CN109762051B

CN109762051B - 一种环状抗菌肽及其制备方法和应用

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Publication number: CN109762051B
Application number: CN201910246779.8A
Authority: CN
Inventors: 王建浩; 王建鹏; 滕一万; 贾文静; 邱琳; 蒋林伯; 雷晓玲; 刘晓骞
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109762051A

Abstract

本发明属于抗菌剂技术领域，具体涉及一种环状抗菌肽及其制备方法和应用。所述环状抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，为分子内环状多肽，其中，多肽位于β转角处的脯氨酸替换成_DPRO‑_LPRO来增加β‑转弯的稳定性，通过其氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间形成分子内二硫键，形成具有分子内环状结构。本发明抗菌肽其氨基酸序列短、结构简单、合成方便、抗菌活性高，可用于白色念珠菌引起的疾病的预防与治疗。

Description

一种环状抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗菌剂技术领域，具体涉及一种环状抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

耐药性真菌病原体的出现迫切需要具有改善的药代动力学和药效学的新一代抗真菌药物。抗菌肽(AMPs)主要是由少于50个氨基酸组成的阳离子和两亲性肽，由多种生物体产生，用于杀死各种入侵细菌，真菌和病毒，同时对生物体本身具有低细胞毒性。由于它们具有杀微生物作用的新机制和抗药性，它们已被公认为是抗菌药物的金矿。目前在临床上抗真菌的药物种类有限，以抗生素为主，但是抗生素容易产生耐药性。

防御素是植物和动物中广泛传播的抗菌肽,它具有由几个二硫桥稳定的紧凑三维结构。植物防御素是入侵者的先天防御线，具有抗真菌活性，同时对哺乳动物细胞系的毒性有限。具体而言，据报道，从白芸豆中分离出的防御素具有抗真菌和抗菌活性，甚至在胰蛋白酶处理后仍保留。尽管防御素是潜在的候选药物，但仍需要解决一些障碍：1)蛋白质难以分离；2)defesins的生物合成效率低；3)体内活性和耐药性仍有待提高。因此，肽的生物活性形式的半合成具有前景。

虽然生物学家致力于解决防御素蛋白的晶体结构和生物活性，但是这种蛋白质家族的部分序列受到越来越多的关注。几种结构参数，如两亲性，疏水性，疏水动量，α螺旋度和净正电荷，在抗菌肽的生物活性中起重要作用。因此，开发一种类防御素的抗菌肽具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种新型抗菌肽，该抗菌肽对白色念珠菌具有抗菌活性。

本发明提供的一种新型环状抗菌肽，为分子内环状多肽，通过其氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基形成分子内二硫键，形成环状。其氨基酸序列为如序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列所示。

具体的，所述多肽通过位于β转角处的两个脯氨酸_DPRO-_LPRO来增加β-转弯的稳定性，通过其氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间成分子内二硫键，进一步加强其稳定性。

第19位点的氨基酸为非天然氨基酸；所述非天然氨基酸包括但不限于非天然氨基酸L-1-奈丙氨酸，(L-1-Nal，缩写E46)，非天然氨基酸L-2-奈丙氨酸，(L-2-Nal，缩写E48)，非天然氨基酸Tic(缩写E58)，从而增加整个环状多肽的两亲性。

本发明的抗菌肽全序列包括但不限于：

(抗菌肽AM-22)，

(抗菌肽AM-23)

(抗菌肽AM-24)等。

本发明多肽的序列特征：多肽结构中半胱氨酸中的巯基形成分子内二硫键；拓扑结构：环状；结构特点：富含碱性氨基酸。

此外，本发明还提供了上述环状多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用固相合成法合成多肽序列；

(2)对步骤(1)制备得到的多肽进行环化；

(3)纯化步骤(2)制备得到的多肽。

其中，步骤(2)环化方法优选为氧化法；具体为：冻干后用NaHCO₃和Na₂CO₃来做巯基脱氢反应，使两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，从而形成环状。

步骤(3)所述纯化方法优选采用HPLC进行纯化。

本发明制备得到的环状多肽用作白色念珠菌感染的广谱抗菌药物。

本发明的有益效果是：本发明制备得到的环状多肽对白色念珠菌具有显著的抑制作用，其抗菌效果好，MIC值很低；本发明多肽的环状结构有利于提高多肽稳定性，并不会对哺乳动物细胞产生明显的细胞毒性。

附图说明

图1为实施例1-实施例3合成的抗菌肽AM-22、AM-23、AM-24的结构图。

图2为实施例1合成的抗菌肽AM-22对白色念珠菌抑制生物膜50％抑菌浓度(IC50)的测定。

图3为实施例1合成的抗菌肽AM-22对人血THP-1细胞毒性检测。

图4为实施例1合成的抗菌肽AM-22对人红血球的溶血试验。

图5为荧光标记的实施例1合成的抗菌肽AM-22处理过的白色念珠菌。

图6为对比实施例1合成的抗菌肽AM9的结构图。

图7为对比实施例2合成的抗菌肽AM10的结构图。

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。

实施例1

本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。

1、基本材料：

(1)树脂与连接分子：固相Fmoc法选择的树脂为Rink Amide-

树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。

(2)单体：合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸。

2、反应步骤：

第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上

加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；

第二步，去保护

采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。

第三步，激活和交联

采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键。

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照KWKWHLLWRRCR_DPPFRCWE₄₆RR序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。

3、合成后处理：

(1)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上切割下来，并脱除保护基。

(2)HPLC分析纯化，冻干。

(3)冻干后用NaHCO₃和Na₂CO₃来做巯基脱氢反应，使两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，从而整个多肽成环状。将5mg多肽溶于5mL缓冲液(0.1mol/L NaHCO₃,4mL；0.1mol/LNa₂CO₃,1mL；pH 9.4)，震荡4h后用HPLC纯化，冻干保存。

通过上述方法，合成多肽序列AM-22(图1)。

4、最小抑菌浓度检测

通过测定抗菌肽AM-22最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。参照美国国家临床实验室标准化委员会M27-A的研究方案，首先将被测多肽溶到100μl PBS缓冲液中，然后加入96孔板中两倍稀释，再加入2000个/ml菌体的悬液100ml,37℃培养48小时，以无菌生长的最小稀释浓度作为该多肽的MIC。低的MIC值表明多肽药物的杀菌活性更高，经检测AM-22的MIC低至2.23μM。

5、多肽对白色念珠菌抑制生物膜50％抑菌浓度(IC50)的测定

将100μl RPMI含有浓度为10⁵个/ml的菌体的悬液接种到96孔板中，在37℃ 5％的CO₂孵箱中培养36小时。弃去培养基和悬浮菌，用PBS洗3次，将被测多肽溶到100ml PBS缓冲液中，然后加入96孔板中两倍稀释，继续培养48小时。弃去培养基和悬浮菌，用PBS洗3次，加入100μl XTT/孔，再培养2小时，测定490nm的吸光率。计算出该多肽抑制白色念珠菌的IC50。经测定，AM-22抑制白色念珠菌生物膜的IC50为15μM(图2)。

6、多肽对人血PBMC和THP-1细胞毒性检测

将取自志愿者提供的全血通过梯度离心法得到PBMC细胞，将PBMC细胞接种于96孔板中，10⁴个细胞/孔。然后将不同浓度的多肽加入孔中，放置37℃，5％CO₂孵箱中培养6小时，离心弃上清，每孔加10μl MTT(5mg/ml)，再培养4h，离心弃上清，每孔加100μl DMSO，振荡溶解后，检测吸光率，计算细胞毒性。对细胞株THP-1的毒性测试也是用相同的方法测试。

结果发现多肽AM-22在MIC浓度下对这两类细胞毒性都较低。对于人血PBMC，它的IC50为14μM，对于THP-1细胞系，IC50为17μM。在MIC浓度下，均有80％以上的细胞处在存活状态(图3)。

7、多肽对人红血球的溶血试验

首先，将50μl多肽用PBS在96孔板上进行2倍系列稀释，再在每个孔中加入50μl用PBS稀释到1.5％的人红血球。将96孔板置于37℃,5％CO₂的环境中24小时。培养结束后，把96孔板离心，吸取上清到另一个96孔板中，测量414nm的吸光率。计算出不同浓度下多肽的红血球溶血率。实验发现，AM-22在7倍于MIC的浓度时都无溶血现象(溶血率低于0.4％)(图4)。

8、共聚焦显微镜观察荧光标记的AM22与真菌细胞的结合

首先合成了荧光标记的多肽，将制备的荧光标记肽按照其IC50的浓度加入真菌细胞细胞培养皿中,在35℃孵育。分别在3、12、24、48小时吸出1mL菌液，用5mL PBS将真菌细胞洗涤两次。之后用共聚焦显微镜观察荧光标记肽与真菌细胞的结合情况。结果发现，被标记的多肽在与真菌细胞共同孵育5分钟时，已经可以迅速有选择性结合到真菌表面(而标记多肽与哺乳动物细胞(THP-1)共同孵育5分钟后没有观察到此现象，因此这表明多肽选择性地结合真菌细胞)。60分钟后多肽能够完全进入整个真菌细胞。(图5)

实施例2

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照KWKWHLLWRRCR_DPPFRCWE₄₈RR序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。

其他步骤同实施例1，通过上述方法，合成多肽序列AM-23(图1)。

合成的该环状多肽的MIC值4.46。

实施例3

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照KWKWHLLWRRCR_DPPFRCWE₅₈RR序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。

其他步骤同实施例1，通过上述方法，合成多肽序列AM-24(图1)。

合成的该环状多肽的MIC值30.98。

对比实施例1

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照KNKEHLLSGRAR_DPPFRAWATR序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。其他步骤同实施例1，通过上述方法，合成多肽序列AM-9(图6)。

该多肽不成环，没有抗菌性

对比实施例2

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照KNKEHLLSGRCR_DPPFRCWATR序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。

其他步骤同实施例1，通过上述方法，合成多肽序列AM-10(图7)。

合成的该序列的多肽没有抗菌性。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

序列表

<110> 常州大学

<120> 一种环状抗菌肽及其制备方法和应用

<141> 2019-03-28

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 白色念珠菌(Candida albicans)

<400> 1

Lys Trp Lys Trp His Leu Leu Trp Arg Arg Cys Xaa Pro Pro Phe Arg

1 5 10 15

Cys Trp Xaa Arg Arg

20

Claims

1.一种环状抗菌肽，其特征在于：所述环状抗菌肽为分子内环状多肽，通过其氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基形成分子内二硫键，形成环状，位于β转角处的脯氨酸替换成_DPRO-_LPRO；

其氨基酸序列为：

KWKWHLLWRRCR_DPPFRCWE₄₆RR 抗菌肽AM-22，

E₄₆为非天然氨基酸L-1-奈丙氨酸；

KWKWHLLWRRCR_DPPFRCWE₄₈RR 抗菌肽AM-23，

E₄₈为非天然氨基酸L-2-奈丙氨酸；

或 KWKWHLLWRRCR_DPPFRCWE₅₈RR 抗菌肽AM-24，

E₅₈为非天然氨基酸Tic。

2.一种如权利要求1所述的环状抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）采用固相合成法合成多肽序列；

（2）对步骤（1）制备得到的多肽进行环化；

（3）纯化步骤（2）制备得到的多肽。

3.如权利要求2所述的环状抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述环化方法为氧化法；步骤（3）所述纯化方法采用HPLC进行纯化。