CN111533787A - 一种线性抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种线性抗菌肽及其制备方法和应用，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明以线性β‑折叠原则为基础，设计出亲疏水交替肽模板(RXKY)2(YRY)2‑NH2，其中，X为疏水性异亮氨酸，Y为疏水性亮氨酸，抗菌肽命名为RIKL，序列如SEQ ID No.1所示。该抗菌肽RIKL在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。该抗菌肽具有很低的溶血活性和真核细胞毒性。该抗菌肽在128μmol/L浓度下未能引起10％的红细胞溶血以及小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到80％以上。

Description

一种线性抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种线性抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，具有广谱抗菌和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性。抗菌肽由于其主要通过物理渗透作用于细菌胞膜而产生抑菌或者杀菌作用，而细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构，因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。
目前，上千种抗菌肽已经从各种动植物体中提取出来，但作为抗生素替代品用于医疗领域的天然抗菌肽却很少。限制天然抗菌肽成为抗生素替代物的一个重要原因是：天然抗菌肽对于正常细胞，比如红细胞等也造成溶血作用，那么，寻找一种提高抗菌肽细胞选择性的方法势在必行。细胞选择性是抗菌肽对不同细胞的不同选择性作用而言的。对有害微生物有抑制或杀伤作用，而对正常细胞没有毒性的抗菌肽具有较高的细胞选择性。抗菌肽的细胞选择性越高，说明成为抗生素替代品的可行性越大。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的是公开一种线性抗菌肽RIKL，该抗菌肽具有很低的溶血活性和真核细胞毒性。
本发明所采用的技术方案如下：一种线性抗菌肽RIKL，其序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的另一目的在于公开该抗菌肽RIKL的制备方法，如下：以线性β-折叠原则为基础，设计出亲疏水交替肽模板(RXKY)2(YRY)2-NH2，其中，X为疏水性异亮氨酸，Y为疏水性亮氨酸，抗菌肽命名为RIKL，序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的另一目的在于公开该抗菌肽RIKL在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
本发明的有益效果及优点如下：本抗菌肽RIKL抑菌作用机理为抗菌肽通过作用于细菌细胞膜表面，使其通透性增加，从而使细胞膜表面破碎导致其死亡，对该抗菌肽RIKL进行抗菌和溶血活性检测，发现不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等六种菌种有高效的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μmol/L浓度下造成0.28％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血以及小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到87.38％。综上所述，该抗菌肽RIKL是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为本发明的抗菌肽的高效液相色谱图。
图2为本发明的抗菌肽的高效液相质谱图。
图3为本发明的抗菌肽与蜂毒素ME的溶血活性对比图。
图4为本发明的抗菌肽蜂毒素ME对小鼠巨噬细胞的细胞毒性影响对比图。
具体实施方式
下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明:
实施例1
抗菌肽的设计
抗菌肽RIKL的氨基酸序列为：
RIKLRIKLLRLLRL-NH2；
以线性β-折叠原则为基础，设计出亲疏水交替肽，抗菌肽命名为RIKL。抗菌肽的序列如表1所示。
表1氨基酸序列
Figure BDA0002430563450000021
RIKL的电荷数为为+7，疏水值为1.12。将肽的N端乙酰化以增加一个正电荷。该方法使抗菌肽具有高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性，提高抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，具有成为抗生素替代物的发展潜力。
实施例2
固相化学合成法合成RIKL抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：
抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(OD492nm)处测定光吸收值，,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性
Figure BDA0002430563450000031
通过表2可以看出，RIKL对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较高的抑菌活性。
表3短肽的MHC(μM)、GM(μM)和SI值
Figure BDA0002430563450000041
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3。
3、通过图3可以看出，RIKL在检测范围内未表现出溶血活性，在128μmol/L浓度下造成0.28％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，于对照组蜂毒素呈显著性差异。
4、真核细胞毒性的测定：采用MTT，并通过小鼠巨噬细胞RAW264.7进行细胞毒性检测。
5、(1)培养基的制备及细胞的培养：将DMEM(培养基)与胎牛血清9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的小鼠巨噬细胞RAW264.7，以细胞长满瓶底80％-90％为宜。
6、(2)待用细胞的试验处理：无菌PBS清洗并重悬细胞3次，并用0.25％胰蛋白酶液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入终浓度约为2×104的50μL细胞悬液。
7、(3)抗菌肽处理：另附96孔板第一孔内加10μL抗菌肽并倍比稀释后，取出50μL肽液加入原96孔板1-10孔，11孔加50μL完全培养基，12孔加100μL完全培养基。恒温培养4h；
8、(4)毒性检测：取50μL 5mg/mL MTT溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加150μLDMSO(二甲基亚砜)，酶标仪OD570nm测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然。检测结果见图4。
9、通过图4可以看出，肽RIKL在检测范围内未表现出对小鼠巨噬细胞的毒性，在128μmol/L浓度下小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到87.38％，于对照组蜂毒素呈显著性差异。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种线性抗菌肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ile Lys Leu Arg Ile Lys Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
1 5 10

Claims (3)

1.一种线性抗菌肽RIKL，其特征在于：其序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种线性抗菌肽RIKL的制备方法，其特征在于，以线性β-折叠原则为基础，设计出亲疏水交替肽模板(RXKY)2(YRY)2-NH2，其中，X为疏水性异亮氨酸，Y为疏水性亮氨酸，抗菌肽命名为RIKL，序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种线性抗菌肽RIKL在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
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