, TNF-α, IL-1β, PGE1, 및 IL-6을 포함한다. 예를 들어, 수지상 세포는 골수 세포를 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)와 같은 사이토카인과 함께 시험관 내에서 배양함으로써 유래될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 PBMC로부터 단리된 CD14+ 단핵구로부터 유래될 수 있다. 단핵구를 수지상 세포로 유도하는 데 사용될 수 있는 사이토카인 또는 성장 인자는, 비제한적으로, GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 폴리I:C를 포함한다.
전형적으로, 비전문 항원 제시 세포는 MHC 클래스 II 단백질을 항시적으로 발현하지 않는다. MHC 클래스 II 단백질은 전형적으로 IFN-γ와 같은 특정 사이토카인에 의해 비전문 항원 제시 세포의 자극시에만 발현된다.
항원 제시 세포(APC)의 공급원은 전형적으로 항원 펩타이드를 시험관 내에서 발현 및 제시할 수 있는 APC 또는 APC 전구체를 포함하는 조직 공급원일 수 있다. 일부 구현예에서, APC는 표적 RNA가 로딩되고/거나 필요한 사이토카인 또는 인자로 처리될 때 전문 APC를 증식시키고 전문 APC가 될 수 있다.
일 양태에서, APC 전구체 세포는 시험관 내에서 수지상 세포(DC)로 증식 및 성숙할 수 있다. 많은 조직 공급원이 사용될 수 있지만, 전형적인 조직 공급원은 비장, 흉선, 조직 생검, 종양, 구심성 림프(afferent lymph), 림프절, 골수, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물, 및/또는 말초 혈액을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 성분채집술 생성물, 골수 및 말초 혈액이 공급원일 수 있다. 또한 성장 인자가 풍부한 태아 조직, 태아 또는 제대혈이 또한 APC 및/또는 전구체 APC를 수득하기 위한 혈액의 공급원으로서 사용될 수 있다. 전구체 세포의 예는, 비제한적으로, 배아 줄기 세포, CD34+ 세포, 단핵구 전구세포(progenitor), 단핵구, 및 전구-B-세포를 포함한다. 예를 들어, APC는 단핵구 또는 CD34+ 세포를 포함하는 전구체 세포로부터 유래될 수 있다.
일 양태에서, APC 및/또는 전구체 APC의 공급원은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물일 수 있다. 세포는 당업계에 공지된 성분채집술 절차를 사용하여 수집될 수 있다(예컨대, Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, pp. 610-616(1994)). 성분채집 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B-세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 가공 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 두기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 세척 용액은 칼슘이 결여될 수 있고, 마그네슘이 결여될 수 있거나 또는 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 결여될 수 있다. 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반자동 "플로우 쓰루(flow-through)" 원심분리를 사용하여 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생물양립가능한 완충제, 예를 들어, 무 Ca, 무 Mg PBS에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 구성요소는 제거될 수 있고, 세포는 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
APC는 인간 및 비인간 영장류, 다른 포유동물, 및 척추동물을 포함하는 다양한 공급원으로부터 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, APC는 인간 또는 비인간 척추동물의 혈액으로부터 제조될 수 있다. APC는 또한 백혈구의 농축된 집단으로부터 단리될 수 있다. 백혈구의 집단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 헤파린 첨가된(heparinized) 혈액의 수집, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술, 버피 코트(buffy coat)의 제조, 로제팅(rosetting), 원심분리, 밀도 구배 원심분리(예컨대, 피콜(Ficoll), 콜로이드성 실리카 입자, 및 수크로스를 사용하여), 차별적 용해(differential lysis) 비백혈구 세포, 및 여과를 포함한다. 백혈구 집단은 또한 대상체로부터 혈액을 수집하고, 제세동하여 혈소판을 제거하고, 적혈구를 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 백혈구 집단은 선택적으로 단핵구성 수지상 세포 전구체가 농축될 수 있다.
혈액 세포 집단은 백혈구의 농축된 집단의 원하는 용도에 따라, 다양한 대상체로부터 수득될 수 있다. 대상체는 건강한 대상체일 수 있다. 대안적으로, 혈액 세포는 예를 들어, 암 환자 또는 면역자극이 유익할 다른 환자와 같은 면역자극을 필요로 하는 대상체로부터 수득될 수 있다. 마찬가지로, 혈액 세포는, 예를 들어, 자가면역 장애(예컨대, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 루푸스, 다발성 경화증 등)를 갖는 환자와 같은, 면역 억제가 필요한 대상체로부터 수득될 수 있다. 백혈구의 집단은 또한 HLA 매치된 건강한 개체로부터 수득될 수 있다.
혈액이 APC의 공급원으로서 사용되는 경우, 혈액 백혈구는 이들의 생존율을 유지시키는 통상적인 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 혈액은 헤파린 또는 다른 적합한 항응고제를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 배지 내로 희석될 수 있다. 혈액 대 배지의 부피는 약 1 대 1일 수 있다. 세포는 4℃에서 약 1,000 rpm(150 g)에서 배지 중의 혈액의 원심분리에 의해 농축될 수 있다. 혈소판 및 적혈구는 적혈구를 용해시킬 당업계에 공지된 많은 용액, 예를 들어 염화 암모늄에 세포를 재현탁시킴으로써 고갈될 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 약 1:1 부피의 배지 및 염화 암모늄일 수 있다. 세포는 원심분리에 의해 농축될 수 있고, 혈소판 및 적혈구가 실질적으로 없는 백혈구의 집단이 수득될 때까지 원하는 용액에서 세척될 수 있다. 조직 배양에서 일반적으로 사용되는 임의의 등장성 용액이 혈소판 및 적혈구로부터 혈액 백혈구를 분리하기 위한 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 등장성 용액의 예는 인산 완충 식염수, 행크스 평형 염 용액, 및 완전 성장 배지일 수 있다. APC 및/또는 APC 전구체 세포는 또한 용리(elutriation)에 의해 정제될 수 있다.
일 구현예에서, APC 및/또는 전구체 APC의 단리는 피콜 전체 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액을 22 내지 37℃에서 약 30분 내지 2시간 동안 하나의 배치의 세포(전형적으로 약 5×108 내지 약 2×1010 세포)에 대해 하나 이상의 다양한 관련없는 또는 비-항체 결합된 상자성 입자(대략 1 바이알의 비드 또는 4×109 비드)와 함께 전배양한 후, 상자성 입자에 부착되거나 상자성 입자를 삼킨 세포를 자성 제거함으로써 수행될 수 있다. 이러한 분리는 당업계에서 이용가능한 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 다양한 것(예컨대, DYNAL® 자성 입자 농축기(DYNAL MPC®))을 포함하는 임의의 자성 분리 방법이 사용될 수 있다. 단리의 보증은 상기 단리 전후의 세포의 유세포 분석을 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
APC는 적절한 배양 배지에서 적절한 배양 용기에서 일차 배양물을 형성하도록 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 하나 이상의 사이토카인이 보충될 수 있다. 적절한 배양 용기는 조직 배양 양립가능한 표면을 갖는 임의의 용기일 수 있다. 예는 조직 배양에 사용하기 위해 제조된 다양한 백, 플라스크, 롤러 병, 페트리 디쉬 및 다중 웰 함유 플레이트를 포함한다. 세포 부착을 촉진하기 위해 물질, 예를 들어 콜라겐 또는 폴리-L-리신, 또는 특정 세포 유형에 특이적인 항체로 처리된 표면은 또한 하기에 기재된 바와 같이 세포의 차별적인 부착을 허용하는 경우에 사용될 수 있다. 표면은 또한, 예를 들어 이온화에 의해 화학적으로 처리될 수 있다. 세포는 약 105 내지 107 세포/cm2의 초기 세포 밀도로 플레이팅될 수 있다. 일 양태에서, 세포는 106 세포/cm2로 플레이팅될 수 있다.
일 구현예에서, 선택된 조직 공급원으로부터의 일차 배양물은 세포의 집단이 비부착성 세포의 분리를 허용할 정도로 기질에 충분히 부착될 때까지 습도, CO2, 및 pH의 표준 조직 배양 조건 하에 약 37℃에서 인큐베이션된다. 혈액 내의 일부 미성숙한 APC, 특히 미성숙한 DC는 단핵구와 달리 초기에 플라스틱에 비부착성이므로, 전구체는 밤새 배양 후 분리될 수 있다. 단핵구 및 섬유아세포는 대부분의 부착성 세포를 포함할 수 있고, 일반적으로 약 30분 내지 약 24시간 내에 기질에 부착할 수 있다. 특정 양태에서, 비부착성 세포는 약 1 내지 16시간 사이에 부착성 세포로부터 분리될 수 있다. 비부착성 세포는 약 1 내지 2시간에 분리될 수 있다. 상당한 양의 부착성 세포를 제거하지 않는 임의의 방법이 비부착성 세포로부터 부착성 세포를 분리하는 데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 세포는 간단한 진탕 또는 피펫팅에 의해 제거될 수 있다. 특정 양태에서, 피펫팅이 가장 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 단리된 전구체 APC(예컨대, 단핵구)를 포함하는 부착성 세포는 세포의 집단이 미성숙한 APC 단계에 도달할 때까지 습도, CO2, 및 pH의 표준 조직 배양 조건 하에 약 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용에 따르면, 부착성 세포는 4시간 내지 7일의 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 그러나, 당업자는 인큐베이션 시간 및 조건이 달라질 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 미성숙한 APC는 전구체 세포의 기원에 따라 CD14- 또는 CD14+일 수 있다. 미성숙한 APC는 또한 CD1a, CD40, CD86, CD54, 및 중간 수준의 MHC 클래스 II를 발현할 수 있다(샘플 세포 상에서의 마커 발현의 수준은 유세포 분석에 의해 MHC 클래스 II-음성 세포 및 높은 수준의 MHC 클래스 II를 발현하는 것으로 알려진 세포 상의 발현 수준과 비교될 수 있음). 미성숙한 APC는 전형적으로 CCR7을 발현하지 않는다.
본 개시내용의 특정 양태에서, T 세포를 APC로부터 분리할 필요가 없다. 예를 들어, 일 구현예에서, APC 및 T 세포를 포함하는 PBMC는 본원에 기재된 바와 같이 항원에 노출될 수 있고, 생성된 항원 특이적 T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 확장된다.
본 발명의 특정 양태에서, 본원에 기재된 APC 또는 T 세포는 자가 공급원으로부터 유래될 필요는 없다. 따라서, APC 및 T 세포는 매치되거나 비매치된 공여자로부터, 또는 세포주, T 세포주, 또는 시험관내에서 성장한 다른 세포로부터 수득될 수 있다. 일배체형(haplotype)을 매칭시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, APC 및 T 세포 또는 이로부터의 상층액은 이종 공급원으로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어, 마우스, 랫트, 비인간 영장류, 및 돼지 세포가 사용될 수 있다.
APC의 적합한 제제는, 예를 들어, 수지상 세포 및 단핵구를 포함한다. 다른 구현예에서, APC는, 예를 들어, B 세포, 세포, 또는 상피 또는 내피 세포와 같은 활성화된 비노미널(non-nominal) APC일 수 있다. APC는 미성숙하거나 성숙할 수 있다. APC 및 T 세포는 전형적으로 약 6 내지 약 48시간 동안 공배양되지만, 더 크고 더 작은 시간이 본 발명의 범위에 속한다. 공배양은 전형적으로 T 세포의 활성화를 허용하기에 충분한 시간 동안 수행될 수 있지만, 상당수의 미성숙한 APC 또는 APC 전구체의 분화 및/또는 성숙에 필요한 시간보다 적다.
특정 구현예에서, 단핵구성 수지상 세포 전구체는, 예를 들어, 농축된 백혈구 또는 단핵구를 단핵구성 수지상 세포 전구체 부착 기질과 접촉시킴으로써 단리될 수 있다. 요약하면, 농축된 백혈구 또는 단핵구의 집단이 기질과 접촉될 때, 세포 집단 내의 단핵구성 수지상 세포 전구체, 또는 단핵구는 기질에 부착될 수 있다. 다른 백혈구는 기질에 대해 감소된 결합 친화성을 나타내어, 단핵구성 수지상 세포 전구체가 우선적으로 기질의 표면 상에 농축되게 할 수 있다. 적합한 기질은 미립자 기질, 예를 들어, 유리 입자, 플라스틱 입자, 유리 코팅된 플라스틱 입자, 유리 코팅된 폴리스티렌 입자, 모세관 튜브, 및 미세융모 막을 포함한다. 기질의 표면은 선택적으로 기질에 대한 단핵구성 수지상 세포 전구체의 부착을 향상시키기 위해 처리될 수 있다. 기질의 표면은, 예를 들어, 단백질, 사이토카인, 혈장, 및/또는 단핵구-결합 단백질로 코팅될 수 있다. 백혈구- 또는 단핵구 농축된 세포 집단을 단핵구성 수지상 세포 전구체 부착 기질과 접촉시킨 후, 단핵구성 수지상 세포 전구체는 기질에 부착되어 기질 상에 단핵구성 수지상 세포 전구체를 포함하는 복합체를 형성한다. 단핵구성 수지상 세포 전구체 결합은, 예를 들어, FACS 전면 및 측면 산란 분석 등에 의해, 예를 들어, 항-CD14 항체와 같은 항-세포 표면 마커 항체를 사용한 항체 검출에 의해 모니터링될 수 있다. 일부 구현예에서, 백혈구 집단은 약 5 내지 약 300분, 더욱 전형적으로 약 30 내지 약 120분 동안 기질과 접촉될 수 있다. 단핵구성 수지상 세포 전구체 복합체는 비특이적으로 결합된 백혈구를 제거하기 위해 선택적으로 적합한 세척 완충제로 세척될 수 있다. 적합한 세척 완충제는 조직 배양 배지, 인산 완충 식염수, 둘베코 인산 완충 식염수 등을 포함한다. 배지는 단핵구성 수지상 세포 전구체의 생존율 및/또는 증식을 촉진하기 위해 아미노산, 비타민, 및/또는 호르몬이 보충될 수 있다. 세척 효율은 세척 완충제의 FACS 전면 및 측면 산란 분석에 의해, 세포 표면 마커에 대한 용리된 세포를 염색하는 것 등에 의해 모니터링될 수 있다. 전형적으로, 복합체는 비특이적으로 결합된 백혈구를 제거하기 위해 수회 세척될 수 있다. 부착된 단핵구성 수지상 세포 전구체는 기질로부터 용리될 수 있다. 예를 들어, 전구체는 0.4% EDTA 또는 다른 비독성 킬레이트제를 함유하는 인산 완충 식염수로 처리함으로써 기질로부터 용리될 수 있다. 단핵구성 수지상 세포 전구체는 전형적으로 트립신 또는 다른 프로테아제를 사용하지 않고 기질로부터 용리될 수 있다.
다른 구현예에서, 수지상 세포는 당업자에게 공지된 다른 방법에 따라 단리될 수 있다(예컨대, O'Doherty et al., J. Exp. Med. 178:1067-76 (1993); Young and Steinman, J. Exp. Med. 171:1315-32 (1990); Freudenthal and Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-702 (1990); Macatonia, et al., Immunol.67:285-89 (1989); Markowicz and Engleman, J. Clin. Invest. 85:955-61 (1990); 미국 특허 제5,994,126호 및 제5,851,756호). 수지상 세포를 면역선택하는 방법은, 예컨대, 기질에 커플링된 항-CD34 및/또는 항-CD14 항체와 같은 수지상 세포 전구체와 회합된 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하는 것(예컨대, Bernhard et al., Cancer Res. 55:1099-104(1995); Caux at al., Nature 360:258-61(1992)) 또는 CD11c, CD54, CD83, CD80, 및 CD86과 같은 완전 분화된 수지상 세포와 회합된 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, APC는 염증성 또는 활성화된 조건 하에서 비노미널 APC일 수 있다. 예를 들어, 비노미널 APC는 인터페론-감마로 자극된 상피 세포, T 세포, B 세포, 및/또는 APC 활성을 유도하는 인자 또는 조건에 의해 활성화된 단핵구를 포함할 수 있다. 이러한 비노미널 APC는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
APC는 APC의 유형에 따라, 원하는 경우, 배양되고, 확장되고, 분화되고/거나 성숙될 수 있다. APC는, 예를 들어, 배양 플레이트, 플라스크, 배양 백, 및 생물반응기와 같은 임의의 적합한 배양 용기에서 배양될 수 있다.
특정 구현예에서, APC는 제제 내의 APC의 수를 유지 및/또는 확장시키기 위해 적합한 배양 또는 성장 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 단리된 APC의 유형에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 APC, 예컨대 성숙한 수지상 세포는 이들의 유지 및 확장에 적합한 성장 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 아미노산, 비타민, 항생제, 2가 양이온 등이 보충될 수 있다. 또한, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 호르몬이 성장 배지에 포함될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 수지상 세포의 유지 및/또는 확장을 위해, 사이토카인, 예컨대 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및/또는 인터루킨 4(IL-4)이 첨가될 수 있다. 다른 구현예에서, 미성숙한 APC는 배양 및/또는 확장될 수 있다. 미성숙한 수지상 세포는 표적 mRNA를 흡수하고 새로운 항원을 가공하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 미성숙한 수지상 세포는 이들의 유지 및 배양에 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 아미노산, 비타민, 항생제, 2가 양이온 등이 보충될 수 있다. 또한, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 호르몬이 성장 배지에 포함될 수 있다.
다른 미성숙한 APC는 유사하게 배양되거나 확장될 수 있다. 미성숙한 APC의 제제는 성숙되어 성숙한 APC를 형성할 수 있다. APC의 성숙은 항원 펩타이드에의 노출 동안 또는 노출 후에 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 미성숙한 수지상 세포의 제제는 성숙될 수 있다. 적합한 성숙 인자는, 예를 들어, 사이토카인 TNF-α, 박테리아 생성물(예컨대, BCG) 등을 포함한다. 또 다른 양태에서, 단리된 APC 전구체는 미성숙한 APC의 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다. APC 전구체는 배양되고, 분화되고/거나, 성숙될 수 있다. 특정 구현예에서, 단핵구성 수지상 세포 전구체는 단핵구성 수지상 세포 전구체의 미성숙한 수지상 세포로의 분화를 촉진하기 위해, 아미노산, 비타민, 사이토카인, 및/또는 2가 양이온이 보충된 적합한 배양 배지의 존재하에 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, APC 전구체는 PBMC로부터 단리된다. PBMC는 공여자, 예를 들어, 인간 공여자로부터 수득될 수 있고, 신선하게 사용될 수 있거나 추후에 사용하기 위해 동결될 수 있다. 일부 구현예에서, APC는 하나 이상의 APC 제제로부터 제조된다. 일부 구현예에서, APC는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 자가 APC, 동종이계 APC, 또는 인공 APC이다.
일부 구현예에서, APC 전구체는 단핵구이다. 일부 구현예에서, 단핵구는 CD14+ 단핵구이다. 일부 구현예에서, 단핵구는 항-CD14 항체에 의해 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 2 mL 배지에 105 내지 107 세포/웰로 플레이팅된다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 2 mL 배지에 약 3Х106 세포/웰로 플레이팅된다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 사이토카인 또는 성장 인자를 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 성숙되기 전에 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 또는 적어도 6일 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 단핵구는 배양 배지에서 생체외에서 수지상 세포로 유래된다. 일부 구현예에서, 유래된 수지상 세포는 생체외에서 추가로 성숙되고 항원 펩타이드가 로딩된다. 일부 구현예에서, 유래된 수지상 세포는 하나 이상의 항원 펩타이드를 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 항원 펩타이드는 신생항원 펩타이드이다. 신생항원 펩타이드의 예는, 비제한적으로, HIV 짧은 펩타이드, HIV 긴 펩타이드, 이전에 확인된 신생항원(PIN) 짧은 펩타이드, 및 PIN 긴 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 유래된 수지상 세포는 적어도 30분, 적어도 50분, 적어도 1시간, 또는 적어도 2시간 동안 하나 이상의 신생항원 펩타이드를 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 유래된 수지상 세포는 항원 펩타이드와 함께 인큐베이션된 후 하나 이상의 사이토카인과 추가로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 전체 PBMC는 APC를 제조하는 데 사용되며, APC는 T 세포를 자극하는데 추가로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC는 T 조절 세포(Treg 세포)가 고갈된 다음, FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC는 CD14+ 세포가 고갈된 다음, FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC는 CD25+ 세포가 고갈된 다음, FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC는 CD25+ 및 CD14+ 세포가 고갈된 다음, FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC는 CD25+ 세포, CD14+ 세포, 및 CD19+ 세포가 고갈된 다음, FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC는 FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된 다음, CD14+ 세포가 고갈된다. 일부 구현예에서, PBMC는 FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된 다음, CD25+ 세포가 고갈된다. 일부 구현예에서, PBMC는 FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된 다음, CD14+ 세포 및 CD25+ 세포가 고갈된다. 일부 구현예에서, 단리된 CD14+ 단핵구는 FLT3L을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, FLT3L을 함유하는 배지에서 배양한 후, PBMC(전체, CD14+ 고갈됨, CD25+ 고갈됨, CD25+/CD14+ 고갈됨, 또는 CD25+/CD14+/CD19+ 고갈됨) 또는 단리된 CD14+ 단핵구는 하나 이상의 항원을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, PBMC 또는 단리된 CD14+ 단핵구는 하나 이상의 성숙 사이토카인을 함유하는 배지에서 배양된다. 성숙 사이토카인의 예는, 비제한적으로, GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함한다. 성숙 사이토카인은 다양한 농도로 세포 배양물 또는 배지에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙 사이토카인은 적어도 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.8 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 12 ng/mL, 15 ng/mL, 18 ng/mL, 또는 20 ng/mL의 최종 농도로 세포 배양물 또는 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, 성숙 사이토카인은 적어도 0.05 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.3 μg/mL, 0.4 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.8 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 3 μg/mL, 4 μg/mL, 5 μg/mL, 6 μg/mL, 7 μg/mL, 8 μg/mL, 9 μg/mL, 또는 10 μg/mL의 최종 농도로 세포 배양물 또는 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, 성숙 사이토카인은 적어도 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 80 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 500 U/mL, 800 U/mL, 1000 U/mL, 1500 U/mL, 2000 U/mL, 또는 2500 U/mL(본원에 사용된 바와 같이, 효소 단위는 제조사의 프로토콜에 따라 계산됨)의 최종 농도로 세포 배양물 또는 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, APC 제제에 사용된 PBMC 배양물(전체 PBMC 또는 특정 세포가 고갈된 PBMC)은 T 세포 유도 또는 자극을 위해 추가 인큐베이션 또는 사이토카인 처리된다. 이 경우, APC 제제(예컨대, 성숙 및 펩타이드 로딩) 및 T 세포 유도 또는 자극은 동일한 세포 배양물을 사용하여 수행된다. 일부 다른 경우, APC 제제는 T 세포 자극에 사용된 PBMC 집단과 별개의 세포 집단이다.
일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 펩타이드와 함께 인큐베이션하여, 펩타이드 로딩된 APC 샘플을 생성하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 0.001 - 100 μM의 농도에서 하나 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하여, 펩타이드 로딩된 APC 샘플을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 적어도 약 0.001 μM, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 농도에서 하나 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 최대 약 0.001 μM, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 농도에서 하나 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 약 0.001 μM, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 농도에서 하나 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 적어도 약 0.001 μM, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 농도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 최대 약 0.001 μM, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 농도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 APC 또는 하나 이상의 APC 제제를 약 0.001 μM, 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 농도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
T 세포
T 세포는 림프구로서 알려진 백혈구의 그룹에 속하며, 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 한다. T 세포는 CD4+ T 세포(헬퍼 T 세포) 및 CD8+ T 세포(세포독성 T 세포)를 포함한다. CD4+ T 세포는 B-세포의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는, 면역 과정에서 다른 백혈구를 도울 수 있다. CD4+ T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에 발현된 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원으로 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, T 세포는 빠르게 분열하여 활발한 면역 반응을 조절하는 사이토카인을 분비할 수 있다. CD8+ T 세포는 바이러스로 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴할 수 있고, 또한 이식 거부와 관련될 수 있다. CD8+ T 세포는 신체의 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 회합된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식할 수 있다. 대부분의 T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 갖는다. 다양한 암 또는 감염성 유기체와 관련된 항원을 인식하는 T 세포의 능력은 알파(α) 사슬 및 베타(β) 사슬 또는 감마(γ) 및 델타(δ) 사슬 모두로 구성된 그의 TCR에 의해 부여된다. 이들 사슬을 구성하는 단백질은 TCR의 다양성을 생성하는 고유한 메커니즘을 이용하는 DNA에 의해 코딩된다. 이러한 다중-하위유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합될 수 있고 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 MHC 클래스 I 및 II 단백질에 의해 제시된 펩타이드에 결합할 수 있다. T 세포의 활성화에서의 제1 신호는 T 세포 수용체를 또 다른 세포 상의 MHC에 의해 제시된 짧은 펩타이드에 결합시킴으로써 제공될 수 있다. 이것은 상기 펩타이드에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포만이 활성화되는 것을 보장한다. 파트너 세포는 일반적으로 항원 제시 세포, 예컨대 전문 항원 제시 세포, 일반적으로 나이브 반응의 경우 수지상 세포이지만, B-세포 및 대식세포는 중요한 APC일 수 있다. APC 상의 항원성 펩타이드에 대한 TCR의 결합은 T 세포 활성화에서 중요한 사건일 수 있으며, 이는 T 세포 및 APC 사이의 접촉점에서 면역학적 시냅스에서 발생한다.
각각의 TCR은 가변 상보성 결정 영역(CDR)뿐만 아니라 프레임워크 영역(FR) 및 불변 영역을 함유한다. α 및 β 사슬 가변 도메인의 제3 상보성-결정 영역(CDR3) 루프의 아미노산 서열은 주로 각각 β 사슬 유전자좌에서 가변(Vβ), 다양성(Dβ), 및 결합(Jβ) 유전자 세그먼트 사이, 및 α 사슬 유전자좌에서 유사한 Vα 및 Jα 유전자 세그먼트 사이의 재조합으로부터 발생하는 αβ T 세포의 서열 다양성을 결정한다. TCR α 및 β 사슬 유전자좌에 다수의 이러한 유전자 세그먼트의 존재는 다수의 별개의 CDR3 서열이 코딩되게 한다. TCR 유전자의 재배열 과정 동안 Vβ-Dβ, Dβ-Jβ, 및 Vα-Jα 접합(junction)에서 뉴클레오타이드의 독립적인 부가 및 결실의 존재는 CDR3 서열 다양성을 추가로 증가시킨다. 이와 관련하여, 면역능력은 TCR의 다양성에서 반영된다. γδ TCR은 선천 면역계와 밀접하게 상호작용하는 수용체를 코딩한다는 점에서 αβ TCR과 구별된다. TCRγδ는 발달 초기에 발현되고, 특수한 해부학적 분포를 가지며, 독특한 병원체 및 소분자 특이성을 갖고, 광범위한 선천성 및 적응성 세포 상호작용을 갖는다. 개체발생(ontogeny) 초기에, TCRγδ 세포의 제한된 하위집합은 출생 전에 다양한 조직에 살기 때문에, TCRγ V 및 J 세그먼트 발현의 편향된 패턴이 확립된다.
T 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. T 세포는 농축된 T 세포 제제, APC 고갈된 세포 제제, 또는 실질적으로 정제된 T 세포 제제일 수 있다. T 세포는 혼합된 T 세포 집단 또는 정제된 T 세포 하위집합일 수 있다. T 세포는 T 세포의 단리된 집단에 비해 증가된 T 세포의 수 또는 백분율을 함유하는 농축된 T 세포 제제일 수 있다.
T 세포, 또는 T 세포의 하위집합은 다양한 림프성 조직으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 림프절 조직, 장 관련 림프성 조직, 점막 관련 림프성 조직, 비장 조직, 림프성 조직, 및 종양을 포함하는, 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "말초 혈액 림프구"(PBL) 및 그의 문법적 등가물은 혈액(예컨대, 말초 혈액)에서 순환하는 림프구를 지칭할 수 있다. 말초 혈액 림프구는 기관에 국소화하지 않는 림프구를 지칭할 수 있다. 말초 혈액 림프구는 T 세포, NK 세포, B 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
방법은 대상체로부터 T 세포를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 대상체로부터 단리된 T 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. T 세포는 T 세포주로부터 수득될 수 있다. T 세포는 자가 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 동종이계 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 이종 공급원, 예를 들어, 마우스, 랫트, 비인간 영장류, 및 돼지로부터 수득될 수 있다.
T 세포는 APC 고갈된 세포 제제일 수 있다. T 세포는 APC가 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, T 세포는 APC의 75% 이상으로부터 분리된 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는, 예컨대, 헤파린 첨가된 바이알에서 혈액으로부터 수득될 수 있다. PBMC는 원심분리에 의해 적혈구로부터 분리될 수 있고, PBMC는 계면으로부터 회수될 수 있다. 회수된 PBMC는 선택적으로 세척될 수 있다(예컨대, PBS로).
T 세포 정제는, 예를 들어, 비제한적으로, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD16, CD19 및/또는 CD25에 대한 항체의 사용을 포함하는, 양성 또는 음성 선택에 의해 달성될 수 있다. 특정 T 세포 하위집합, 예컨대 CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD45RO+, CD14-, 및/또는 CD25- T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD45RA+, CD14-, 및/또는 CD25- T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD3+, CD14-, 및/또는 CD25- T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD28+, CD14-, 및/또는 CD25- T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD4+, CD14-, 및/또는 CD25- T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD8+, CD14-, 및/또는 CD25- T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD14- 및/또는 CD25- T 세포는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD19- T 세포는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD16- T 세포는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, CD3+ 및 CD28+ T 세포는 CD3/CD28 접합된 자성 비드를 사용하여 양성 선택될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포 집단의 농축은 CD19, CD16, CD14, CD25 또는 이의 임의의 조합에 대한 항체를 사용한 음성 선택에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포 집단의 농축은 CD19, CD16, CD25 및/또는 CD14에 대한 항체의 조합을 사용한 음성 선택에 의해 달성될 수 있다.
예를 들어, T 세포 샘플은 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포를 포함할 수 있고 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득될 수 있다. T 세포 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및/또는 혈소판을 포함하는, 림프구를 함유할 수 있다. T 세포 샘플의 원하지 않는 구성요소는 제거될 수 있고, 나머지 T 세포는 배양 배지에 현탁될 수 있다. 예를 들어, 세포는 혈장 분율을 제거하기 위해 세척될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 적혈구를 용해시키고 PERCOLL™ 구배를 통한 웜심분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리될 수 있다.
다양한 구현예에서, T 세포를 포함하는 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, T 세포는 TCR 알파 및 TCR 베타 사슬을 갖는 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 TCR 감마 및 TCR 델타 사슬을 갖는 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8 농축된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 나이브 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 기억 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 기억 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 펩타이드 서열은 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 펩타이드 서열은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 펩타이드 서열은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 T 세포의 TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 펩타이드-HLA 복합체에 결합한다.
일부 구현예에서, T 세포는 사이토카인을 함유하는 배지에서 배양된다. 사이토카인의 예는 IL-7 및 IL-15를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 배양물 또는 배지 중의 사이토카인은 적어도 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.8 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 12 ng/mL, 15 ng/mL, 18 ng/mL, 또는 20 ng/mL의 최종 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포 배양물 또는 배지 중의 IL-7은 적어도 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.8 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 12 ng/mL, 15 ng/mL, 18 ng/mL, 또는 20 ng/mL의 최종 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포 배양물 또는 배지 중의 IL-15는 적어도 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.8 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 12 ng/mL, 15 ng/mL, 18 ng/mL, 또는 20 ng/mL의 최종 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포는 FLT3L을 추가로 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, T 세포 배양물 또는 배지 중의 FLT3L은 적어도 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 12 ng/mL, 15 ng/mL, 18 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 또는 200 ng/mL의 최종 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포는 제1 기간 동안 FLT3L을 함유하는 배지에서 인큐베이션, 유도, 또는 자극된다. 일부 구현예에서, T 세포는 제2 기간 동안 추가적으로 첨가된 배지에서 인큐베이션, 유도, 또는 자극된다. 일부 구현예에서, T 세포는 제3 기간 동안 추가적으로 첨가된 FLT3L을 함유하는 배지에서 인큐베이션, 유도, 또는 자극된다. 일부 구현예에서, T 세포는 제4, 제5, 또는 제6 기간 동안 추가적으로 첨가된 FLT3L을 함유하는 배지에서 인큐베이션, 유도, 또는 자극되며, 각 기간에 FLT3L이 새로 첨가된다.
항원
본 개시내용은 면역원성 항원에 특이적인 T 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 APC로 자극된 항원 특이적 T 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 펩타이드는 APC 상에 로딩되며, 이후 펩타이드 로딩된 APC는 T 세포를 자극하여 항원 특이적 T 세포를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원이다. 일부 구현예에서, 펩타이드 로딩에 사용되는 APC는 수지상 세포이다.
일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 대상체의 암 세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 적어도 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,500; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 7,500; 또는 10,000개 이상의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 클래스 I HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 8-12개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 클래스 II HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고, 16-25개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 복수의 항원 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 펩타이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 항원 펩타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원은 신생항원이다. 후보 면역원성 신생항원 서열은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 확인될 수 있다. 본 개시내용의 방법은, 예를 들어, 대상체의 질환에 특이적인 요법을 생성하거나 질환에 대한 백신을 생성하는데 유용할 수 있다. 후보 면역원성 신생항원은 이전에 확인된 신생항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 후보 면역원성 신생항원은 이전에 확인되지 않을 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 후보 면역원성 신생항원은 대상체에 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 후보 신생항원은 복수의 대상체에 특이적일 수 있다.
동물 및 인간 모두에서, 돌연변이된 에피토프는 잠재적으로 면역 반응을 유도하거나 T 세포를 활성화시키는데 효과적일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에서의 감염원, 예컨대 바이러스의 잠재적으로 면역원성 에피토프가 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 암과 같은 질환을 갖는 대상체의 잠재적으로 면역원성 돌연변이된 에피토프가 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적으로 면역원성 항원 또는 신생항원은 이들이 생성된 조직의 유형의 종양 및 세포에서 발현된 분화 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적으로 면역원성 항원 또는 신생항원은 또 다른 분화된 조직에서 발현되지 않는 암/생식 계열 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적으로 면역원성 항원 또는 신생항원은 돌연변이된 항원일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 후보 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드는 유전자 세그먼트의 종양 특이적 전좌를 통해 생성된 융합 단백질의 미스센스 점 돌연변이 또는 항원 또는 신생항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적으로 면역원성 항원 또는 신생항원은 과발현된 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 잠재적으로 면역원성 항원 또는 신생항원은 종양에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적으로 면역원성 항원 또는 신생항원은 분화된 정상 조직의 세포에서 발현이 엄격히 조절된 단백질을 포함할 수 있다.
잠재적 면역원성 돌연변이된 에피토프는 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 암 환자로부터의 종양 조직 및 건강한 조직의 게놈 또는 엑솜 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 이들의 돌연변이 빈도 및 항원 또는 신생항원으로서 작용하는 능력에 기초하여 선택된 유전자는 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱될 수 있다. 일 구현예에서, 시퀀싱 데이터는 대상체의 HLA 분자에 결합할 수 있는 잠재적 면역원성 돌연변이된 펩타이드를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 일 구현예에서, 데이터는 컴퓨터를 사용하여 분석될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 서열 데이터는 항원 또는 신생항원 펩타이드의 존재에 대해 분석될 수 있다. 일 구현예에서, 잠재적 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드는 MHC 분자에 대한 이들의 친화성에 의해 결정될 수 있다.
잠재적 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드는 직접 단백질 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 다차원 질량 분석 기술(예컨대, 탠덤 질량 분석(MS/MS))을 사용한 효소적 단백질의 단백질 시퀀싱은 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 잠재적 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드를 확인하는 데 사용될 수 있다.
공지되지 않은 단백질의 드 노보 시퀀싱을 위한 고처리량 방법은 잠재적 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드를 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공지되지 않은 단백질의 드 노보 시퀀싱을 위한 고처리량 방법, 예컨대 메타-샷건 단백질 시퀀싱은 대상체의 종양의 프로테옴을 분석하여 잠재적 면역원성 발현된 신생항원을 확인하는 데 사용될 수 있다.
잠재적 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드는 또한 항원 특이적 T 세포 반응을 확인하기 위해 MHC 다량체를 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 환자 샘플에서 항원 특이적 T 세포 반응의 고처리량 분석은 MHC 사량체 기반 스크리닝 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 사량체 기반 스크리닝 기술은 잠재적 면역원성 종양 특이적 항원의 초기 확인을 위해, 또는 대안적으로 환자가 어떠한 잠재적 면역원성 항원에 이미 노출되었는지 평가하기 위한 2차 스크리닝 프로토콜로 사용될 수 있고, 이에 의해 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적 면역원성 항원의 선택을 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 분석 또는 특성화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 면역 세포는 분석 또는 특성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극된 면역 세포 샘플은 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC로 자극된 면역 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC와 함께 인큐베이션하여, 자극된 면역 세포 샘플을 수득하는 단계; 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 발현을 측정하는 단계 및 결합을 측정하는 단계는 동시에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 탈과립 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 세포-표면 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 마커는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 것은 펩타이드-MHC 복합체의 펩타이드 및 MHC를 포함하는 MHC 사량체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC는 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC이다. 일부 구현예에서, 펩타이드-MHC 복합체는 하나 이상의 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단은 각각 하나 이상의 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 2개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 샘플은 2개 이상의 샘플 표지로 표지된다. 일부 구현예에서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 단일 세포 분석을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 하나 이상의 세포 마커를 모두 발현하고 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 면역 세포의 백분율을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 형광단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 본원에 기재된 조성물의 면역 세포의 집단을 대표하는 면역 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD3, CD28, CD4, CD8, 또는 임의의 조합을 발현하고/거나, CD14, CD19, CD16, CD25, 또는 이의 임의의 조합을 발현하지 않는 면역 세포 집단은 분석되거나 특성화될 수 있다. 예를 들어, 방법은 특이적 T 세포 하위집단, 예컨대 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD3, CD28, CD4, CD8, 또는 임의의 조합을 발현하고/거나 CD14, CD19, CD16, CD25, 또는 이의 임의의 조합을 발현하지 않는 T 세포 하위 집합을 분석하거나 특성화하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 CD14, CD25, CD19, CD16, 또는 이의 임의의 조합을 발현하지 않는 면역 세포 집단을 분석하거나 특성화하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포 집단에서 하나 이상의 세포 마커의 발현이 결정될 수 있다. 예를 들어, 방법은 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD14, CD25, CD19, CD16 또는 이의 임의의 조합의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC와 함께 인큐베이션하여, 자극된 면역 세포 샘플을 수득하는 단계; 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD14, CD25, CD19, CD16, 또는 이의 임의의 조합의 발현을 측정하는 단계; 및 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 동시에 수행될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재적 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드는 공지된 항원 또는 신생항원 서열일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 잠재 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드는 항원 또는 신생항원 서열의 데이터베이스로부터 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법을 사용하여 확인된 펩타이드(예컨대, 종양 특이적 돌연변이를 갖는 펩타이드, 바이러스 펩타이드, 또는 비암성 질환과 관련된 펩타이드) 또는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일부 구현예에서, 광학적 방법은 면역원성 항원을 선택하거나 확인하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 바코딩된 프로브는 면역원성 항원을 선택하거나 확인하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 특이적 영역 및 바코딩된 영역을 포함하는 바코딩된 프로브는 면역원성 항원을 선택하거나 확인하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 특이적 영역은 표적 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열에 혼성화하거나 적어도 약 90%, 95% 또는 100% 서열 상보성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 시퀀싱 방법은 면역원성 항원을 확인하는 데 사용된다. 임의의 적합한 시퀀싱 방법, 예를 들어, 차세대 시퀀싱(NGS) 기술이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 3세대 시퀀싱 방법은 방법의 시퀀싱 단계의 속도를 높이기 위해 미래에 NGS 기술을 대체할 수 있다. 명확성 목적을 위해: 본 발명의 맥락에서 용어 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"는 생거(Sanger) 화학으로 공지된 "종래의" 시퀀싱 방법과 달리 전체 게놈을 작은 조각으로 쪼개서 전체 게놈을 따라 무작위로 병렬로 핵산 주형을 읽는 모든 고처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술(대규모 병렬 시퀀싱 기술로도 공지됨)은 매우 짧은 기간에, 예컨대 1-2주 내에, 예를 들어, 1-7일 내에 또는 24시간 미만 이내에, 전체 게놈, 엑솜, 전사체(게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(methylome)(게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 전달할 수 있고, 원칙적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 허용할 수 있다. 상업적으로 이용가능하거나 문헌에 언급된 다수의 NGS 플랫폼, 예컨대 WO 제2012/159643호에 상세히 기재된 것이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드 또는 이의 에피토프는, 비제한적으로, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120개 이상의 아미노산 잔기, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 항원 또는 이의 에피토프는 100개 이하의 아미노산이다.
일부 구현예에서, MHC 클래스 I에 대한 항원 또는 신생항원 펩타이드 또는 이의 에피토프는 13개 이하의 잔기 길이이고, 일반적으로 약 8 내지 약 11개의 잔기, 특히 9 또는 10개의 잔기로 구성된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II에 대한 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드 또는 이의 에피토프는 9-24개의 잔기 길이이다.
더 긴 면역원성 펩타이드는 몇 가지 방식으로 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, HLA-결합 펩타이드가 예측되거나 공지된 경우, 더 긴 면역원성 펩타이드는 (1) 각각의 상응하는 유전자 생성물의 N- 및 C-말단 쪽으로의 2-5개의 아미노산의 연장을 갖는 개별적인 결합 펩타이드; 또는 (2) 각각에 대한 연장된 서열을 갖는 결합 펩타이드의 일부 또는 전부의 연쇄(concatenation)로 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, 시퀀싱이 긴(>10 잔기) 에피토프 서열, 예컨대, 종양에 존재하는 신생에피토프(예컨대, 신규한 펩타이드 서열을 초래하는 프레임시프트, 리드쓰루 또는 인트론 포함으로 인해)를 밝혀내는 경우, 더 긴 신생항원 펩타이드는 단일의 더 긴 펩타이드 또는 몇 개의 중첩되는 더 긴 펩타이드로서 신규한 종양 특이적 아미노산의 전체 스트레치로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 더 긴 펩타이드의 사용은 환자 세포에 의한 내인성 가공을 허용하는 것으로 추정되며, T 세포 반응의 보다 효과적인 항원 제시 및 유도를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있으며, 여기서 펩타이드는 중첩되고 긴 신생항원 펩타이드 위에 타일링(tiling)된다.
일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 HLA 단백질(예컨대, HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II)에 결합한다. 특정 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 HLA 단백질에 결합한다. 특정 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 적어도 5000 nM 미만, 적어도 500 nM 미만, 적어도 100 n 미만 M, 적어도 50 nM 미만 또는 그 이하의 IC50 또는 KD를 갖는다.
일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 30, 약 8 내지 약 20, 약 8 내지 약 18, 약 8 내지 약 15, 또는 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 약 8 내지 약 500개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 450, 약 8 내지 약 400, 약 8 내지 약 350, 약 8 내지 약 300, 약 8 내지 약 250, 약 8 내지 약 200, 약 8 내지 약 150, 약 8 내지 약 100, 약 8 내지 약 50, 또는 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 신생항원 펩타이드는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 미만의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 미만의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 또는 적어도 500개의 아미노산의 총 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 350, 최대 400, 최대 450, 또는 최대 500개의 아미노산의 총 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 신생항원 펩타이드는 약 0.5 내지 약 12, 약 2 내지 약 10, 또는 약 4 내지 약 8의 pI 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 신생항원 펩타이드는 적어도 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 이상의 pI 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 신생항원 펩타이드는 최대 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 미만의 pI 값을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 100 pM 내지 약 500 μM, 약 500 pM 내지 약 10 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 1 μM의 HLA 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 μM 이상의 HLA 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 μM의 HLA 결합 친화성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 당업계에 널리 공지된 것과 같은 캐리어, 예컨대, 갑상선글로불린(thyroglobulin), 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 폴리아미노산 잔기, 예컨대 폴리 L-리신, 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자 바이러스 단백질, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 말단-NH2 아실화에 의해, 예컨대, 알카노일(C1-C20) 또는 티오글리콜릴 아세틸화, 말단-카르복실 아미드화, 예컨대, 암모니아, 메틸아민 등에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변형은 지지체 또는 다른 분자에 연결하기 위한 부위를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 비제한적으로 글리코실화, 측쇄 산화, 바이오티닐화, 인산화, 표면 활성 물질, 예컨대 지질의 첨가와 같은 변형을 함유할 수 있거나, 화학적으로 변형될 수 있고, 예컨대, 아세틸화 등이 될 수 있다. 더욱이, 펩타이드에서의 결합은 펩타이드 결합 이외의 것, 예컨대, 공유 결합, 에스테르 또는 에테르 결합, 이황화 결합, 수소 결합, 이온 결합 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 생성된 펩타이드의 물리적 특성(예컨대, 안정성 또는 용해도)을 변형시키기 위한 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 신생항원 펩타이드는 시스테인(C)을 α-아미노 부티르산("B")으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 시스테인은 그의 화학적 성질로 인해 이황화 다리를 형성하고 결합 능력을 감소시키기 위해 펩타이드를 충분히 변화시키는 경향이 있다. C를 α-아미노 부티르산으로 치환하는 것은 이 문제를 완화할 뿐만 아니라 특정 경우 결합 및 교차결합 능력을 실제로 개선한다. 시스테인을 α-아미노 부티르산으로 치환하는 것은 항원 또는 신생항원 펩타이드의 임의의 잔기에서, 예컨대, 펩타이드 내의 에피토프 또는 유사체의 앵커 또는 비앵커 위치에서, 또는 펩타이드의 다른 위치에서 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 펩타이드 또는 신생항원 펩타이드는 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산 잔기, 예컨대 D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2-티에네일알라닌; D- 또는 L- 1, 2, 3, 또는 4-피레네일알라닌; D- 또는 L-3 티에네일알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로-메틸)-페닐알라닌; D-ρ-플루오로페닐알라닌; D- 또는 L-ρ-바이페닐-페닐알라닌; D- 또는 L-ρ-메톡시바이페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알릴)알라닌; 및, D- 또는 L-알킬알라닌을 포함할 수 있고, 여기서 알킬기는 치환되거나 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, sec-이소틸, 이소-펜틸, 또는 비산성 아미노산 잔기일 수 있다. 비천연 아미노산의 방향족 고리는, 예컨대, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다. 다양한 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산 잔기를 갖는 변형된 펩타이드는 생체 내에서 증가된 안정성을 나타내는 경향이 있기 때문에 특히 유용하다. 이러한 펩타이드는 또한 개선된 저장 수명 또는 제조 특성을 가질 수 있다.
펩타이드 안정성은 여러 방식으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티다제 및 다양한 생물학적 배지, 예컨대 인간 혈장 및 혈청이 안정성을 시험하기 위해 사용되었다. 예컨대, 문헌[Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986)]을 참고한다. 본원에 기재된 펩타이드의 반감기는 25% 인간 혈청(v/v) 어세이를 이용하여 편리하게 결정된다. 프로토콜은 다음과 같다: 풀링된 인간 혈청(유형 AB, 비가열 불활성화됨)은 사용 전에 원심분리에 의해 황폐화된다. 이후, 혈청은 RPMI-1640 또는 또 다른 적합한 조직 배양 배지를 이용하여 25%로 희석된다. 미리 결정된 시간 간격으로, 소량의 반응 용액이 제거되고 6% 수성 트리클로로아세트산(TCA) 또는 에탄올에 첨가된다. 탁한 반응 샘플이 15분 동안 (4℃) 냉각된 다음, 침전된 혈청 단백질을 펠렛화하기 위해 회전된다. 이후, 펩타이드의 존재는 안정성 특이적 크로마토그래피 조건을 사용하여 역상 HPLC에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 용액이거나, 동결건조되거나, 또는 결정 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 합성적으로, 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있거나, 또는 천연 종양 또는 병원성 유기체와 같은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 에피토프는 개별적으로 합성되거나 펩타이드에서 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 본원에 기재된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 다른 자연발생 숙주 세포 단백질 및 이의 단편이 실질적으로 없을 것이지만, 일부 구현예에서, 펩타이드는 천연 단편 또는 입자에 결합되도록 합성적으로 접합될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩타이드는 종래의 기술에 따라 용액에서 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 상업적으로 이용가능하며, 공지된 프로토콜에 따라 사용될 수 있다(예를 들어, Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co., 1984 참고). 또한, 개별적인 펩타이드는 화학적 결찰을 사용하여 연결되어 여전히 본 발명의 범위에 속하는 더 큰 펩타이드를 생산할 수 있다.
대안적으로, 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 발현 벡터 내에 삽입되고, 적절한 숙주 세포로 형질전환되거나 형질감염되고, 발현을 위한 적합한 조건 하에 배양되는 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이들 절차는 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]에 기재된 바와 같이, 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 하나 이상의 에피토프를 포함하거나 구성된 재조합 펩타이드는 적절한 T 세포 에피토프를 제시하는 데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기재된 본 개시내용은 또한 1개, 적어도 2개, 또는 2개 초과의 항원 펩타이드 또는 신생항원 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 적어도 2개의 구별되는 펩타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 구별되는 펩타이드는 동일한 폴리펩타이드로부터 유래된다. 구별되는 폴리펩타이드는 펩타이드가 길이, 아미노산 서열 또는 둘 모두가 다르다는 것을 의미한다. 펩타이드는 종양 특이적 돌연변이를 함유하는 것으로 알려져 있거나 이를 함유하는 것으로 밝혀진 임의의 폴리펩타이드로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 단리된 항원 또는 신생항원 펩타이드는 점 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩되어 천연 펩타이드의 아미노산 치환을 초래한다.
약학 조성물
약학 조성물은 활성제를 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의존할 수 있다. 임의의 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제가 당업계에서 적합한 바와 같이 그리고 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 경우에, 약학 조성물은 세포 기반 치료제, 예컨대, T 세포 치료제로서 제제화된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 펩타이드 기반 요법, 핵산 기반 요법, 항체 기반 요법, 및/또는 세포 기반 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 펩타이드 기반 치료제, 또는 핵산 기반 치료제를 포함하고, 여기서 핵산은 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 항체 기반 치료제를 포함한다. 조성물은 2개 이상의 면역원성 항원 또는 신생항원 펩타이드에 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다.
약학 조성물은, 활성 성분 외에, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 비독성인 것이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리딘; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
허용 가능한 담체는 투여된 환자에게 생리학적으로 허용가능하며 그것이 투여되는 화합물의 치료적 특성을 유지한다. 허용 가능한 담체 및 이들의 제제는 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Remington' pharmaceutical Sciences(18th ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)]에 기재되어 있다. 담체의 한 가지 예는 생리 식염수이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 대상 화합물을 한 기관의 투여 부위, 또는 신체의 일부로부터, 또 다른 기관, 또는 신체의 일부로 운반 또는 전달하는데 관여하거나 시험관내 어세이 시스템에 관여하는, 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이다. 허용 가능한 담체는 제제의 다른 성분과 양립가능하며 그것이 투여되는 대상체에게 유해하지 않다. 허용 가능한 담체는 신생항원의 특정 활성을 변경하지 않아야 한다.
일 양태에서, 약학적 투여와 양립가능한, 용매(수성 또는 비수성), 용액, 유화액, 분산 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함하는 약학적으로 허용가능하거나 생리학적으로 허용 가능한 조성물이 본원에 제공된다. 따라서, 약학 조성물 또는 약학적 제제는 대상체에서 약학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 조성물은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 국소)와 양립가능하도록 제제화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 경로에 의해 투여하기에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 조성물에서 면역 세포의 안정성을 개선하기 위해 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 허용 가능한 첨가제는 면역 세포의 특이적 활성을 변경하지 않을 수 있다. 허용 가능한 첨가제의 예는, 비제한적으로, 당, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 자일리톨, 트레할로스, 소르보스, 수크로스, 갈락토스, 덱스트란, 덱스트로스, 프럭토스, 락토스 및 이의 혼합물을 포함한다. 허용 가능한 첨가제는 허용 가능한 담체 및/또는 부형제, 예컨대 덱스트로스와 조합될 수 있다. 대안적으로, 허용 가능한 첨가제의 예는 펩타이드의 안정성을 증가시키고 용액의 겔화를 감소시키기 위해 비제한적으로, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 계면활성제는 용액의 0.01% 내지 5%의 양으로 조성물에 첨가될 수 있다. 이러한 허용 가능한 첨가제의 첨가는 저장시 조성물의 안정성 및 반감기를 증가시킨다.
약학 조성물은, 예를 들어, 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사용 조성물은 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 항균 및 항진균제는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장화제, 예를 들어, 당류, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 생성된 용액은 사용을 위해 그대로 포장되거나 동결건조될 수 있고; 동결건조된 제제는 나중에 투여 전에 멸균 용액과 조합될 수 있다. 정맥내 주사, 또는 고통 부위에서의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대 염화 나트륨 주사, 링거 주사, 락테이티드 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 필요한 양의 활성 성분을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합을 갖는 적절한 용매에 혼입시킨 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 이외의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조일 수 있다.
조성물은 통상적으로, 예를 들어, 정맥 내로, 예컨대 단위 용량의 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사를 위해, 활성 성분은 실질적으로 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대 염화 나트륨 주사, 링거 주사, 락테이티드 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 또한, 조성물은 에어로졸화를 통해 투여될 수 있다.
조성물이 본원에 제공된 의약 또는 임의의 방법에 사용하기 위해 고려되는 경우, 조성물은 실질적으로 발열원이 없을 수 있으므로 인간 환자에게 투여될 때 염증 반응 또는 안전하지 않은 알레르기 반응을 일으키지 않을 것임이 고려된다. 조성물을 발열원에 대해 시험하는 것 및 실질적으로 발열원이 없는 조성물을 제조하는 것은 당업자에게 널리 이해되며, 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 달성될 수 있다.
허용 가능한 담체는 안정화시키거나, 흡수를 증가 또는 지연시키거나, 또는 제거를 증가 또는 지연시키는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물은, 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란; 저분자량 단백질; 펩타이드의 제거 또는 수화를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 다른 안정화제 및/또는 완충제를 포함한다. 흡수를 지연시키는 제제는, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다. 세제는 또한 약학 조성물을 안정화시키거나 이의 흡수를 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 리포좀 담체를 포함한다. 소화를 방지하기 위해, 화합물은 산성 및 효소적 가수분해에 내성을 갖도록 조성물과 복합체화되거나, 또는 화합물은 리포좀과 같은 적절하게 내성인 담체 내에 복합체화될 수 있다. 화합물을 소화로부터 보호하는 수단은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Fix(1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen(1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; 및 미국 특허 제5,391,377호).
조성물은 투여 제제와 양립가능한 방식으로, 그리고 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 치료될 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체의 면역계의 능력, 및 원하는 결합 능력의 정도에 따라 달라진다. 투여될 필요가 있는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 다르며, 각 개체에 고유하다. 초기 투여 및 부스터 샷을 위한 적합한 요법은 또한 가변적이지만, 초기 투여 후 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 1시간 이상의 간격의 반복 투여로 대표된다. 대안적으로, 혈액 내 농도를 유지하는데 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 면역원성 조성물, 예컨대, 신생항원 특이적 반응(예컨대, 체액 또는 세포 매개 면역 반응)을 일으킬 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 종양 특이적 항원 또는 신생항원에 상응하는 본원에 기재된 신생항원 치료제(예컨대, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, TCR, CAR, TCR 또는 CAR을 함유하는 세포, 폴리펩타이드를 함유하는 수지상 세포, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 수지상 세포, 항체 등)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 특이적 세포독성 T 세포 반응, 특이적 헬퍼 T 세포 반응, 또는 B 세포 반응을 일으킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포)로서 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 항원 제시 세포는 환자에서 사용하기 위해 T 세포를 자극하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 관련된 구현예에서, 수지상 세포는 신생항원 펩타이드 또는 핵산으로 펄싱된 자가 수지상 세포이다. 신생항원 펩타이드는 적절한 T 세포 반응을 일으키는 임의의 적합한 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 CTL이다. 일부 구현예에서, T 세포는 HTL이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예는 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로 펄스되거나 로딩된 적어도 하나의 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포)를 함유하는 면역원성 조성물이다. 일부 구현예에서, 이러한 APC는 자가(예컨대, 자가 수지상 세포)이다. 대안적으로, 환자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 생체외에서 신생항원 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 로딩될 수 있다. 관련된 구현예에서, 이러한 APC 또는 PBMC는 환자에게 다시 주사된다. 폴리뉴클레오타이드는 수지상 세포를 형질도입하여, 신생항원 펩타이드의 제시 및 면역의 유도를 초래할 수 있는 임의의 적합한 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 항원 제시 세포(APC)(예컨대, 수지상 세포) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 T 세포(예컨대, 자가 T 세포)를 자극하는 데 사용된다. 관련된 구현예에서, T 세포는 CTL이다. 다른 관련된 구현예에서, T 세포는 HTL이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 이후, 이러한 T 세포는 환자에게 주사된다. 일부 구현예에서, CTL은 환자에게 주사된다. 일부 구현예에서, HTL은 환자에게 주사된다. 일부 구현예에서, CTL 및 HTL 모두는 환자에게 주사된다. 치료제의 투여는 동시에 또는 순차적으로 그리고 임의의 순서로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료적 치료를 위한 본원에 기재된 약학 조성물(예컨대, 면역원성 조성물)은 비경구, 국소, 비강, 경구 또는 국소 투여를 위해 제제화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 비경구로, 예컨대, 정맥내로, 피하로, 피내로, 또는 근육내로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 종양내로 투여될 수 있다. 조성물은 종양에 대해 국소 면역 반응을 유도하기 위해 수술 절제 부위에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 신생항원 펩타이드의 용액을 포함하는 비경구 투여를 위한 조성물이 본원에 기재되고, 면역원성 조성물은 허용 가능한 담체, 예를 들어, 수성 담체에 용해 또는 현탁된다. 다양한 수성 담체, 예컨대, 물, 완충수, 0.9% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 사용될 수 있다. 이들 조성물은 통상적이고 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장될 수 있거나 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다.
항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 보조제의 능력은 전형적으로 면역 매개 반응의 유의한 증가, 또는 질환 증상의 감소에 의해 나타난다. 예를 들어, 체액 면역의 증가는 항원에 대해 발생한 항체의 역가의 유의한 증가에 의해 나타날 수 있고, T 세포 활성의 증가는 증가된 세포 증식, 또는 세포 세포독성, 또는 사이토카인 분비에서 나타날 수 있다. 보조제는 또한, 예를 들어, 주로 체액 또는 T 헬퍼 2 반응을 주로 세포, 또는 T 헬퍼 1 반응으로 변화시킴으로써 면역 반응을 변경할 수 있다.
적합한 보조제는 당업계에 공지되어 있고(WO 제2015/095811호 참고), 비제한적으로 폴리(I:C), 폴리-ICLC, STING 작용제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod), 이뮤팩트(ImuFact) IMP321, IS Patch, ISS, 이스코마트릭스(ISCOMATRIX), 주브이뮨(JuvImmune), 리포박(LipoVac), MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타니드(Montanide) IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V, 몬타니드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, 펩텔(PepTel)® 벡터 시스템, PLG 미세입자, 레시퀴모드(resiquimod), SRL172, 바이로좀(virosome) 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, β-글루칸, Pam3Cys, Pam3CSK4, 사포닌으로부터 유래된 아퀼라 QS21 스티물론(Aquila's QS21 stimulon, Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA), 마이코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체, 및 다른 독점적 보조제, 예컨대 리비 데톡스(Ribi's Detox), 퀼(Quil) 또는 수퍼포스(Superfos)를 포함한다. 수지상 세포에 특이적인 몇 가지 면역학적 보조제(예컨대, MF59) 및 이들의 제조가 기재되었다(Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11) (Mosca et al. Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060) (Gamvrellis et al. Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516)). 또한 사이토카인이 사용될 수 있다. 몇 가지 사이토카인은 림프성 조직으로의 수지상 세포 이동에 영향을 미치는 것(예컨대, TNF-α), T-림프구에 대한 효율적인 항원 제시 세포로의 수지상 세포의 성숙을 가속화시키는 것(예컨대, GM-CSF, PGE1, PGE2, IL-1, IL-1β, IL-4, IL-6 및 CD40L)(그 전체가 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제5,849,589호) 및 면역보조제로서 작용하는 것(예컨대, IL-12)(Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)과 직접적으로 관련되었다.
CpG 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 또한 치료 환경에서 보조제의 효과를 향상시키는 것으로 보고되었다. 이론에 구속되지 않고, CpG 올리고뉴클레오타이드는 톨 유사 수용체(TLR), 주로 TLR9를 통해 선천적(비적응성) 면역계를 활성화시킴으로써 작용한다. CpG 촉발된 TLR9 활성화는 예방적 및 치료적 면역원성 약학 조성물 모두에서 펩타이드 또는 단백질 항원, 생존 또는 사멸된 바이러스, 수지상 세포 면역원성 약학 조성물, 자가 세포 면역원성 약학 조성물 및 다당류 접합체를 포함하는, 광범위한 항원에 대한 항원 특이적 체액 및 세포 반응을 향상시킨다. 중요하게도, 그것은 수지상 세포 성숙 및 분화를 향상시켜, CD4+ T 세포 도움이 없는 경우에도 TH1 세포 및 강한 세포독성 T-림프구(CTL) 생성의 향상된 활성화를 초래한다. TLR9 자극에 의해 유도된 TH1 편향은 일반적으로 TH2 편향을 촉진하는 명반 또는 불완전 프로인트 보조제(IFA)와 같은 보조제의 존재하에서도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오타이드는 다른 보조제와 함께 제제화되거나 공동 투여될 때 또는 특히 항원이 상대적으로 약한 경우 강한 반응을 유도하는데 유용한 미세입자, 나노입자, 지질 유화액 또는 유사한 제제와 같은 제제에서 훨씬 더 큰 보조제 활성을 나타낸다. 이들은 또한 면역 반응을 가속화할 수 있고 일부 실험에서 CpG가 없는 전용량 면역원성 약학 조성물에 대해 대등한 항체 반응으로 항원 용량을 감소시킬 수 있었다(Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, June 2006, 471-484). 미국 특허 제6,406,705호는 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위해 CpG 올리고뉴클레오타이드, 비핵산 보조제 및 항원의 조합된 사용을 기술한다. 상업적으로 이용가능한 CpG TLR9 길항제는 Mologen(Berlin, DE)에 의한 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며, 이는 본원에 기재된 약학 조성물의 구성요소이다. 다른 TLR 결합 분자, 예컨대 RNA 결합 TLR7, TLR8 및/또는 TLR9가 또한 사용될 수 있다.
유용한 보조제의 다른 예는, 비제한적으로, 화학적으로 변형된 CpG(예컨대 CpR, Idera), 폴리(I:C)(예컨대, 폴리I:CI2U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA, TLR8에 대한 ssRNA40 뿐만 아니라 면역활성 소분자 및 항체, 예컨대 사이클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맙, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라피닙, XL-999, CP-547632, 파조파닙, ZD2171, AZD2171, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 및 SC58175를 포함하며, 이는 치료적으로 및/또는 보조제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 유용한 보조제 및 첨가제의 양 및 농도는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 추가의 보조제는 콜로니-자극 인자, 예컨대 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 사르그라모스팀(sargramostim))을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 면역원성 조성물은 1개 초과의 상이한 보조제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 중 어느 것 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 보조제 물질을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 신생항원 치료제(예컨대, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, TCR, CAR, TCR 또는 CAR을 함유하는 세포, 폴리펩타이드를 함유하는 수지상 세포, 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 수지상 세포, 항체 등)를 포함하고, 보조제는 임의의 적절한 순서로 개별적으로 투여될 수 있다.
지질화는 몇 개의 상이한 유형, 예컨대 N-미리스토일화, 팔미토일화, GPI-앵커 첨가, 프레닐화, 및 몇 개의 추가적인 유형의 변형으로 분류될 수 있다. N-미리스토일화는 글리신 잔기에 대한 C14 포화산인 미리스테이트의 공유 부착이다. 팔미토일화는 시스테인 잔기에 대한 장쇄 지방산(C16)의 티오에스테르 연결이다. GPI-앵커 첨가는 아미드 결합을 통한 글리코실-포스파티딜시노시톨(GPI)의 연결이다. 프레닐화는 시스테인 잔기에 대한 이소프레노이드 지질(예컨대, 파르네실(C-15), 제라닐제라닐(C-20))의 티오에테르 연결이다. 추가적인 유형의 변형은 시스테인의 황 원자에 의한 S-디아실글리세롤의 부착, 세린 또는 트레오닌 잔기를 통한 O-옥타노일 접합, 시스테인 잔기에 대한 S-아르카에올(S-archaeol) 접합, 및 콜레스테롤 부착을 포함할 수 있다.
지질화된 펩타이드를 생성하기 위한 지방산은 C2 내지 C30 포화된, 단일불포화된, 또는 다중불포화된 지방 아실기를 포함할 수 있다. 예시적인 지방산은 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일 및 데카노일기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 보조제 특성을 갖는 지질 모이어티는 외인성 보조제의 부재하에 면역원성을 유도하거나 향상시키기 위해 관심있는 폴리펩타이드에 부착된다. 지질화된 펩타이드 또는 지질펩타이드는 자가 보조 지질펩타이드로 지칭될 수 있다. 상기 및 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 지방산은 관심있는 폴리펩타이드의 면역원성을 유도 또는 향상시킬 수 있다. 면역원성을 유도 또는 향상시킬 수 있는 지방산은 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일, 라우로일, 옥타노일, 및 데카노일기를 포함할 수 있다.
네이키드 펩타이드 또는 지질화된 펩타이드와 같은 폴리펩타이드는 리포좀에 혼입될 수 있다. 때때로, 지질화된 펩타이드는 리포좀에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 지질화된 펩타이드의 지질 부분은 리포좀의 지질 이중층 내로 자발적으로 통합될 수 있다. 따라서, 지질펩타이드는 리포좀의 "표면" 상에 제시될 수 있다. 제제에 혼입하기에 적합한 예시적인 리포좀은 비제한적으로, 다중라멜라 비히클(MLV), 올리고라멜라 비히클(OLV), 단일라멜라 비히클(UV), 작은 단일라멜라 비히클(SUV), 중간 크기 단일라멜라 비히클(MUV), 큰 단일라멜라 비히클(LUV), 거대한 단일라멜라 비히클(GUV), 다중소포성 비히클(MVV), 역상 증발 방법(REV)에 의해 제조된 단일 또는 올리고라멜라 비히클, 역상 증발 방법에 의해 제조된 다중라멜라 비히클(MLV-REV), 안정한 다중라멜라 비히클(SPLV), 동결 및 해동된 MLV(FATMLV), 압출 방법에 의해 제조된 비히클(VET), 프렌치 프레스에 의해 제조된 비히클(FPV), 융합에 의해 제조된 비히클(FUV), 탈수-수화 비히클(DRV), 및 버블좀(BSV)을 포함한다.
제조 방법에 따라, 리포좀은 단일라멜라 또는 다중라멜라일 수 있고, 약 0.02 μm 내지 약 10 μm 초과의 범위의 직경으로 크기다 다양할 수 있다. 리포좀은 많은 유형의 세포를 흡수한 다음 혼입된 제제(예컨대, 본원에 기재된 펩타이드)를 방출할 수 있다. 일부 경우에, 리포좀은 표적 세포와 융합하고, 이에 의해 그 후 리포좀의 내용물이 표적 세포로 흘러간다. 리포좀은 식세포성 세포에 의해 세포내이입될 수 있다. 세포내이입에 후 리포좀 지질의 리소좀내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출이 뒤따를 수 있다.
본원에 제공된 리포좀은 또한 담체 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 담체 지질은 인지질이다. 리포좀을 형성할 수 있는 담체 지질은, 비제한적으로 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 포스파티딜콜린(PC; 레시틴), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS)를 포함한다. 다른 적합한 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), di팔미토일포스파티드산(DPPA); 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 등, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 리포좀 형성을 조절하는 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)을 추가로 포함한다. 담체 지질은 임의의 공지된 비포스페이트 극성 지질일 수 있다.
약학 조성물은 널리 공지된 기술을 사용하여 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다. 생분해성 미소구체는 또한 본 발명의 약학 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다.
약학 조성물은 리포좀 또는 미소구체(또는 미세입자)로 투여될 수 있다. 환자에게 투여하기 위한 리포좀 및 미소구체를 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본질적으로, 물질은 수용액에 용해되고, 필요한 경우 계면활성제와 함께 적절한 인지질 및 지질이 첨가되고, 물질은 필요에 따라 투석 또는 초음파 처리된다.
중합체 또는 단백질로 형성된 미소구체는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 위장관을 통해 직접 혈류 내로 들어가도록 맞춤화될 수 있다. 대안적으로, 화합물은 혼입될 수 있고, 미소구체, 또는 미소구체의 복합물은 며칠 내지 몇 달 범위의 기간에 걸쳐 서방성을 위해 이식된다.
세포 기반 면역원성 약학 조성물은 또한 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포(APC) 기반 면역원성 약학 조성물은 당업계에 적합한 바와 같이 그리고 이해되는 바와 같이 임의의 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제를 사용하여 제제화될 수 있다. APC는 단핵구, 단핵구 유래된 세포, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 때대로, APC 기반 면역원성 약학 조성물은 수지상 세포 기반 면역원성 약학 조성물일 수 있다.
수지상 세포 기반 면역원성 약학 조성물은 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 경우, 수지상 세포 기반 면역원성 약학 조성물은 생체외 또는 생체내 방법을 통해 제조될 수 있다. 생체외 방법은 환자 내로 투여하기 전에 DC를 활성화시키거나 로딩하기 위해, 본원에 기재된 폴리펩타이드로 생체외에서 펄싱된 자가 DC의 사용을 포함할 수 있다. 생체내 방법은 본원에 기재된 폴리펩타이드와 커플링된 항체를 사용하여 특이적 DC 수용체를 표적화하는 단계를 포함할 수 있다. DC 기반 면역원성 약학 조성물은 TLR3, TLR-7-8, 및 CD40 작용제와 같은 DC 활성화제를 추가로 포함할 수 있다. DC 기반 면역원성 약학 조성물은 보조제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
보조제는 면역원성 약학 조성물을 받는 환자에서 유발된 면역 반응(체액 및/또는 세포)을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 때때로, 보조제는 Th1-유형 반응을 유발할 수 있다. 다른 경우에, 보조제는 Th2-유형 반응을 유발할 수 있다. IL-4, IL-5 및 IL-10과 같은 사이토카인의 생산을 특징으로 할 수 있는 Th2-유형 반응과 대조적으로 Th1-유형 반응은 IFN-γ와 같은 사이토카인의 생산을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 지질 기반 보조제, 예컨대 MPLA 및 MDP는 본원에 개시된 면역원성 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A(MPLA)는 특정 T 림프구에 대한 리포좀 항원의 제시를 증가시키는 보조제이다. 또한, 무라밀 디펩타이드(MDP)는 또한 본원에 기재된 면역원성 약학적 제제와 함께 적합한 보조제로서 사용될 수 있다.
보조제는 또한 사이토카인과 같은 자극 분자를 포함할 수 있다. 사이토카인의 비제한적인 예는 CCL20, α-인터페론(IFNα), β-인터페론(IFNβ), γ-인터페론(IFNγ), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), TNFα, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인(TECK), 점막 관련 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1-, IL-8, L- 셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, 및 TAP2를 포함한다.
추가의 보조제는 MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능적 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제는 톨 유사 수용체의 조절제일 수 있다. 톨 유사 수용체의 조절제의 예는 TLR9 작용제를 포함하고 이미퀴모드와 같은 톨 유사 수용체의 소분자 조절제에 제한되지 않는다. 때때로, 보조제는 박테리아 톡소이드, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 중합체, 알루미늄 염, 리포좀, CpG 중합체, 수중유 유화액, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 때때로, 보조제는 수중유 유화액이다. 수중유 유화액은 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함할 수 있고, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성(대사가능)이고 생체양립가능하다. 유화액 내의 오일 액적은 5 μm 미만의 직경일 수 있고, 마이크론 이하의 직경을 가질 수 있으며, 이들 작은 크기는 미세유동기로 달성되어 안정적인 유화액을 제공한다. 220 nm 미만의 크기를 갖는 액적은 여과 멸균될 수 있다.
일부 경우에, 면역원성 약학 조성물은 담체 및 부형제(비제한적으로 완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신, 항산화제, 정균제, 킬레이트제, 현탁화제, 증점제 및/또는 보존제 포함), 물, 바셀린, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩 오일, 콩기름, 미네랄 오일, 참기름 등, 식염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 향미제, 착색제, 탈점착제(detackifier) 및 다른 허용 가능한 첨가제, 보조제, 또는 결합제, 생리학적 조건을 근사화하기 위해 필요한 다른 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 완충제, 등장성 조절제, 유화제, 습윤제 등을 포함할 수 있다. 부형제의 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화 나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 또 다른 경우에, 약학적 제제는 실질적으로 보존제가 없다. 다른 경우에, 약학적 제제는 적어도 하나의 보존제를 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본원에 기재된 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 담체의 유형이 투여 방식에 따라 달라질 것임이 인식될 것이다.
면역원성 약학 조성물은 티메로살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역원성 약학 조성물은 실질적으로 수은 물질이 없고(예컨대, <10 μg/mL), 예컨대 티메로살이 없다. α-토코페롤 석시네이트는 수은 화합물의 대안으로서 사용될 수 있다.
등장성을 제어하기 위해, 나트륨 염과 같은 생리학적 염이 면역원성 약학 조성물에 포함될 수 있다. 다른 염은 염화 칼륨, 인산 이수소 칼륨, 및/또는 염화 마그네슘 등을 포함할 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 240-360 mOsm/kg, 또는 290-310 mOsm/kg의 범위 내의 삼투압을 가질 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 하나 이상의 완충제, 예컨대 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 석시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(특히 수산화 알루미늄 보조제를 가짐); 또는 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 완충제는 5-20 또는 10-50 mM 범위로 포함된다.
면역원성 약학 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 7.0 내지 약 7.8일 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 멸균일 수 있다. 면역원성 약학 조성물은 비발열원성일 수 있고, 예컨대 용량당 <1 EU(내독소 단위, 표준 척도)를 함유하고 용량당 <0.1 EU일 수 있다. 조성물은 글루텐이 없을 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 세제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tweens'으로 공지됨), 또는 옥톡시놀(예컨대, 옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 포함할 수 있다. 세제는 미량으로만 존재할 수 있다. 면역원성 약학 조성물은 1 mg/mL 미만의 각각의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 미량의 다른 잔류 구성요소는 항생제(예컨대, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹시 B)일 수 있다.
면역원성 약학 조성물은 당업계에 공지된 적합한 비히클에서의 멸균 용액 또는 현탁액으로 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장될 수 있거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다.
예를 들어, 하나 이상의 보조제와 조합된, 본원에 개시된 면역 세포와 같은 활성제를 포함하는 약학 조성물은 특정 몰비를 포함하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 보조제와 조합된 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제의 약 99:1 내지 약 1:99의 몰비가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 보조제와 조합된 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제의 몰비의 비율은 약 80:20 내지 약 20:80; 약 75:25 내지 약 25:75, 약 70:30 내지 약 30:70, 약 66:33 내지 약 33:66, 약 60:40 내지 약 40:60; 약 50:50; 및 약 90:10 내지 약 10:90으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 보조제와 조합된 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제의 몰비는 약 1:9일 수 있고, 일부 경우에 약 1:1일 수 있다. 하나 이상의 보조제와 조합된 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제의 몰비는 예컨대, 하나의 바이알, 좌제, 정제, 캡슐, 에어로졸 스프레이에서, 동일한 투여량 단위로 함께 제제화될 수 있거나; 또는 각각의 제제, 형태, 및/또는 화합물은 별도의 단위, 예컨대, 2개의 바이알, 좌제, 정제, 2개의 캡슐, 정제 및 바이알, 에어로졸 스프레이 등으로 제제화될 수 있다.
일부 경우에, 면역원성 약학 조성물은 추가의 제제와 함께 투여될 수 있다. 추가의 제제의 선택은 치료될 상태에 적어도 일부 좌우될 수 있다. 추가의 제제는, 예를 들어, 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 항-CTLA4, 항-PD-L1, 항 CD40, 또는 항-TIM3 제제(예컨대, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-PD-L1, 항 CD40, 또는 항-TIM3 항체); 또는 예컨대, NSAID, 예컨대, 이부프로펜, 나프록센, 아세타미노펜, 케토프로펜, 또는 아스피린과 같은 염증 상태를 치료하는 데 사용되는 약물을 포함하는, 병원체 감염(예컨대, 바이러스 감염)에 치료적 효과를 갖는 임의의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 체크포인트 억제제는 니볼루맙(ONO-4538/BMS-936558, MDX1 106, OPDIVO), 펨브롤리주맙(MK-3475, KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011), 및 MPDL328OA(ROCHE)로 이루어진 군으로부터 선택된 PD-1/PD-L1 길항제일 수 있다. 또 다른 예로서, 제제는 비타민 C, E 또는 다른 항산화제와 같은 하나 이상의 보충제를 추가적으로 함유할 수 있다.
하나 이상의 보조제와 조합된 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제를 포함하는 약학 조성물은 예컨대, 활성제를 투여될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는, 부형제, 희석제, 및/또는 보조제를 포함하는, 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 적어도 부분적으로 의존할 수 있다. 본원에 기재된 제제(들)는 경구, 협측, 국소, 직장, 경피, 경점막, 피하, 정맥내, 및 근육내 적용 뿐만 아니라 흡입을 포함하는 다수의 투여 경로 또는 방식을 사용하여 환자에게 전달될 수 있다.
활성제는 비경구 투여(예컨대, 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해)를 위해 제제화될 수 있고, 앰플, 프리필드 시린지, 소량 주입 또는 추가된 보존제를 갖는 다용량 용기에서 단위 용량 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 유화액, 예를 들어 수성 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액과 같은 형태를 취할 수 있다.
주사가능한 제제의 경우, 비히클은 당업계에서 적합한 것으로 공지된 것으로부터 선택될 수 있으며, 이는 참기름, 옥수수 오일, 면실유, 또는 땅콩유뿐만 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로스, 또는 멸균 수성 용액, 및 유사한 약학적 비히클을 갖는 수용액 또는 오일 현탁액, 또는 유화액을 포함한다. 제제는 또한 생체양립가능한 생분해성 중합체 조성물, 예컨대 폴리(락틱-co-글리콜)산을 포함할 수 있다. 이들 물질은 약물이 로딩되고 추가로 코팅 또는 유도체화되어 우수한 지속 방출 성능을 제공하는, 마이크로 또는 나노구체로 제조될 수 있다. 안구주위 또는 안구내 주사에 적합한 비히클은, 예를 들어, 친유성 물질에 적합한 주사용수, 리포좀 및 비히클 중의 치료제의 현탁액을 포함한다. 안구주위 또는 안구내 주사를 위한 다른 비히클은 당업계에 널리 공지되어 있다.
일부 경우에, 약학 조성물은 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약학 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위해 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰트와 같은 밀봉된 용기에서 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서, 개별적으로 공급되거나 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
투여가 주사에 의하는 경우, 활성제는 특히 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 완충제와 같은 생리학적으로 양립가능한 완충제에서, 수용액으로 제제화될 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 펩타이드에 의해 자극된 면역 반응을 향상시키기 위해 첨가된 보조제 또는 임의의 다른 물질을 포함하지 않는다.
전술한 제제 외에, 활성제는 또한 데포(depot) 제제로서 제제화될 수 있다. 이러한 지속 작용 제제는 이식 또는 경피 전달(예를 들어, 피하로 또는 근육내로), 근육내 주사 또는 경피 패치의 사용에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제제는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지를 이용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 제제를 포함하는 약학 조성물은 국소적으로 투여되거나 감염의 특정 부위에 또는 근처에 주사될 때 국소 및 지역 효과를 발휘한다. 예컨대, 점성 액체, 용액, 현탁액, 디메틸설폭사이드(DMSO) 기반 용액, 리포좀 제제, 겔, 젤리, 크림, 로션, 연고, 좌제, 포말, 또는 에어로졸 스프레이의 직접 국소 적용은, 예를 들어 국소 및/또는 지역 효과를 생성하기 위해 국소 투여용으로 사용될 수 있다. 이러한 제제를 위한 약학적으로 적절한 비히클은, 예를 들어, 저급 지방족 알콜, 폴리글리콜(예컨대, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜), 지방산의 에스테르, 오일, 지방, 실리콘 등을 포함한다. 이러한 제제는 또한 보존제(예컨대, p-하이드록시벤조산 에스테르) 및/또는 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 토코페롤)을 포함할 수 있다. 또한 문헌[Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (Ed.), Marcel Dekker Incl, 1983]을 참고한다. 또 다른 구현예에서, 수송체, 담체, 또는 이온 채널 억제제를 포함하는 국소 제제는 표피 또는 점막 바이러스 감염을 치료하는 데 사용된다.
약학 조성물은 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 선스크린제, 냄새 흡수제 및 염료와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 고려되는 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예를 들어, 조성물의 총 중량의 약 0.01% 내지 약 20%이다. 이들의 성질에 따라, 이들 보조제는 지방 상, 수성 상 및/또는 지질 비히클에 도입될 수 있다.
치료 방법
질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 치료 방법은 본원에 개시된 조성물 또는 약학 조성물을 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 면역원성 요법을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 질환(예컨대, 암 또는 바이러스 감염)을 위한 치료 방법이 제공된다. 방법은 본원에 제공된 방법에 따라 면역원성 항원 특이적 T 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 종양 항원을 포함한다.
제조될 수 있는 치료제의 비제한적인 예는 펩타이드 기반 요법, 핵산 기반 요법, 항체 기반 요법, T 세포 기반 요법, 및 항원 제시 세포 기반 요법을 포함한다.
일부 다른 양태에서, 요법에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 조성물 또는 약학 조성물의 용도가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 면역원성 신생항원 펩타이드를 특이적으로 인식하는 T 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 T 세포에서 발현된 TCR과 같은 면역원성 신생항원 펩타이드를 특이적으로 인식하는 TCR의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 폐암(소 세포 폐암, 비소 세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암(위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 흑색종, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 두경부암, 결장직장암, 직장암, 연조직 육종, 카포시 육종, B-세포 림프종(저 등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 작은 림프성(SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 확산성 NHL, 고 등급 면역모세포성 NHL, 고 등급 림프모세포성 NHL, 고 등급 작은 비절단된 세포 NHL, 거대 질환(bulky disease) NHL, 맨틀 세포 림프종, AIDS 관련 림프종, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함), 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 골수종, 모양 세포 백혈병, 만성 골수모세포 백혈병, 및 이식후 림프구증식성 장애(PTLD), 모반증과 연관된 비정상적인 혈관 증식, 부종, 메이그 증후군, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법에 따라 확인된 면역원성 신생항원 펩타이드가 동일한 개체에 대한 치료제(예컨대, 백신 또는 치료 항체)를 개발하는 데 사용되는 경우, 본원에 기재된 방법은 개인맞춤형 의료 맥락에서 특히 유용하다. 따라서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 본원에 기재된 방법에 따라 대상체에서 면역원성 신생항원 펩타이드를 확인하는 단계; 및 펩타이드(또는 이의 전구체)를 합성하는 단계; 및 확인된 신생항원에 특이적인 T 세포를 제조하는 단계; 및 신생항원 특이적 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 비관련)과 같은 종래의 치료 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 종양 항원의 세트가 본원에 기재된 방법을 사용하여 확인될 수 있고, 예컨대, 대부분의 암 환자에서 유용하다.
일부 구현예에서, 면역원성 요법을 포함하는 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 면역요법제가 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 화학요법제는 상이한 부류의 화학요법제에 속할 수 있다.
본원에 제공된 치료 또는 사용 방법의 실시에서, 치료제의 치료적 유효량이 질환 또는 상태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강, 사용된 화합물의 효능, 및 다른 인자에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.
대상체는, 예를 들어, 포유동물, 인간, 임산부, 노인, 성인, 청소년, 사춘기 이전의 청소년, 어린이, 유아, 또는 신생아일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 인간일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 어린이(즉, 사춘기 미만의 어린 인간)일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 유아일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 유아식을 먹는 유아일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 임상 연구에 등록된 개인일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 실험실 동물, 예를 들어, 포유동물, 또는 설치류일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 마우스일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 비만 또는 과체중인 대상체일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 이전에 하나 이상의 상이한 암 치료 양식으로 치료받았다. 일부 구현예에서, 대상체는 이전에 방사선요법, 화학요법, 또는 면역요법 중 하나 이상으로 치료받았다. 일부 구현예에서, 대상체는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 방식의 이전 요법으로 치료받았다. 일부 구현예에서, 이전 요법은 세포독성 요법이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 질환 또는 상태는 암이다. 암은 제어되지 않는 방식으로 증식하고, 일부 경우에 전이(확산)되는 경향이 있는 세포의 비정상적인 성장이다. 종양은 암성이거나 양성일 수 있다. 양성 종양은 종양이 성장할 수 있지만 확산하지 않는다는 것을 의미한다. 암성 종양은 악성이며, 이는 그것이 성장할 수 있고 신체의 다른 부분으로 확산할 수 있다는 것을 의미한다. 암이 확산(전이)하는 경우, 새로운 종양은 원래(1차) 종양과 동일한 이름을 갖는다.
본 개시내용의 방법은 당업계에 공지된 임의의 유형의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암의 비제한적인 예는 흑색종(예컨대, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예컨대, 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(예컨대, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 췌장 선암종, 유방암, 결장암, 폐암(예컨대, 비소 세포 폐암), 식도암, 두경부의 편평 세포 암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경교종, 백혈병, 림프종, 및 다른 신생물 악성종양을 포함할 수 있다.
또한, 본원에 제공된 질환 또는 상태는 본 개시내용의 치료 방법을 사용하여 성장이 억제될 수 있는 불응성 또는 재발성 악성종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 암종, 편평 암종, 선암종, 육종, 자궁내막암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 나팔관암, 원발성 복막암, 결장암, 결장직장암, 항문생식기 부위의 편평 세포 암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 비소 세포 폐암, 폐의 편평 세포 암종, 위암, 방광암, 담낭암, 간암, 갑상선암, 후두암, 타액선암, 식도암, 두경부암, 교모세포종, 신경교종, 두경부의 편평 세포 암종, 전립선암, 췌장암, 중피종, 육종, 혈액암, 백혈병, 림프종, 신경종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은, 예를 들어, 암종, 편평 암종(예를 들어, 자궁경관, 눈꺼풀, 결막(tunica conjunctiva), 질, 폐, 구강, 피부, 방광, 혀, 후두, 및 식도), 및 선암종(예를 들어, 전립선, 소장, 자궁내막, 자궁경관, 대장, 폐, 췌장, 식도, 직장, 자궁, 위, 유선, 및 난소)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은 육종(예를 들어, 근육성 육종), 백혈병, 신경종, 흑색종, 및 림프종을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 난소암이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 결장직장암이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약학 조성물로 치료될 환자 또는 환자의 집단은 고형 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 타액선암, 전립선암, 췌장암, 또는 메르켈 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 약학 조성물로 치료될 환자 또는 환자의 집단은 혈액암을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 혈액암, 예컨대 확산성 거대 B 세포 림프종("DLBCL"), 호지킨 림프종("HL"), 비호지킨 림프종("NHL"), 여포성 림프종("FL"), 급성 골수 백혈병("AML"), 또는 다발성 골수종("MM")을 갖는다. 일부 구현예에서, 치료될 환자 또는 환자의 집단은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는다.
본 개시내용에 따라 예방 및/또는 치료될 수 암의 특정 예는, 비제한적으로, 다음을 포함한다: 신장암, 다형성 교모세포종, 전이성 유방암; 유방 암종; 유방 육종; 신경섬유종; 신경섬유종증; 소아 종양; 신경모세포종; 악성 흑색종; 표피의 암종; 백혈병, 예컨대 비제한적으로, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 예컨대 골수모구, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 적백혈병 백혈병 및 골수형성이상 증후군, 만성 백혈병, 예컨대 비제한적으로, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병; 진성 다혈구증; 림프종, 예컨대 비제한적으로 호지킨병, 비호지킨병; 다발성 골수종, 예컨대 비제한적으로 무증상 다발성 골수종, 비분비 골수종, 골경화성 골수종, 혈장 세포 백혈병, 고립성 형질세포종 및 수질외 형질세포종; 발덴스트롬 매크로글로불린혈증; 미확정 단클론 감마글로불린혈증; 양성 단클론 감마글로불린혈증; 중쇄 질환; 골암 및 결합 조직 육종, 예컨대 비제한적으로 골 육종, 골수종 골 질환, 다발성 골수종, 진주종 유도된 골 골육종, 골의 파제트병, 골육종, 연골육종, 유윙 육종, 악성 거대 세포 종양, 골의 섬유육종, 척색종, 골막육종, 연조직 육종, 혈관육종(hemangiosarcoma), 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 신경집종, 횡문근육종, 윤활막 육종; 뇌 종양, 예컨대 비제한적으로, 신경교종, 성상세포종, 뇌 줄기 신경교종, 뇌실막종, 희소돌기아교세포종, 비신경교 종양, 청각 신경초종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 송과체종, 송과체모세포종, 및 원발성 뇌 림프종; 비제한적으로 선암종, 소엽(소세포) 암종, 관내 암종, 수질 유방암, 점액성 유방암, 관상 유방암, 유두 유방암, 파제트병(소아 파제트병 포함) 및 염증성 유방암을 포함하는 유방암; 부신암, 예컨대 비제한적으로 갈색세포종 및 부신피질 암종; 갑상선암, 예컨대 비제한적으로 유두 또는 여포 갑상선암, 수질 갑상선암 및 미분화 갑상선암; 췌장암, 예컨대 비제한적으로, 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마, 소마토스타틴 분비 종양, 및 유암 또는 섬 세포 종양; 뇌하수체암, 예컨대 비제한적으로 쿠싱병, 프로락틴 분비 종양, 말단비대증(acromegaly), 및 요붕증; 눈암, 예컨대 비제한적으로 안구 흑색종, 예컨대 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 및 섬모체 흑색종, 및 망막모세포종; 질암, 예컨대 편평 세포 암종, 선암종, 및 흑색종; 외음부암, 예컨대 편평 세포 암종, 흑색종, 선암종, 기저 세포 암종, 육종, 및 파제트병; 자궁경부암, 예컨대 비제한적으로, 편평 세포 암종, 및 선암종; 자궁암, 예컨대 비제한적으로 자궁내막 암종 및 자궁 육종; 난소암, 예컨대 비제한적으로, 난소 상피 암종, 경계성 종양, 생식 세포 종양, 및 기질 종양; 자궁경부 암종; 식도암, 예컨대 비제한적으로, 편평암, 선암종, 선양 낭성 암종, 점액표피모양 암종, 선편평 암종, 육종, 흑색종, 혈질세포종, 사마귀모양 암종, 및 귀리 세포(소 세포) 암종; 위암, 예컨대 비제한적으로, 선암종, 돌출형(폴립성), 궤양성, 표재 확산성, 미만 확장성, 악성 림프종, 지방육종, 섬유육종, 및 암육종; 결장암; 결장직장암, KRAS 돌연변이된 결장직장암; 결장 암종; 직장암; 간암, 예컨대 비제한적으로 간세포 암종 및 간모세포종, 담낭암, 예컨대 선암종; 담관암종, 예컨대 비제한적으로 유두상, 결절성, 및 미만성; 폐암, 예컨대 KRAS 돌연변이된 비소 세포 폐암, 비소 세포 폐암, 편평 세포 암종(표피모양 암종), 선암종, 거대 세포 암종 및 소세포 폐암; 폐 암종; 고환암, 예컨대 비제한적으로 생식세포 종양, 고환종, 역형성, 고전적(전형적), 정모세포성, 비정상피종, 배아 암종, 기형종 암종, 융모막암종(난황낭 종양), 전립선암, 예컨대 비제한적으로, 안드로겐 비의존적 전립선암, 안드로겐 의존적 전립선암, 선암종, 평활근육종, 및 횡문근육종; 음경암; 구강암, 예컨대 비제한적으로 편평 세포 암종; 기저 암; 타액선암, 예컨대 비제한적으로 선암종, 점막표피모양 암종, 및 선양낭성 암종; 인두암, 예컨대 비제한적으로 편평 세포 암, 및 사마귀; 피부암, 예컨대 비제한적으로, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 및 흑색종, 표재 확산성 흑색종, 결절성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 말단 흑자 흑색종; 신장암, 예컨대 비제한적으로 신장 세포 암, 선암종, 부신종, 섬유육종, 이행 세포 암(신우 및/또는 우테러(uterer)); 신장 암종; 윌름스 종양; 방광암, 예컨대 비제한적으로 이행 세포 암종, 편평 세포 암, 선암종, 암육종을 포함한다. 또한, 암은 점액육종, 골육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 윤활막종, 혈관모세포종, 상피 암종, 낭샘암종, 기관지원성 암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종 및 유두 선암종을 포함한다.
키트
본원에 기재된 방법 및 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 키트 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로 키트는 단위 투여 형태로 용기 내에 원하는 신생항원 치료용 조성물 및 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 추가 치료제, 예를 들어, 사이토카인, 림포카인, 체크포인트 억제제, 항체가 또한 키트에 포함될 수 있다. 또한 바람직할 수 있는 다른 키트 구성요소는, 예를 들어, 멸균 시린지, 부스터 투여량, 및 다른 원하는 부형제를 포함한다.
키트 및 제조 물품은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 방법과 함께 사용하기 위해 본원에 제공된다. 키트는 하나 이상의 유형의 면역 세포를 함유할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 바와 같은 항원 특이적 면역 세포(예컨대, 신생항원 특이적 T 세포) 생산에 유용한 시약, 펩타이드, 및/또는 세포를 함유할 수 있다. 키트는 항원 특이적 면역 세포의 구성 및 전달에 필요한 보조제, 시약, 및 완충제를 추가로 함유할 수 있다.
키트는 또한 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 포장, 또는 용기를 포함할 수 있고, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에 사용될 폴리펩타이드 및 보조제와 같은 개별 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다.
본원에 제공된 제조 물품은 포장 물질을 함유한다. 약학적 포장 물질의 예는, 비제한적으로, 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장 물질을 포함한다. 키트는 전형적으로 내용물을 열거하는 라벨 및/또는 사용 설명서, 및 사용 설명서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한다. 설명서 세트가 또한 포함될 수 있다.
구현예 단락
[1] (a) 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단, 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양과 비례적으로 상이한 것인 약학 조성물.
[2] 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적은 것인 조성물.
[3] (a) 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로서, T 세포는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하고 APC 자극된 T 세포인 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하고, APC는 FLT3L로 자극된 APC인 것인 면역 세포의 집단; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
[4] 단락 [1]에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 APC 자극된 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[5] 단락 [1], [3] 및 [4] 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적은 것인 조성물.
[6] 단락 [1], [3] 및 [4] 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 집단 중의 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 많은 것인 조성물.
[7] 단락 [1]-[6] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된 것인 조성물.
[8] 단락 [7]에 있어서, 대상체는 인간인 것인 조성물.
[9] 단락 [7] 또는 [8]에 있어서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는 것인 조성물.
[10] 단락 [9]에 있어서, 질환 또는 장애는 암인 것인 조성물.
[11] 단락 [10]에 있어서, 암은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
[12] 단락 [1]-[11] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[13] 단락 [1]-[12] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[14] 단락 [1]-[13] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4 농축된 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[15] 단락 [1]-[14] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8 농축된 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[16] 단락 [1]-[15] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 기억 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[17] 단락 [1]-[16] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 나이브 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[18] 단락 [1]-[17] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 기억 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[19] 단락 [1]-[18] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[20] 단락 [1]-[19] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 기억 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[21] 단락 [1]-[20] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 나이브 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[22] 단락 [1]-[21] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 조성물.
[23] 단락 [1]-[22] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 조성물.
[24] 단락 [1]-[23] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 조성물.
[25] 단락 [1]-[24] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하는 것인 조성물.
[26] 단락 [1]-[25] 중 어느 한 단락에 있어서, TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 펩타이드-HLA 복합체에 결합하는 것인 조성물.
[27] 단락 [1]-[26] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함하는 것인 조성물.
[28] 단락 [1]-[27] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩되는 것인 조성물.
[29] 단락 [1]-[28] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 적어도 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,500; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 7,500; 또는 10,000개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 조성물.
[30] 단락 [1]-[29] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 I HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 8-12개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 조성물.
[31] 단락 [1]-[30] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 II HLA 대립유전자에 코딩된 단백질에 결합하고 16-25개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 조성물.
[32] 단락 [1]-[31] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 복수의 항원 펩타이드 서열을 포함하는 것인 조성물.
[33] 단락 [32]에 있어서, 복수의 항원 펩타이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 항원 펩타이드 서열을 포함하는 것인 조성물.
[34] 단락 [3]-[33] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 하나 이상의 APC 제제인 것인 조성물.
[35] 단락 [3]-[34] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 성숙한 APC인 것인 조성물.
[36] 단락 [3]-[35] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함하는 것인 조성물.
[37] 단락 [3]-[36] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 자가 APC, 동종이계 APC, 또는 인공 APC인 것인 조성물.
[38] 단락 [3]-[37] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 수지상 세포(DC)를 포함하는 것인 조성물.
[39] 단락 [4]-[38] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래되거나, CD14 농축된 APC이거나, CD141 농축된 APC인 것인 조성물.
[40] 단락 [39]에 있어서, CD14+ 단핵구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 농축된 것인 조성물.
[41] 단락 [39] 또는 [40]에 있어서, CD14+ 단핵구는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된 것인 조성물.
[42] 단락 [41]에 있어서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
[43] 단락 [39]-[42] 중 어느 한 단락에 있어서, CD14+ 단핵구는 PBMC를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된 것인 조성물.
[44] 단락 [43]에 있어서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된 것인 조성물.
[45] 단락 [1]-[44] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 것인 조성물.
[46] 단락 [1] 및 [3]-[45] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 IL-7, IL-15, 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 자극된 것인 조성물.
[47] 단락 [46]에 있어서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
[48] 단락 [1]-[47] 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 조성물.
[49] 단락 [1]-[48] 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 조성물.
[50] 단락 [1]-[49] 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 조성물.
[51] 단락 [1]-[50] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%인 것인 조성물.
[52] 단락 [1]-[51] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%인 것인 조성물.
[53] 단락 [1]-[52] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%인 것인 조성물.
[54] 단락 [1]-[53] 중 어느 한 단락에 있어서, 항원은 신생항원, 종양 관련 항원, 과발현된 항원, 바이러스 항원, 부조직적합 항원 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
[55] 단락 [1]-[54] 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 수는 적어도 약 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 또는 5x108개의 항원 특이적 CD8+ T 세포인 것인 조성물.
[56] 단락 [1]-[54] 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 수는 적어도 약 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 또는 5x108개의 항원 특이적 CD4+ T 세포인 것인 조성물.
[57] 단락 [1]-[56] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
[58] 단락 [1]-[57] 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 집단 중의 CD19 및/또는 CD16을 발현하는 면역 세포의 양은 생물학적 샘플에서 CD19 및/또는 CD16을 발현하는 면역 세포의 양보다 적은 것인 조성물.
[59] 단락 [1] 또는 [3]-[58] 중 어느 한 단락의 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
[60] 요법에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 단락 [1] 또는 [3]-[58] 중 어느 한 단락의 조성물의 용도.
[61] APC를 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법.
[62] FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법.
[63] (a) FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)를 제1 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (b) 이후 생물학적 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법.
[64] 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제 중 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나, 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법.
[65] 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 별개의 기간 동안 3개 이하의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포는 확장되거나 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포는 유도되는 것인 방법.
[66] 단락 [62]-[65] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 세포의 집단은 CD14 및/또는 CD25 발현 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터 유래된 것인 방법.
[67] 단락 [61] 또는 [66]에 있어서, 생물학적 샘플은 CD19 발현 세포가 추가로 고갈된 것인 방법.
[68] 단락 [61] 또는 [63]에 있어서, APC는 FLT3L로 자극된 APC인 것인 방법.
[69] 단락 [64]-[67] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 세포의 집단을 인큐베이션하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합을 함유하는 배지에서 수행되는 것인 방법.
[70] 단락 [69]에 있어서, 배지는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
[71] 단락 [70]에 있어서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
[72] 단락 [64]-[71] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 제제 중 적어도 하나는 FLT3L로 자극된 APC를 포함하는 것인 방법.
[73] 단락 [64]-[71] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 제제 중 적어도 2개는 LT3L 자극된 APC를 포함하는 것인 방법.
[74] 단락 [64]-[71] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 제제 중 적어도 3개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함하는 것인 방법.
[75] 단락 [64]-[71] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 제제 각각은 FLT3L로 자극된 APC를 포함하는 것인 방법.
[76] 단락 [61]-[63] 중 어느 한 단락에 있어서, APC는 하나 이상의 APC 제제를 포함하는 것인 방법.
[77] 단락 [61]-[76] 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 APC 제제는 3개 이하의 APC 제제를 포함하는 것인 방법.
[78] 단락 [64]-[77] 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 APC 제제는 하나 이상의 별개의 기간 내에 순차적으로 면역 세포와 함께 인큐베이션되는 것인 방법.
[79] 단락 [61]-[78] 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나는 생물학적 샘플로부터의 APC인 것인 방법.
[80] 단락 [61]-[79] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 세포의 집단은 APC 또는 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
[81] 단락 [61]-[79] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 세포의 집단은 APC를 포함하지 않고, 면역 세포의 집단은 하나 이상의 APC 제제 중 하나를 포함하지 않는 것인 방법.
[82] 단락 [61]-[81] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, FLT3L은 제1 기간 동안 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션되고 적어도 하나의 펩타이드는 제1 펩타이드 자극 기간 동안 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션되어, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 방법.
[83] 단락 [82]에 있어서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L은 제2 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되고 적어도 하나의 펩타이드는 제2 펩타이드 자극 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되어, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 것인 단계; 및 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제1 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[84] 단락 [83]에 있어서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L은 제3 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되고 적어도 하나의 펩타이드는 제3 펩타이드 자극 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되어, 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 것인 단계; 및 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제2 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[85] 단락 [61]-[84] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된 것인 방법.
[86] 단락 [85]에 있어서, 대상체는 인간인 것인 방법.
[87] 단락 [85] 또는 [86]에 있어서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는 것인 방법.
[88] 단락 [87]에 있어서, 질환 또는 장애는 암인 것인 방법.
[89] 단락 [88]에 있어서, 암은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
[90] 단락 [61]-[89] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
[91] 단락 [61]-[90] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
[92] 단락 [61]-[91] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD4 농축된 T 세포를 포함하는 것인 방법.
[93] 단락 [61]-[92] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 CD8 농축된 T 세포를 포함하는 것인 방법.
[94] 단락 [61]-[93] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 T 세포를 포함하는 것인 방법.
[95] 단락 [61]-[94] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 T 세포를 포함하는 것인 방법.
[96] 단락 [61]-[95] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
[97] 단락 [61]-[96] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
[98] 단락 [61]-[97] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 기억 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
[99] 단락 [61]-[98] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 나이브 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
[100] 단락 [61]-[99] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 (A) 점 돌연변이, (B) 스플라이스-부위 돌연변이, (C) 프레임시프트 돌연변이, (D) 리드쓰루 돌연변이, (E) 유전자-융합 돌연변이, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
[101] 단락 [61]-[100] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 점 돌연변이를 포함하고, 상응하는 야생형 펩타이드보다 큰 친화성으로 대상체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 방법.
[102] 단락 [61]-[101] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합하는 것인 방법.
[103] 단락 [61]-[102] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하는 것인 방법.
[104] 단락 [61]-[103] 중 어느 한 단락에 있어서, TCR은 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD로 펩타이드-HLA 복합체에 결합하는 것인 방법.
[105] 단락 [61]-[104] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
[106] 단락 [61]-[105] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각은 대상체의 암 세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩된 것인 방법.
[107] 단락 [61]-[106] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 적어도 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,500; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 7,500; 또는 10,000개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
[108] 단락 [61]-[107] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 I HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 8-12개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
[109] 단락 [61]-[108] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상은 클래스 II HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하고 16-25개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
[110] 단락 [61]-[109] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열은 복수의 항원 펩타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
[111] 단락 [110]에 있어서, 복수의 항원 펩타이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 항원 펩타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
[112] 단락 [61]-[111] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 또는 APC 제제의 APC는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함하는 것인 방법.
[113] 단락 [61]-[112] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 또는 APC 제제의 APC는 자가 APC 또는 동종이계 APC인 것인 방법.
[114] 단락 [61]-[113] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 또는 APC 제제의 APC는 수지상 세포(DC)를 포함하는 것인 방법.
[115] 단락 [114]에 있어서, DC는 CD141+ DC인 것인 방법.
[116] 단락 [61]-[114] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
[117] 단락 [116]에 있어서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
[118] 단락 [116] 또는 [117]에 있어서, CD14 또는 CD25 또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 CD14 또는 CD25 또는 CD19 결합제를 APC 또는 APC 제제의 APC에 결합시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
[119] 단락 [118]에 있어서, CD14 또는 CD25 또는 CD19 결합제는 바이오티닐화된 것인 방법.
[120] 단락 [118] 또는 [119]에 있어서, CD14 또는 CD25 또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 고체 지지체 상의 항-바이오틴 시약을 CD14 또는 CD25 또는 CD19 결합제에 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
[121] 단락 [118]-[120] 중 어느 한 단락에 있어서, CD14 또는 CD25 또는 CD19 결합제는 고체 지지체에 부착되는 것인 방법.
[122] 단락 [61]-[121] 중 어느 한 단락에 있어서, 단락 [61]-[63] 또는 [66]-[121] 중 어느 한 단락의 APC, 또는 단락 [64]-[121] 중 어느 한 단락의 APC 제제의 APC는 CD14+ 단핵구로부터 유래되거나, CD14 농축된 APC이거나, CD141 농축된 APC인 것인 방법.
[123] 단락 [61]-[122] 중 어느 한 단락에 있어서, 단락 [61]-[63] 또는 [66]-[122] 중 어느 한 단락의 APC, 또는 단락 [64]-[122] 중 어느 한 단락의 APC 제제의 APC는 생물학적 샘플로부터 농축된 것인 방법.
[124] 단락 [61]-[123] 중 어느 한 단락에 있어서, 단락 [61]-[63] 또는 [66]-[123] 중 어느 한 단락의 APC, 또는 단락 [64]-[123] 중 어느 한 단락의 APC 제제의 APC는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된 것인 방법.
[125] 단락 [124]에 있어서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
[126] 단락 [61]-[125] 중 어느 한 단락에 있어서, 단락 [61]-[63] 또는 [66]-[125] 중 어느 한 단락의 APC, 또는 단락 [64]-[125] 중 어느 한 단락의 APC 제제의 APC는 제2 생물학적 샘플로부터 유래된 것인 방법.
[127] 단락 [126]에 있어서, 제2 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 유래된 것인 방법.
[128] 단락 [61]-[127] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 것인 방법.
[129] 단락 [61]-[128] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 방법.
[130] 단락 [61]-[129] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 방법.
[131] 단락 [61]-[130] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것인 방법.
[132] 단락 [61]-[131] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%인 것인 방법.
[133] 단락 [61]-[132] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%인 것인 방법.
[134] 단락 [61]-[133] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 항원 특이적 CD4+ T 세포의 백분율은 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 총 T 세포 또는 총 면역 세포의 최대 약 0.00001%, 0.00005%, 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 또는 0.5%인 것인 방법.
[135] 단락 [61]-[134] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
[136] 단락 [61]-[135] 중 어느 한 단락에 있어서, 별개의 기간의 총 기간은 28일 미만인 것인 방법.
[137] 단락 [61]-[136] 중 어느 한 단락에 있어서, 인큐베이션하는 것은 APC 제제 중 제1 APC 제제를 7일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[138] 단락 [61]-[137] 중 어느 한 단락에 있어서, 인큐베이션하는 것은 APC 제제 중 제1 APC 제제를 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[139] 단락 [61]-[138] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 새롭게 수득되거나 동결된 샘플인 것인 방법.
[140] 단락 [61]-[139] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 APC 또는 APC 제제 중 하나 이상을 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[141] 단락 [140]에 있어서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
[142] 단락 [140] 또는 [141]에 있어서, 방법은 APC 제제 중 하나 이상을 제2 기간 동안 적어도 하나의 펩타이드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[143] 단락 [140]-[142] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 단락 [61]-[63] 또는 [66]-[142] 중 어느 한 단락의 APC, 또는 단락 [64]-[142] 중 어느 한 단락의 APC 제제 중 하나 이상을 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[144] 단락 [143]에 있어서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
[145] 단락 [143] 또는 [144]에 있어서, 방법은 제3 기간 후 및 제4 기간의 시작 전에 제2 배지의 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
[146] 단락 [61]-[145] 중 어느 한 단락에 있어서, APC 제제의 APC는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된 것인 방법.
[147] 단락 [61]-[146] 중 어느 한 단락에 있어서, 항원은 신생항원, 종양 관련 항원, 바이러스 항원, 부조직적합 항원 또는 이들의 조합인 것인 방법.
[148] 단락 [61]-[147] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 생체 외에서 수행되는 것인 방법.
[149] 단락 [61]-[148] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포는 복수의 항원 특이적 T 세포를 포함하는 것인 방법.
[150] 단락 [61]-[149] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 PBMC 또는 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[151] 단락 [61]-[150] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[152] 단락 [61]-[151] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[153] 단락 [61]-[152] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[154] 단락 [61]-[153] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[155] 단락 [154]에 있어서, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
[156] 단락 [155]에 있어서, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하는 것은 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
[157] 단락 [156]에 있어서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
[158] 단락 [61]-[157] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[159] 단락 [61]-[157] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩타이드 로딩 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[160] 단락 [61]-[157] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[161] 단락 [158]-[160] 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 배양하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
[162] 단락 [161]에 있어서, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 배양하는 것은 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
[163] 단락 [162]에 있어서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
[164] 단락 [61]-[163] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[165] 단락 [61]-[163] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드 로딩 샘플와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[166] 단락 [61]-[163] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[167] 단락 [164]-[166] 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 인큐베이션하는 것은 IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
[168] 단락 [167] 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 인큐베이션하는 것은 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO) 억제제, 항-PD-1 항체, IL-12, 또는 이들의 조합의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
[169] 단락 [168] 중 어느 한 단락에 있어서, IDO 억제제는 에파카도스타트, 나복시모드, 1-메틸트립토판, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
[170] 단락 [61]-[169] 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 별개의 기간, 3개 이하의 별개의 기간, 제1 기간, 제2 기간, 제3 기간, 제4 기간, 또는 제5 기간은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 13시간, 적어도 14시간, 적어도 15시간, 적어도 16시간, 적어도 17시간, 적어도 18시간, 적어도 19시간, 적어도 20시간, 적어도 21시간, 적어도 22시간, 적어도 23시간, 적어도 24시간, 적어도 25시간, 적어도 26시간, 적어도 27시간, 적어도 28시간, 적어도 29시간, 적어도 30시간, 적어도 31시간, 적어도 32시간, 적어도 33시간, 적어도 34시간, 적어도 35시간, 적어도 36시간, 적어도 37시간, 적어도 38시간, 적어도 39시간, 또는 적어도 40시간인 것인 방법.
[171] 단락 [61]-[170] 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 별개의 기간, 3개 이하의 별개의 기간, 제1 기간, 제2 기간, 제3 기간, 제4 기간, 또는 제5 기간은 1 내지 4시간, 1 내지 3시간, 1 내지 2시간, 4 내지 40시간, 7 내지 40시간, 4 내지 35시간, 4 내지 32시간, 7 내지 35시간 또는 7 내지 32시간인 것인 방법.
[172] 단락 [61]-[171] 중 어느 한 단락에 있어서, 방법은 제1 또는 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
[173] (a) 대상체로부터 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14를 발현하는 세포를 농축시켜, CD14+ 세포 농축 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14+ 세포 농축 샘플을 제1 기간 동안 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14+ 세포 농축 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계; (f) 성숙 APC 샘플의 APC를 제4 기간 동안 T 세포를 포함하는 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하는 단계; (g) T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계; (h) T 세포를 제6 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (i) T 세포 중 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[174] (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (f) 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[175] (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (f) 선택적으로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[176] (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (f) 선택적으로, 제1 자극 T 세포 샘플을 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩타이드 로딩 샘플와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드 로딩 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[177] (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계; (c) CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 적어도 하나의 펩타이드를 제2 기간 동안 (c)의 CD14 및/또는 CD25 및/또는 CD19 세포 고갈 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; (e) 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (f) 선택적으로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[178] (a) FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L은 제1 기간 동안 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션되고 적어도 하나의 펩타이드는 제1 펩타이드 자극 기간 동안 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션되어, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 단계; (b) 선택적으로, FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L은 제2 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되고 적어도 하나의 펩타이드는 제2 펩타이드 자극 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되어, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 및 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제1 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; (c) 선택적으로, FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L은 제3 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되고 적어도 하나의 펩타이드는 제3 펩타이드 자극 기간 동안 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션되어, 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 및 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제2 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 및 (d) 제1 자극 T 세포 샘플, 제2 자극 T 세포 샘플 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[179] (a) 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계, 및 (b) 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 발현을 측정하는 것과 결합을 측정하는 것은 동시에 수행되는 것인 방법.
[180] 단락 [179]에 있어서, 자극된 면역 세포 샘플은 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC로 자극된 면역 세포의 집단을 포함하는 것인 방법.
[181] 단락 [179] 또는 [180]에 있어서, 면역 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 유래된 것인 방법.
[182] (a) 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC와 함께 인큐베이션하여, 자극된 면역 세포 샘플을 수득하는 단계; (b) 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 동시에 수행되는 것인 방법.
[183] 단락 [179]-[182] 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 세포 마커는 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
[184] 단락 [179]-[183] 중 어느 한 단락에 있어서, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 것은 펩타이드-MHC 복합체의 펩타이드 및 MHC를 포함하는 MHC 사량체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
[185] 단락 [179]-[184] 중 어느 한 단락에 있어서, MHC는 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC인 것인 방법.
[186] 단락 [179]-[185] 중 어느 한 단락에 있어서, 펩타이드-MHC 복합체는 하나 이상의 표지를 포함하는 것인 방법.
[187] 단락 [179]-[186] 중 어느 한 단락에 있어서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단은 각각 하나 이상의 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 포함하는 2개 이상의 샘플을 포함하는 것인 방법.
[188] 단락 [187]에 있어서, 2개 이상의 샘플은 2개 이상의 샘플 표지로 표지된 것인 방법.
[189] 단락 [179]-[188] 중 어느 한 단락에 있어서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는 것인 방법.
[190] 단락 [179]-[189] 중 어느 한 단락에 있어서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 단일 세포 분석을 포함하는 것인 방법.
[191] 단락 [179]-[190] 중 어느 한 단락에 있어서, 발현을 측정하는 것 및 결합을 측정하는 것은 하나 이상의 세포 마커를 모두 발현하고 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 면역 세포의 백분율을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
[192] 단락 [186] 또는 [187]에 있어서, 표지는 형광단을 포함하는 것인 방법.
[193] 단락 [179]-[192] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 세포의 집단은 단락 [1]-[58] 중 어느 한 단락의 조성물의 면역 세포의 집단을 대표하는 면역 세포의 집단을 포함하는 것인 방법.
실시예
본 개시내용은 하기의 특정 실시예에 의해 더 상세히 설명될 것이다. 하기 실시예는 예시적인 목적을 위해 제공되며 어떤 식으로든 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 당업자는 본 발명에 따른 대한적인 구현예를 생성하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 인식할 것이다. 본원에 열거된 모든 특허, 특허 출원, 및 인쇄된 간행물은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
실시예의 요약:
하기 실시예 1 및 2는 T 세포 제조 프로토콜(프로토콜 1 및 프로토콜 2)의 예이다. 예시적인 프로토콜의 개략도가 도 1A 및 도 1B에 나타나 있다. 실시예 21-23은 APC의 제조 단계 및 이들 2개의 프로토콜의 단계를 도시한다. 실시예 12 및 14-16 및 표 2-5는 프로토콜 1 및 2로부터 수득된 결과를 요약한다. 실시예 13은 시험될 프로토콜의 파라미터를 기술한다.
실시예 3-7 및 20은 프로토콜 1 및 프로토콜 2를 사용한 CD4+ 기억 T 세포 확장 및 CD8+ 나이브 T 세포 유도의 결과의 예이다. 유세포 분석 결과가 도 2B, 도 5A 및 B, 도 7, 도 10, 및 도 12-23에 나타나 있다.
실시예 8-11 및 16-19는 본원에 기재된 방법을 사용하여 확장되거나 유도된 T 세포의 특이성, 표현형 및/또는 기능을 평가하는 데 이용된 어세이의 결과의 예이다. 도 25는 T 세포 제조 공정의 일반적인 개요 및 T 세포의 이들 어세이 특이성, 표현형 및/또는 기능의 용도를 도시한다.
실시예 1 - T 세포 제조 프로토콜 1
본 실시예는 도 1에 예시된 바와 같은 T 세포 제조 프로토콜 1의 예를 제공한다.
재료:
DC 배지(CellGenix)
CD14 마이크로비드, 인간, Miltenyi #130-050-201
사이토카인 및/또는 성장 인자
T 세포 배지(AIM V + RPMI 1640 glutamax + 혈청 + PenStrep)
펩타이드 스톡 - 펩타이드(HIV A02 - 5-10 펩타이드, HIV B07- 5-10 펩타이드, DOM - 4-8 펩타이드, PIN - 6-12 펩타이드)당 1 mM
단계 1: DC 제조를 위한 단핵구 단리
1. 각각의 공여자에 대해 예측된 DC 수율에 기초하여 해동할 PBMC의 대략적인 수를 계산한다.
2. PBMC를 해동시키고 DC 배지에 ~1x106 - 1x108 세포/mL로 재현탁시킨다.
3. 벤조나제(1:1000 희석)를 첨가하고 뚜껑이 느슨한 인큐베이터에 둔다.
4. 제조사 프로토콜에 따라 CD14+ 단핵구 농축을 수행한다.
5. 농축된 세포를 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 폴리I:C로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인 및/또는 성장 인자를 갖는 DC 배지에 웰당 1x105 - 1x107으로 6웰 플레이트에 플레이팅한다.
단계 2: 펩타이드 로딩 및 성숙
1. DC를 계수하고 15 mL 튜브에 실험 조건에 따라 세포를 분할한다; 조건당 0.01-1백만 세포.
2. 1200 rpm에서 5분 동안 회전시키고 50 - 400 μL DC 배지에 재현탁시킨다. 펩타이드(들)를 첨가하고 뚜껑이 느슨한 인큐베이터에 0.5-3시간 동안 둔다. 펩타이드당 1 mM의 농도로 펩타이드 풀에 대해 부피를 계산한다. A02(5개의 펩타이드) 및 B07(5개의 펩타이드)의 각각의 별개의 풀의 부피를 펩타이드당 0.001 - 100 μM의 최종 농도로 각 웰에 첨가한다.
3. 0.5-3시간 후, 성숙 혼합물을 함유하는 200 μL 내지 1.5 mL의 DC 배지를 첨가하고 세포를 24웰 플레이트로 옮긴다.
성숙 혼합물은 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 폴리I:C로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 함유한다.
단계 3: 장기 자극(LTS) 실험의 설정
1. DC 플레이트의 웰로부터 모든 배지를 조심스레 제거하고, 각각의 웰을 24웰 딥웰 블록의 개별 웰로 옮긴다.
2. 각각의 웰을 0.5 - 3 mL T 세포 배지로 세척하고 딥웰 블록에서 DC 배지와 조합한다.
3. 100 μL 내지 2 mL T 세포 배지를 각 웰에 첨가한다.
4. DC를 1200 rpm에서 5분 동안 스핀 다운시킨다.
5. 모든 상층액을 제거하고, DC를 100 μL 내지 2 mL T 세포 배지에 재현탁시키고, 올바른 웰로 다시 옮긴다.
6. T 세포 배지에서 PBMC를 해동시키고, IL-7 및 IL-15를 갖는 T 세포 배지에서 0.5x106 - 4x106 세포/mL로 재현탁시킨다.
7. 0.5 - 3 mL의 제조된 PBMC를 각 웰에 첨가한다.
단계 4: LTS 공급
글루코스 측정기를 이용하여 배지가 노란색인지 확인한다. 글루코스가 여전히 높으면, IL-7 및 IL-15를 갖는 배양물을 웰에 공급한다. 글루코스가 낮으면, 세포를 6웰 플레이트(4 mL/웰)로 확장하고, IL-15 및 IL-7을 보충한다. 글루코스가 매우 낮으면, 6웰 플레이트에서 6 mL/웰로 확장한다.
단계 5: LTS 공급
1-4일마다 배양물을 공급하고, 글루코스 농도가 낮아지면 필요에 따라 신선한 IL-15/IL-7를 첨가하고, 배양 부피를 확장한다.
단계 6: 재자극
T 세포를 계수하고 펩타이드 로딩된 DC의 새로운 배치에서 단계 3부터 반복한다. 남은 세포를 분석을 위해 동결시킨다.
단계 7: LTS 공급
-1-5일마다 배양물을 공급한다.
단계 8: 재자극
T 세포를 계수하고 펩타이드 로딩된 DC의 새로운 배치에서 단계 3부터 반복한다. 남은 세포를 분석을 위해 동결시킨다.
단계 9: LTS 공급
1-5일마다 배양물을 공급한다.
단계 10
T 세포를 계수하고, 분석을 위해 동결시킨다.
실시예 2 - T 세포 제조 프로토콜 2
이 프로토콜은 실시예 1에 기재된 프로토콜의 대안일 수 있다.
실시예 2는 도 1에 예시된 바와 같은 예시적인 T 세포 제조 프로토콜(프로토콜 2)을 제공한다.
재료:
AIM V 배지(Invitrogen)
배지 1(RPMI 1640 glutamax + 혈청 + PenStrep)
배지 2(AIM V + RPMI 1640 glutamax + 혈청 + PenStrep)
절차:
단계 1: 배지 2에 하나 이상의 사이토카인을 갖는 24웰 플레이트의 각각의 웰에 4백만 PBMC를 플레이팅한다. 하나 이상의 사이토카인은 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 폴리I:C로부터 선택된다.
단계 2: 배지 2에서 펩타이드 로딩 및 성숙
1. 각 웰에서 쇼트머(shortmer)에 대해 0.001 - 100 μM 및 롱머(longmer)에 대해 0.001 - 100 μM 최종 농도로 관심있는 스톡 펩타이드 풀(펩타이드가 없는 조건은 제외)을 제조하고 혼합한다.
2. 0.5 - 3시간 동안 인큐베이션한다.
3. 스톡 성숙 칵테일을 만들고, 인큐베이션 후 각 웰에 첨가하고 혼합한다. 성숙 칵테일은 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 폴리I:C로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 함유한다.
단계 3: 인간 혈청을 2.5-20 부피%의 최종 농도로 각 웰에 첨가하고 혼합한다.
단계 4: 배지의 50-90%를 IL-7 및 IL-15가 보충된 신선한 배지 1로 각각 0.005-500 ng/mL의 최종 농도로 조심스럽게 대체한다.
단계 5: 배지의 50-90% 를 IL-7 및 IL-15가 보충된 신선한 배지 1로 1-5일마다 각각 0.005-500 ng/mL의 최종 농도로 조심스럽게 대체한다.
비공급일에 웰이 주황색에서 황색으로 변하는 경우(투명한 배지의 경우 글루코스 판독값), 기존 배지의 25-75%를 신선한 배지 1 및 IL-7/IL-15로 변경한다.
단계 6: 계수하고 동결시킨다(또는 T 세포 자극을 프로토콜 1의 단계 8 및/또는 단계 100으로 가져가기 위해 다음의 단계를 진행한다).
단계 1 내지 단계 6의 배양 단계 동안, 펩타이드 로딩된 DC는 프로토콜 1 "단계 1" 및 "단계 2"의 절차에 따라 동시에 제조될 수 있다.
T 세포를 계수하고 펩타이드 로딩된 DC의 새로운 배치로 T 세포를 자극시킨다. 남은 세포를 분석을 위해 동결시킨다. T 세포 자극 절차는 프로토콜 1 "단계 3"의 절차에 따라 수행될 수 있다.
단계 7: T 세포를 계수하고 펩타이드 로딩된 DC의 새로운 배치에서 프로토콜 1 "단계 3"의 T 세포 자극 절차를 반복한다. 남은 세포를 분석을 위해 동결시킨다.
단계 8: T 세포를 계수하고 분석을 위해 동결시킨다.
실시예 3 - CD8
+
T 세포 유도
인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용하여 프로토콜 1 또는 프로토콜 2에 따라 항원 특이적 T 세포 유도를 수행하였다. 상이한 프로토콜을 사용하여 T 세포를 제조한 후에 CD8+ 기억 및 나이브 T 세포 유도를 분석하였다. 세포 샘플은 분석을 위해 상이한 시점에 취할 수 있다. pMHC 다량체를 사용하여 유도 배양물에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 모니터링하고, 조합 코딩을 사용하여 동시에 다수의 T 세포 반응을 검출하였다. 도 2는 프로토콜 1(프로토콜 1) 및 프로토콜 2(프로토콜 2)를 사용하여 긴 펩타이드 또는 짧은 펩타이드로 유도된 항원 특이적 CD8+ 기억 T 세포의 분율을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다. "벌크"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 전체 PBMC임을 나타낸다. "Treg-"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 CD25 발현 세포가 고갈된 PBMC임을 나타낸다. 도 3은 단기 자극 또는 유도 후 유세포 분석에 의해 분석된 GAS7 펩타이드에 반응한 항원 특이적 CD8+ 나이브 T 세포의 분율을 나타내는 T 세포 반응 어세이의 예시적인 결과를 도시한다(본 실시예에서 배양 길이는 자극의 시작으로부터 계산됨). 항원 특이적 기억 T 세포 및 나이브 PIN 특이적 T 세포의 분율의 증가는 단기 자극 후에 관찰될 수 있다.
실시예 4 - CD8
+
T 세포 유도
상이한 프로토콜을 사용하여 T 세포를 제조한 후 CD8+ T 세포 유도를 분석하였다. 유도된 T 세포를 시험 웰에서 상이한 항원 펩타이드와 함께 인큐베이션하고, 펩타이드에 반응한 T 세포의 분율을 유세포 분석에 의해 분석하였다. pMHC 다량체를 사용하여 유도 배양물에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분율을 모니터링하고 조합 코딩을 사용하여 동시에 다수의 T 세포 반응을 검출하였다. 적중률은 T 세포가 항원 펩타이드에 대해 얼마나 반응성인지 도시하는 데 사용될 수 있다. 적중률은 양성 반응 시험 웰의 수를 시험 웰의 총 수로 나눈 것으로 정의된다. 실험을 중복하여 수행하였고, 적중률을 듀플리케이트 웰에서 확인하였다. 도 4는 프로토콜 1(prot. 1) 및 프로토콜 2(prot. 2)를 사용하여 유도한 후 HIV 짧은 펩타이드, 이전에 확인된 신생항원(PIN) 짧은 펩타이드, 또는 PIN 긴 펩타이드로 유도된 CD8+ T 세포의 분율을 나타내는 결과의 예를 도시한다. "전체 PBMC"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 전체 PBMC임을 나타낸다. "CD25- PBMC"는 유도에 사용된 T 세포를 함유하는 샘플이 CD25+ 세포가 고갈됨을 나타낸다. 단기 및 장기 유도 모두가 나타나 있다. 도 6은 2명의 인간 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용한 장기 유도된 CD8+ T 세포의 분율을 나타내는 예시적인 결과를 도시한다.
실시예 5 - CD4
+
T 세포 반응
이전에 확인된 신생-항원(PIN)에 대한 CD4+ T 세포 반응은 생체외 유도 프로토콜을 사용하여 유도될 수 있다. 본 실시예에서, IFNγ 생산을 항원 특이적인 방식으로 모니터링함으로써 CD4+ T 세포 반응을 확인하였다. 도 10은 이러한 유세포 분석의 대표적인 예를 나타낸다. 마지막으로, 야생형이 아닌 돌연변이 펩타이드에 대한 CD4+ T 세포 반응의 특이성은 유도된 T 세포 집단을 돌연변이 또는 야생형 펩타이드로 자극시킴으로써 나타났다(도 11).
실시예 6 - 나이브 CD8
+
T 세포 유도
프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 T 세포를 제조한 후 유세포 분석에 의해 나이브 CD8+ T 세포 유도를 분석하였다. PBMC 샘플은 인간 공여자 1 또는 인간 공여자 2, 및 전체 PBMC 또는 CD25- 고갈된 PBMC로부터 유래되었다. 세포 샘플을 도 1의 프로토콜에 따라 짧은 또는 긴 유도 후에 분석하였다. 유도된 CD8+ T 세포의 나이브 CD8+ 반응을 상이한 펩타이드에 대해 분석하고 도 12-23에 플롯팅하였다.
실시예 7 - CD8
+
나이브 T 세포 반응
실시예 1의 T 세포 제조 프로토콜은 나이브 구획으로부터 CD8+ T 세포 반응을 유도하는데 성공적으로 사용될 수 있다. 도 7은 2회의 자극 후에 건강한 공여자에서 돌연변이된 에피토프에 대해 생성된 2개의 CD8+ T 세포 반응의 대표적인 흐름도를 나타낸다. 더욱이, 기억 구획으로부터의 CD8+ T 세포 반응은 높은 수로 확장될 수 있다. 도 8A에 나타낸 대표적인 예에서, 최대 3회 자극 후, 모든 CD8+ T 세포의 대략 50%는 면역 우성 에피토프인 CMV pp65, EBV YVL, EBV BMLF1 및 Mart-1에 대해 특이적이었다. 유도된 CD8+ 기억 반응은 펩타이드 리콜 어세이에서 다기능성을 입증한다(탈과립 및 사이토카인 방출, 도 8B).
실시예 8 - T 세포의 유세포 분석
도 5A는 프로토콜 2를 사용하여 도면에 표시된 조건 하에 유도된 CD8+ 나이브 T 세포의 ME-1 반응의 예시적인 유세포 분석을 도시한다. 도 5B는 도면에 표시된 조건 하에 유도된 CD8+ 나이브 T 세포의 ME-1 반응의 유세포 분석의 예를 도시한다. CD8+ T 세포의 12.6%는 긴 유도 후에 ME-1에 특이적인 것으로 관찰되었다.
실시예 9 - 유도된 T 세포의 세포독성 어세이
세포독성 어세이를 이용하여 유도된 T 세포 배양물이 항원 발현 종양주를 사멸시킬 수 있는지 평가하였다. 본 실시예에서, 생존 및 사멸 종양 세포 상에서의 활성 카스파제 3의 발현을 측정하여 초기 세포 사멸 및 사멸 종양 세포를 정량화하였다. 도 9에서, 유도된 CD8+ 기억 반응은 종양 표적을 발현하는 항원을 사멸시킬 수 있었다.
실시예 10 -생성된 CD8
+
T 세포의 표현형 분석
실시예 1에서 생산된 CD8+ T 세포주는 표현형 발현, 사이토카인 프로파일 및 자가 표적 세포에 대한 특이적 세포독성 활성에 대해 특성화될 수 있다. 표현형 발현을 분석하기 위해, 각 배양물의 1x104 - 1x106 T 세포는 0.1-10% FBS 및 0.1% 나트륨 아지드(FBS-PBS)를 함유하는 PBS에서 세척되고 형광색소 표지된 항체(CD45RA 및 CD62L)의 1:100 희석을 함유하는 FBS-PBS에 재현탁될 수 있다. 얼음 상에서 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 유세포 분석을 위해 고정시킨다. 선택된 CD8+ T 세포 배양물이 다양한 펩타이드에 대한 이들의 반응성에 관계없이 CD62L을 발현하나 CD45RA를 발현하지 않으면, 이것은 선택된 T 세포 배양이 CD8+ 기억 T 세포 하위집합에 속한다는 것을 나타낼 수 있다.
실시예 11 - CD8
+
T 세포의 사이토카인 생성
CD8+ T 세포 배양물의 사이토카인 프로파일을 분석할 수 있다. T 세포 배양은 먼저 항원 펩타이드로 펄싱된 자가 APC로 챌린징될 것이다. 사이토카인 프로파일은 ELISA 키트(PharMingen, San Diego, Calif.)를 사용하여 정량적으로 결정될 것이다. 마이크로타이터 플레이트(96웰, NUNC Maxisorp)는 인간 사이토카인(IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-γ)(PharMingen)에 대한 0.2-4 μg/웰의 정제된 마우스 포획 단클론 항체로 4℃에 밤새 코팅될 것이다. 플레이트는 세척될 것이고, 비특이적 결합 부위는 0.5-3시간 동안 10%(w/v) 우태아 혈청(FBS)으로 포화된 후 세척될 것이다. 상층액 및 사이토카인 표준품은 PBS로 희석되고 듀플리케이트 웰에 첨가될 것이다. 플레이트는 37℃에서 1-3시간 동안 인큐베이션된 후 PBS-T로 세척될 것이다. 매치된 바이오티닐화된 검출 항체는 각 웰에 첨가되고 실온에서 1-3시간 동안 인큐베이션될 것이다. 세척 후, 아비딘 접합된 호스래디쉬 퍼옥시다제가 첨가되고 0.5-3시간 동안 인큐베이션될 것이다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, Sigma)이 발색을 위해 기질로서 사용될 것이다. 광학 밀도가 ELISA 리더(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)를 사용하여 450 nm에서 측정될 것이고, 사이토카인 농도가 이중 8점 표준 곡선을 사용하여 마이크로플레이트 컴퓨터 소프트웨어(Bio-Rad)에 의해 정량될 것이다.
실시예 12 - 프로토콜 1 및 프로토콜 2: 요약
표 1. 프로토콜 1 및 2로부터의 결과의 요약
실시예 13 -프로토콜 1 및 2 파라미터 시험
프로토콜의 파라미터를 시험하기 위한 예시적인 실험은 소규모로 환자 샘플에서 프로토콜 1을 시험하는 것일 수 있다. 프로토콜의 파라미터를 시험하기 위한 또 다른 예시적인 실험은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 기능성을 시험하는 것 및 항원 특이적 세포를 분류하는 것 및 단일 세포 RNAseq에 의해 특성화하는 것을 포함하여, 이전 배치에서 생성된 T 세포 생성물을 특성화하는 것일 수 있다. 프로토콜의 파라미터를 시험하기 위한 또 다른 예시적인 실험은 DC 제조 동안 폴리-ICLC/aCD40L의 첨가를 시험하고 T 세포 농축을 정량화하는 것일 수 있다. 프로토콜의 파라미터를 시험하기 위한 또 다른 예시적인 실험은 사멸 어세이에서 항원 특이적 세포독성을 평가하는 것, 더 넓은 유동 패널로 펩타이드 리콜 어세이를 수행하여 분화 및 소진을 측정하는 것, 적중의 하위집합에 대한 민감성(펩타이드 역가) 및 특이성(WT 대 돌연변이체, 풀 디콘볼루션)을 결정하는 것, 및 항원 특이적 CD4+ T 세포로부터의 방관자 효과의 가능성을 제거하기 위해 CD8+를 농축하는 것을 포함하여, 유도된 CD8+ 나이브 T 세포 반응의 기능성을 시험하는 것일 수 있다. 프로토콜의 파라미터를 시험하기 위한 또 다른 예시적인 실험은 기능성을 조사하는 것, 적중의 하위집합에 대한 민감성(펩타이드 역가) 및 특이성(WT 대 돌연변이체, 풀 디콘볼루션)을 결정하는 것, 표현형을 더 잘 이해하기 위해 분화 및 소진 유동 패널로 리콜 어세이를 수행하는 것일 수 있다. 프로토콜의 파라미터를 시험하기 위한 또 다른 예시적인 실험은 상이한 유도의 표현형을 비교하는 것, 상이한 구획으로부터 유도의 표현형을 비교하는 것, 동력학을 조사하는 것을 포함하여, 항원 특이적 T 세포(CD8+ 기억, CD8+ 나이브, CD4+ 나이브)를 분류하고 단일 세포 RNAseq에 의해 프로파일링하는 것일 수 있다.
실시예 14 - CD14 및/또는 CD25 발현 세포가 고갈된 T 세포 투입은 CD4
+
및 CD8
+
나이브 T 세포의 유도를 개선한다
하기 표 2는 CD14-/CD25- 고갈이 CD8+ 나이브 적중률을 증가시키고 일관된 CD4+ 적중률을 갖는다는 것을 입증하는 프로토콜 1 T 세포 제조 방법으로부터의 결과를 나타낸다.
표 2. CD14
-
/CD25
-
고갈 결과
실시예 15 - CD8
+
나이브 유도는 프로토콜 1 및 프로토콜 2를 사용하여 유의하게 개선되었다
하기 표 3A 및 3B는 본원에 기재된 프로토콜 1 및 프로토콜 2 T 세포 제조 방법 모두로부터의 결과를 보여준다. 시험된 2개의 인간 공여자에서, CD8+ 나이브 유도는 CD14 발현 세포의 고갈을 사용하는 것과 비교하여 CD25 발현 세포의 고갈 또는 CD25 및 CD14 발현 세포의 고갈을 사용하여 유의하게 개선되었다. CD8+ 나이브 유도는 또한 FLT3L 자극을 사용하여 유의하게 개선되었다.
실시예 16 - UV 매개된 펩타이드 교환 어세이
조건부 리간드의 UV 매개 절단은 시간 의존적일 수 있다. 하기 기재된 설정으로, 펩타이드 절단은 1분 후에 검출될 수 있고 대략 15분 후에 본질적으로 완료될 수 있다. 조건부 리간드를 관심있는 펩타이드로 최적으로 교환하기 위해 30분 내지 60분의 인큐베이션 시간이 일반적으로 사용될 수 있다. 니트로페닐 모이어티 및 반응 생성물 모두가 긴 파장 UV 광을 흡수하기 때문에, 단백질 농도는 UV 매개 절단의 속도에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 경로 길이는 반응 속도에 영향을 미칠 수 있다. UV 노출시 형성되는 빈 펩타이드 수용성 MHC 분자는 관심있는 MHC 리간드의 존재 하에 UV 매개 절단을 수행함으로써 구제될 수 있다. 대부분의 실험에서, MHC에 비해 100배 몰 과량의 펩타이드가 사용된다. UV 유도된 펩타이드 교환은 25 μg/mL의 UV 민감성 MHC 클래스 I 복합체를 사용하여 일상적으로 수행된다. 그러나, 펩타이드 교환 반응은 최대 100-200 μg/mL의 MHC 클래스 I 농도로 수행될 수 있다.
재료:
96웰 플레이트(카탈로그 번호: 651201 폴리프로필렌 마이크로플레이트 96 웰 V 샤프, Greiner Bio-one)
UV 램프 장파 UV, 366 nm, 2 x 8 W(카탈로그 번호: 022.9115, CAMAG)가 설치되거나 2 x 15W, 365 nm 블랙라이트 블루 튜브를 갖는 Uvitec 튜브 광(모델 - LI215BLB 크기 L x W x H 505 x 140 x117 mm)이 설치된 UV-램프 366 nm CAMAG UV 캐비넷 3(카탈로그 번호: 022.9070, CAMAG)
마이크로타이터 플레이트용 로터를 갖는 원심분리기.
절차:
1. 96웰 플레이트에서, 하기 시약을 각 웰에 첨가한다:
2. 96웰 플레이트를 1시간 동안 UV 램프(366nm) 아래에 대략 5 cm의 UV 램프 및 샘플의 간격으로 둔다.
3. 플레이트를 3,300g에서 5분 동안 회전시킨다. 하류 적용을 위해 100 μL의 상층액(임의의 펠렛이 이송되는 것을 피하기 위해 플레이트를 비스듬히 유지시킴)을 새로운 96웰 플레이트로 옮긴다.
실시예 17 - 형광색소 접합된 pMHC 다량체 조립
MHC 클래스 I 복합체는 형광단 표지된 스트렙타비딘과 복합체화되어 T 세포 분석을 위한 MHC 클래스 I 사량체를 형성할 수 있다. 일반적으로 사용되는 형광단은 알로피코시아닌 및 피코에리트린을 포함하며, 이들 접합체를 갖는 MHC 다량체의 형성은 하기에 기재되어 있다. 그러나, 스트렙타비딘 코팅된 양자점이 또한 T 세포 검출을 위한 MHC 다량체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
재료:
PE-스트렙타비딘 용액 1 mg/mL(카탈로그 번호: S866, Molecular Probes) 또는 APC 스트렙타비딘 용액 1 mg/mL(카탈로그 번호: S868, Molecular Probes)
100 μL /웰에 25 μg/mL의 pMHC를 함유하는, 교환된 MHC 클래스 I 복합체를 갖는 마이크로타이터 플레이트. 이것은 웰당 2.5 μg 또는 0.05 nmol MHC 클래스 I에 해당한다.
절차:
1. PBS에서 27 μg/mL의 스트렙타비딘-PE의 희석액, 또는 PBS에서 14.6 μg/mL의 스트렙타비딘-APC의 희석액을 생성하여, MHC 클래스 I의 각 웰에 대해 100 μL를 준비한다.
2. 스트렙타비딘-PE 또는 -APC를 10분 간격으로 25 μL의 4개의 순차적 첨가에 의해 MHC 클래스 I에 첨가한다.
실시예 18 - MHC 다량체의 조합 코딩
UV 매개 MHC 펩타이드 교환
1. 바이오티닐화된 p*MHC 복합체의 스톡 용액을 얼음 상에서 해동시킨다.
2. PBS 중의 관심있는 바이오티닐화된 p*MHC 복합체를 200 μg/mL로 희석한다. 교환 반응당 60 μL의 부피가 필요하다. pMHC 복합체를 Qdot585에 접합시키기 위해, 교환 반응당 80 μL가 필요하다.
3. 펩타이드 스톡을 PBS에서 400 μM로 희석한다. 펩타이드당 최소 70 μL를 준비하고; pMHC 복합체를 Qdot585에 접합시키는 데 사용된 펩타이드의 경우, 펩타이드당 최소 90 μL를 준비한다.
4. V-바닥을 갖는 96웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트에서, 웰당 60 μL 200 μg/mL p*MHC의 선택된 대립유전자 및 60 μL의 400 μM 펩타이드 용액을 혼합한다(최종 농도: 100 μg/mL p*MHC 및 200 μM 펩타이드). pMHC 복합체를 Qdot585에 접합시키기 위해, 80 μL의 200 μg/mL p*MHC 및 80 μL의 400 μM 펩타이드 용액을 혼합한다.
5. 96웰 마이크로플레이트를 실온에서 1시간 동안 UV 광(~366 nm)에 노출시킨다. UV 램프까지의 거리는 2-5 cm이어야 한다.
6. 플레이트를 실온에서 5분 동안 3,300g에서 원심분리한다.
7. 일시정지 점이 포함된 경우 단계 6을 반복하고 2 × 50 μL의 상층액을 V-바닥을 갖는 2개의 신선한 96웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트로 옮기고, 얼음 위에 유지시킨다. pMHC 복합체를 Qdot585에 접합시키기 위해, 2 × 70 μL를 옮긴다. 응집물의 이동은 잠재적으로 최종 MHC 다량체 염색의 백그라운드를 증가시킬 것이므로, 바닥 펠렛(종종 보이지 않음)을 옮기지 않도록 주의한다.
8. pMHC 단량체를 형광색소-스트렙타비딘 접합체에 접합시켜 다량체화한다. 차등 접합이 하기에 기재되어 있다: Qdot605-, 625-, 655- 또는 705-스트렙타비딘에 접합시키기 위한 옵션 A; Qdot585-스트렙타비딘에 접합시키기 위한 옵션 B; 및 PE-, APC- 또는 PE-Cy7-스트렙타비딘에 접합시키기 위한 옵션 C.
(A) Qdot605-, 625-, 655- 또는 705-스트렙타비딘에의 접합: (i) 50 μL의 pMHC 단량체당 3.5 μL의 Qdot-스트렙타비딘 접합체(스톡 농도 1 μM)를 첨가한다(66 nM의 최종 농도).
(B) Qdot585-스트렙타비딘에의 접합: (i) 70 μL의 pMHC 단량체당 4.9 μL의 Qdot585-스트렙타비딘 접합체(스톡 농도 1 μM)를 첨가한다(66 nM의 최종 농도).
(C) PE -, APC- 또는 PE-Cy7-스트렙타비딘에의 접합: (i) 50 μL의 pMHC 단량체당 4.6 μL의 PE-, APC- 또는 PE-Cy7-스트렙타비딘 접합체(스톡 농도 200 μg/mL)를 첨가한다(16.8 μg/mL의 최종 농도).
9. 잘 혼합하고 얼음 위에서 30분간 접합시킨다.
10. D-바이오틴 및 NaN3을 25 μM D-바이오틴 및 0.02%(wt/vol) NaN3의 최종 농도로 첨가한다. 2.5 μL의 20배 스톡 용액(0.4%(wt/vol) NaN3을 갖는 500 μM D-바이오틴)을 각 웰에 첨가하여 이를 수행하고; Qdot585에 접합된 MHC 다량체의 경우, 각 웰에 3.5 μL를 첨가한다. 잘 혼합하고 얼음 위에서 20분간 인큐베이션한다.
11. 25 μM D-바이오틴 및 0.02%(wt/vol) NaN3을 함유하는 50 μL의 PBS를 PE, APC 또는 PE-Cy7에 접합된 MHC 다량체에 첨가한다(2배 희석).
12. 상이한 복합체들을 혼합한다. 혼합할 때, Qdot585 대 다른 모든 색상 복합체의 2:1 비율을 사용한다. 다른 모든 색상 복합체를 1:1 비율로 혼합한다.
MHC 다량체를 이용한 T 세포 염색
13. 27개의 모든 색상 조합에 대한 MHC 다량체를 혼합하여 1개의 즉시 사용가능한 샘플을 수득하고, 4℃에서 5분 동안 3,300g에서 원심분리하고, 상층액을 옮긴다. 전체적으로, 각각의 T 세포 염색에 대해 54 μL의 상층액이 필요할 것이다(즉, 혼합물에 존재하는 각각의 개별 pMHC 복합체에 대해 2 μL).
14. PBMC 샘플(또는 다른 관련된 T 세포 샘플)을 해동시키고 RPMI로 2회 세척한다. 해동시 DNase로 처리하여 세포의 응고를 감소시키는 것이 권고된다(예컨대, 0.025 mg/mL 풀모자임(Pulmozyme) 및 2.5 mM MgCl2를 함유하는 배지에서 세포를 해동시킴으로써).
15. 세포를 2%(vol/vol) FBS(FACS 완충제)를 갖는 PBS에 재현탁시키고 200 μL의 FACS 완충제에서 웰당 최대 3x106 세포로 96웰 폴리스티렌 U-바닥 마이크로플레이트에 분배한다.
16. 플레이트를 실온에서 5분 동안 490g에서 회전시킨다.
17. 플레이트를 거꾸로 기울여 완충제를 버리고 ― 세포는 웰의 바닥에 펠렛으로 남는다.
18. 단계 13으로부터의 54 μL의 MHC 다량체를 첨가하고 잘 혼합한다.
19. 37℃에서 15분간 인큐베이션한다.
20. 플레이트를 얼음 위로 이동시키고 5× 스톡으로부터 20 μL의 항체 혼합물을 첨가한다.
21. 근적외선 사멸 세포 염색의 40배 희석액 4 μL를 첨가하고 잘 혼합한다.
22. 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다.
23. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 490g에서 회전시킨다.
24. 플레이트를 거꾸로 기울여 상층액을 버린다.
25. 200 μL의 FACS 완충제로 2회 세척한다(4℃에서 5분 동안 490g에 2회 원심분리하고, 각 회전 후 플레이트를 거꾸로 기울여 상층액을 제거한다).
26. 펠렛을 50-100 μL의 FACS 완충제에 재현탁시키고, 1.4 mL 또는 5 mL FACS 튜브로 옮긴다. 샘플은 이제 유세포 분석기에서 획득할 준비가 된다.
단일 색상 보상 대조군
27. 100 μL의 FACS 완충제 및 한 방울의 음성 보상 비드를 11개의 FACS 튜브(번호 1-11)에 첨가한다.
28. 1방울의 항-마우스 Ig-κ 보상 비드를 단계 27로부터의 튜브 1-10에 첨가하고, 1방울의 ArC 아민 반응성 비드를 새로운 튜브(번호 12)에 첨가한다.
29. 5 μL의 1 mg/mL 항-CD8-바이오틴을 튜브 1-8에 첨가하고 혼합한다.
30. 튜브 1-8을 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션한다.
31. 튜브 1-8을 2 mL의 FACS 완충제로 2회 세척한다(4℃에서 5분 동안 490g에서 원심분리한다).
32. 1 μL의 근적외선 사멸 세포 염색을 튜브 12(단계 28로부터의)에 첨가하고; 혼합하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
33. 스트렙타비딘-형광색소 접합체를 10배로 희석하고(Qdot585 제외), 각각 5 μL를 튜브 1-7에 첨가하고, 1 μL의 희석되지 않은 Qdot585-스트렙타비딘을 튜브 8에 첨가한 다음, 어두운 곳에서 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션한다.
34. 5 μL의 FITC 항체(덤프 채널 항체 중 하나 사용) 또는 5 μL의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 700 항-CD8a 항체를 튜브 9 및 10(단계 28로부터의)에 첨가하고; 어두운 곳에서 얼음 위에서 20분간 인큐베이션한다.
35. 튜브 1-11을 2 mL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 튜브 12를 2 mL의 PBS로 2회 세척한다(4℃에서 5분 동안 490g에서 원심분리한다).
36. 모든 튜브를 150 μL의 FACS 완충제에 재현탁시킨다. 1방울의 ArC-음성 비드를 튜브 12에 첨가하고 혼합한다. 보상 대조군은 유세포 분석기에서 획득할 준비가 된다.
게이팅 전략
37. 먼저 림프구 상에서, 그리고 그 후 단일 세포(FSC-α, FSC-W), 생존 세포, 덤프 채널-음성 세포 및 CD8+ 세포 상에서 게이팅한다.
38. 8개의 상이한 MHC 다량체 채널에서 양성 이벤트를 정의하는 별도의 게이트를 뽑는다.
39. 8개의 MHC 다량체-양성 게이트를 반전시켜, 각각의 MHC 다량체 채널에 대해 CD8+ 및 MHC 다량체-음성 세포를 선택하는 8개의 게이트를 수득한다.
40. 2개의 MHC 다량체-양성 집단에 대한 게이트를 다른 6개의 MHC 다량체 집단 각각에 대한 반전된 게이트와 교차시킨다. 이러한 게이트의 조합은 2개 및 오직 2개의 MHC 다량체 채널에서 양성인 CD8+ 세포를 선택한다(즉, 세포가 1개 또는 3개 이상의 MHC 다량체 채널에서 양성이면, 게이트 아웃된다). 이러한 게이트의 예는 PE+ 및 APC+ 및 PE-Cy7- 및 Qdot585- 및 Qdot605- 및 Qdot625- 및 Qdot655- 및 Qdot705-이다.
41. MHC 다량체에 대한 모든 28개의 가능한 2색 조합에 대해 이들 교차된 게이트(단계 40에 기재됨)를 만든다.
42. 단계 41로부터의 28개의 모든 게이트(예컨대, 게이트 1 또는 게이트 2 또는 ... 또는 게이트 28)를 연결한다.
43. 단계 39로부터의 8개의 반전된 게이트(PE- 및 APC- 및 PE-Cy7- 및 Qdot585- 및 Qdot605- 및 Qdot625- 및 Qdot655- 및 Qdot705-)를 교차시킨다.
44. 단계 42 및 43으로부터의 2개의 게이트를 연결한다.
45. 단게 44에서 게이팅된 이벤트를 나타내는, 모든 가능한 2색 코드를 이용하여 28개 점 플롯을 만든다. 이들 플롯은 모든 MHC 다량체에 대해 음성이거나 2개에 대해 양성인 CD8+ 세포만을 나타낼 것이고; 모든 백그라운드 이벤트는 게이트 아웃된다.
46. 또한 모든 CD8+ 세포를 나타내는, 모든 가능한 2색 코드를 이용하여 28개의 점 플롯을 만든다. 이들 플롯은 샘플의 백그라운드 수준을 잘 표시할 것이고, 또한 부적절한 보상을 나타내는데 사용될 수 있다. 반응을 백그라운드와 구별하는데 경험을 얻기 위해 이들 '비게이팅된' 플롯을 게이팅된 플롯과 비교하는 것이 권고된다. 이것은 낮은 강도 집단에 특히 중요할 수 있다.
실시예 19 - 형광 세포 바코딩 포스포 유동
세포 바코딩은 유세포 분석에 의해 멀티플렉스된 표현형 및 기능적 분석을 수행하는 데 사용될 수 있다. 포스포 유동은 FCB 표지화를 포함하도록 약간 변형하여 수행될 수 있다. 포름알데히드 고정 후, 샘플은 지시된 농도의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 또는 퍼시픽 블루(Pacific Blue) 석신이미딜 에스테르를 함유하는 100% 20-25℃ 메탄올(전형적으로 106 세포당 500 μL)에 재현탁될 것이며, 각각의 샘플은 상이한 농도의 형광 염료를 받는다. 일부 경우에, 샘플은 메탄올에 재현탁될 수 있고, 이후 DMSO에 용해된 FCB 형광단(전형적으로 1:50 희석)이 첨가될 것이다. 이것은 96웰 플레이트 실험에 필요한, DMSO 중의 FCB 염색 매트릭스의 사전 제조 및 저장을 허용하기 위해 수행될 수 있다. 20-25℃에서 15분 동안 표지한 후, 세포는 염색 배지(0.5% BSA 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 인산 완충 식염수(pH 7.0))로 2회 세척될 것이다. 4℃ 이하에서의 표지화는 매우 낮은 표지화 강도를 생성하여, FCB 염색 수준을 증가시키지 않고 메탄올 염색 용액에서 -80℃에서 샘플의 저장을 가능하게 할 수 있다.
차등적으로 표지된 샘플은 하나의 FACS 튜브 또는 웰로 조합되고, 생성된 부피가 100 μL보다 큰 경우 다시 펠렛화될 것이다. 조합된 바코딩된 샘플(전형적으로 100 μL)은 포스포 특이적 및/또는 표면 마커 항체로 염색되고, 세척되고, 유세포 분석에 의해 분석될 것이다. 유세포 분석은 캐스케이드 옐로우(Cascade Yellow)에 대한 405 nm 옥타곤 밴드패스 필터가 양자점 605의 검출을 위한 610/20 밴드패스 필터로 대체된, 405 nm, 488 nm 및 633 nm 레이저 및 제조사의 스톡 필터가 장착된, BD LSR2 유세포 분석기에서 수행될 수 있다.
실시예 20 - CD4
+
나이브 유도
프로토콜 1 및 2를 PIN 펩타이드를 사용하여 수행하였다. 항원 특이적 CD4+ 나이브 유도를 평가하였다. 결과를 하기 표 4에서 볼 수 있다.
표 4 - 공여자 1 및 2로부터의 CD4
+
나이브 유도 결과
실시예 21 - 제조 공정: DC 유도
실시예 22 - T 세포 유도 프로토콜 1
T 세포 유도 #1
T 세포 유도 #2
T 세포 유도 #3
채집 & 동결보존
실시예 23 - T 세포 유도 프로토콜 2
T 세포 유도 #1
T 세포 유도 #2
T 세포 유도 #3
채집 & 동결보존
실시예 24 - 멀티플렉스된 다중파라미터 유세포 분석을 사용한 CD4
+
및 CD8
+
신생항원 특이적 T 세포 반응의 동시 검출 및 기능적 특성화
암 세포에서 단백질 코딩 유전자 서열을 변경시키는 체세포 돌연변이로부터 발생하는 신생항원은 면역요법의 매력적인 표적으로 떠오르고 있다. 이들은 건강한 조직이 아닌 종양 세포 상에서 독특하게 발현되며, 면역계에 의해 외래 항원으로 인식되어, 면역원성을 증가시킬 수 있다. T 세포 제조 공정은 수 회의 세포외 T 세포 자극을 통해 환자 특이적 신생항원에 대한 기억 및 드 노보 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 일으켜, 입양 세포 요법에 사용하기 위한 신생항원 반응성 T 세포 생성물을 생성하도록 개발되었다. 자극된 T 세포 생성물의 상세한 특성화는 이들 공정이 이용하는 많은 잠재적인 변수를 시험하는 데 사용될 수 있다.
T 세포 기능성 및/또는 특이성을 조사하기 위해, 항원 특이적 T 세포 반응을 동시에 검출하고 이들의 크기 및 기능을 특성화하는 어세이가 개발되었다. 이 어세이는 다음 단계를 사용하였다. 먼저, T 세포-APC 공배양물을 사용하여 항원 특이적 T 세포에서 반응성을 유도하였다. 선택적으로, 형광 세포 바코딩을 사용한 샘플 멀티플렉싱을 사용하였다. 항원 특이적 CD8+ T 세포를 확인하고 T 세포 기능성을 조사하기 위해, 펩타이드-MHC 다량체의 염색 및 다중파라미터 세포내 및/또는 세포 표면 세포 마커 염색을 FACS 분석을 사용하여 동시에 조사하였다. 이 간소화된 어세이의 결과는 건강한 공여자로부터 유도된 T 세포 반응을 연구하기 위한 이의 적용을 입증하였다. 펩타이드에 대해 유도된 신생항원 특이적 T 세포 반응이 건강한 공여자에서 확인되었다. 유도된 T 세포 반응의 크기, 특이성 및 기능성을 또한 비교하였다. 도 25 및 도26은 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석을 위한 예시적인 공정을 도시한다.
요약하면, 상이한 T 세포 샘플을 상이한 농도에서 상이한 형광 염료로 바코딩하였다(예컨대, 실시예 19 참고). 각각의 샘플은 상이한 농도의 형광 염료 또는 상이한 농도에서 다수의 염료의 조합을 받았다. 샘플을 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킨 다음, DMSO에 용해된 형광단(전형적으로 1:50 희석)을 5 μM의 최대 최종 농도로 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 표지한 후, 단백질 함유 배지(예컨대, 10% 풀링된 인간 유형 AB 혈청을 함유하는 RPMI 배지)를 첨가하여 과량의 형광 염료를 켄칭하였다. 독특하게 바코딩된 T 세포 배양물을 상기 기재된 항원 펩타이드로 펄싱된 자가 APC로 챌린징시켰다.
차등적으로 표지된 샘플을 하나의 FACS 튜브 또는 웰로 조합하고, 생성된 부피가 100 μL보다 큰 경우 다시 펠렛화하였다. 조합된 바코딩된 샘플(전형적으로 100 μL)을 LAMP-1을 포함하는 표면 마커 항체로 염색하고(예컨대, 실시예 11 참고), 조립된 형광색소 접합된 펩타이드-MHC 다량체와 함께 인큐베이션하였다(예컨대, 상기 실시예 17 및 18 참고). 고정 및 투과 후, 샘플을 TNF-α 및 IFN-γ를 표적화하는 항체를 이용하여 추가로 세포내 염색하였다.
이후, 조합된 바코딩된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색을 유세포 분석기 상에서 유세포 분석에 의해 동시에 분석하였다. T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색을 개별적으로 분석하는 다른 방법과 달리, 본 실시예에 기재된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석은 항원 특이적이고 증가된 세포 마커 염색을 갖는 T 세포의 백분율에 관한 정보를 제공한다. T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색을 분석하는 다른 방법은 항원 특이적인 샘플의 T 세포의 백분율을 개별적으로 결정하고, 증가된 세포 마커 염색을 갖는 T 세포의 백분율을 개별적으로 결정하여, 이들 빈도의 상관관계만을 허용한다. 본 실시예에 기재된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석은 항원 특이적 T 세포의 빈도 및 증가된 세포 마커 염색을 갖는 T 세포의 빈도의 상관관계에 의존하지 않고; 오히려, 항원 특이적이고 증가된 세포 마커 염색을 갖는 T 세포의 빈도를 제공한다. 본 실시예에 기재된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석은 단일 세포 수준에서 항원 특이적이고 증가된 세포 마커 염색을 갖는 세포를 결정할 수 있게 해 준다.
주어진 유도 공정의 성공을 평가하기 위해, 리콜 반응 어세이를 이용한 후 멀티플렉스된 다중파라미터 유세포 분석 패널 분석을 사용하였다. 유도 배양물로부터 채취한 샘플을 독특한 2색 형광 세포 바코드로 표지하였다. 표지된 세포를 항원 로딩된 DC 또는 로딩되지 않은 DC 상에서 밤새 인큐베이션하여 항원 특이적 세포에서 기능적 반응을 자극하였다. 다음날, 독특하게 표지된 세포를 하기 표에 따라 항체 및 다량체 염색 전에 조합하였다.
개별적으로 또는 혼합물로서 취득된, 표지화에 의한 멀티플렉스된 샘플을 완전히 디콘볼루션하는 능력을 결정하였다(도 27A). 독특하게 표지된 샘플은 다른 바코드에 대한 최소한의 교차 오염으로 또는 교차 오염 없이 완전히 분해될 수 있었다. 다량체 염색에 의한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 검출은 샘플 멀티플렉싱으로 유지되었다. CMV pp65, EBV BRLF1, EBV BMLF1 및/또는 MART-1에 대해 특이성을 갖는 ~20%의 T 세포를 함유하는 유도 배양물의 샘플을 분리하고, 9개의 고유한 2색 바코드로 표지한 다음, 동일한 2색 조합(브릴리언트 바이올렛 650 [BV650] 및 피코에리트린 [PE])에서 4개의 모든 특이성을 표적화하는 사량체로 염색하기 위해 조합하였다(도 27B). 9개의 모든 바코드는 대등한 사량체 염색 패턴을 생성하였고 사량체+ 세포의 빈도를 검출하였다.
드 노보 CD4+ T-세포 반응을 함유하는 2개의 유도된 배양물의 샘플을 또한 바코팅 없이 단독으로 또는 관련이 없는 샘플과 혼합하여, 리콜 반응 어세이에서 분석하였다(도 28A 및 도 28B). 세포로부터 유발된 반응의 기능 및 크기의 수는 샘플 바코딩으로 유의하게 변하지 않았다.
유도된 CD8+ 기억 반응의 특이성 및 기능성의 동시 분석은 CMV pp65, MART-1 및 EBV BRLF1 및 BMLF1 에피토프에 대한 CD8+ 기억 반응이 출발하는 건강한 공여자 물질에서 CD8+ T 세포의 0.23%에서 > 60%로 증가될 수 있음을 입증하였다(도 29A)
CD8+ 다량체+ 세포 상에서 예비 게이팅함으로써, 항원 특이적 T 세포의 기능을 선택적으로 조사하였다(도 29B). 세포는 항원 로딩된 DC에 노출시 세포독성 기능(CD107a 표면 노출) 및 IFNγ 분비를 나타내었다.
동일한 배양물에서 다수의 특이성을 갖는 드 노보 유도된 CD4+ 반응의 검출 및 기능적 특성화가 또한 입증되었다. 항원 특이적 기능성을 이용하여 유도된 CD4+ T-세포 반응을 확인하였다(도 30A). 나타낸 예에서, HIV-음성 건강한 공여자에서 나이브 표적인 10개의 HIV 유래 에피토프를 표적화하는 4개의 리플리케이트 배양물에서 유도를 수행하였다. 4개의 모든 생물학적 리플리케이트에서 항원 특이적 반응이 검출되었다. 풀 디콘볼루션에 의한 추가 조치를 위해 검출된 반응 중 3개를 선택하여 유도된 반응의 특이성을 확인하였다(도 30B). 시험된 각각의 리플리케이트에서 다수의 반응이 검출되었고, 동일한 2개의 에피토프(HIV #5 및 HIV #7)가 각각의 경우에 가장 큰 크기의 반응을 유도하였다. 임의의 이론에 구속되지 않고, 이것은 MHC 클래스 II 일배체형으로 인한 이러한 공여자에서 이들 에피토프의 더 큰 면역원성 또는 나이브 레퍼토리에서 이들 에피토프를 표적화하는 T 세포의 더 큰 전구체 빈도를 반영할 수 있다. 항원에 대한 민감성을 DC 로딩 동안 펩타이드 적정에 의해 3개의 선택된 반응에 대해 결정하였다(도 30C). HIV #5, HIV #6 및 HIV #4에 대한 반응은 각각 0.45 μM, 0.43 μM 및 9.1 μM의 EC50을 입증하였다.
실시예 25 - T 세포 제조 프로토콜 3
재료:
AIM V 배지(Invitrogen)
인간 FLT3L, 임상전 CellGenix #1415-050 스톡 50 ng/μL
TNF-α, 임상전 CellGenix #1406-050 스톡 10 ng/μL
IL-1β, 임상전 CellGenix #1411-050 스톡 10 ng/μL
PGE1 또는 알프로스타딜(Alprostadil) - Cayman from Czech republic 스톡 0.5 μg/μL
R10 배지- RPMI 1640 glutamax + 10% 인간 혈청+ 1% PenStrep
20/80 배지- 18% AIM V + 72% RPMI 1640 glutamax + 10% 인간 혈청 + 1% PenStrep
IL7 스톡 5 ng/μL
IL15 스톡 5 ng/μL
절차:
단계 1: 2 mL AIM V 배지 중의 FLT3L을 갖는 24 웰 플레이트의 각 웰에 500만 PBMC(또는 관심있는 세포)를 플레이팅한다.
단계 2: AIMV에서 펩타이드 로딩 및 성숙
1. 각각의 웰에서 관심있는 펩타이드 풀(펩타이드가 없는 조건 제외)을 PBMC(또는 관심있는 세포)와 혼합한다.
2. 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. 인큐베이션 후 각각의 웰에 성숙 칵테일(TNF-α, IL-1β, PGE1, 및 IL-7 포함)을 혼합한다.
단계 3: 10 부피%의 최종 농도로 각각의 웰에 인간 혈청을 첨가하고 혼합한다.
단계 4: 배지를 IL7 + IL15가 보충된 신선한 RPMI+ 10% HS 배지로 교체한다.
단계 5: 배지를 1-6일마다 인큐베이션 기간 동안 IL7 + IL15가 보충된 신선한 20/80 배지로 교체한다.
단계 6: 2 ml AIM V 배지 중의 FLT3L을 갖는 새로운 6웰 플레이트의 각 웰에 500만 개의 PBMC(또는 관심있는 세포)를 플레이팅한다.
단계 7: 재자극을 위한 펩타이드 로딩 및 성숙(새로운 플레이트)
1. 각각의 웰에서 관심있는 펩타이드 풀(펩타이드가 없는 조건 제외)을 PBMC(또는 관심있는 세포)와 혼합한다.
2. 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. 인큐베이션 후 각각의 웰에 성숙 칵테일을 혼합한다.
단계 8: 재자극:
1. 제1 자극 FLT3L 배양물을 계수하고 새로운 재자극 플레이트에 500만 개의 배양된 세포를 첨가한다.
2. 배양 부피를 5 mL(AIM V)로 맞추고 500 ul의 인간 혈청(10 부피%)을 첨가한다.
단계 9: 3 ml의 배지를 제거하고 IL7 + IL15가 보충된 6 ml의 RPMI+ 10% HS 배지를 첨가한다.
단계 10: 배지의 75%를 IL7 + IL15가 보충된 신선한 20/80 배지로 교체한다.
단계 11: 필요한 경우 재자극을 반복한다.
실시예 26 - T 세포 제조 프로토콜 3을 사용한 실험 데이터
T 세포를 T 세포 제조 프로토콜 3을 사용하여 제조하고 자극된 T 세포를 분석하였다. 샘플을 흑색종을 갖는 2명의 환자로부터 수득하였다. T 세포를 실시예 24에 기재된 바와 유사한 어세이를 이용하여 분석하였다. 도 34는 흑색종을 갖는 2명의 환자로부터 유도된 CD8+ T 세포 반응을 정량화하는 pMHC 다량체 플롯을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, NEO-STIM은 T 세포 제조 프로토콜을 지칭한다. 도 35는 1, 2, 3, 또는 4개의 기능의 조합에 의해 나타낸 바와 같이, 흑색종을 갖는 환자에서 유도된 기억 및 드 노보 반응의 다기능성 프로파일의 데이터를 나타낸다. 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα, CD107a 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성이다. 도 36은 돌연변이 및 야생형 펩타이드에 대한 흑색종 환자에서 유도된 기억 및 드 노보 반응의 특이성을 나타낸다. 도 37A 및 37B 및 37C는 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같은 흑색종 환자에서 유도된 기억 및 드 노보 반응의 세포독성 프로파일을 나타낸다(상부 패널). 도 37A 및 37B 및 37C의 하부 패널은 aCAS3+ 종양 세포의 빈도에 의해 정량화된 바와 같은 이들 T 세포 반응에 의한 표적 세포 사멸을 나타낸다. 도 38A는 흑색종 환자에서 신생항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 확인을 나타낸다. 도 38B는 돌연변이 및 야생형 펩타이드에 대해 도 38A에서 확인된 이들 CD4+ T 세포 반응의 특이성을 나타낸다. 도 38C는 1, 2, 3, 또는 4개의 기능의 조합에 의해 나타낸 바와 같이, 이들 CD4+ T 세포 반응의 다기능성 프로파일을 나타낸다. 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα, CD107a 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성이다.
실시예 27 - T 세포 제조 프로토콜 1 또는 2를 사용한 실험 데이터
T 세포를 T 세포 제조 프로토콜 1 또는, 대안으로서, 프로토콜 2를 사용하여 제조하였다. 자극된 T 세포를 실시예 24에 기재된 바와 유사한 어세이를 이용하여 분석하였다. 도 39는 1, 2 또는 3개의 기능(예컨대, 하나 이상의 기능은 IFNγ, TNFα 및 CD107a로부터 선택된 하나 이상의 인자의 생성임)의 조합에 의해 나타낸 바와 같이, 에파카도스타트를 첨가하거나 첨가하지 않은 2명의 건강한 공여자(예컨대, HD66 및 HD63)에서 유도된 기억 반응의 기능을 나타낸다. 도 40은 에파카도스타트를 첨가하거나 첨가하지 않은 6개의 리플리케이트 유도에서 퍼센트 유도된 드 노보 CD8+ T 세포 반응('적중률', 4명의 건강한 공여자에 걸친 평균)을 도시한다. 도 41A는 PD-1 블로킹 항체를 첨가하거나 첨가하지 않고, 본원에 제공된 T 세포 제조 프로토콜로 유도한 후 공여자 HD55로부터 항원 특이적 세포의 절대 수를 나타낸다. 도 41B는 PD-1 블로킹 항체를 첨가하거나 첨가하지 않은, 본원에 제공된 T 세포 제조 프로토콜로 유도 후 공여자 HD67로부터의 항원 특이적 세포의 절대 수를 도시한다. 도 42A는 IL-12를 첨가하거나 첨가하지 않은 드 노보 CD8+ T 세포 반응의 pMHC+ CD8+ T 세포의 분율을 도시한다. 도 42B는 IL-12를 첨가하거나 첨가하지 않은 드 노보 CD8+ T 세포 반응 내에서 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다.
실시예 28: 환자 특이적 신생항원에 대해 유도된 면역 반응의 심층 특성화
바이오인포매틱스 엔진을 사용하여 환자 특이적 신생항원을 예측하였다. 예측된 신생항원을 커버하는 합성된 긴 펩타이드를 자극 프로토콜에서 면역원으로 사용하여 면역원성 능력을 평가하였다. 자극 프로토콜은 이들 신생항원 코딩 펩타이드를 환자 유래 APC에 공급한 다음, 환자 유래 T 세포와 함께 공배양하여 신생항원 특이적 T 세포를 프라이밍하는 것을 포함한다.
기억 및 드 노보 T 세포 반응을 프라이밍, 활성화 및 확장하기 위해 자극 프로토콜에 수 회의 자극이 포함된다. 이들 반응을 하기 어세이로 특성화하여 이들 신생항원 특이적 T 세포의 특이성, 표현형 및 기능성을 분석하였다: pMHC 다량체를 사용한 조합 코딩 분석을 사용하여 다수의 신생항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 검출하였다. 멀티플렉스된 다중파라미터 유세포 분석을 사용한 리콜 반응 어세이를 이용하여 CD4+ T 세포 반응을 확인하고 검증하였다. IFN-γ 및 TNFα를 포함하는 향염증성 사이토카인의 생성, 및 탈과립 마커로서 CD107a의 상향 조절을 측정함으로써 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응의 기능성을 평가하였다. 자연적으로 가공되고 제시된 항원에 대한 반응으로 표적 세포를 인식하고 사멸시키는 CD8+ T 세포 반응의 능력을 이해하기 위해 신생항원-발현 종양주를 사용한 세포독성 어세이를 이용하였다. T 세포 상의 CD107a의 세포 표면 상향조절 및 신생항원 발현 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절에 의해 세포독성을 측정하였다. 이 연구에서, 흑색종 환자 샘플(NV6 및 NV10)은 IRB 승인 하에 수득하였다.
자극 프로토콜은 기존 CD8+ T 세포 반응의 확장뿐만 아니라 드 노보 CD8+ T 세포 반응의 유도에 성공적이었다(표 1).
표 1
흑색종 환자 NV10으로부터의 PBMC를 사용하여, CD8+ T 세포의 4.5%로부터 CD8+ T 세포의 72.1%로의 기존 CD8+ T 세포 반응의 확장이 관찰되었다(SRSF1E>K). 더욱이, 자극 프로토콜은 환자 특이적 신생항원에 대한 2개의 추정된 드 노보 CD8+ T 세포 반응을 유도하는데 효과적이었다(ARAP1Y>H: CD8+ T 세포의 6.5% 및 PKDREJG>R: CD8+ T 세포의 13.4%; 자극 과정 전에 세포가 검출되지 않음)(도 34). 자극 프로토콜은 또 다른 흑색종 환자 NV6으로부터의 PBMC를 사용하여 이전에 기술된 신생항원 및 신규한 모델 신생항원에 대해 다양한 크기까지(ACTN4K>N CSNK1A1S>L DHX40neoORF 7, GLI3P>L, QARSR>W, FAM178BP>L 및 RPS26P>L, 범위: CD8+ T 세포의 0.2%부터 CD8+ T 세포의 최대 52%까지) 7개의 드 노보 CD8+ T 세포 반응을 성공적으로 유도하였다. 또한, 환자 특이적 신생항원에 대한 CD8+ 기억 T 세포 반응은 확장되었다(AASDH신생ORF, 자극 후 CD8+ T 세포의 최대 13%까지).
환자 NV10으로부터의 유도된 CD8+ T 세포를 더 상세히 특성화하였다. 돌연변이체 펩타이드 로딩된 DC로 재챌린징시, 신생항원 특이적 CD8+ T 세포는 1개, 2개 및/또는 3개의 모든 기능을 나타내었다(SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H에 대해 각각 16.9% 및 65.5% 기능적 CD8+ pMHC+ T 세포)(도 35).
상이한 농도의 신생 항원 펩타이드로 재챌린징되는 경우, 유도된 CD8+ T 세포는 돌연변이 신생항원 펩타이드에 유의하게 반응하였지만 야생형 펩타이드에는 반응하지 않았다(도 36).
환자 NV10에서, 돌연변이 신생항원 로딩된 DC를 이용한 리콜 반응 어세이를 이용하여 CD4+ T 세포 반응을 확인하였다(도 38A-C). 돌연변이 신생항원 펩타이드가 로딩된 DC에 대한 반응성에 기초하여 3개의 CD4+ T 세포 반응을 확인하였다(MKRN1S>L, CREBBPS>L 및 TPCN1K>E). 이들 CD4+ T 세포 반응은 또한 돌연변이 신생항원 펩타이드로 재챌린징되는 경우 다기능성 프로파일을 나타내었다. CD4+ T 세포의 31.3%, 34.5% & 41.9%는 1개, 2개 및/또는 3개의 기능; 각각 MKRN1S>L, CREBBPS>L 및 TPCN1K>E 반응을 나타내었다.
환자 NV10으로부터의 유도된 CD8+ 반응의 세포독성 능력을 또한 평가하였다(도 37A-C). SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H 반응은 CD8+ T 세포 상에서 CD107a의 유의한 상향조절 및 공배양 후 돌연변이 작제물로 형질도입된 종양 세포 상에서 활성 카스파제3의 유의한 상향조절을 나타내었다.
자극 프로토콜을 사용하여, 예측된 환자 특이적 신생항원뿐만 아니라 모델 신생항원은 환자 물질에서 다수의 신생항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응의 유도에 의해 면역원성인 것으로 확인되었다. 다기능성 및 돌연변이-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 능력은 고품질 신생항원을 예측하고 강력한 T 세포 반응을 생성하는 능력을 입증한다. 자극 과정의 말기에 다수의 농축된 신생항원 특이적 T 세포 집단(기억 및 드 노보)의 존재는 새로운 T 세포 반응을 증가시키고 암 환자를 치료하기 위한 효과적인 암 면역요법을 생성하는 능력을 입증한다.
Claims (54)
- (a) 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)로 자극된 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단으로서,
(i) 상기 집단 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양이 상기 생물학적 샘플 중의 CD14 및 CD25를 발현하는 면역 세포의 양보다 비례적으로 적거나, 또는
(ii) 상기 APC는 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC인 면역 세포의 집단; 및
(b) 약학적으로 허용 가능한 부형제
를 포함하는 약학 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 암을 갖는 인간 대상체로부터 유래된 것인 약학 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열이 500 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 대상체에 의해 발현된 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하는 것인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 각각이, 대상체의 암 세포의 발현된 유전자에 의해 코딩되고 대상체의 비암 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 포함하는 것인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상이 8 내지 50개의 자연발생 아미노산의 길이를 갖는 것인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열이 적어도 2개의 항원 펩타이드 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중의 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율이 상기 조성물 중의 총 CD8+ T 세포의 적어도 약 1%인 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물 중의 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 백분율이 상기 조성물 중의 총 CD8+ T 세포의 적어도 약 5%인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중의 적어도 하나의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 수가 적어도 약 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 또는 5x108개의 항원 특이적 CD8+ T 세포인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
- 요법에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 용도.
- (a) 하나 이상의 항원 제시 세포(APC) 제제를, CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 하나 이상의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(b) 하나 이상의 APC 제제를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 하나 이상의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 상기 하나 이상의 APC는 하나 이상의 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)로 자극된 APC를 포함하는 것인 단계; 또는
(c) FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 상기 FLT3L을 상기 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하고 상기 적어도 하나의 펩타이드를 면역 세포의 집단과 함께 제1 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 상기 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 단계
를 포함하는 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서,
적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포가 확장되거나, 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포가 유도되는 것인 방법. - 제12항에 있어서, 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제 중 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 APC 제제와 함께 3개 이하의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 2개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 3개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션하는 것은 APC 제제 중 제1 APC 제제를 T 세포와 함께 7일 초과 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 APC 제제의 APC가 적어도 하나의 항원 펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩타이드가 로딩된 APC를 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 APC 제제의 APC가 자가 APC 또는 동종이계 APC인 방법.
- 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 APC 제제의 APC가 수지상 세포(DC)를 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 DC가 CD141+ DC인 방법.
- 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 것은 CD14 또는 CD25 결합제를 하나 이상의 APC 제제의 APC에 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션하는 것은 하나 이상의 APC 제제 중 제1 APC 제제를 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 초과 동안 T 세포와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
- 제27항에 있어서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 성숙 APC를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 제3 기간 후에 제2 배지의 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 APC 제제의 APC가 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 신생항원, 종양 관련 항원, 바이러스 항원, 부조직적합 항원 또는 이들의 조합인 방법.
- 제12항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 외에서 수행되는 방법.
- 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 펩타이드를 CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 (i) 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC, (ii) 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩타이드 로딩 샘플, 또는 (iii) 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 (i) 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC, (ii) 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드 로딩 샘플, 또는 (iii) 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드 로딩 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 별개의 기간, 3개 이하의 별개의 기간, 제1 기간, 제2 기간, 제3 기간, 제4 기간, 또는 제5 기간이 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 13시간, 적어도 14시간, 적어도 15시간, 적어도 16시간, 적어도 17시간, 적어도 18시간, 적어도 19시간, 적어도 20시간, 적어도 21시간, 적어도 22시간, 적어도 23시간, 적어도 24시간, 적어도 25시간, 적어도 26시간, 적어도 27시간, 적어도 28시간, 적어도 29시간, 적어도 30시간, 적어도 31시간, 적어도 32시간, 적어도 33시간, 적어도 34시간, 적어도 35시간, 적어도 36시간, 적어도 37시간, 적어도 38시간, 적어도 39시간, 또는 적어도 40시간인 방법.
- 제12항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 별개의 기간, 3개 이하의 별개의 기간, 제1 기간, 제2 기간, 제3 기간, 제4 기간, 또는 제5 기간이 1 내지 4시간, 1 내지 3시간, 1 내지 2시간, 4 내지 40시간, 7 내지 40시간, 4 내지 35시간, 4 내지 32시간, 7 내지 35시간 또는 7 내지 32시간인 방법.
- 제12항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포의 집단이 APC 또는 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포의 집단이 APC를 포함하지 않고, 상기 면역 세포의 집단이 하나 이상의 APC 제제 중 하나를 포함하지 않는 것인 방법.
- 제12항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 상기 FLT3L을 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하고 상기 적어도 하나의 펩타이드를 면역 세포의 집단과 함께 제1 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 상기 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하고 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 제2 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 및 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제1 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제44항에 있어서, FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하고 상기 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 제3 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 및 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제2 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플 중 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- (a) 대상체로부터 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플로부터 CD14를 발현하는 세포를 농축시켜, CD14+ 세포 농축 샘플을 수득하는 단계;
(c) CD14+ 세포 농축 샘플을 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 적어도 하나의 펩타이드를 (c)의 CD14+ 세포 농축 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계;
(e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계;
(f) 성숙 APC 샘플의 APC를 T 세포를 포함하는 CD14 및 CD25 고갈된 샘플과 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(g) T 세포를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(h) T 세포를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제6 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및
(i) T 세포의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계;
(c) CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 적어도 하나의 펩타이드를 (c)의 CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계;
(e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(f) 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계;
(c) CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 적어도 하나의 펩타이드를 (c)의 CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계;
(e) APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(f) 선택적으로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계;
(c) CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 적어도 하나의 펩타이드를 (c)의 CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계;
(e) 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(f) 선택적으로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩타이드 로딩 샘플와 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩타이드 로딩 샘플와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - (a) 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 수득하는 단계;
(c) CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 적어도 하나의 펩타이드를 (c)의 CD14 및 CD25 세포 고갈 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계;
(e) 제1 APC 펩타이드 로딩 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(f) 선택적으로, 제1 자극 T 세포 샘플을 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(g) 선택적으로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(h) 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - (a) FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 인큐베이션하는 단계로서, 상기 FLT3L을 상기 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하고 상기 적어도 하나의 펩타이드를 상기 면역 세포의 집단과 함께 제1 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 상기 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 단계;
(b) 선택적으로, FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 상기 FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하고 상기 적어도 하나의 펩타이드를 상기 적어도 하나의 APC와 함께 제2 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 및 제1 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제1 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계;
(c) 선택적으로, FLT3L 및 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 상기 FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하고 상기 적어도 하나의 펩타이드를 적어도 하나의 APC와 함께 제3 펩타이드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 수득하는 단계; 및 제2 성숙 APC 펩타이드 로딩 샘플을 제2 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 및
(d) 제1 자극 T 세포 샘플, 제2 자극 T 세포 샘플 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법. - (a) 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및
(b) 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계
를 포함하는 방법으로서,
발현의 측정과 결합의 측정을 동시에 수행하는 것인 방법. - (a) 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 APC와 함께 인큐베이션하여, 자극된 면역 세포 샘플을 수득하는 단계;
(b) 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 측정하는 단계; 및
(c) 펩타이드-MHC 복합체에 대한 자극된 면역 세포 샘플의 적어도 하나의 면역 세포의 결합을 측정하는 단계
를 포함하는 방법으로서,
발현의 측정과 결합의 측정을 동시에 수행하는 것인 방법.
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