CN103073628A - 一种利用超声波从林蛙体中提取抗菌肽的生产制备方法 - Google Patents
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Abstract
发明涉及一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法。本发明的提取生物抗菌肽工艺，是以除脂除卵的林蛙干体为原料，经过前期清洗处理，酸化处理后，采用超声波提取，经离心沉淀、过滤、浓缩、收集等步骤，最后制得林蛙抗菌肽浓缩液。本发明从林蛙体中直接提取抗菌肽的新工艺，操作简单，生产效率高，产率高，广普抗菌杀菌效率明显等优点，可广泛的应用于药品、食品、水果及蔬菜保鲜、日用化妆品及饲料添加剂等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种林蛙抗菌肽提取方法，尤其是利用超声波从林蛙体中提取抗菌肽的生产制备方法。其产品可广泛的应用于药品、食品、水果及蔬菜保鲜、日用化妆品及饲料添加剂等领域。
背景技术
在现有技术中，抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是对一些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。鉴于抗菌肽天然广谱抗菌、耐热、无毒无药残、不易产生耐药菌株等众多的特点，抗菌肽有可能成为继青霉素等传统抗生素之后又一类重要的新型抗菌药物。因此，抗菌肽的开发应用将是医药行业、食品行业、日化行业、饲料养殖行业等领域的一次革命，具有广阔的应用前景。 抗生素应用的最佳时机是感染的前期，抗菌肽对感染的前、中、后期都有显著的效果，不存在时机问题。抗生素应用有配伍禁忌，抗菌肽可以和任何药物配伍应用。抗生素在不同给药方式会产生不同的治疗效果，抗菌肽口服和注射的效果相同，不存在用药注意事项，可以按照最方便的方法给药。抗生素存在不同程度的副作用、药残等问题，使用中有停药期的规定，抗菌肽无药残、无毒副作用，无停药期规定。抗菌肽还有起效时间快，10分钟内被吸收完毕而且100%被吸收。抗生素存在吸收利用不完全，以及代谢造成的蓄积中毒危险，对肝肾损伤最大，抗菌肽无积累性中毒现象，并有协助排毒功能，抗菌肽来自于动植物自身免疫系统，是纯正的绿色产品，其抗菌肽在各行业的应用前景也很广泛。
根据相关资料对东北林蛙皮抗菌肽的初步研究表明，林蛙皮分泌物由多种组分组成，一只东北林蛙个体可以同时在表面分泌多达12种的成熟抗菌肽。林蛙皮抗菌肽是具有广谱抗菌作用的多肽。
林蛙皮抗菌肽在畜牧业中的应用：作为饲料添加剂，使转化率、成活率有了较大的提高。
林蛙皮抗菌肽在日化用品中的应用：化妆品：温和杀菌，消炎祛红肿。
卫生用品：有洗手液，沐浴露，湿纸巾等。抗菌肽无毒、无不良反应、无残留且无致细菌耐药性的一类环保型制剂，与酒精或抗生素等传统抗菌成分比有巨大的优势。
林蛙皮抗菌肽在剃须膏和须后水等男士用品：划伤皮肤防感染，促进伤口愈合。
林蛙皮抗菌肽在口腔保健品：漱口水、口腔喷剂、牙膏、含片、口香糖等。适当添加抗菌肽达到杀菌，消炎的效果。
抗菌肽水溶性好，用于水果蔬菜保鲜可形成无色保护摸，杀死表面细菌，从而达到保鲜目的。
抗菌肽是具有生物活性的多肽类物质，对绿脓杆菌、金黄葡萄杆菌等多种病菌 和病毒都有明显的杀灭效果。在医药中，林蛙皮抗菌肽可起到消炎，抗感染，抗真菌、促进伤口愈合的作用，如果将此液应用于烧烫伤产品中，在防止皮肤感染、止痛镇痛方面都有明显的效果。应用于日化产品中，对于皮肤无刺激性伤害，消炎杀菌消毒效果明显。应用于果蔬保鲜能明显延长保鲜期，应用于养殖业可提高家畜免疫力，提高拦存活率。
已有从林蛙表皮中提取抗菌肽的方法。如《吉林工学院学报》自然科学版2002年第2期发表了邱芳萍、周杰文章“从吉林林蛙皮中提取抗菌肽”，其方法是原料蛙皮、溶胀、抽提、离心制得。
再如《食品科学》2008年第10期发表了金莉莉;丁忠福;王秋雨文章“中国林蛙皮抗菌肽提取条件的优化研究”，其方法是原料蛙皮、浸提、冷冻干燥制得。
中国发明专利申请说明书于2009年06月17日公开了一种名称为“林蛙抗菌肽及制备工艺和在抗病毒药物中的应用”，专利申请号: 200810051423.0 申请日:2008.11.14。该发明公开了一种林蛙抗菌肽及其制备工艺，包括以下步骤：(1)将林蛙干蛙皮，用pH4．00．2mol／L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液以料液比为1：8-12(m／v)的比例室温浸泡20—30小时；(2)将所得浸提液5000r．p．m离心30min，弃沉淀，留上清；将上清液再煮沸5min，冷却，5000r．p．m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。其缺点是原料直接采用林蛙皮，林蛙皮剥皮困难，并且费工费时，损失浪费严重。按此工艺得到的抗菌肽滤液其抗菌效果不够理想。
发明内容
本发明目的是提供一种工艺优化、生产效率高、抗菌活力显著的生物抗菌肽生产工艺及其制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，采用除尘除杂除脂除卵的林蛙干体为原料制备。
一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其步骤如下：
（1）原料：林蛙干体；之前进行常规除脂除卵去尘除杂处理。
（2）加10-20倍于蛙体的4-8%醋酸于10-30℃溶胀0.5-1.5小时。
（3）将溶胀后的蛙体及醋酸液，在功率为100-250W,频率为20-60kHz超声波发生器内进行超声提取至少一次，提取时间10－40分钟（常温）；过滤，得提取液。
（4）提取液在3000-10000p.r.m/10-20min条件下离心，弃去沉淀，收集上清液。
（5）在35℃-65℃温度下加热5-15min，然后降至5-10℃过滤。
（6）按步骤（3）、（4）重复操作1-3次；合并上清液，再按步骤（5）进行，得抗菌肽滤清液。
或在步骤（5）后，将抗菌肽滤清液在30-60℃和-0.5个大气压条件下浓缩至1/3-1/10体积，抗菌肽浓缩液于0-4℃条件下保存。
一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其步骤如下：
（1）取林蛙干体50g，进行去尘除杂处理。
（2）加15倍于蛙体的6%醋酸750mL于15℃溶胀0.3小时。
（3）溶胀后的蛙体，放入功率为150W,频率为30kHz的超声波中提取10分钟；在步骤（2）、（3）同样条件下，再提取1次。
（4）合并提取液，在5000p.r.m,15min离心，弃去沉淀，收集上清，重复操作步骤（3）、（4）两次。
（5）合并上清液，在55℃环境下加热10min后降至10℃过滤。
（6）在45℃环境下，在-0.5个大气压条件下浓缩至1/5体积。
（7）收集浓缩液于4℃条件下保存。
上述方法获得的抗菌肽具有如下特征；
（1）热稳性：抗菌肽60℃ 6小时不失活，95℃ 10min还有活力。
（2）pH值稳定性：在pH2-6范围内活力稳定，最适合pH值3.5。
（3）等电点：用pH值调节采用吸光度法测定林蛙抗菌肽pI值，pI值为8.0-10.5的碱性多肽。
（4）分子量：采用凝胶过滤层析法、聚丙稀酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得分子量为 4KDa。
超声提取法是利用超声波的空化作用、机械作用等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解的方法，当大能量的超声波作用于介质时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时闭合，并产生高达几千个大气压的瞬间压力，使整个生物体细胞壁的破裂在瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率，提高有效成分析出，最终提高了林蛙抗菌肽抑菌活性。
本发明优点：1、以林蛙干体为原料，直接提取，省掉人工扒皮的繁琐工序，降低了劳动强度、节省原材料，降低生产成本，提高了生产效率，符合工业化生产。2、增加超声波提取步骤，代替了以前传统的药物浸提、离心处理蛙皮提取抗菌肽的工艺制备方法，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率，优化了提取工艺，最终提高了林蛙抗菌肽抑菌活性。经试验，以相同质量的林蛙干（皮）进行提取，在提取液体积相同的条件下，超声提取林蛙干抗菌肽，抑菌活性更高。3、所制备的林蛙抗菌肽产品具有广谱杀菌作用。对假铜绿单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤感杆菌、白色念珠菌等都具有很强的抑菌作用。可广泛的应用于药品、食品、水果及蔬菜保鲜、日用化妆品及饲料添加剂等领域。
附图说明
图1是林蛙抗菌肽液对绿脓杆菌抑菌活性实验结果图。
图2是林蛙干多肽对绿脓杆菌抑菌活性图。
图3是采用不同提取方法及不同林蛙体（干）多肽与浸提提取林蛙皮多肽对绿脓杆菌抑菌圈大小比较图。
图4是采用不同提取方法及不同林蛙干（皮）多肽与浸提提取林蛙皮多肽对绿脓杆菌抑菌活性比较图。
图5是实验例3多菌抑菌活性比较图。
参见图6是实验例3中绿脓杆菌抑菌实验结果一组图。
参见图7是实验例3中大肠杆菌抑菌实验结果一组图。
参见图8是实验例3中金葡菌株抑菌实验结果一组图。
参见图9是实验例3中伤寒杆菌抑菌实验结果一组图。
参见图10是抗菌肽对温度的稳定性实验图。
下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述，但不限于此。
具体实施方式
实施例1
一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法：
1、取脱脂除卵林蛙干体50g，进行去尘除杂处理。
2、加10倍于蛙体的5%醋酸500 mL于10℃溶胀0.2小时。
3、将溶胀后的蛙体及10倍于蛙体的5%醋酸液，一起放入功率为100W,频率为20kHz的超声波中提取15分钟。在2、3同样条件下，再提取1次。
4、合并提取液，在3000p.r.m,20min离心，弃去沉淀，收集上清，按3、4步骤再操作1次。
5、合并上清液，在50℃环境下加热5min后降至10℃过滤。
6、在35℃环境下，在-0.5个大气压条件下浓缩至1/3体积。
7、收集浓缩液于4℃条件下保存。
实施例2
一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法：
1、取林蛙干体50g，进行去尘除杂处理。
2、加15倍于蛙体的6%醋酸750 mL于15℃溶胀0.3小时。
3、溶胀后的蛙体，放入功率为150W,频率为30kHz的超声波中提取10分钟。在2、3同样条件下，再提取1次。
4、合并提取液，在5000p.r.m,15min离心，弃去沉淀，收集上清，可重复操作3、4步骤2次。
5、合并上清液，在55℃环境下加热10min后降至10℃过滤。
6、在45℃环境下，在-0.5个大气压条件下浓缩至1/5体积。
7、收集浓缩液于4℃条件下保存。
实施例3
一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法：
1、取林蛙干体50g，进行去尘除杂处理。
2、加20倍于蛙体的7%醋酸1000 mL于20℃溶胀0.5小时。
3、溶胀后的蛙体，放入功率为200W,频率为40kHz的超声波中提取15分钟。在2、3同样条件下，再提取1次。
4、合并提取液，在5000p.r.m,10min离心，弃去沉淀，收集上清，可重复操作3、4步骤1次。
5、合并上清液，在60℃环境下加热15min后降至10℃过滤。
6、在55℃环境下，在-0.5个大气压条件下浓缩至1/6体积。
7、收集浓缩液于4℃条件下保存。
实验例1
本发明在抑菌中的应用：
1、材料和方法
1.1 受试物 林蛙抗菌肽液。
1.2 实验菌体 假铜绿单胞杆菌（CMCC（B）10 104）。
1.3 实验材料 直径为5mm的新华一号定性滤纸。
1.4 实验方法
（a）抑菌剂载体 5mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h，保存备用。
（b）抗菌肽样片的制备：取（a）中制备的无菌并干燥的滤纸片，每片滴加抗菌肽液5μL，备用。
（c）阴性对照样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加相同pH醋酸液5μL，备用。
（d）抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片抗菌肽样片， 1 片阴性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm 以上， 与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置 37℃恒温培养箱，培养 12h 观察结果。用菌落分析仪测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。
1.5 测试结果：抗菌肽样品对绿脓杆菌的抑菌实验结果参见图1。图1中间样品为阴性对照样片，周围为抗菌肽样片。
实验例2
生理活性实验：采用滤纸片法测定抗菌肽提取液的活性。经测定，利用超声波提取蛙体中的抗菌肽可抑制多种革兰氏阳性、阴性细菌及真菌，用不同方法在林蛙皮和林蛙体中提取抗菌肽对绿浓杆菌抑菌活性情况对照。
参见图2，林蛙干多肽对绿脓杆菌抑菌活性的抑菌圈清晰并比较大，抑菌活力强。
参见图3，采用不同提取方法及不同林蛙体（干）多肽与浸提提取林蛙皮多肽对绿脓杆菌抑菌圈大小比较，超声提取林蛙干多肽的抑菌圈清晰并比较大（甚至比超声提取林蛙皮多肽的抑菌圈更清晰，更大），抑菌活力强。
上面图中间样品为阴性对照样片，周围为抗菌肽样片。
参见图4，采用不同提取方法及不同林蛙干（皮）多肽与浸提提取林蛙皮多肽对绿脓杆菌抑菌活性比较，超声提取林蛙干多肽的抑菌圈直径最大。
综上，从对比结果看出，以相同质量的林蛙干（皮）进行提取，在提取液体积相同的条件下，超声提取林蛙干抗菌肽，抑菌活性更高。
实验例3
本发明提取的抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤感杆菌、绿脓杆菌等都具有很强的抑菌作用。
本发明提取的抗菌肽生产制剂抑菌效果与上市的同类同功能产品对比，见下表格，并参见图5。
| 菌株 | 软膏抑菌圈直径（mm） | 滤纸片直径（mm） | 凝胶剂抑菌圈直径（mm） | 滤纸片直径（mm | 上市药品生机抑菌软膏抑菌直径（mm） |
| 绿脓杆菌 | 16.18 | 9.94 | 11.63 | 8.05 | 6.87 |
| 15.24 | 9.93 | 13.23 | 7.26 | 7.71 | |
| 大肠杆菌 | 13.63 | 7.92 | 14.26 | 9.06 | 9.74 |
| 12.4 | 8.41 | 9.93 | 7.26 | 7.01 | |
| 金黄色葡萄球菌 | 13.99 | 9.02 | 9.85 | 6.9 | 10.31 |
| 14.04 | 8.84 | 9.77 | 7.41 | 12.32 | |
| 伤寒杆菌 | 14.98 | 7.92 | 12.99 | 7.14 | 7.8 |
| 14.92 | 9.09 | 13.13 | 8.4 | 11.23 |
参见图5，是本实验例3多菌抑菌活性比较图。本发明产品抑菌效果明显优于市面出售产品。
参见图6，绿脓杆菌抑菌实验结果一组图。
参见图7，大肠杆菌抑菌实验结果一组图。
参见图8，金葡菌株抑菌实验结果一组图。
参见图9，伤寒杆菌抑菌实验结果一组图。
牛津杯中分别为凝胶剂、软膏、上市产品抑菌生肌软膏药物。黑斑点为对照，其样品为市面出售的产品抑菌生肌软膏药物，抑菌直径大的是我公司软膏剂，抑菌直径小的是我公司凝膏剂。实验表明，本发明产品抑菌效果明显优于市面出售的同类同功能产品。
实验例4
抗菌肽对温度的稳定性
取1.277mg·ml-1本发明抗菌肽，分别置于-20℃、4℃、15℃、25℃、37℃、50℃、70℃、90℃、100℃下处理60min，并在121℃灭菌30min，以4℃处理的样品做标准，以杯碟法检测其对ATCC 27853的抑菌活性。参见图10，数字对应温度如下：。1、-20℃；2、4℃；3、15℃；4、25℃；5、37℃；6、50℃；7、70℃；8、90℃；9、100℃；10、121℃。
抑菌实验表明经不同温度处理后的抗菌肽活性仍保持不变，即使121℃、高温高压灭菌处理30min；抗菌肽仍保持原有活性，说明抗菌肽具有对热稳定的特性。另外，4℃冰箱保持12~16个月的抗菌肽仍保持有活性。
Claims (6)
1. 一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其特征在于采用除尘除杂除脂除卵的林蛙干体为原料制备。
2.如权利要求书1所述的一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其特征在于其步骤如下：
（1）原料：林蛙干体；
（2）加10-20倍于蛙体的4-8%醋酸于10-30℃溶胀0.5-1.5小时；
（3）将溶胀后的蛙体及醋酸液，在功率为100-250W,频率为20-60kHz超声波发生器内进行超声提取至少一次；提取时间10－40分钟，过滤，得提取液；
（4）提取液，在3000-10000p.r.m/10-20min条件下离心，弃去沉淀，收集上清液；
（5）在35℃-65℃温度下加热5-15min，然后降至5-10℃过滤，得抗菌肽滤清液。
3.如权利要求书2所述的一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其特征在于按步骤（3）、（4）重复操作1－3次；合并上清液，再按步骤（5）进行。
4.如权利要求书3所述的一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其特征在于在步骤（5）后，将抗菌肽滤清液在30-60℃和-0.5个大气压条件下浓缩至1/3-1/10体积，抗菌肽浓缩液于0-4℃条件下保存。
5.如权利要求书4所述的一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其特征在于其步骤如下：
（1）取林蛙干体50g，进行去尘除杂处理；
（2）加15倍于蛙体的6%醋酸750 mL于15℃溶胀0.3小时；
（3）溶胀后的蛙体，放入功率为150W,频率为30kHz的超声波中提取10分钟；在步骤（2）、（3）同样条件下，再提取1次；
（4）合并提取液，在5000p.r.m,15min离心，弃去沉淀，收集上清，重复操作步骤（3）、（4）两次；
（5）合并上清液，在55℃环境下加热10min后降至10℃过滤；
（6）在45℃环境下，在-0.5个大气压条件下浓缩至1/5体积；
（7）收集浓缩液于4℃条件下保存。
6.如权利要求书5所述的一种利用超声波从林蛙体中直接提取抗菌肽的生产制备方法，其特征在于抗菌肽具有如下特征；
（1）热稳性：抗菌肽60℃ 6小时不失活，95℃ 10min还有活力；
（2）pH值稳定性：在pH2-6范围内活力稳定，最适合pH值3.5；
（3）等电点：用pH值调节采用吸光度法测定林蛙抗菌肽pI值，pI值为8.0-10.5的碱性多肽；
（4）分子量：采用凝胶过滤层析法、聚丙稀酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得分子量为 4KDa。
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Denomination of invention: Preparation method for extracting antibacterial peptides from wood frog bodies by using ultrasonic waves Effective date of registration: 20191115 Granted publication date: 20140305 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA KANG YUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2019220000042 |
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Denomination of invention: A method of extracting antimicrobial peptides from Rana chensinensis by ultrasonic Effective date of registration: 20201119 Granted publication date: 20140305 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA KANG YUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2020220000085 |
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Denomination of invention: A preparation method of extracting antibacterial peptides from Rana chensinensis by ultrasound Effective date of registration: 20220620 Granted publication date: 20140305 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA KANG YUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022220000018 |
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Denomination of invention: A Preparation Method for Extracting Antibacterial Peptides from Forest Frog Body Using Ultrasound Effective date of registration: 20230324 Granted publication date: 20140305 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA KANG YUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023220000019 |
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Denomination of invention: A preparation method for extracting antimicrobial peptides from forest frog body using ultrasound Granted publication date: 20140305 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA KANG YUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024220000023 |