CN103073621A - 一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途，该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly，制备时以脱脂金枪鱼碎肉作为原料，加入磷酸盐缓冲液，调节pH到5.0~7.0，得混合液；将混合液搅拌预热，加入木瓜蛋白酶，得酶解产物；将酶解产物先灭酶再依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易监控，制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，本发明还涉及该金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的制备方法，本发明还涉及该金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的用途。
背景技术
抗氧化剂是一类可以阻止氧气不良影响，帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害和保护食品免受氧化损伤变质的一类物质。抗氧化剂按照来源分为天然抗氧化剂和化学合成抗氧化剂两类。化学合成抗氧化剂（如丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）和特丁基对苯二酚（TBHQ）等）由于价格便宜、活性好，因而被广泛地应用到食品工业中阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长食品贮存期。然而，世界卫生组织(FA0/WHO)、欧共体儿童保护组织(HACSG)、英国生物工业协会(BIBRA)、日本、美国的政府和组织的研究表明，合成抗氧化剂具有诸多副作用，如对人体的肝、脾、肺均有不利影响，会诱发恶性肿瘤等。所以美国食品药品管理局(FDA)建议在一般认为安全的物质中删去BHT；日本有关卫生部门经研究曾做出禁止使用BHA的结论；对于TBHQ，虽然美国等少数国家批准了它在某些油脂中的使用，但欧盟、日本等国家认为它的毒理试验资料不完善，尚未批准使用。因此，基于食品安全的考虑，化学合成抗氧化剂的应用受到了较大影响。事实也证明，在人们长期食用的食品中，天然抗氧化剂成分的毒性远远低于人工合成的抗氧化剂毒性。因此，近年来从自然界中寻求天然抗氧化剂的研究引起了各国科学家的高度重视。
目前，世界各国已从多种植物、动物组织中提取得到了多种抗氧化活性显著的物质，如茶叶中的茶多酚、大豆中的异黄酮、河蟹及虾外壳中的虾青素，枸杞中的多糖，蔬菜水果中的类胡萝卜素和抗坏血酸等物质。而已有的研究揭示，多肽类物质也具有显著的抗氧化活性，如存在于肌肉组织中的肌肽不仅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品贮藏时有护色作用；谷胱甘肽（GSH）亦具有抗氧化作用和整合解毒作用，并具有显著的抗氧化作用；而以生物蛋白为原料，采用酶解技术得到的蛋白酶解物及其组成多肽也具有显著的抗氧化活性，如Suetsuma等从酪蛋白的酶解产物中得到的纯度较高的六肽Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu具有显著的自由基清除作用；Chen Hua-Ming等从大豆酶解物中制备的五肽Leu-Leu-Pro-His-His具有很强的抗氧化活性；Ali Bougatef等从沙丁鱼蛋白酶解物中制备的三肽Leu-His-Tyr亦显示出显著的自由基清除活性；Seung-Jae Lee等从鸭皮酶解物中制备的八肽His-Thr-Val-Gln-Cys-Met-Phe-Gln亦显示出显著的自由基清除活性；陈宁等从胡桃酶解物中制备的四肽Ala-Asp-Ala-Phe表现出与谷胱甘肽（GSH）类似的抗氧化活性；王勇刚研究发现鱼精多肽中的二肽Pro-Arg可显著清除羟自由基，而且还可有效降低MRC-5（胚肺细胞）胞内自由基的含量，从而保护细胞避免氧化损伤。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，该抗氧化肽安全无毒副作用，抗氧化活性强和易于消化吸收，可清除自由基和抑制脂质过氧化作用。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的制备方法，工艺科学合理、易操作。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的应用。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1，HR-ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 539.2096 Da[M+H]+。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以脱脂金枪鱼碎肉作为原料，按固液比1 g:15mL ~ 25mL加入磷酸盐缓冲液（pH 5.5~6.5），用HCl或NaOH调节pH到5.0 ~ 7.0，得混合液；
2）将混合液温度升至55 ℃ ~ 65 ℃搅拌预热10 min ~ 15 min，按照脱脂鱼肉质量的1.0 % ~ 1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解温度为55 ℃ ~ 65 ℃，酶解时间1 h ~ 3 h，得酶解产物；
3）将制备的脱脂鱼肉蛋白酶解产物先经灭酶处理得金枪鱼碎肉蛋白酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。
作为改进，所述步骤1）中的脱脂金枪鱼碎肉的制备过程为：将洗净除杂的金枪鱼碎肉按照固液比1 g:1 mL ~ 2 mL放入磷酸盐缓冲液（pH 5.5~6.5）中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:2~ 4放入乙醚中脱脂20 ~ 25 h，用冷冻离心机在3~5℃温度下以4000 ~ 5000 rpm离心10 ~ 15 min除去乙醚，收集固形物即得到脱脂金枪鱼碎肉。
作为优选，所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×106 U/g。
作为改进，所述步骤3）中的灭酶处理为：将金枪鱼碎肉蛋白酶解产物升温至90 ℃~ 100℃，并于此温度保持10 min~15min后，冷却至15 ℃~ 25 ℃，然后离心，得金枪鱼碎肉蛋白酶解液。
再改进，所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：
脱盐：将得到的金枪鱼碎肉蛋白酶解液制成浓度为15 mg/ mL ~ 20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度45~55%乙醇进行洗脱，得脱盐金枪鱼碎肉蛋白酶解液。脱盐酶解液于40 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；
超滤：将脱盐后的酶解物干粉溶于pH 5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和20 ~ 25 ℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用pH 5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.9~1.1 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用pH 5.5~6.5磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用pH 5.5~6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解液，将上述凝胶层析酶解液用pH 5.5~6.5磷酸盐缓冲液配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化肽Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1。
优选，所述大孔树脂为D101。
再优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Zorbax C18；柱温为25 ℃；流动相：A为含0.1%三氟乙酸的水，B为含0.1%三氟乙酸的乙腈；梯度洗脱：0-55 min乙腈浓度从0至50%，每5 min增加5%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
最后，所述金枪鱼碎肉为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）碎肉。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1对DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂进行应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明工艺科学合理，选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合大孔树脂脱盐、超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的抗氧化肽具有较高的活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。
附图说明
图1是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52纤维素层析图；
图2分离各组分的DPPH自由基清除活性图；
图3是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析图（A）和所分离各组分的DPPH自由基清除活性图（B）；
图4 是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（F43）的RP-HPLC分析图；
图5 是本发明的Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1的反相高效液相色谱（RP-HPLC）；
图6是本发明的Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1的高分辨质谱（HR-ESI-MS）图。
具体实施方式
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：参照图1至图6，一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼碎肉"脱脂"酶解"酶解物"大孔树脂脱盐"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗氧化肽。
1）将洗净除杂的金枪鱼碎肉按照固液比1 g:1 mL放入磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1: 3放入乙醚中脱脂24 h，用冷冻离心机在4℃下以5000 rpm离心15 min除去乙醚，收集固形物，即为脱脂金枪鱼碎肉；
2）将脱脂金枪鱼碎肉按固液比1 g:20mL加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH到6.0，得混合液；
3）将混合液温度升至60 ℃搅拌预热10 min，按照脱脂鱼肉质量的1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解温度为60 ℃，酶解时间2 h，得酶解产物；
4）将步骤3）所得的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：
①灭酶：酶解产物升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10 min~15min后，冷却至15 ℃~ 25 ℃，然后离心，得酶解液；
②脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15 mg/ mL ~ 20 mg/mL溶液，加入到D101大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用50%乙醇进行洗脱得洗脱液，洗脱液于40 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；
③超滤：将上述脱盐酶解物干粉溶于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）配成10 mg/mL的溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和20 ~ 25 ℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；
④阴离子交换层析：将上述超滤酶解液用磷酸盐缓冲液（pH 6.0）配成10 mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换酶解液（F4）（图1、2）；
⑤凝胶色谱层析：将所述离子交换酶解液（F4）用磷酸盐缓冲液（pH 6.0）配成10 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解液（F43）（图3）。
⑥高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解液用磷酸盐缓冲液（pH 6.0）配成50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（条件：进样量20 μg；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温为室温；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈（含0.1%三氟乙酸）；梯度洗脱：0-55 min乙腈浓度从0至50%，每5 min增加5%；洗脱速度1.0 ml/min；紫外检测波长280 nm），根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化肽（见图4）。
⑦结构检测：收集活性最高的1个抗氧化肽经检测为单一峰（见图5），利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1，HR-ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 539.2096 Da（见图6）。
将上述制得的金枪鱼碎肉醇溶蛋白抗氧化肽Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1进行DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明：Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1对DPPH 自由基 (EC50 1.21 mg/mL)、羟基自由基（EC50 0.11 mg/mL）、ABTS (EC50 0.13 mg/mL)和超氧阴离子自由基均具有良好的清除作用；同时，Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
SEQUENCE LISTING
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<120> 一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途
<130> 2012
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Thunnus sp.
<400> 1
Tyr Glu Asn Gly Gly
1 5
Claims (10)
1.一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于：所述的抗氧化肽的HR-ESI-MS检测的分子离子峰为m/z 539.2096 Da [M+H]+。
3.一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以脱脂金枪鱼碎肉作为原料，加入缓冲液调节pH到5.0 ~ 7.0，得混合液；
2）将混合液温度升至55 ℃ ~ 65 ℃搅拌预热，按照脱脂鱼肉质量的0.8 % ~ 1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解温度为55 ℃ ~ 65 ℃，酶解时间1 h ~ 3 h，得酶解产物；
3）将得到的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的脱脂金枪鱼碎肉的制备过程为：将洗净除杂的金枪鱼碎肉按照固液比1 g:1 mL ~ 2 mL放入缓冲液中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:2~ 4放入乙醚中脱脂20 ~ 25 h，用冷冻离心机在3~5℃温度下以4000 ~ 5000 rpm离心10 ~ 15 min除去乙醚，收集固形物即得到脱脂金枪鱼碎肉。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×106 U/g。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的灭酶处理为：将酶解产物升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10 min~15min后，冷却至15 ℃~ 25 ℃，然后离心，得酶解液。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：
脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15 mg/ mL ~ 20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度45~55%乙醇进行解析，40 ℃以下低压旋蒸除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；
超滤：将脱盐后的酶解物干粉溶于pH 5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和20 ~ 25 ℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用pH 5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将所述离子交换层析酶解液用pH 5.5~6.5磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解液，将上述凝胶层析酶解液用pH 6.0磷酸盐缓冲液配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进行纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为D101；所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Zorbax C18；柱温为25 ℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水，B含0.1%三氟乙酸的乙腈；梯度洗脱：0-55 min乙腈浓度从0至50%，每5 min增加5%；洗脱速度1.0 ml/min；紫外检测波长280 nm。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述金枪鱼碎肉为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）碎肉。
10.一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1对DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除的应用； Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1对脂质过氧化抑制的应用；Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly SEQ ID NO：1作为药品、保健食品和食品添加剂的应用。
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