CN105861396B - 海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白MD及其制备方法，涉及一种微生物来源的抗菌蛋白。芽孢杆菌培养后取上清，加入硫酸铵至饱和度为60％，离心，取沉淀物重新溶于水中，经透析、冻干、再溶解，得粗蛋白溶液，再在乙基氨基乙基阴离子交换色谱柱上分离纯化，收集各组分，离心超滤浓缩后，以金黄色葡萄球菌为受试指示菌跟踪活性组分；将浓缩后具有活性组分在季铵盐强阴离子交换柱上分离纯化，收集各洗脱组分，超滤浓缩并检验抑菌活性，确定活性成分后通过SDS‑PAGE电泳判断组分纯度；割取SDS‑PAGE电泳图上的单一条带，进行液相色谱‑质谱联用检测鉴定，并以全基因组编码蛋白序列为数据库进行比对，获得MD抗菌蛋白序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物来源的抗菌蛋白，尤其是涉及一种海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白MD及其制备方法。
背景技术
目前在全球范围内都面临着严重的食品安全问题，特别是食品污染菌及致病菌对食品安全的影响极大。食品污染菌主要有大肠杆菌、沙门氏菌、肉毒梭菌、李斯特菌、葡萄球菌等。无论在食品领域还是医药领域，对抗细菌药物的需要量都在不断地增长。然而，大量使用防腐剂、抗生素等来抑制食品中的细菌的方法对人类健康造成了巨大的负面影响，因此来源天然的抗菌物质已经引起了人们的广泛关注。其中抗细菌蛋白不仅来源广、具有独特的作用机制，而且基本不会使作用菌产生抗药性的优点为新型抗细菌活性物质的研究提供了重要信息。
芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，呈杆状并能产生芽孢，其芽孢具有很强的抗逆性，对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性，因此在自然界中芽孢杆菌分布非常广泛。另外芽孢杆菌属菌株普遍具有较发达的分泌系统，能产生多种次级代谢产物如脂肽、多肽、蛋白质(酶)、非蛋白类产物等，而且有些代谢产物具有广泛的抑菌谱，所以它们被广泛地应用于医药、农业等领域并取得了许多重要的成果([1]Wang T,Liang Y,Wu M,Chen Z,Lin J,Yang L.2015.Natural products from Bacillus subtiliswith antimicrobial properties.Chinese Journal of Chemical Engineering 23:744-754.)。
目前已发现的芽孢杆菌抗菌肽主要由两种途径合成：非核糖体合成及核糖体合成。非核糖体合成的抗菌肽主要有：伊枯草菌素、表面活性肽、Fengycin、Maltacines等；核糖体合成的抗菌肽有：枯草菌素、Ericin、Mersacidin、Sublancin等。枯草菌素是一种硫醚类抗菌肽，它由32个氨基酸组成五元环，分子量一般小于5kDa，其中它有60％的氨基酸序列与目前应用广泛的食品级抗生素Nisin一致。由枯草芽孢杆菌菌株B.subtilisA1/3产生的Ericin也是一种硫醚类抗菌肽。美杀菌素(Mersacidin)是由枯草芽孢杆菌菌株B.subtilisHILY-85发酵产生的，它是一种含有羊毛硫氨酸的抗菌肽，由20个氨基酸构成，分子量为1825Da([2]S.W.Fuchs,T.W.Jaskolla,S.Bochmann,P.T.Wichelhaus,M.Karas,T.Stein,K.D.Entian,Entianin,a novel subtilin-like lantibiotic fromBacillus subtilissubsp.spizizenii DSM 15029T with high antimicrobialactivity,Appl.Environ.Microbiol.77(5)(2011)1698–1707；[3]T.Stein,S.Borchert,B.Conrad,J.Feesche,B.Hofemeister,J.Hofemeister,K.D.Entian,Two differentlantibiotic-like peptides originate from the ericin gene cluster of Bacillussubtilis A1/3,J.Bacteriol.184(6)(2002)1703–1711；[4]M.S.Barrett,R.P.Wenzel,R.N.Jones,In vitro activity of mersacidin(M87-1551),an investigationalpeptide antibiotic tested against gram-positive bloodstream isolates,Diagn.Microbiol.Infect.Dis.15(7)(1992)641–644)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5。
本发明的目的之二在于提供一种海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD及其制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种液相色谱-质谱联用结合海洋芽孢杆菌MD-5(Bacillus sp.MD-5)基因组图谱鉴定MD抗菌蛋白的方法。
所述海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016211，中国典型培养物保藏中心的地址是中国，武汉，武汉大学。
所述海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5是从中国第六次北极科学考察获取的海洋沉积物样品中分离得到。将该菌株接种于L B培养基，在28℃、180rpm条件下培养48h。
海洋芽孢杆菌蛋白MD是从海洋芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5发酵液上清中分离纯化得到的一种抗菌蛋白，由93个氨基酸组成，序列如下：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
所述海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD的制备方法，包括以下步骤：
1)活化海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5并接种于L B培养基进行发酵培养后，收集发酵液上清；
在步骤1)中，所述L B培养基按质量百分比的组成为：每100mL液体培养基中含1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，其余为去离子水；
所述发酵培养的条件为28℃、180rpm，发酵培养时间为48h；所述收集发酵液上清可通过8,000rpm离心的方法将所得发酵液中的菌体去除后获得。
2)在步骤1)所收集到的发酵液上清中加入硫酸铵至60％的饱和度静置后得混合溶液；
在步骤2)中，所述静置的条件可于4℃下静置过夜。
3)将步骤2)所得混合溶液离心，收集的沉淀用水重新溶解，获得含盐的粗蛋白溶液；
在步骤3)中，所述离心的条件可将混合溶液于10,000rpm、4℃条件下离心30min。
4)将步骤3)所得含盐的粗蛋白溶液转移到透析袋中进行透析，除去多余的盐离子，待硫酸铵除干净后，收集除盐后的粗蛋白溶液；
在步骤4)中，所述透析可用ddH2O，在4℃条件下进行；检验硫酸铵是否透析干净用奈氏试剂。
5)将步骤4)所得除盐后的粗蛋白溶液冻干浓缩，去除水相，得到固体的粗蛋白，再用缓冲液将粗蛋白溶解，得重新溶解后的粗蛋白溶液；
在步骤5)中，所述粗蛋白溶液冻干，可先将除盐后的粗蛋白溶液转移到冷冻真空干燥机中于-80℃冻上再放入冻干机中冻干；所述缓冲液采用20mM Tris-HCl，pH 8.1。
6)将步骤5)所得重新溶解后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上进行第一步的分离纯化，洗脱程序为：0％B、3％B、10％B、100％B，根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂平板扩散法在指示菌板上检测各个组分的抑菌活性；
在步骤6)中，所述洗脱液B组成为:20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH 8.1；所述超滤浓缩的条件为4,100rpm、4℃；所述指示菌板为含金黄色葡萄球菌LB固体培养平板，具体步骤如下：指示菌培养基为LB培养基，以1：100接种金黄色葡萄球菌于37℃摇至OD600为1.0左右，用LB培养基稀释至OD600为0.5，以0.16μL/mL的浓度将稀释好金黄色葡萄球菌接入到琼脂浓度为0.75％灭过菌的LB培养基中，接入温度约为45～50℃为宜，充分混匀后倒板，凝固后用封口膜封口并置于4℃冰箱冷藏备用；所述琼脂平板扩散法检验抑菌活性的具体步骤如下：用灭过菌的打孔器(直径10mm)在混菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块，每孔加入50μL待检测的组分，并于超净台中吹干后置于37℃培养箱培养12h并观察是否有抑菌圈。
7)将步骤6)获得的具有抗真菌活性的组分继续在季铵盐(Capto Q)强阴离子交换色谱柱上进行第二步分离纯化，直线洗脱100mL至洗脱液B比例为13％，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂扩散法追踪各个组分的抑菌活性，同样以金黄色葡萄球菌为指示菌，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度。
8)将步骤7)获得的活性组分再一次用季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱进行分离，变换平衡缓冲液A和洗脱液B(A:50mM MES，pH 6；B:50mM MES+1M NaCl，pH 6)，直线洗脱50mL至洗脱液B比例为20％，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行离心超滤浓缩，利用琼脂扩散法检验各个组分的抑菌活性，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度。
9)将步骤8)获得的活性组分进行15％SDS-PAGE电泳，在10kDa以下得到单一条带，再用该组分进行小分子蛋白电泳，在4.6kDa附近得到单一条带，将该组分命名为MD抗菌蛋白。
所述海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD的鉴定包括以下步骤：
1)将小分子蛋白电泳凝胶上的单一条带切下，用无菌去离子水洗涤。
2)用液相色谱-质谱联用的方法进行检测。
3)以芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5全基因组编码蛋白序列为数据库，对检测结果进行数据比对；
在步骤3)中，比对到一条由93个氨基酸组成的多肽序列，其序列为：MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
本发明是从海洋芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5发酵液上清中分离纯化到一种抗菌蛋白MD，该抗菌蛋白对食品污染菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌有明显的抑制作用。该抗菌蛋白氨基酸序列新颖，是一种新的抗菌蛋白。经检测，MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为7.33μg/mL，而且在pH为10的条件下该蛋白仍具有抗菌活性，显示出其在食品保藏等方面具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为活性组分Q1再次使用季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱进行色谱分离的情况。在图1中，横坐标表示洗脱运行时间(min)，纵坐标表示紫外吸收值(mAU)；1，表示组分1；2表示活性组分2。
图2为组分2进行小分子蛋白胶电泳图谱。在图2中，泳道M为蛋白分子量标准，泳道1和2为活性组分2。
图3为Q1组分在季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱上分离后的各个组分对金黄色葡萄球菌的抑制效果。1表示组分1，2表示组分2。
图4为Q1组分在季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱上分离后的各个组分对单增李斯特菌的抑制效果。1表示组分1，2表示组分2，CK表示洗脱缓冲液的空白对照。
图5为微量稀释法检验最小抑菌浓度。通过二倍稀释法，用OD600检测敏感指示菌金黄色葡萄球菌的生长，判断MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度，拐点所对应的浓度7.33μg/mL即为其最小抑菌浓度。
图6为pH对MD抗菌蛋白抑菌活性的影响。所用指示菌混菌板为金黄色葡萄球菌，通过测量抑菌半径，以pH为x轴，以抑菌半径(mm)为y轴做柱状图。
图7为温度对MD抗菌蛋白抑菌活性的影响。所用指示菌混菌板为金黄色葡萄球菌，通过测量抑菌半径，以温度为x轴，以抑菌半径(mm)为y轴做柱状图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作详细说明。
1.菌种
本发明涉及菌株芽孢杆菌MD-5是从中国第六次北极科学考察获取的海洋沉积物样品中分离得到，它的发酵上清对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、苏云金芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌等具有明显抑制活性。
2.培养基
LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，及1％NaCl，用去离子水配制。
实施例1：活性吸附组分Q1使用季铵盐(Capto Q)强阴离子交换色谱柱再次进行色谱分离
平衡液A:50mM MES，pH 6，洗脱液B:50mM MES+1M NaCl，pH 6。先使用平衡缓冲液A平衡Capto Q阴离子交换色谱柱，将浓缩至700μL左右的吸附组分Q1在Capto Q阴离子交换色谱柱上样，使用两个柱体积的平衡缓冲液A冲洗层析柱，未获得非吸附组分，再采用直线洗脱方式洗50mL至洗脱液B为20％，将吸附组分1、2洗脱下来(图1)。
实施例2：活性组分2跑小分子蛋白胶
分离到的各活性组分2跑小分子蛋白电泳，硝酸银染色后在电泳染色图谱得到组分2为一条单一条带，并显示该蛋白的分子量约为4.6kDa(图2)，命名为MD抗菌蛋白。
实施例3：分离产物MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的抑制效果
采用琼脂平板扩散法检验抑菌活性具体步骤如下：用灭过菌的打孔器(直径10mm)在金黄色葡萄球菌及李斯特菌混菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块，每孔加入50μL分离组分2(MD抗菌蛋白)，并于超净台中吹干后置于37℃培养箱培养12h并观察是抑菌圈(图3、图4)。
实施例4：MD抗菌蛋白的鉴定及信号肽预测
对MD抗菌蛋白进行LC-MS鉴定，比对到一条由93个氨基酸组成的序列：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
实施例5：MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度的测定
最小抑菌浓度测定通过微孔稀释法在96孔板中测定，抗菌蛋白采用二倍梯度稀释法。用50mM MES缓冲液(pH＝6)进行梯度稀释。指示菌金黄色葡萄球菌用LB培养基摇培至OD600＝0.5，梯度稀释至105CFU/mL，分别取90μL该菌液于96孔板的2～10孔中，每孔加入10μL各个梯度稀释过的抑菌蛋白。第一孔加入90μL LB和10μL的MES作为阴性空白对照，第十二孔加90μL指示菌菌液和10μLMES缓冲液阳性空白对照，上述过程15min内做完，每株指示菌做三个平行。把96孔板置于37℃培养12～18h，取出后用灭过菌的枪头打匀，用酶标仪测定OD600。以抗菌蛋白浓度为横坐标，以OD600值为纵坐标做曲线，拐点为最小抑菌浓度。通过二倍稀释法，检测到MD抗菌蛋白金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为7.33μg/mL(图5)。
实施例6：pH对抗菌蛋白MD抗菌活性的影响
纯化出来的抗菌蛋白保存在50mM MES-NaOH缓冲液中(pH＝6)。取250μL的抗菌蛋白分别于灭过菌的2mL EP管中，分别加入pH为2(50mM甘氨酸-HCl缓冲液)、4(50mM NaAC-HAC)、6(50mM MES-NaOH)、7(50mM NaH2PO4-NaHPO4)、8(50mMTris-HCl)、9(50mM甘氨酸-NaOH)、10(50mM甘氨酸-NaOH)、11(50mM甘氨酸-NaOH-NaCl)的缓冲液各1.5mL，混匀后室温下作用4h，13,000rpm离心15min，把上清转到3kDa超滤管中，4,100rpm离心至每管250μL，以各个梯度缓冲液为对照用琼脂扩散法在金黄色葡萄球菌混菌板上检验抑菌效果，结果表明MD抗菌蛋白在pH 6～10基本保持稳定且活性好，pH为4和11时虽然有所降低但仍保持一定的活性(图6)。
实施例7：温度对抗菌蛋白MD抗菌活性的影响
将MD抗菌蛋白溶液于40℃、60℃、80℃、100℃条件下分别处理30min以及121℃高压灭菌条件下处理20min；处理后的MD抗菌蛋白溶液冷却后后离心，以未处理的MD蛋白溶液为阳性对照，检测各样品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性；结果表明MD抗菌蛋白受热处理程度的影响较大，当温度小于40℃活性蛋白的抑菌效果基本保持不变，当温度达到60℃抑菌性有略微的降低但仍不明显，当温度升高到80℃以上抑菌效果有明显的降低直至120℃完全失活，说明MD蛋白可耐受一定程度的高温条件(图7)。
Claims (8)
1.海洋芽孢杆菌（Bacillus sp. ）MD-5，已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016211。
2.海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于所述海洋芽孢杆菌蛋白MD是从如权利要求1所述的海洋芽孢杆菌（Bacillus sp. ）MD-5发酵液上清中分离纯化得到的一种抗菌蛋白，由93个氨基酸组成，序列如下：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY；
所述制备方法包括以下步骤：
1) 活化海洋芽孢杆菌（Bacillus sp. ）MD-5并接种于L B培养基进行发酵培养后，收集发酵液上清；
2) 在步骤1) 所收集到的发酵液上清中加入硫酸铵至60%的饱和度静置后得混合溶液；
3) 将步骤2) 所得混合溶液离心，收集的沉淀用水重新溶解，获得含盐的粗蛋白溶液；
4) 将步骤3) 所得含盐的粗蛋白溶液转移到透析袋中进行透析，除去多余的盐离子，待硫酸铵除干净后，收集除盐后的粗蛋白溶液；
5) 将步骤4) 所得除盐后的粗蛋白溶液冻干浓缩，去除水相，得到固体的粗蛋白，再用平衡缓冲液A将粗蛋白溶解，得重新溶解后的粗蛋白溶液；所述平衡缓冲液A采用20 mMTris- HCl，pH 8.1；
6) 将步骤5) 所得重新溶解后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上进行第一步的分离纯化，洗脱程序为：0% B、3% B、10% B、100% B，根据依次出现的280 nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂平板扩散法在指示菌板上检测各个组分的抑菌活性；所述洗脱液B组成为:20 mM Tris-HCl + 1 M NaCl，pH 8.1；
7) 将步骤6)获得的具有抗菌活性的组分继续在季铵盐强阴离子交换色谱柱上进行第二步分离纯化，直线洗脱100mL至洗脱液B比例为13%，同样根据依次出现的280 nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂扩散法追踪各个组分的抑菌活性，同样以金黄色葡萄球菌为指示菌，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度；
8) 将步骤7)获得的活性组分再一次用季铵盐强阴离子交换柱进行分离，变换平衡缓冲液A和洗脱液B，直线洗脱50 mL至洗脱液B比例为20%，同样根据依次出现的280 nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行离心超滤浓缩，利用琼脂扩散法检验各个组分的抑菌活性，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度；所述平衡缓冲液A的组成为50 mM MES，pH 6；所述洗脱液B的组成为50 mM MES+ 1 M NaCl，pH 6；
9) 将步骤8)获得的活性组分进行15 % SDS-PAGE电泳，在10 kDa以下得到单一条带，再用该组分进行小分子蛋白电泳，在4.6 kDa附近得到单一条带，将该组分命名为MD抗菌蛋白。
3.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤1) 中，所述LB培养基按质量百分比的组成为：每100 mL液体培养基中含1%氯化钠，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，其余为去离子水；
所述发酵培养的条件为28℃、180 rpm，发酵培养时间为48 h；所述收集发酵液上清通过8,000 rpm离心的方法将所得发酵液中的菌体去除后获得。
4.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤2) 中，所述静置的条件是于4℃下静置过夜；在步骤3) 中，所述离心的条件是将混合溶液于10,000rpm、4℃条件下离心30 min。
5.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤4) 中，所述透析是用ddH2O，在4℃条件下进行；检验硫酸铵是否透析干净用奈氏试剂。
6.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤5) 中，所述粗蛋白溶液冻干，是先将除盐后的粗蛋白溶液转移到冷冻真空干燥机中于-80℃冻上再放入冻干机中冻干。
7.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤6) 中，所述超滤浓缩的条件为4,100 rpm、4℃；所述指示菌板为含金黄色葡萄球菌LB固体培养平板，具体步骤如下：指示菌培养基为LB培养基，以1∶100接种金黄色葡萄球菌于37℃摇至OD600为1.0，用LB培养基稀释至OD600为0.5，以0.16 μL/mL 的浓度将稀释好金黄色葡萄球菌接入到琼脂浓度为0.75%灭过菌的LB培养基中，接入温度为45~50℃，混匀后倒板，凝固后用封口膜封口并置于4℃冰箱冷藏备用。
8.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤6) 中，所述琼脂平板扩散法检验抑菌活性的具体步骤如下：用灭过菌的打孔器在混菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块，每孔加入50 μL待检测的组分，并于超净台中吹干后置于37℃培养箱培养12 h并观察是否有抑菌圈。
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