CN112063732A - 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物 - Google Patents

一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物 Download PDF

Info

Publication number
CN112063732A
CN112063732A CN202010979402.6A CN202010979402A CN112063732A CN 112063732 A CN112063732 A CN 112063732A CN 202010979402 A CN202010979402 A CN 202010979402A CN 112063732 A CN112063732 A CN 112063732A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enterobacter sakazakii
sample
cells
suspension
espyzu05
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010979402.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063732B (zh
Inventor
杨振泉
张元嵩
杨晓珺
周文渊
高璐
胡钦
郑香峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202010979402.6A priority Critical patent/CN112063732B/zh
Publication of CN112063732A publication Critical patent/CN112063732A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063732B publication Critical patent/CN112063732B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物，所述检测方法，包括如下步骤：1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品稀释液共培养；3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量；4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数，实现样品中阪崎肠杆菌存活细胞数快速定量测定。本发明中的检测方法对死亡细胞和其他菌株无交叉反应，检测周期为5.5h，检测通量高，适合于食品或环境样本中阪崎肠杆菌存活细胞的定量检测，以及快速评价消毒杀菌条件对阪崎肠杆菌的有效性。

Description

一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方 法及其引物
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物。
背景技术
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii，Es)为革兰氏阴性短杆菌，是一种重要的食源性致病菌，能引起新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，死亡率达40％-80％。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)将Es定义为“对特定人群可产生严重的生命危害及产生慢性实质性或长期影响的后遗症”的致病菌。研究显示Es广泛分布于环境中，其生长速度快，具有耐高参透压，抗干燥特性，在水分活度(Aw)0.3-0.69条件下可存活，低温条件下抗干燥能力增强，极易污染婴幼儿奶粉、乳制品、肉制品等食品，引发食源性疾病爆发。由于Es致病性高和传播性强，是食品中必检的微生物指标之一，建立精确的Es快速检测技术对控制该菌引起的疾病具有重要意义。
目前Es检测方法主要有传统微生物培养法、分子生物学检测法和免疫学检测法等。其中，传统微生物培养法是通过分离、纯化培养、生化鉴定等检测手段，该方法技术成熟，但操作繁琐、检测周期长，不利于突发事件中对阪崎肠杆菌的快速检测。分子生物学检测法主要以Es特异性基因序列设计相应的特异性引物，建立基于聚合酶链式反应(PCR)的快速检测方法，这些方法具有特异性好、快速灵敏度等优势，但是只能检测Es的总细胞数，无法辨别样品中Es细胞死亡/存活状态。此外，在食品加工中，往往需要快速筛查食品以及环境样本Es存活细胞的数量，判断加工手段对Es灭活的有效性和可靠性，现有的基于PCR快速检测无法提供有效结果。因此建立PCR联合其他特异性识别Es存活细胞的快速检测技术具有广阔的应用前景。噬菌体具有严格的宿主特异性，能识别一定范围的宿主菌。噬菌体随着宿主生长而复制，具有区分宿主菌细胞死活的能力，目前尚无利用噬菌体联合qPCR进行Es存活细胞的快速检测的报道。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，有效实现了阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测。
本发明还提供了一种用于阪崎肠杆菌存活细胞特异性快速定量检测的引物。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所述一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，包括如下步骤：
1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；
2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养；
3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量(△Ct)。
4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液的活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数。
其中，步骤1)中制备的培养液灭菌冷却后加入过滤除菌处理的噬菌体悬液，制成含有102-106PFU/mL阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；作为优选，制成含有103PFU/mL阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液。
作为优选，通过常规方法称取1g蛋白胨，0.3g牛肉膏，0.5g NaCl，0.5g CaCl2，0.5g CaCl2，蒸馏水定容至100mL，调节pH为7.5，121℃灭菌15min制备培养液。
作为优选，步骤1)中所述噬菌体阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05，保藏编号CCTCC NO：M 2016716(CN107828743A)。
其中，步骤2)中将样品进行匀浆、稀释处理，制备样品梯度悬液；制备标准菌株梯度悬液；将样品稀释液和标准菌株梯度悬液分别步骤1)制备的裂解培养液混合，混匀共培养。
作为优选，所述通过常规方法将样品进行匀浆、稀释处理，制备样品梯度悬液或者稀释液；按常规方法制备标准菌株10倍梯度悬液；将样品稀释液和标准菌株10倍梯度悬液分别步骤1)制备的裂解培养液混合，200rmp涡旋混匀，37℃下共培养时间为4h，每隔30min取出200rmp涡旋混匀1min。
其中，步骤3)中取步骤2)获得共培养物，离心上清液沸水浴后作为DNA模板建立qPCR反应体系，测定Ct值。
作为优选，步骤3)中使用特异性的qPCR引物为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'；Ct值变化量(△Ct)为裂解培养液与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养物Ct值，分别与裂解培养液和不含菌株的对照共培养物Ct值(Ct0)的差值。
其中，步骤4)中将步骤3)中测定的Ct值变化量(△Ct值)和标准菌株梯度悬液的活菌数进行相关性分析，根据获得的线性方程，计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞含量。
本发明所述用于特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测的引物，所述引物为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'。
作为优选，本发明的具体检测过程包括如下步骤：
(1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液。将噬菌体EspYZU05(CCTCCNO：M 2016716)与宿主菌按照感染复数MOI＝1比例混合，静置10min后加入10mL液体培养基中，37℃、150r/min培养8h。培养液经6000r/min离心10min取上清，通过0.45μm孔径滤膜，滤过液4℃保存。应用常规双层平板法测定滤过液中噬菌体滴度，并用无菌SM缓冲液(SM缓冲液(5.80g NaCl，2g MgSO4·7H2O，0.10g明胶，50mL 1M pH 7.50Tris-HCl)将噬菌体悬液的滴度调节至107PFU/mL，备用。按常规方法称取1g蛋白胨，0.3g牛肉膏，0.5g NaCl，0.5gCaCl2，蒸馏水定容至100mL，调节pH为7.5，121℃灭菌15min；冷却后加入过滤除菌处理的噬菌体EspYZU05悬液至终浓度102、103、104、105、106PFU/mL，根据步骤(4)中△Ct变化范围，筛选△Ct变化最大的浓度作为特异性裂解培养液中的最佳噬菌体浓度，最优浓度是103PFU/mL。
(2)噬菌体EspYZU05特异性核酸标志物筛选及引物设计与特异性验证。按常规方法提取噬菌体EspYZU05基因组DNA，通过Illumina Hiseq测序平台获得全基因组序列，通过比对筛选特异性核酸序列。依据EspYZU05基因组中特异性核酸序列ORF18基因，利用BLAST工具盒BioEdit软件线上分析设计引物的特异性，并委托商业化生物工程有限公司合成引物。获得的引物序列为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'。扩增产物大小为180bp。引物特异性验证具体为：选取EspYZU05基因组DNA以及其他基因组DNA作为模板，建立PCR反应体系：2×Taq MasterMix 12.5μL，DNA模板1μL，EspYZU05-ORF18-F1 0.5μL，EspYZU05-ORF18-R10.5μL，ddH2O10.5μL，总体系为25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃再延伸10min，反应结束，利用2％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。
(3)步骤(1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养。按常规方法将样品匀浆处理、稀释，制备待测样品梯度悬液；按常规方法制备空白对照(无菌SM缓冲液)以及101、102、103、104、105、106CFU/mL阪崎肠杆菌标准菌株10倍梯度悬液；将样品稀释液和标准菌株梯度悬液分别步骤(1)制备的裂解培养液混合，200rmp涡旋混匀，置于37℃下共培养2h、3h、4h，每隔30min取出200rmp涡旋混匀1min。根据步骤(4)中测得的△Ct值，筛选△Ct值与活菌数的线性关系最佳的共培养时间，最优的培养时间为4h。
(4)通过qPCR测定步骤(3)共培养物Ct值变化(△Ct)。取500μL步骤(3)获得的共培养物，4℃条件下10000g离心2min，取250μL上清液沸水浴5min，取2μL作为DNA模板建立qPCR反应体系，应用qPCR测定Ct值。测定Ct值所使用的引物为步骤(2)获得：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'。qPCR反应体系为：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL，EspYZU05-ORF18-F1 0.8μL，EspYZU05-ORF18-R1 0.8μL，DNA模板为2μL，ddH2O 6.4μL，总体系为20μL。热循环参数优化为：预变性95℃30s，95℃5s，退火55℃30s，72℃30s，40个循环。95℃15s，60℃1min。熔解60℃5s，50个循环。记录样品的Ct值，Ct值变化量(△Ct)为裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养物的Ct值，再分别与裂解培养液和不含菌株的对照(0CFU/ml菌株)共培养物Ct值(Ct0)的差值。
(5)根据步骤(4)中△Ct值与活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数。将步骤(4)中测定的△Ct值和标准菌株梯度悬液的活菌数进行相关性分析，根据获得的线性范围和方程，计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞含量。
设计原理：本发明利用一株广谱高效的裂解型噬菌体作为阪崎肠杆菌存活细胞特异性识别原件，通过制备特异性裂解培养液、建立共培养条件、筛选阪崎肠杆菌噬菌体特异性核酸标志物、设计特异性引物、构建qPCR反应体系测定Ct值，以及△Ct值与起始活菌数的线性分析等步骤，建立一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法。本发明中发现一段阅读框569000018(ORF18)，该段序列只有噬菌体EspYZU05基因组中才含有，同源性仅为29.1％，通过其设计引物对噬菌体EspYZU05具有特异性，与宿主菌及其它生物体的核酸无交叉反应，可以测定噬菌体EspYZU05的增殖，来反映宿主菌的含量。
本方法依靠阪崎肠杆菌噬菌体宿主专一性，只能识别阪崎肠杆菌的活细菌。待检样品与阪崎肠杆菌噬菌体共培养，阪崎肠杆菌感染后产生子代噬菌体，阪崎肠杆菌经培养后噬菌体浓度增加，建立噬菌体浓度变化与起始阪崎肠杆菌的线性关系，通过实时定量荧光PCR来检测噬菌体数量变化，依据噬菌体数量变化的值来反映样品阪崎肠杆菌活菌数。该方法具有具有辨别活菌和死菌能力，同时具有PCR的灵敏性和快速性，对阪崎肠杆菌死亡细胞和其他菌株无交叉反应，无需培养鉴定，检测周期短，检测通量高等优势，适合于食品或环境样本中阪崎肠杆菌存活细胞的定量检测，具有良好应用前景。
本发明提供了含有阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05(CCTCC NO：M 2016716)的特异性裂解培养液的制备方法、裂解培养液与标准菌株梯度悬液及样品稀释液共培养条件，阪崎肠杆菌噬菌体特异性检测引物和共培养产物的qPCR检测步骤，以及样品中阪崎肠杆菌存活细胞数的计算方法。实现了阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测，在此基础上对试剂和步骤进行了组装和优化，检测过程无需细菌培养鉴定，操作简单，检测周期小于5.5小时，检测精确性优于目前使用的传统方法和常规qPCR检测方法。
有益效果：相对于现有技术，本发明方法具有以下优势：
(1)本发明提供了一种含有噬菌体EspYZU05的裂解培养液和共培养条件，能够特异性裂解阪崎肠杆菌活细胞并产生增殖，对样品中阪崎肠杆菌死亡细胞和其它微生物没有交叉反应。
(2)本发明提供了一对能特异性检测噬菌体EspYZU05的基因组序列、引物及qPCR检测体系，能够快速、灵敏的检测阪崎肠杆菌活细胞和裂解培养液共培养过程中噬菌体的增殖。
(3)本发明提供了一种噬菌体扩增联合qPCR的快速检测方法，具有特异性检测样本中阪崎肠杆菌活细胞含量的效果，检测过程简单，检测通量高，整个过程无需常规鉴定，检测限达到102CFU/mL，检测周期不超过5.5h；该方法适合大量的，菌群复杂的食品和环境样品中阪崎肠杆菌存活细胞的定量检测。
附图说明
图1为噬菌体EspYZU05检测引物设计与特异性验证。其中，图(A)为噬菌体EspYZU05特异性核酸序列在基因组上的位置；下划线序列为上下游引物对应的序列；图(B)为上下游引物的PCR扩增产物的电泳图，其中，泳道M为Marker，泳道1-10分别为EspYZU05噬菌体基因组DNA、阪崎肠杆菌基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA、沙门氏菌基因组DNA、金黄色葡萄球菌基因组DNA、霍氏肠杆菌基因组DNA、弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA、副溶血性弧菌基因组DNA、噬菌体VppYZU84基因组DNA、噬菌体EspYZU08基因组DNA为模板的PCR扩增产物。
图2为噬菌体EspYZU05 qPCR定量检测体系的建立。其中，图(A)为浓度为108PFU/mL，107PFU/mL，106PFU/mL，105PFU/mL，104PFU/mL，103PFU/mL噬菌体EspYZU05悬液的qPCR扩增曲线(曲线从左到右)；图(B)为噬菌体浓度的对数值与测得的Ct值在3-8Log10 PFU/mL范围内线性关系(R2＝0.9908)。
图3为噬菌体扩增联合qPCR定量检测阪崎肠杆菌的特异性验证。其中，图(A)为样品稀释液和菌株梯度悬液与噬菌体裂解培养液共培养产物的qPCR扩增曲线；图(B)为Ct值变化值(ΔCt)与菌株梯度悬液浓度的线性关系；图(C)为A组样品(无背景菌)阪崎肠杆菌活菌测定结果，黑色柱形图代表传统平板稀释计数法测得结果，灰色柱形图代表本发明方法测得的活菌数；图(D)为B组样品(含背景菌CICC 10664)阪崎肠杆菌活菌测定结果，黑色柱形图代表传统平板稀释计数法测得结果，灰色柱形图代表本发明方法测得的活菌数，*代表与A组样品测定结果又显著差异(P<0.01)。
图4为应用噬菌体扩增联合qPCR测定牛乳中阪崎肠杆菌热失活动态结果。其中，实心数据点代表传统平板稀释计数法测得60℃(■)、65℃(●)和70℃(▲)失活条件下的活菌数；空心数据点代表噬菌体扩增联合qPCR测得60℃(□)、65℃(○)和70℃(△)失活条件下的活菌数。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
本发明使用的阪崎肠杆菌菌株CICC 21596、大肠杆菌CICC 10664购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，噬菌体EspYZU05(CCTCC NO：M 2016716)由CCTCC保存；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；其它试剂设备除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验，所用试剂均为市购。
实施例1
噬菌体EspYZU05特异性引物设计与验证结果
提取噬菌体EspYZU05基因组DNA，通过Illumina Hiseq测序获得全基因组序列，通过Blastn比对，筛选同源性最低的阅读框569000018(ORF18)作为特异性核酸检测靶标(序列如图1A所示)，ORF18核酸序列为SEQ ID NO.1：ATG GAT ATG AAG AAT ATC GTG GCA GTATTT AAC GAA CAG AAT CCC AAC TTC AAG ATG CGG CTC GGT GAG CTG CTT CAA GAT GTAGCC GAG AGC ATG TGC GGC GGG GTT ATG TGT GCG GGC ATT CCA TGC AGT GAC TGC CCGTTT GAA CGT CAG AAC GAC CCG GAA GAT ACG GTC GTT GTT ATG CAA TCC TTA CTT GAGGAA ATG AAC TGA；经比对与NCBI数据库中发表的核酸序列的最大同源性仅为29.1％。根据ORF18上下游序列设计PCR上游引物序列为SEQ ID NO.2:5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'(命名为EspYZU05-ORF18-F1)，下游引物序列为SEQ ID NO.3:5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'(命名为EspYZU05-ORF18-R1)，预期扩增产物大小为180bp，利用BLAST工具盒BioEdit软件在线分析结果表明所设计的引物具有特异性。
建立PCR扩增体系并验证引物的特异性，委托上海生工生物工程有限公司合成引物EspYZU05-ORF18-F1和EspYZU05-ORF18-R1。经优化PCR反应体系为：2×Taq Master Mix12.5μL，DNA模板1μL，EspYZU05-ORF18-F1 0.5μL，EspYZU05-ORF18-R1 0.5μL，ddH2O 10.5μL，总体系为25μL。热循环参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃再延伸10min。反应结束后，扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳溶液检测，并在凝胶成像仪上拍片分析扩增结果。结果如图1B所示，结果显示只有EspYZU05基因组DNA作为模板(泳道1)能够扩增出预期大小的片段，而对其它细菌和病毒的基因组DNA无交叉反应，验证结果显示合成引物EspYZU05-ORF18-F1和EspYZU05-ORF18-R1具有良好特异性。
实施例2
噬菌体EspYZU05 qPCR扩增体系的建立
将噬菌体EspYZU05(CCTCC NO：M 2016716)与阪崎肠杆菌CICC 21596按照感染复数MOI＝1比例混合，静置10min后加入10mL液体培养基中，37℃、150r/min培养8h。培养液经6000r/min离心10min取上清，通过0.45μm孔径滤膜，滤过液4℃保存。应用常规双层平板法测定滤过液中噬菌体滴度，并用无菌SM缓冲液将噬菌体悬液的滴度调节至108PFU/mL，备用。取噬菌体EspYZU05悬液进行10倍稀释，分别制成108PFU/mL，107PFU/mL，106PFU/mL，105PFU/mL，104PFU/mL，103PFU/mL。每个稀释度做3个重复。每个稀释度取250μL沸水浴5min，取2μL作为DNA模板建立qPCR反应体系，应用qPCR测定Ct值。qPCR反应体系为：TB GreenPremix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL，EspYZU05-ORF18-F1 0.8μL，EspYZU05-ORF18-R1 0.8μL，DNA模板为2μL，ddH2O 6.4μL，总体系为20μL。热循环参数优化为：预变性95℃30s，95℃5s，退火55℃30s，72℃30s，40个循环。95℃15s，60℃1min。熔解60℃5s，50个循环。记录qPCR扩增曲线和Ct值，并与噬菌体滴度的对数值做线性分析，结果如图2(A、B)所示。图2A显示从左到右依次浓度为108PFU/mL，107PFU/mL，106PFU/mL，105PFU/mL，104PFU/mL，103PFU/mL的噬菌体EspYZU05悬液，均能够扩增出曲线，图2B显示噬菌体浓度的对数值与测得的Ct值在3-8Log10 PFU/mL范围内线性相关(R2＝0.9908)，表明噬菌体热处理能够释放出噬菌体DNA，所建立的qPCR体系能够有效检测出噬菌体含量。
实施例3
模拟污染牛乳中阪崎肠杆菌的快速定量检测
含103PFU/mL噬菌体的裂解培养液制备：称取1g蛋白胨，0.3g牛肉膏，0.5g NaCl，0.5g CaCl2，0.5g CaCl2，蒸馏水定容至100mL，调节pH为7.5，121℃灭菌15min；冷却后加入过滤除菌处理的103PFU/mL的噬菌体EspYZU05悬液，形成最终含量为103PFU/mL的裂解培养液。
模拟污染牛乳样品的制备：去离子水100mL中添加12g脱脂乳粉制成12％的脱脂乳粉，于115℃高压灭菌20min，备用。在质量分数12％无菌脱脂乳中加入阪崎肠杆菌CICC21596，进行匀浆、稀释处理，使其形成最终浓度为102-106CFU/mL的各种样品梯度悬液，作为A组样品(样品号：A1-A5，102、103、104、105、106CFU/mL)；在A组样品中加入大肠杆菌CICC10664作为背景菌，使其最终浓度为104CFU/mL作为B组样品(样品号：B1-B5)。
制备空白对照(无菌SM缓冲液)以及用无菌SM缓冲液稀释的101、102、103、104、105、106CFU/mL阪崎肠杆菌CICC21596标准菌株的10倍梯度悬液；将模拟污染牛乳(A组和B组样品)即制备的各种待测样品梯度悬液，取一部分样品应用平板稀释计数法测定活菌数；另一部分样品梯度悬液和标准菌株梯度悬液分别取100μL与900μL含有103PFU/mL噬菌体的裂解培养液混合，200rmp涡旋混匀，置于37℃下共培养4h，每隔30min取出200rmp涡旋混匀1min。共培养物经6000r/min离心10min取上清，取250μL上清沸水浴5min，取2μL作为DNA模板建立qPCR反应体系，应用qPCR测定Ct值。qPCR反应体系为：TB Green Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)10μL，EspYZU05-ORF18-F1 0.8μL，EspYZU05-ORF18-R1 0.8μL，DNA模板为2μL，ddH2O 6.4μL，总体系为20μL。热循环参数为：预变性95℃30s，95℃5s，退火55℃30s，72℃30s，40个循环。95℃15s，60℃1min。熔解60℃5s，50个循环；记录qPCR扩增曲线Ct值，按ΔCt＝Ctx-Ct0计算Ct值变化，式中，Ctx为各样品测定的Ct值；Ct0为空白对照样品的Ct值。
样品梯度悬液和菌株梯度悬液与噬菌体裂解培养液共培养产物产生的qPCR扩增曲线如图3A所示，结果显示随着菌浓度增加曲线Ct值呈减小趋势。按ΔCt＝Ctx-Ct0计算Ct值变化，并与菌株梯度悬液浓度做线性回归分析，获得的标准曲线如图3B所示，结果表明菌株梯度悬液与含103PFU/mL噬菌体的裂解培养液共培养4h，共培养产物的ΔCt值与阪崎肠杆菌浓度(CFU/mL)呈现良好线性关系(R2＝0.9836)，线性方程为：Y＝3.3386X-6.7049，检测限为1.02×102CFU/mL。将各样品测定的ΔCt值，带入线性方程计算出各样品的结果，A组样品(无背景菌)阪崎肠杆菌活菌测定结果如图3C所示，结果显示本发明方法测得的活菌数与传统平板稀释计数法测得的结果无显著差异(P<0.05)；B组样品(含背景菌CICC 10664)阪崎肠杆菌活菌测定结果如图3D所示，结果显示应用本发明方法测得的活菌数与A组样品一致，而传统平板稀释计数法测得的结果(B4和B5)显著高于A组相应样品结果(P<0.01)，结果表明本发明方法检测阪崎肠杆菌活菌具有特异性，不受背景菌的干扰，更适合含有复杂菌群样品中阪崎肠杆菌测定，而平板稀释法无法测定。此外，本发明方法测定每次至少可测30个样品，时间仅需5.5h，平板稀释涂布计数法每次仅能测定1个样品，至少需要12h，操作更加简单、快速。
实施例4
本发明方法在牛乳杀菌过程中阪崎肠杆菌活性细胞测定中的应用
脱脂乳样品制备：去离子水100mL中添加添加12g脱脂乳粉制成12％的脱脂乳粉，于115℃高压灭菌20min，备用。取12％无菌脱脂乳900μL加入1.5mL无菌离心管中，再加入100μL 107CFU/mL阪崎肠杆菌CICC 21596菌悬液，制备脱脂乳模拟污染样品。所有样品放置于HX-20恒温金属浴样品孔，温度设置为60℃、65℃和70℃，分别加热20min，每隔4min取一管样品，进行平板稀释涂布计数，并应用本发明方法与含有噬菌体的裂解培养液混合，测定△Ct，并分析比较，进行定量检测，测定阪崎肠杆菌残存活菌数，检测程序同实施例3；若样品活菌数在本发明方法检测限以下，则将样品接种于LB液体培养基中培养8h，再次应用本发明方法进行检测，如仍未检出则认为活菌数为0。将获得的数据绘制失活曲线，考察失活细菌对本发明方法测定的影响。测定结果如附图4所示，图中，实心数据点代表传统平板稀释计数法测得60℃(■)、65℃(●)和70℃(▲)失活条件下的活菌数；空心数据点代表本发明中噬菌体扩增联合qPCR法测得60℃(□)、65℃(○)和70℃(△)失活条件下的活菌数。结果显示，平板稀释涂布计数和本发明提供的方法均能测出不同温度下阪崎肠杆菌的失活曲线，数据间精确因子Af为1.029，偏差因子Bf为1.026，表明本发明方法测定结果不受阪崎肠杆菌失活细菌影响。相比现有qPCR快速检测方法不能区别菌体死活，样品中失活细菌往往导致假阳性结果等缺陷，本发明提供的方法在阪崎肠杆菌快速定量检测方面具有明显优势，并能有效区别菌体死活。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> 阪崎肠杆菌噬菌体(噬菌体EspYZU05)
<400> 1
atggatatga agaatatcgt ggcagtattt aacgaacaga atcccaactt caagatgcgg 60
ctcggtgagc tgcttcaaga tgtagccgag agcatgtgcg gcggggttat gtgtgcgggc 120
attccatgca gtgactgccc gtttgaacgt cagaacgacc cggaagatac ggtcgttgtt 180
atgcaatcct tacttgagga aatgaactga 210
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatatgaag aatatcgtgg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggattgcata acaacgaccg 20

Claims (8)

1.一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；
2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养；
3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量(△Ct)；
4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液的活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数。
2.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤1)中将制备的培养液灭菌冷却后加入过滤除菌处理的噬菌体悬液，形成最终含有102-106PFU/mL阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液。
3.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤1)中所述的阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05，保藏编号CCTCC NO：M 2016716。
4.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤2)中优选将样品进行匀浆、稀释处理，制备样品梯度悬液；制备标准菌株梯度悬液；并将样品梯度悬液和标准菌株梯度悬液分别与步骤1)制备的裂解培养液混合，混匀，共培养。
5.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤3)中取步骤2)获得的共培养物，离心取上清液沸水浴后作为DNA模板建立qPCR反应体系，测定Ct值。
6.根据权利要求5所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤3)中使用的特异性qPCR引物为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'；Ct值变化量(△Ct)为裂解培养液与标准菌株梯度悬液和样品梯度悬液共培养物Ct值，分别与裂解培养液和不含菌株的对照共培养物Ct值(Ct0)的差值。
7.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤4)中将步骤3)中测定的Ct值变化量(△Ct值)和标准菌株梯度悬液的活菌数进行相关性分析，根据获得的线性方程，计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞含量。
8.一种用于特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测的引物，其特征在于，所述引物为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'。
CN202010979402.6A 2020-09-17 2020-09-17 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物 Active CN112063732B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010979402.6A CN112063732B (zh) 2020-09-17 2020-09-17 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010979402.6A CN112063732B (zh) 2020-09-17 2020-09-17 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063732A true CN112063732A (zh) 2020-12-11
CN112063732B CN112063732B (zh) 2022-05-31

Family

ID=73682355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010979402.6A Active CN112063732B (zh) 2020-09-17 2020-09-17 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063732B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080475A (zh) * 2020-07-30 2020-12-15 扬州大学 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101160410A (zh) * 2005-02-16 2008-04-09 恩尼格马诊断有限公司 使用病毒检测样本中活细胞的方法
CN101775444A (zh) * 2010-03-05 2010-07-14 中国检验检疫科学研究院 阪崎肠杆菌噬菌体效价快速测定方法
ES2363497T3 (es) * 2003-11-19 2011-08-05 Nestec S.A. Fagos aislados y su utilización como desinfectante en alimentos y para la higienización de un entorno de fabricación.
CN102471768A (zh) * 2009-07-24 2012-05-23 森永乳业株式会社 用于微生物检测的方法及试剂盒
EP3052650A1 (en) * 2013-10-01 2016-08-10 The University Of Nottingham Mycobacteria detection using bacteriophages
CN107828743A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途
CN109239333A (zh) * 2018-10-29 2019-01-18 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体偶联的纳米磁珠及其制备方法和应用
CN110205306A (zh) * 2019-06-10 2019-09-06 武汉轻工大学 蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2363497T3 (es) * 2003-11-19 2011-08-05 Nestec S.A. Fagos aislados y su utilización como desinfectante en alimentos y para la higienización de un entorno de fabricación.
CN101160410A (zh) * 2005-02-16 2008-04-09 恩尼格马诊断有限公司 使用病毒检测样本中活细胞的方法
CN102471768A (zh) * 2009-07-24 2012-05-23 森永乳业株式会社 用于微生物检测的方法及试剂盒
CN101775444A (zh) * 2010-03-05 2010-07-14 中国检验检疫科学研究院 阪崎肠杆菌噬菌体效价快速测定方法
EP3052650A1 (en) * 2013-10-01 2016-08-10 The University Of Nottingham Mycobacteria detection using bacteriophages
CN107828743A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途
CN109239333A (zh) * 2018-10-29 2019-01-18 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体偶联的纳米磁珠及其制备方法和应用
CN110205306A (zh) * 2019-06-10 2019-09-06 武汉轻工大学 蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOPHIE ZUBER 等: "Decreasing Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) food contamination level with bacteriophages:prospects and problems", 《MICROBIAL BIOTECHNOLOGY》 *
刘子芝 等: "应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核分支杆菌的方法研究", 《中国动物检疫》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080475A (zh) * 2020-07-30 2020-12-15 扬州大学 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用
CN112080475B (zh) * 2020-07-30 2022-02-11 扬州大学 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112063732B (zh) 2022-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Greenwood et al. Rapid and definitive detection of Salmonella in foods by PCR
Rohde et al. FISHing for bacteria in food–A promising tool for the reliable detection of pathogenic bacteria?
Rodríguez-Lázaro et al. Trends in analytical methodology in food safety and quality: monitoring microorganisms and genetically modified organisms
CN112159854A (zh) 一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法
CN112063732B (zh) 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物
CN114480679B (zh) 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法
Ou et al. Direct detection of viable but non-culturable (VBNC) Salmonella in real food system by a rapid and accurate PMA-CPA technique
Kot et al. Application of multiplex PCR for monitoring colonization of pig tonsils by Yersinia enterocolitica, including biotype 1A, and Yersinia pseudotuberculosis
Afzal et al. Molecular diagnostics for foodborne pathogen (Salmonella spp.) from poultry
Zhang et al. Specific detection of viable Cronobacter sakazakii in powdered infant formula by phage amplification combined with qPCR (PAA‐qPCR) assay
CN106282354B (zh) 一种鲁氏不动杆菌的检测引物及荧光定量pcr检测方法
CN113957164B (zh) 一种婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌属的CRISPR One Pot检测方法及其试剂盒
Saleh et al. Isolation and identification of Salmonella typhimurium bacteria with detection of type-1 fimbriae coding gene by polymerase chain reaction (PCR) technique
Ziros et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella spp. isolated from different food types
CN111020040B (zh) 乳制品中致病菌多重荧光定量pcr检测引物组、试剂盒及其应用
CN112795673B (zh) 一种食品中克罗诺杆菌属的crispr检测方法及其试剂盒
CN112080475B (zh) 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用
Zhang et al. Real‐time loop‐mediated isothermal amplification assays combined with ethidium monoazide bromide and bentonite coated activated carbon for rapid and sensitive detection of viable Escherichia coli O157: H7 from milk without enrichment
Guyassa et al. A short review on Salmonella detection methods
Fatima et al. Designing a rapid, reliable and reproducible method for the detection of Salmonella spp. from poultry meat
Jordan et al. Sensitive detection of Escherichia coli O157: H7 by conventional plating techniques
JP5006607B2 (ja) 核酸増幅反応における阻害を回避する方法
CN105986029B (zh) 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法
CN114317790B (zh) 预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量pcr检测方法及试剂盒
TWI727134B (zh) 一種識別一樣本中活菌細胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant