KR101784672B1 - 미생물(담자균류균사) 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물을 포함하는 항알레르기능이 있는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물(담자균류균사) 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물을 포함하는 항알레르기능이 있는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물 등에 관한 것으로, 담자균류균사 발효 및 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물은 발효되지 않은 느릅나무에 비하여 항알레르기 물질을 많이 함유하고 있으므로, 이를 이용하여 식품 등으로 개발시 알레르기 발생을 저감시킬 수 있는 효과를 발휘한다.

Description

미생물(담자균류균사) 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물을 포함하는 항알레르기능이 있는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물{A pharmaceutical or food composition containing the fermentative products of elm-tree converted biologically by Basidiomycota hyphae or lysate of Basidiomycota hyphae with anti-allergenic effect}

본 발명은 미생물(담자균류균사) 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물을 포함하는 항알레르기능이 있는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물에 관한 것이다.

알레르기 질환은 전국민의 25% 정도가 1~2가지 알레르기로 고통받고 있을 정도로 광범위한 질환이며, 선진국에서 유행하는 알레르기성 비염은 지난 30년간 매년 10%씩 증가하고 있다. 최근 도시지역에 알레르기 환자의 통계를 보면 비염 15~20%. 천식 6~8%, 아토피 10~15%, 눈 알레르기 3%로 나타나며, 한 가지 이상의 알레르기를 갖는 환자의 수도 약 25%로 나타난다. 알레르기 질환은 사회경제적 비용이 매우 높은 것으로 파악되는데, 대한천식협회가 2005년도에 보고한 바에 따르면 기관지 천식의 사회경제적 비용은 연간 2조 원에 달한다고 한다. 알레르기 질환은 현재 선진국이 저개발국 및 개발도상국에 비해 그 유병률이 현저히 높은 특성을 보이고 있는데, 우리나라도 발병률이 증가할 것이라 예측되고 있다.

알레르기 질환의 일반적인 치료법에는 회피요법, 약물요법, 수술요법 및 면역요법 등이 있다. 회피요법(avoidance)은 원인이 되는 항원을 피하는 치료법으로서 가장 기본적이고 중요한 치료법이며 알레르기 질환 관리에 매우 중요한 방법이나, 면역반응을 일으키는 원인물질을 완벽히 피하기는 사실상 어려움이 있다. 약물요법은 알레르기 질환의 치료에 있어서 가장 큰 진보를 보이고 있으나, 현재의 약물요법은 화학전달물질의 분비를 억제하는 치료로서 약제의 작용기간 동안만 효과가 있다. 또한 치료제의 선택에 있어서도 류코트리엔 조절제를 제외하고 스테로이드제, 항히스타민제, 교감신경자극제, 테오필린제(Theophylline) 등이 20년 이상 크게 바뀌지 않고 사용되고 있다. 물론 최근 만성 천식 등 지속성 알레르기질환에 대한 스테로이드제와 같은 항염증 치료의 중요성이 강조되면서 유병률의 감소를 기대하고 있지만, 이 치료전략은 알레르기 질환의 일차적 예방이나 완치적 치료를 겨냥하고 있지는 않다. 수술요법은 소작술, 적출술, 냉동결요법(cryosurgery), 점막하 온열요법(diathermy), 신경절제술, 레이저 소작술 등을 포함하나, 알레르기 질환의 병태생리 자체를 수술로 교정하는 것은 아니기 때문에 수술 후에도 항원에 지속적으로 노출되면 증상이 재발되는 경우가 많다. 면역요법은 여러 가지의 검사 방법을 통하여 항원이 밝혀진 경우, 원인 항원을 지속적이고 규칙적으로 투여하여 체내에서 면역반응의 변화를 일으키는 치료법으로서 결국 원인물질에 대한 감수성을 축소시키는 방법이다.

상기와 같이, 대부분의 알레르기 질환이 대증요법 이외에는 특별한 치료제나 예방제가 없으므로 천연물자원 유래의 건강기능식품 개별인정형 원료 및 제품 개발의 필요성이 대두되고 있다. 지금까지 느릅나무 추출물을 유효성분으로 하는 면역증강용 조성물(KR 0757220) 및 건강 증진용 식품 조성물(KR 2005-0101134) 등의 기술이 개발되었으나, 미생물(담자균류균사) 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물을 유효성분으로 하는 알레르기질환 치료제나 예방제에 대한 기술 개발은 미비한 실정이다.

따라서 본 발명은 담자균류균사 또는 그 파쇄액으로 생물전환된 느릅나무 발효물을 포함하는 항알레르기능이 있는 치료용 약학조성물 또는 식품조성물 및 이의 효과에 대한 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 담자균류균사 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물을 포함하는 항알레르기 기능이 있는 식품조성물에 관한 것이다. 그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 담자균류란, 진균류의 한 아문으로 유성생식 한 결과로 담자기라는 세포가 되어 홀씨를 만드는 균류이다. 스스로 양분을 만들지 못하여 다른 생물체에 붙어 기생하며, 버섯으로 알려진 것이 많은데 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯 따위가 대표적이다. 성숙한 버섯의 갓주름 면에는 담자기가 빽빽이 생긴다. 담자균류 버섯의 대부분은 고등식물의 유체에서 부생적으로 생활하며, 특히 셀룰로오스와 리그닌을 분해하여 물질의 생물학적 순환에 없어서는 안 될 중요한 역할을 하지만, 또 수목의 뿌리에 균근을 형성하여 공동생활을 하는 것도 많다. 그밖에 식용균으로 중요시되거나 독버섯으로 주의를 해야 할 종류도 있다.

본 발명의 일 구체예에서 균사란, 사상균(곰팡이)의 영양세포이다. 영양적 기능이나 생리적 기능 같은 기능 분화도 볼 수 있다. 형태적으로는 격벽의 유무가 분류에 사용되고 있으며, 포자의 발아관에서 발육하여 선단생장에 의해서 신장한다. 분지한 균사의 집단을 균사체(mycelium)라고 한다. 생리적 기능에 따라 배지나 기주의 표면 또는 내부에 들어가면서 신장하는 기저균사와 공기 중에서 신장하는 기생균사로 구별된다. 기생균사는 영양을 기저균사로부터의 이송에 의존하고 있으며, 그 일부는 포자 형성기관 등으로 분화한다. 유기물이 있고 적당한 습도와 온도 등 환경조건이 양호하면 여러 가지 균사조직을 형성한다. 자낭균류의 균사의 격막은 단순하지만 담자균류에서는 꺾쇠연결을 형성하는 것을 많이 볼 수 있다. 곰팡이류에서는 여러 갈래로 분지하여 실처럼 엉겨 있고, 버섯류에서는 집합하여 자실체를 만든다. 엽록소가 없어 광합성을 하지 못하고 기주생물에 붙어서 영양분을 흡수한다. 버섯인 담자균류의 경우, 포자에서 발아한 균사는 핵을 1개 가지고, 이것이 다른 균사와 융합하면 1개의 세포에 핵을 2개 가지게 된다. 핵을 1개 가진 균사를 1차 균사, 핵을 2개 가진 균사를 2차 균사라고 한다. 균사의 세포벽은 일반적으로 키틴(chitin) 또는 헤미셀룰로오스(hemicellulose)가 주성분이며 이 둘을 합한 경우도 있다.

본 명세서에 있어서 담자균류균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양받아 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 느릅나무란, 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacg.)를 포함하는 Ulmus속의 장미목 느릅나무과의 식물로 겨울에 잎이 지는 큰키나무다. 전체 길이는 20~30m쯤 자라며 온대 북부지방의 산기슭에서 저절로 자란다. 잎은 어긋나고 거꾸로 된 달걀모양이며 끝이 뾰족하고 가장자리에 겹톱니가 있다. 앞면은 풀색이고 뒷면은 연한 풀색이다. 뒷면에 거친 털이 있어 까끌까끌하다. 4월에 잎이 나기 전에 잎겨드랑이에서 자잘한 옅은 풀색 꽃이 모여 핀다. 열매는 6월에 여무는데 둥글납작하며 둘레에 날개가 달린 시과이다. 나무껍질이 짙은 회갈색이고 세로로 불규칙하게 갈라진다. 느릅나무과 느릅나무의 뿌리 속껍질을 유근피, 줄기껍질을 유피, 잎을 유엽이라 한다. 뿌리 속껍질은 가을에, 줄기껍질은 봄에 채취하여 바람이 잘 통하는 그늘에 말려서 쓴다. 느릅나무는 위장병, 장염, 기관지염, 비염, 불면증, 기미 및 주근깨 등에 효염이 있다고 알려져 있다. 위장병, 장염, 기관지염, 비염에는 뿌리껍질 또는 줄기껍질 말린 것을 넣고 달여서 마신다. 잎은 봄에 채취하여 바람이 잘 통하는 그늘에 말려서 쓰는데, 불면증에는 달여서 마시며 기미, 주근깨에는 말린 것을 달인 물을 바른다.

본 명세서에 있어서 느릅나무 또는 느릅나무 분말은 느릅나무 전체 또는 일부로 구성된 것을 의미하며, 느릅나무 일부는 느릅나무 뿌리, 뿌리털, 줄기, 가지, 잎, 나무갓, 껍질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 생물전환이란, 생물의 생리적 기능을 이용해 첨가된 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환시키는 것을 말한다.

본 발명의 일 구체예에서 발효란, 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효라고 하는 것은 효소작용에 의해 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유 에너지를 내놓는 현상이지만, 일반적으로는 미생물이 유기물을 분해해서 대사물을 축적하는 현상을 말한다. 즉, 효모가 당을 무산소적으로 분해해서 에틸알코올과 이산화탄소로 하는 알코올 발효, 락트산균이 당을 무산소적으로 분해해서 락트산으로 하는 락트산 발효 등이 전형적인 발효이지만, 현재는 아세트산균이 공기 중의 산소를 이용해서 알코올을 아세트산으로 산화시키는 현상, 곰팡이가 공기 중의 산소를 이용해서 글루코오스를 글루콘산으로 산화시키는 현상 등도 각각 아세트산 발효, 글루콘산 발효 등으로 부르고 있다. 또 이러한 것들을 혐기적 발효, 호기적 발효(산화 발효)로 나누어 논하기도 하고, 위에 언급한 것 외의 혐기적 발효로는 글리세롤 발효, 아세톤부탄올 발효, 2, 3-부틸렌글리콜 발효, 부티르산 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이, 또 호기적 발효로는 시트르산 발효, 이타콘산 발효, 효모산 발효, 2-케토글루타르산 발효, 옥살산 발효, 푸마르산 발효, 소르보오스 발효 등이 있다. 이외에 미생물에 의한 아미노산, 비타민, 항생물질의 생산도 예를 들면 글루탐산 발효, 리보플라빈 발효, 페니실린 발효 등으로 불리는데, 그다지 좋은 호칭은 아니다. 발효작용명은 생산물로 부르는 것이 원칙이나, 때로는 셀룰로오스 발효, 펙틴 발효 등으로 기질의 이름을 붙이기도 한다.

본 발명의 일 구체예에서 알레르기 질환이란, 알레르기 때문에 생기는 질환이다. 알레르기(allergy)란, 개체에 어떤 종류의 물질(항원 또는 알레르겐)이 들어왔을 때 이것에 대하여 IgE 항체가 만들어지고, 그 후 다시 동일물질인 항원이 체내로 들어갔을 때 생기는 항원항체반응을 말한다. 주된 질환은 기관지천식, 알레르기성 비염, 두드러기, 약진, 약제 알레르기, 혈청병 등이고, 알레르겐의 종류나 알레르기반응을 일으키는 조직에 따라 여러 가지 병의 유형을 나타낸다. 알레르기 질환의 진단에는 가족이나 환자의 그때까지의 경과, 발병시기나 생활환경, 섭취한 식사내용 등이 참고가 된다. 경우에 따라서는 의심스러운 알레르겐을 제거하여 증상이 나아지는 정도를 관찰하며, 알레르겐에 의한 유발시험을 하기도 한다. 그 밖에 피부반응으로서 소파시험(scratch test)이나 피부 내 반응을 조사하는 경우도 있다. 치료법은 알레르겐의 제거, 탈감작 요법과 함께 알레르기반응을 억제하는 약물요법 등이 있다. 호흡기계의 대표적인 알레르기 질환으로서 알레르기비염은 코 점막이 특정물질에 대하여 과민반응을 나타내는 것으로, 알레르기를 일으키는 원인물질(항원)이 코 점막에 노출된 후 자극 부위로 비만세포, 호산구를 비롯한 여러 종류의 IgE 항체를 매개로 하는 염증세포가 몰려들어 이들이 분비하는 다양한 매개물질에 의하여 염증반응이 발생하는 질환이다. 연속적으로 일어나는 발작적인 재채기, 맑은 콧물, 코막힘 등의 세 가지 주요 증상을 특징으로 하며, 이 세 가지 증상 중 두 가지 이상의 증상을 가지고 있을 때 알레르기비염을 의심할 수 있다. 특징적인 증상 외에도 코 주위 가려움, 두통, 후각 감퇴 등의 증상이 동반될 수 있으며 합병증으로 중이염, 부비동염, 인후두염 등이 동반될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 IgE란, 면역글로불린 E라고도 불리는 항체 단백질이다. 알레르기반응에서 중요한 역할을 하므로 종종 "알레르기 항체"라고도 한다. 특정물질(알레르겐)에 알레르기반응을 보이는 경우, 면역체계가 일반적으로 무해한 물질을 몸에 유해하다고 잘못 판단하는데, 이런 특정한 물질에 노출되면 면역체계는 우리 몸을 보호하기 위해 IgE를 생산하기 시작한다. IgE 항체는 몸 안에 남아있다가 다음에 알레르겐 물질과 다시 접촉하면 알레르기반응을 일으킨다. 결과적으로 알레르기가 있는 사람은 혈중 IgE 농도가 증가하며, IgE는 각 알레르겐에 특이도를 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에서 히스타민이란, 아미노산의 일종인 히스티딘이 히스티딘 탈탄산효소의 작용으로 인해 생성되는 물질이다. 주로 비만세포(mast cell)에 저장되어 있다가 상처, 세균 감염 등으로 인해 세포가 손상을 입으면 방출된다. 방출된 히스타민은 혈관을 확장시키고 혈관의 투과성을 증가시켜 백혈구와 여러 혈장단백질들이 세균이 침입한 부위로 빨리 이동할 수 있도록 하여 면역기능에 아주 중요한 역할을 담당한다. 과도한 면역반응으로 인한 히스타민의 과다 분비는 알레르기반응과 아나필락시스를 일으키기도 한다. 이러한 면역기능 외에도 임신 중 자궁의 운동을 조절하며 위액을 분비하는 강력한 활성제 중 하나이다. 혈관 확장으로 인한 혈류량 증가도 유발한다.

본 발명의 일 구체예에서 알레르기의 발병기전을 구체적으로 설명하면, 알레르기란 외부에서 들어온 물질에 대해 과도하게 항진된 면역반응을 보이는 증상을 말하는 것으로, 알레르기질환은 주로 Th2세포 매개 면역반응의 관점에서 기술되어 왔다. 계절성 알레르기비염 등 급성, 경증의 알레르기질환은 알레르기항원-특이 IgE 항체 증가, 비만세포의 IgE-의존적 활성화, 활성화된 Th2세포 및 호산구의 점막표면으로의 침윤 등의 특징을 나타낸다.

알레르기 발병과 관련하여 ①알레르기를 일으키는 항원이 우리 몸에 들어와 항원 특이 Th2세포의 활성화가 이루어지고, ②활성화된 Th2세포가 분비하는 사이토카인(IL-4 등)에 의해 B세포가 IgE 항체 생성 B세포로 전환(class switching) 되어 IgE 항체의 생성이 유도, 분비되면 우리 몸은 알레르기항원(allergen)에 민감한 상태가 된다. 이때 ③알레르기항원이 재유입되면 IgE 항체 매개반응이 일어나 알레르기 증상이 나타나게 된다. 즉, IgE 항체가 비만세포의 IgE 수용체와 결합하여 비만세포가 감작되고 이때 알레르기항원이 재유입되면 비만세포 표면의 IgE와 결합하면서 비만세포가 활성화 되어, 즉시 탈과립이 유도되고 히스타민 같은 세포내 과립물질과 염증성 사이토카인 등 새로 생성된 여러 가지 화학적 매개물질이 세포 밖으로 분비된다. 이때 분비된 여러 화학적 알레르기 매개물질로 인해 알레르기 반응이 시작된다. 알레르기 반응은 초기반응과 후기반응으로 나눌 수 있다. 초기반응은 수분 내에 발생하여 비만세포로부터 히스타민(histamine), β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase), 세로토닌(serotonin)과 같이 이미 생성되어 있는 매개물질과 새로 합성된 지방성분의 매개물질을 분비하고, 후기반응은 수시간 내에 발생하며 Th2 면역반응의 대표적 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13 등을 합성, 분비하여 염증반응을 지속시킨다. 비만세포에 의해 새롭게 생성된 지방성분의 매개물질과 사이토카인은 알레르기 급성 및 만성 염증반응을 유발하는 주요인자이다. ④Th2세포와 비만세포에서 분비된 사이토카인(IL-5 등)에 의해 말초 및 조직에서 호산구의 침윤이 유도, 항진되면 호산구과다증이 유발되어 호산구성 염증이 발생하게 되는데 이를 호산구성 알레르기라고 부른다. 또한 ⑤이때 IL-13에 의해 과민반응이 유도되어 과민성을 나타나게 되는데, 호산구과다증이 알레르기성 과민반응 유도에 직접적인 원인이 된다.

면역반응이 과도하게 항진되어 나타나는 알레르기 질환의 경우 항진된 면역반응의 조절이 필요하며 발병기전에 의거 ①Th1 면역반응 및 Treg 면역반응의 유도를 통해 Th2 면역반응을 억제하고, ②B세포로부터의 IgE 분비를 감소시켜 혈청 IgE 농도를 저하시키고, ③화학적 알레르기 매개물질 및 Th2 type 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13)의 감소와 함께 ④알레르기 염증 부위에서 호산구 및 비만세포를 감소시키고, ⑤과민반응을 감소시키는 등의 면역조절을 겨냥한 치료법들이 알레르기 질환 치료의 새로운 가능성을 제시하고 있다.

본 발명의 일 구체예에서 패혈증이란, 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38도 이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36도 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 부른다. 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 원인이 되는 감염 부위는 신체의 모든 장기가 가능하다. 폐렴, 신우신염, 뇌막염, 봉와직염, 감염성 심내막염, 복막염, 욕창, 담낭염, 담도염 등이 패혈증의 원인이 될 수 있다. 이러한 감염증이 발생한 경우, 원인 미생물이 혈액 내로 침범하여 패혈증을 일으킬 수 있다. 그러나 미생물이 혈액 내로 침투하지 않더라도 신체 일부의 염증반응 및 염증물질의 생성에 의해서 전신적인 패혈증이 발생할 수도 있다. 패혈증의 초기 증상으로는 호흡 수가 빨라지고, 지남력(시간, 장소, 사람에 대한 인지력)의 상실이나 정신 착란 등의 신경학적 장애가 나타날 수 있다. 혈압의 저하 및 신체 말단에 공급되는 혈액량의 저하로 인하여 피부가 시퍼렇게 보이기도 한다. 균혈증(세균이 혈액 내에 돌아다니는 증상)이 있으면 세균이 혈류를 따라 돌아다니다가 신체의 특정부위에 자리를 잡아 그 부위에 병적인 변화를 일으킬 수 있다. 원인균에 특이적인 피부의 변화가 나타나므로, 패혈증의 원인을 진단하는 데 도움이 될 수 있다. 소화기 계통의 증상으로는 구역, 구토, 설사 및 장 마비 증세가 나타나고 심한 스트레스 상황에서는 소화기의 출혈 증상도 나타날 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 약학조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 패혈증 발병군에서 생존율을 증진시키거나, 염증활성 물질의 억제를 위해 사용되는 것이며, 이를 위한 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 약학조성물에 상응하는 유효성분을 0.1 내지 100 중량%로 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 식품조성물이란, 알레르기 질환의 개선을 위한 식품조성물로 다양하게 이용되는 것으로서, 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연식품 및 이의 발효물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 100%의 비율로 첨가할 수 있다. 여기서, 상기 식품조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 100 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 구체예에서 화장료조성물이란, 알레르기성 피부 상태 또는 알레르기성 피부 질환의 개선을 위한 조성물이다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜워시, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다. 상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다. 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸알콜, 옥틸도데칸올, 올레일알콜, 판텐올, 라놀린알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. 그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명의 일 구체예에서, (a) 느릅나무를 액상으로 배양배지화 하는 단계, (b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상느릅나무배지에 담자균류균사를 접종하여 배양발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계, 및 (c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 생물전환 효소처리공정을 통해 항알레르기 효능을 향상시킨 발효 및 효소처리의 생물전환산물을 생산하는 단계를 포함하는 항 알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하고, 상기 (a)단계의 느릅나무의 배양배지화는 느릅나무를 분말화한 느릅나무분말을 가수분해효소로 처리한 후 멸균하여 액상느릅나무배지로 만드는 것인 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하며, 상기 효소처리는 세포벽 구성성분을 분해할 수 있는 섬유소분해효소 및 아밀라제 계열의 효소에 의한 것인 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하며, 상기 섬유소분해효소는 셀룰라아제, 헤미-셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하며, 상기 (b)단계의 담자균류균사는 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어지는 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 생물전환산물은 IgE를 분비하는 B세포에서의 IgE의 분비를 억제시키고 또한 비만세포에서의 히스타민의 분비를 억제시키는 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 생물전환산물은 대식세포에서 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β의 발현을 증진시키는 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 생물전환산물은 패혈증 증상에 있어서 전신염증반응 지표인 혈청 내 TNF-α, IL-1β 및 산화질소의 농도를 감소시키는 항염증 효능이 증가된 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 느릅나무에 담자균류균사를 접종하여 배양발효한 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 제공하고, 상기 알레르기는 알레르기비염인 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 제공하며, 상기 항알레르기 효능은 알레르기 증상에 있어서 IgE 생성량을 감소시키고 또한 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성을 억제시키는 것과 함께 IL-2, IL-10, IL-12 및 감마-인터페론의 생성을 증가시키는 것인 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 제공하며, 상기 항알레르기 효능은 알레르기 증상에 있어서 기관지폐포세척액에서 에오탁신(Eotaxin) 및 VCAM-1의 농도 감소와 염증매개물질인 아이코사노이드(Eicosanoids), LTC4 및 프로스타글란딘 D2의 생성을 억제시키는 것인 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 느릅나무에 담자균류균사를 접종하여 배양발효한 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 포함하는 알레르기 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 알레르기는 알레르기비염인 알레르기 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 느릅나무에 담자균류균사를 접종하여 배양발효한 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 포함하는 염증 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 염증 치료는 패혈증 치료인 염증 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 느릅나무에 담자균류균사를 접종하여 배양발효한 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 포함하는 항알레르기용 식품조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 느릅나무에 담자균류균사를 접종하여 배양발효한 항알레르기 효능이 증가된 발효물을 포함하는 항알레르기용 화장료조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

미생물(담자균류균사) 발효하거나, 추가로 효소처리를 통해 생물전환된 느릅나무 발효물은 발효되지 않은 느릅나무 추출물(느릅나무 원물)에 비하여 항알레르기 물질을 많이 함유하고 있으므로, 이를 이용하여 식품 등으로 개발시 알레르기 발생을 저감시킬 수 있는 효과가 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무의 배양배지화, 생물전환공정 및 발효분말 수득 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원산지별 원물 및 발효물의 농도별 IgE 항체 생성 억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 비만세포 탈과립 억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 히스타민 방출 억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 세포 독성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 TNF-α 발현능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 IL-6 발현능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 IL-10 발현능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 느릅나무 원물 및 발효물의 농도별 IFN-β 발현능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, OVA-감작 (알레르기비염/천식) 마우스 실험동물모델의 제작 방법을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, OVA-감작 동물모델의 기관지폐포세척액(BALF) 및 혈액에서 IgE 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, OVA-감작 동물모델의 기관지폐포세척액(BALF)에서 Th1, Th2, 및 Treg 면역반응의 대표적 사이토카인에 대한 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, OVA-감작 동물모델의 혈액에서 Th1, Th2, 및 Treg 면역반응의 대표적 사이토카인에 대한 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, OVA-감작 동물모델의 기관지폐포세척액(BALF)에서 호산구 등의 면역세포 세포수에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, OVA-감작 동물모델의 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증 관련 물질의 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, 패혈증 유도된 동물모델에서 느릅나무 발효물의 투여량에 따른 사망률 변화를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 발효 및 효소처리의 생물전환공정

실시예 1-1. 느릅나무 전처리

구입한 느릅나무의 원물로부터 분말화하기까지의 전처리 작업을 위하여 원재료 상태의 곰팡이 오염도를 측정한 후, 천연물 원재료의 이물 및 오염물 제거를 위한 수세작업을 하였다. 수세작업은 총 3단계를 거쳐 수행하였으며 ①이물 및 곰팡이 포자를 제거하기 위한 공기 세척 단계, ②잔류 농약 등의 제거를 위한 물 세척 단계, ③미생물 등의 오염을 제거하기 위한 알코올(Et-OH) 세척 단계를 통해 원재료의 수세작업을 수행하였다. 수세 및 절단작업을 마친 원재료는 대량건조가 가능한 열풍건조기에서 건조작업을 수행한 후 조분쇄 및 미분쇄 공정을 거쳐 각각의 천연물 원재료의 분말화 작업을 수행하였다.

실시예 1-2. 느릅나무의 발효분말 수득

이물 및 곰팡이 오염을 제거한 느릅나무는 액상 배양배지화를 위해 효소처리 및 열처리 살균공정을 수행하였다. 효소는 나무껍질, 근피, 뿌리, 잎 등을 분해할 수 있는 셀룰로오즈 및 헤미-셀룰로오즈 계열의 가수분해효소와 텍티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase) 및 아밀라아제(amylase) 계열의 가수분해효소를 사용하였고, 상기 효소를 첨가 후 60℃에서 1시간 반응시키고, 고온에서 30분간 멸균처리하여 느릅나무의 배양배지화를 수행하였다.

이후, 상기 배양(발효)배지에 별도로 배양한 담자균류균사를 첨가하였다. 담자균류균사 종균배양액을 10%(v/v) 접종하고 28~30℃ 및 pH 4.5~7의 조건에서 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상느릅나무배지를 첨가하는 유가식 공정으로 7~10일간 배양하였다. 상기의 담자균류균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양 받아 사용할 수 있다.

상기 발효물에 대한 생물전환공정의 효소처리는 열수추출 후 섬유소분해효소 즉, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소제를 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량)을 첨가하여 실시하였다. 효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소분해효소인 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물)을 각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 추천 농도(10% v/v)로 첨가하고, 50~60℃조건에서 1~3시간 동안 250 rpm으로 회전시키며 효소/기질반응을 수행하였다.

생물전환공정에 의해 생산된 느릅나무 발효물은 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 느릅나무 발효물 분말을 10배의 물에 녹여 10,000rpm, 30분간 원심분리하여 불용성 잔사를 제거하고, 상등액을 동결 건조하여 수용성분말로 수득하거나 혹은 상등액에 5배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 동결건조하여 면역활성을 갖는 고분자성 다당체 분획의 분말을 수득하였다. 상기의 느릅나무의 배양배지화, 생물전환공정 및 발효분말 수득 과정을 도 1에 기재하였다.

실시예 2. 생물전환시킨 느릅나무 발효물의 체외(in vitro) 효능 평가

실시예 2-1. B세포에서 IgE 항체 생성 억제 활성 평가

생물전환시킨 느릅나무 발효물의 IgE 생성 억제 효과를 확인하기 위한 U266B1 세포주(사람 기원의 B세포)를 세계세포주은행(ATCC)에서 구입하였고, 37℃, 5% CO₂, 포화습도의 조건으로 15%의 보체 비활성화 FBS(heat-inactivated fetal bovine serum)와 100 유니트(units) 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 상기 U266B1 세포를 96 웰 배양접시에 1 x 10⁶ 세포/웰 농도로 접종한 후, 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 10 ㎍/㎖의 LPS와 5 ng/㎖의 IL-4를 처리하여 B 세포를 자극하였다. 자극과 함께, 배양액 내에 느릅나무 원물 및 발효물을 각각 1, 10, 100 ㎍/㎖ 의 농도로 처리하여 72시간 재차 배양하였다. 배양 후, 상층액을 회수하여 U266B1 세포에서 분비된 IgE의 양을 샌드위치 엘라이자 어쎄이(BETHYL, Montgomery, TX) 키드를 이용하여 측정하였다. 느릅나무는 경상북도 영천(CM)산과 강원도 횡성(HS) 두 지역에서 구매하여 사용하였으며, 원물과 발효물 모두 농도 의존적으로 IgE 생성 억제 활성이 있음을 확인하였다. 경상북도 영천(CM)산 느릅나무의 원물 및 발효물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 각각 25.3%와 66.9%의 억제 활성을 보였고, 강원도 횡성(HS)산 느릅나무는 각각 27.2%와 66.2%의 억제 효과를 보임으로써 두 원산지간의 차이는 보이지 않았다. 느릅나무 원물 대비 발효물의 경우 IgE 생성 억제 활성이 현저히 증가함을 확인하였으며, 특히 주목할 만한 점은 원물 100 ㎍/㎖의 농도에서 보다 발효물 1 ㎍/㎖의 농도에서 IgE 항체 생성 억제 활성이 더 높게 나타난 것이다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 2-2. 비만세포에서 탈과립 억제 활성 평가

베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 억제 활성 평가를 위한 RBL-2H3 세포주(랫드 기원의 비만세포)를 ATCC에서 구입하였고, 37℃, 5% CO₂, 포화습도의 조건으로 10%의 보체 비활성화 FBS(heat-inactivated fetal bovine serum)와 100 유니트(units) 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 이를 96 웰 배양접시에 1 x 10⁵ 세포/웰로 분주한 후 추가로 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 배지를 모두 제거하고 티로이드 버퍼(tyroid buffer; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1.1 mM MgCl₂, 11.9 mM NaHCO₃, 0.4 mM NaH₂PO₄, 5.6 mM glucose, pH 7.2)으로 3회 세척한 뒤 적정 농도의 소재를 처리하여 37℃에서 20분간 배양하였다. 티로이드 버퍼로 3회 세척한 뒤, 10 μM의 A23187(calcium ionophore)를 처리하고 20분간 배양하여 탈과립을 유도하였다. DNP-BSA를 이용하여 탈과립을 유도하는 경우에는 세포 접종 시 1 ㎍/㎖의 IgE를 함께 처리하여 감작하였으며, 적정 농도의 소재 처리 후 100 ㎍/㎖의 DNP-BSA를 30분간 처리하여 탈과립을 유도하였다. 유도 후 상층액 100 ㎕를 회수하여 0.1 M 사이트레이트 완충액(Citrate Buffer, pH 5.0)에 용해된 1 mM p-니트로페닐-β-아세틸-글루코사마이드(p-Nitrophenyl-β-Acethyl-Glucosamide) 100 ㎕와 섞어 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시켰으며 200 ㎕의 소듐 비카보네이트 버퍼(Sodium Bicabonate Buffer, pH 10.2)를 넣어 반응을 종결하였고, 마이크로플레이드 리더(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

베타-헥소사미니다아제 분석 실험에서, 원물과 발효물을 원산지에 따라 비교 실험을 수행한 결과 각각의 원물과 발효물에서 자극원에 따른 억제 활성의 큰 차이는 보이지 않았다. A23187로 자극한 경우 강원도 홍천(JM)산 느릅나무 원물에서 100 ㎍/㎖ 농도에서 61%의 억제 활성을 나타내었고, 강원도 영원(SD)과 경상남도 지리산(HG)산 느릅나무 생물전환발효산물에서 100 ㎍/㎖ 농도에서 61.2%로 가장 높은 억제 활성을 나타냈으나 다른 원산지의 느릅나무와 큰 차이를 나타내지는 않아 역시 원산지간의 큰 차이는 보이지 않음을 확인하였다.

DNP-BSA로 자극한 경우 역시 강원도 인제(JC)산 느릅나무 원물에서 100 ㎍/㎖ 농도에서 58.9%, 충청북도 제천(YC)산 느릅나무 발효물에서 100 ㎍/㎖ 농도에서 59.9%로 가장 높은 활성을 보였지만 원산지간의 차이는 보이지 않았다. 또한 원물과 발효물의 활성 차이 역시 크게 나타나지 않아 발효/효소처리 생물전환공정을 거침에 따른 베타-헥소사미니다아제 방출 억제 활성의 증가에는 큰 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 2-3. 비만세포에서 히스타민 방출 억제 활성 평가

히스타민(Histamine) 방출 억제 활성 평가를 위한 RBL-2H3 세포주를 실시예 2-2와 같은 방법으로 배양하였다. 상기 세포를 A23187으로 감작시킨 후, 강원도 횡성(HS)산 느릅나무 원물 및 발효물을 1, 10, 및 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 히스타민의 측정을 위하여, 배양된 RBL-2H3 세포에 0.25%의 트립신을 처리하여 세포를 수거한 후, 티로이드 버퍼(tyroid buffer, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.1 mM MgCl2, 11.9 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, pH 7.2)를 사용하여 세포밀도를 1 × 10⁶ 세포/웰 농도로 조절한 뒤 24 웰 배양접시에 분주하였다. 이후 적정 농도의 소재를 처리하여 15분간 배양한 후 10 μM의 A23187 칼?? 운반체(calcium ionophore)를 처리하여 20분간 재차 배양하였다. 배양 후, 4℃에서 10분간 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액 1 ㎖에 0.2 ㎖의 1 N NaOH, 0.1 ㎖의 1% OPT (o-phthalaldehyde)를 첨가하고 실온에서 5분간 방치하였다. 여기에 0.2 ㎖의 1 N HCl을 처리하여 반응을 종결시킨 후 형광광도측정기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 360 nm의 흥분 파장과 450 nm의 방출 파장에서 측정하였다.

강원도 횡성(HS)산 느릅나무 원물과 발효물을 이용하여 히스타민 방출 억제 활성을 측정한 결과 100 ㎍/㎖ 농도에서 원물은 31.6%, 발효물은 39.9%의 억제 활성을 갖는 것으로 측정되어 발효/효소처리의 생물전환공정에 따른 활성의 증가가 약간 나타남을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 2-4. 세포독성 평가

실시예 2-2의 방법으로 배양된 RBL-2H3 세포주를 96 웰 배양접시에 1 x 10⁴ 세포/웰의 농도로 분주한 후, 느릅나무 원물 및 발효물을 1, 10, 및 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 48시간동안 배양하였다. 배양 후, 상층액을 제거하고 배지에 희석한 0.5 mg/㎖의 MTT시약(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 200 ㎕처리하여 3시간동안 재차 배양하였다. 배양 후 상층액을 제거하고 200 ㎕의 DMSO를 처리하여 세포 내 침전물을 충분히 용해시킨 후 마이크로플레이드 리더(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

RBL-2H3 비만세포주에서 강원도 횡성(HS)산 느릅나무의 세포독성의 측정 결과는, 원물과 발효물 모두 100 ㎍/㎖ 농도에서 특별한 세포독성 및 증식 유도는 보이지 않았다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 2-5. 대식세포에서 TNF -α의 발현율을 이용한 면역반응 활성화능 평가

느릅나무 발효물의 선천성 면역반응 활성화를 평가하기 위하여 5% DMEM 배양액을 사용하여 마크로파지(대식세포)의 배양 및 어세이 분석을 수행하였다. 면역활성 측정에 사용한 마크로파지(대식세포)는 RAW 264.7 세포주로, 계대배양은 24웰 배양접시의 각 웰에 1×10⁵ 세포/ml의 농도로 0.5ml 씩 세포를 계대배양하였다. 24시간 배양 후 현미경으로 세포 배양 상태를 확인한 뒤, 배지를 완전히 제거한 다음 혈청이 첨가되지 않은 배지로 2~3회 세척하였다. 각 웰에 시료가 첨가된 5% FBS DMEM 배지를 0.5ml씩 채워준고, 시료의 농도는 100㎍/㎖ 농도를 시작으로 1/10 단계 희석하여 1, 10, 100㎍/㎖ 농도로 하여 시료를 처리하였다. 또한, 양성대조군(positive control)으로 최종 농도 1㎍/㎖의 LPS를 처리하였다(200㎍/㎖ stock). 시료가 처리된 24웰을 8~24시간 배양 후 각 웰의 배양액을 400㎕씩 취하고, 400㎕씩 취한 배양액을 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 어세이 분석에 사용하였다.

느릅나무 원물 및 발효물의 선천성 면역반응 활성화 효능을 확인하기 위하여 상기 대식세포(macrophage)에서 TNF-α의 발현능을 조사하였다. 느릅나무 원물 및 발효물을 10 및 100㎍/㎖의 농도를 처리하여 실험을 수행하였다. 시료처리 후 18시간 처리한 배양상등액을 취하여 TNF-α (R&D system, MTA00B) 어세이 키드로 제조사의 프로토컬에 따라 분석하였다.

분석 결과 느릅나무 원물에 비하여 느릅나무 발효물에서 더 높은 TNF-α 발현율을 나타내는 것이 확인되었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

실시예 2-6. 대식세포에서 IL-6의 발현율을 이용한 면역반응 활성화능 평가

느릅나무 원물 및 발효물의 선천성 면역반응 활성화 효능을 확인하기 위하여 실시예 2-5와 같은 방법으로 배양한 대식세포(macrophage)에서 IL-6의 발현능을 조사하였다. 느릅나무 원물 및 발효물을 10 및 100㎍/㎖의 농도를 처리하여 실험을 수행하였다. 시료처리 후 18시간 처리한 배양상등액을 취하여 IL-6 (R&D system, M6000B) 어세이 키드로 제조사의 프로토컬에 따라 분석하였다.

분석 결과 느릅나무 원물을 처리한 그룹에서는 IL-6가 거의 발현되지 않는 것으로 나타났으나, 느릅나무 발효물을 처리한 그룹에서는 IL-6의 발현 수치가 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실시예 2-7. 대식세포에서 IL-10의 발현율을 이용한 면역반응 활성화능 평가

느릅나무 원물 및 발효물의 선천성 면역반응 활성화 효능을 확인하기 위하여 실시예 2-5와 같은 방법으로 배양한 대식세포(macrophage)에서 IL-10의 발현능을 조사하였다. 느릅나무 원물 및 발효물을 10 및 100㎍/㎖의 농도를 처리하여 실험을 수행하였다. 시료처리 후 18시간 처리한 배양상등액을 취하여 IL-10 (R&D system, M1000) 어세이 키드로 제조사의 프로토컬에 따라 분석하였다.

분석 결과 느릅나무 원물에 비하여 느릅나무 발효물에서 더 높은 IL-10 발현율을 나타내는 것이 확인되었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

실시예 2-8. 대식세포에서 IFN -β의 발현율을 이용한 면역반응 활성화능 평가

느릅나무 원물 및 발효물의 선천성 면역반응 활성화 효능을 확인하기 위하여 실시예 2-5와 같은 방법으로 배양한 대식세포(macrophage)에서 IFN-β의 발현능을 조사하였다.느릅나무 원물 및 발효물을 10 및 100㎍/㎖의 농도를 처리하여 실험을 수행하였다. 시료처리 후 18시간 처리한 배양상등액을 취하여 IFN-β (R&D system, 42400) 어세이 키드로 제조사의 프로토컬에 따라 분석하였다.

분석 결과 느릅나무 원물에 비하여 느릅나무 발효물에서 더 높은 IFN-β 발현율을 나타내는 것이 확인되었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

IFN-β는 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로 Th1 면역반응을 유도하는 반면 Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 사이토카인이다. 알레르기는 Th2 면역반응이 항진됨에 따라서 나타나는 현상으로 알려져 있다. 느릅나무 발효물은 Th1 면역반응과 관련된 INF-β의 발현을 촉진시킴으로써 알레르기를 유발하는 Th2 면역반응과 관련된 cytokine의 발현을 억제시킬 수 있을 것으로 기대되어, 항알레르기 소재로 적절할 것으로 판단할 수 있다.

실시예 3. 알레르기 비염 모델에서 느릅나무 발효물의 체내(in vivo ) 효능 평가

실시예 3-1. 알레르기비염 유도 실험동물모델의 확립

느릅나무 발효물의 항알레르기 활성을 평가하기 위하여 OVA-감작 (알레르기비염/천식) 마우스 실험동물모델을 확립하였다. 항원으로는 계란 흰자에서 분리한 난백알부민(ovalbumin)을 사용하였고, 보강제로는 알루미나(alumina)를 사용하였다. 실험 시작일과 14일째에 2번의 복강주사를 통해 난백알부민/알루미나를 감작시킨 후, 2주간 경과시간을 거친 후 30일째부터 1일 1회 30분씩 5일간 난백 알부민을 흡입하여 알레르기반응을 유도하였다. 느릅나무 발효물의 평가는 실험 시작일과 14일째에 2번의 난백알부민/알루미나 복강 주사를 통해 감작시킨 후, 15일째부터 실험이 끝날 때까지 매일 느릅나무 원물 및 발효물을 10 ㎎/㎏의 복용량으로 경구 투여하여 효능 및 효과를 평가하였다. 상기 OVA-감작 마우스 실험동물모델의 제작 방법을 도 10에 나타내었다.

실시예 3-2. BALF 및 혈액에서의 IgE 생성 제어능 평가

실시예 3-1의 방법으로 제작된 OVA-감작 (알레르기비염/천식) 실험동물모델에 도 10과 같이 동물모델 제작 30일째부터 5일간 매일 난백알부민을 흡입시켜 알레르기반응을 유도하였다. 또한 느릅나무 발효물은 실험 시작일과 14일째에 2번의 난백알부민/알루미나 복강주사를 통해 감작시킨 후인, 15일째부터 실험이 끝날때까지 매일 투여하고, 35일째에 마우스를 희생하고 기관지폐포세척액 (BALF) 및 혈액를 회수하였다. 회수한 BALF에서 면역글로불린 E(IgE)의 양을 확인한 결과, 느릅나무 원물에서 43.8%, 발효물에서 83.1%의 억제 활성을 보이는 것으로 나타나 IgE 생성 억제 활성이 현저히 증가하는 것으로 확인되었다. 혈액 내의 면역글로불린 E 또한 느릅나무 원물에서 25.8%, 발효물에서 72.1% 생성 억제된 것으로 평가되었다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

실시예 3-3. BALF에서의 사이토카인 생성 제어능 평가

느릅나무 발효물의 투여로 인해 OVA-감작 (알레르기비염/천식) 실험동물모델에서 IgE의 생성이 억제됨에 따라서, B 세포의 증식 및 활성을 조절하는 Th2 세포의 활성화 정도를 조사하기 위하여 마우스 기관지폐포세척액(BALF)에서 Th2 면역반응의 대표적 사이토카인과 함께 Th1 및 Treg 면역반응의 대표적 사이토카인의 생성량을 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 실험 결과, 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 Th2 면역반응의 대표적 사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성이 대조군(OVA only)은 물론 원물 섭취군에 비하여 현저히 억제된 것을 확인하였으며, 원물 섭취군 또한 대조군에 비하여 억제된 것을 확인하였다. 반면에, Th1 면역반응의 대표적 사이토카인인 IL-2, IL-12와 함께 Treg 면역반응의 대표적 사이토카인인 IL-10의 생성은 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 대조군은 물론 원물 섭취군에 비하여 증가된 것으로 나타났으며, 원물 섭취군 또한 대조군에 비하여 증가한 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다.

실시예 3-4. 혈액에서의 사이토카인 농도 평가

OVA-감작 (알레르기비염/천식) 실험동물모델의 혈청에서 느릅나무 발효물의 투여에 따른 Th1, Th2, 및 Treg 면역반응의 대표적 사이토카인의 농도를 실시예 3-3에서와 같이 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 실험 결과, 마우스 기관지폐포세척액(BALF)에서와 마찬가지로, Th1 면역반응의 대표적 사이토카인인 IL-2, IL-12와 함께, Treg 면역반응의 대표적인 사이토카인인 IL-10의 생성은 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 대조군은 물론 원물 섭취군에 비하여 증가한 것으로 나타났으며, 원물 섭취군 또한 대조군에 비하여 증가한 것으로 나타났다. 또한 알레르기 염증 부위에서 호산구 침윤을 억제함이 밝혀져 있는 감마-인터페론(Interferon-γ 또는 IFN-γ)은 Th1세포가 분비하는 대표적 사이토카인으로 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 대조군은 물론 원물 섭취군에 비하여 증가한 것으로 나타났으며, 원물 섭취군 또한 대조군에 비하여 증가한 것으로 나타났다. 반면에, 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 Th2 면역반응의 대표적 사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성이 대조군(OVA only)은 물론 원물 섭취군에 비하여 감소된 것을 확인하였으며, 원물 섭취군 또한 대조군에 비하여 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 13에 나타내었다.

실시예 3-5. BALF에서의 호산구 증식 억제 및 세포수에 미치는 효과 확인

느릅나무 발효물의 투여로 인해 OVA-감작(알레르기비염/천식) 실험동물모델의 마우스 기관지폐포세척액(BALF)에서 호산구 증식 억제 및 세포수에 미치는 효과를 확인하였다. 실험 결과, 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 원물을 섭취한 그룹 대비 BALF내 면역세포수가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, 호산구 및 림프구의 세포수가 현저히 감소하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

실시예 3-6. BALF에서의 염증관련 물질의 억제 효과 평가

느릅나무 발효물의 투여로 인해 OVA-감작(알레르기비염/천식) 실험동물모델의 마우스 기관지폐포세척액(BALF)에서 호산구 유래 물질과 염증매개물질인 아이코사노이드(Eicosanoids)의 농도를 확인하였다. 실험 결과, 느릅나무 발효물을 섭취한 그룹에서 에오탁신(Eotaxin)과 VCAM-1의 농도가 감소하여, OVA-감작 그룹 및 느릅나무 원물을 섭취한 그룹 대비 호산구가 감소하였음을 알 수 있었다. 또한, 마우스 BALF에서 염증매개물질인 아이코사노이드(Eicosanoids), LTC4 및 프로스타글란딘 D2의 생성도 억제됨을 확인하였다. 상기 결과를 도 15에 나타내었다.

실시예 4. 패혈증 모델에서 느릅나무 발효물의 체내(in vivo ) 안전성 평가

실시예 4-1. 패혈증 유도 실험동물모델의 확립

느릅나무 발효물의 체내(in vivo) 안전성 평가 실험 결과를 기반으로 하여 생체 내 느릅나무 발효물의 한계투여량 및 투여경로를 평가하였다. 마우스에 느릅나무 발효물을 1, 10 및 100 mg/kg의 농도로 2주간 복강주사를 통해 투여하고 치사량의 LPS (20 ㎍/kg)와 갈락토사민(galactosamine, 700 mg/kg)을 주사하여 패혈증을 유도하였다.

실시예 4-2. 농도별 및 투여경로에 따른 치사량 비교

실시예 4-1의 방법으로 실험동물모델에 패혈증 유도 후, 60시간까지의 마우스 사망률을 확인한 결과, 실험군당 10마리의 마우스 중에서 느릅나무 발효물 1 mg/kg을 복강투여한 실험군에서는 2마리, 10 mg/kg을 복강투여한 실험군에서는 5마리, 100 mg/kg을 복강투여한 실험군에서는 4마리의 마우스가 생존함을 확인하였다. 즉, 1, 10, 100 ㎎/㎏으로 투여량이 증가할수록 생존율이 향상되어 느릅나무 발효물은 매우 안전한 면역조절소재임을 확인할 수 있었으며 특히, 경구투여에 있어서도 매우 효과적인 물질임을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.

실시예 4-3. 전신염증반응 지표( TNF -α, IL- 1β , 산화질소) 평가

실시예 4-2와 같이 느릅나무 발효물 투여로 인하여 LPS 치사량에서의 패혈증 사망률이 감소하는 결과를 보임에 따라서, 전신염증반응에서의 개발소재가 갖는 염증 억제 효과를 확인하고자 하였다. 결정된 적정 투여량 및 투여경로에 따라 10 mg/kg의 느릅나무 발효물을 경구투여로 2주간 투여한 후 아치사량(sub-lethal dose)의 LPS (5 ㎍/kg)와 갈락토사민(galactosamine, 700 mg/kg)을 주사하여 전신염증반응을 유도하였다. 염증반응을 4시간 동안 유도한 후 마우스를 희생하여 심장에서 채혈하였고, 혈청을 분리하여 전신염증반응 지표인 혈청 내 TNF-α, IL-1β 및 산화질소(nitric oxide)의 농도를 확인하였다.

실험 결과, 느릅나무 발효물이 투여된 마우스는 대조군에 비하여 TNF-α의 생성을 40% 이상 억제함을 확인하였다. 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-1β 생성량 역시 45% 이상의 높은 생성 억제 활성을 나타냄이 확인되어 느릅나무 발효물이 염증반응 억제 활성을 가짐이 확인되었다. LPS에 의해 일어난 전신염증반응의 또 다른 지표인 혈청 내 산화질소의 양 역시 55% 이상의 높은 생성 억제 활성을 보이는 것으로 측정되었다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

Sample	TNF -α ( pg /mL)	IL- 1β	Nitric oxide ( uM )
용제(Vehicle)	32.597 ± 1.209	12.174 ± 0.896	0.722 ± 0.041
대조군(Negative control)	382.226 ± 15.467	128.462 ± 5.447	19.114 ± 1.005
느릅나무 발효물	236.904 ± 14.414	75.643 ± 3.008	8.524 ± 0.566

Claims (18)

1. (a) 느릅나무를 분말화한 느릅나무분말을 가수분해효소로 처리한 후 멸균하여 액상느릅나무배지로 제조하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상느릅나무배지에 담자균류균사를 접종하여 배양발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계; 및
   (c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소분해효소 처리 공정을 통해 항알레르기 효능을 향상시킨 발효 및 효소처리의 생물전환산물을 생산하는 단계를 포함하는, 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법으로써,
   상기 (a) 단계에서의 가수분해효소는 세포벽 구성성분을 분해할 수 있는 섬유소분해효소 및 아밀라아제인 것이고,
   상기 (b) 단계에서의 담자균류균사는 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이며,
   상기 (c) 단계에서의 섬유소분해효소는 셀룰라아제, 헤미-셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서,
   상기 (c)단계의 생물전환산물은 IgE를 분비하는 B세포에서의 IgE의 분비를 억제시키고 또한 비만세포에서의 히스타민의 분비를 억제시키는, 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 (c)단계의 생물전환산물은 대식세포에서 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β의 발현을 증진시키는, 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법.
   
8. 제 1항에 있어서,
   상기 (c)단계의 생물전환산물은 패혈증 증상에 있어서 전신염증반응 지표인 혈청 내 TNF-α, IL-1β 및 산화질소의 농도를 감소시키는, 항알레르기 효능이 증가된 발효물의 제조방법.
   
9. 제 1항의 제조방법으로 제조된, 항알레르기 효능이 증가된 발효물.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 알레르기는 알레르기비염인, 항알레르기 효능이 증가된 발효물.
    
11. 제 9항에 있어서,
    상기 항알레르기 효능은 알레르기 증상에 있어서 IgE 생성량을 감소시키고 또한 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성을 억제시키는 것과 함께 IL-2, IL-10, IL-12 및 감마-인터페론의 생성을 증가시키는 것인, 항알레르기 효능이 증가된 발효물.
    
12. 제 9항에 있어서,
    상기 항알레르기 효능은 알레르기 증상에 있어서 기관지폐포세척액에서 에오탁신(Eotaxin) 및 VCAM-1의 농도 감소와 염증매개물질인 아이코사노이드(Eicosanoids), LTC4 및 프로스타글란딘 D2의 생성을 억제시키는 것인, 항알레르기 효능이 증가된 발효물.
    
13. 제 9항의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 알레르기 치료용 약학조성물.
    
14. 제 13항에 있어서,
    상기 알레르기는 알레르기비염인, 알레르기 치료용 약학조성물.
    
15. 삭제
16. 삭제
17. 제 9항의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 알레르기 개선용 식품조성물.
    
18. 제 9항의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 알레르기 개선용 화장료조성물.
    

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