CN105861396A - 海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 - Google Patents
海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105861396A CN105861396A CN201610421332.6A CN201610421332A CN105861396A CN 105861396 A CN105861396 A CN 105861396A CN 201610421332 A CN201610421332 A CN 201610421332A CN 105861396 A CN105861396 A CN 105861396A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- protein
- component
- crude protein
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title abstract description 6
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 26
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 12
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- -1 ethyl amino ethyl Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 51
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 47
- 241000006384 Jeotgalibacillus marinus Species 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 7
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 241000938169 Bacillus sp. MD-5 Species 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 claims description 3
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 238000012549 training Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 7
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 6
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- JSWKNDSDVHJUKY-CYGWNLPQSA-N mersacidin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]1[C@H](C)SC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@H](CC(C)C)NC1=O)C(=O)N[C@@H]1[C@H](C)SC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(N/C=C/S[C@@H](C)C(NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC1=O)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)[C@H](C)CC)NC(=O)[C@H]1[C@@H](SC[C@H](N)C(=O)N1)C)C1=CC=CC=C1 JSWKNDSDVHJUKY-CYGWNLPQSA-N 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108010067215 mersacidin Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 3
- NTIBMIIYTKPBNR-UHFFFAOYSA-N methoxymethyl 2-hydroxybenzoate Chemical compound COCOC(=O)C1=CC=CC=C1O NTIBMIIYTKPBNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical group C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000028706 ribosome biogenesis Effects 0.000 description 2
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M sodium;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- 235000019037 Bacillus subtilis subsp spizizenii Nutrition 0.000 description 1
- 241000381330 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N L-lanthionine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSC[C@H](N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 1
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010002015 fengycin Proteins 0.000 description 1
- CUOJDWBMJMRDHN-VIHUIGFUSA-N fengycin Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)OC2=CC=C(C=C2)C[C@@H](C(N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)[C@@H](CCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 CUOJDWBMJMRDHN-VIHUIGFUSA-N 0.000 description 1
- 238000009920 food preservation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N meso-lanthionine Natural products OC(=O)C(N)CSCC(N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 1
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白MD及其制备方法，涉及一种微生物来源的抗菌蛋白。芽孢杆菌培养后取上清，加入硫酸铵至饱和度为60％，离心，取沉淀物重新溶于水中，经透析、冻干、再溶解，得粗蛋白溶液，再在乙基氨基乙基阴离子交换色谱柱上分离纯化，收集各组分，离心超滤浓缩后，以金黄色葡萄球菌为受试指示菌跟踪活性组分；将浓缩后具有活性组分在季铵盐强阴离子交换柱上分离纯化，收集各洗脱组分，超滤浓缩并检验抑菌活性，确定活性成分后通过SDS‑PAGE电泳判断组分纯度；割取SDS‑PAGE电泳图上的单一条带，进行液相色谱‑质谱联用检测鉴定，并以全基因组编码蛋白序列为数据库进行比对，获得MD抗菌蛋白序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物来源的抗菌蛋白，尤其是涉及一种海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白MD及其制备方法。
背景技术
目前在全球范围内都面临着严重的食品安全问题，特别是食品污染菌及致病菌对食品安全的影响极大。食品污染菌主要有大肠杆菌、沙门氏菌、肉毒梭菌、李斯特菌、葡萄球菌等。无论在食品领域还是医药领域，对抗细菌药物的需要量都在不断地增长。然而，大量使用防腐剂、抗生素等来抑制食品中的细菌的方法对人类健康造成了巨大的负面影响，因此来源天然的抗菌物质已经引起了人们的广泛关注。其中抗细菌蛋白不仅来源广、具有独特的作用机制，而且基本不会使作用菌产生抗药性的优点为新型抗细菌活性物质的研究提供了重要信息。
芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，呈杆状并能产生芽孢，其芽孢具有很强的抗逆性，对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性，因此在自然界中芽孢杆菌分布非常广泛。另外芽孢杆菌属菌株普遍具有较发达的分泌系统，能产生多种次级代谢产物如脂肽、多肽、蛋白质(酶)、非蛋白类产物等，而且有些代谢产物具有广泛的抑菌谱，所以它们被广泛地应用于医药、农业等领域并取得了许多重要的成果([1]Wang T,Liang Y,Wu M,Chen Z,Lin J,Yang L.2015.Natural products from Bacillus subtilis withantimicrobial properties.Chinese Journal of Chemical Engineering 23:744-754.)。
目前已发现的芽孢杆菌抗菌肽主要由两种途径合成：非核糖体合成及核糖体合成。非核糖体合成的抗菌肽主要有：伊枯草菌素、表面活性肽、Fengycin、Maltacines等；核糖体合成的抗菌肽有：枯草菌素、Ericin、Mersacidin、Sublancin等。枯草菌素是一种硫醚类抗菌肽，它由32个氨基酸组成五元环，分子量一般小于5kDa，其中它有60％的氨基酸序列与目前应用广泛的食品级抗生素Nisin一致。由枯草芽孢杆菌菌株B.subtilisA1/3产生的Ericin也是一种硫醚类抗菌肽。美杀菌素(Mersacidin)是由枯草芽孢杆菌菌株B.subtilisHILY-85发酵产生的，它是一种含有羊毛硫氨酸的抗菌肽，由20个氨基酸构成，分子量为1825Da([2]S.W.Fuchs,T.W.Jaskolla,S.Bochmann,P.T.Wichelhaus,M.Karas,T.Stein,K.D.Entian,Entianin,a novelsubtilin-like lantibiotic from Bacillus subtilissubsp.spizizenii DSM 15029T with high antimicrobialactivity,Appl.Environ.Microbiol.77(5)(2011)1698–1707；[3]T.Stein,S.Borchert,B.Conrad,J.Feesche,B.Hofemeister,J.Hofemeister,K.D.Entian,Two different lantibiotic-like peptidesoriginate from the ericin gene cluster of Bacillus subtilis A1/3,J.Bacteriol.184(6)(2002)1703–1711；[4]M.S.Barrett,R.P.Wenzel,R.N.Jones,In vitro activity of mersacidin(M87-1551),an investigational peptide antibiotic tested against gram-positive bloodstream isolates,Diagn.Microbiol.Infect.Dis.15(7)(1992)641–644)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5。
本发明的目的之二在于提供一种海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD及其制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种液相色谱-质谱联用结合海洋芽孢杆菌MD-5(Bacillussp.MD-5)基因组图谱鉴定MD抗菌蛋白的方法。
所述海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016211，中国典型培养物保藏中心的地址是中国，武汉，武汉大学。
所述海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5是从中国第六次北极科学考察获取的海洋沉积物样品中分离得到。将该菌株接种于L B培养基，在28℃、180rpm条件下培养48h。
海洋芽孢杆菌蛋白MD是从海洋芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5发酵液上清中分离纯化得到的一种抗菌蛋白，由93个氨基酸组成，序列如下：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
所述海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD的制备方法，包括以下步骤：
1)活化海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5并接种于L B培养基进行发酵培养后，收集发酵液上清；
在步骤1)中，所述L B培养基按质量百分比的组成为：每100mL液体培养基中含1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，其余为去离子水；
所述发酵培养的条件为28℃、180rpm，发酵培养时间为48h；所述收集发酵液上清可通过8,000rpm离心的方法将所得发酵液中的菌体去除后获得。
2)在步骤1)所收集到的发酵液上清中加入硫酸铵至60％的饱和度静置后得混合溶液；
在步骤2)中，所述静置的条件可于4℃下静置过夜。
3)将步骤2)所得混合溶液离心，收集的沉淀用水重新溶解，获得含盐的粗蛋白溶液；
在步骤3)中，所述离心的条件可将混合溶液于10,000rpm、4℃条件下离心30min。
4)将步骤3)所得含盐的粗蛋白溶液转移到透析袋中进行透析，除去多余的盐离子，待硫酸铵除干净后，收集除盐后的粗蛋白溶液；
在步骤4)中，所述透析可用ddH2O，在4℃条件下进行；检验硫酸铵是否透析干净用奈氏试剂。
5)将步骤4)所得除盐后的粗蛋白溶液冻干浓缩，去除水相，得到固体的粗蛋白，再用缓冲液将粗蛋白溶解，得重新溶解后的粗蛋白溶液；
在步骤5)中，所述粗蛋白溶液冻干，可先将除盐后的粗蛋白溶液转移到冷冻真空干燥机中于-80℃冻上再放入冻干机中冻干；所述缓冲液采用20mM Tris-HCl，pH 8.1。
6)将步骤5)所得重新溶解后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上进行第一步的分离纯化，洗脱程序为：0％B、3％B、10％B、100％B，根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂平板扩散法在指示菌板上检测各个组分的抑菌活性；
在步骤6)中，所述洗脱液B组成为:20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH 8.1；所述超滤浓缩的条件为4,100rpm、4℃；所述指示菌板为含金黄色葡萄球菌LB固体培养平板，具体步骤如下：指示菌培养基为LB培养基，以1：100接种金黄色葡萄球菌于37℃摇至OD600为1.0左右，用LB培养基稀释至OD600为0.5，以0.16μL/mL的浓度将稀释好金黄色葡萄球菌接入到琼脂浓度为0.75％灭过菌的LB培养基中，接入温度约为45～50℃为宜，充分混匀后倒板，凝固后用封口膜封口并置于4℃冰箱冷藏备用；所述琼脂平板扩散法检验抑菌活性的具体步骤如下：用灭过菌的打孔器(直径10mm)在混菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块，每孔加入50μL待检测的组分，并于超净台中吹干后置于37℃培养箱培养12h并观察是否有抑菌圈。
7)将步骤6)获得的具有抗真菌活性的组分继续在季铵盐(Capto Q)强阴离子交换色谱柱上进行第二步分离纯化，直线洗脱100mL至洗脱液B比例为13％，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂扩散法追踪各个组分的抑菌活性，同样以金黄色葡萄球菌为指示菌，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度。
8)将步骤7)获得的活性组分再一次用季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱进行分离，变换平衡缓冲液A和洗脱液B(A:50mM MES，pH 6；B:50mM MES+1M NaCl，pH 6)，直线洗脱50mL至洗脱液B比例为20％，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行离心超滤浓缩，利用琼脂扩散法检验各个组分的抑菌活性，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度。
9)将步骤8)获得的活性组分进行15％SDS-PAGE电泳，在10kDa以下得到单一条带，再用该组分进行小分子蛋白电泳，在4.6kDa附近得到单一条带，将该组分命名为MD抗菌蛋白。
所述海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD的鉴定包括以下步骤：
1)将小分子蛋白电泳凝胶上的单一条带切下，用无菌去离子水洗涤。
2)用液相色谱-质谱联用的方法进行检测。
3)以芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5全基因组编码蛋白序列为数据库，对检测结果进行数据比对；
在步骤3)中，比对到一条由93个氨基酸组成的多肽序列，其序列为：MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
本发明是从海洋芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5发酵液上清中分离纯化到一种抗菌蛋白MD，该抗菌蛋白对食品污染菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌有明显的抑制作用。该抗菌蛋白氨基酸序列新颖，是一种新的抗菌蛋白。经检测，MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为7.33μg/mL，而且在pH为10的条件下该蛋白仍具有抗菌活性，显示出其在食品保藏等方面具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为活性组分Q1再次使用季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱进行色谱分离的情况。在图1中，横坐标表示洗脱运行时间(min)，纵坐标表示紫外吸收值(mAU)；1，表示组分1；2表示活性组分2。
图2为组分2进行小分子蛋白胶电泳图谱。在图2中，泳道M为蛋白分子量标准，泳道1和2为活性组分2。
图3为Q1组分在季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱上分离后的各个组分对金黄色葡萄球菌的抑制效果。1表示组分1，2表示组分2。
图4为Q1组分在季铵盐(Capto Q)强阴离子交换柱上分离后的各个组分对单增李斯特菌的抑制效果。1表示组分1，2表示组分2，CK表示洗脱缓冲液的空白对照。
图5为微量稀释法检验最小抑菌浓度。通过二倍稀释法，用OD600检测敏感指示菌金黄色葡萄球菌的生长，判断MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度，拐点所对应的浓度7.33μg/mL即为其最小抑菌浓度。
图6为pH对MD抗菌蛋白抑菌活性的影响。所用指示菌混菌板为金黄色葡萄球菌，通过测量抑菌半径，以pH为x轴，以抑菌半径(mm)为y轴做柱状图。
图7为温度对MD抗菌蛋白抑菌活性的影响。所用指示菌混菌板为金黄色葡萄球菌，通过测量抑菌半径，以温度为x轴，以抑菌半径(mm)为y轴做柱状图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作详细说明。
1.菌种
本发明涉及菌株芽孢杆菌MD-5是从中国第六次北极科学考察获取的海洋沉积物样品中分离得到，它的发酵上清对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、苏云金芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌等具有明显抑制活性。
2.培养基
LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，及1％NaCl，用去离子水配制。
实施例1：活性吸附组分Q1使用季铵盐(Capto Q)强阴离子交换色谱柱再次进行色谱分离
平衡液A:50mM MES，pH 6，洗脱液B:50mM MES+1M NaCl，pH 6。先使用平衡缓冲液A平衡Capto Q阴离子交换色谱柱，将浓缩至700μL左右的吸附组分Q1在Capto Q阴离子交换色谱柱上样，使用两个柱体积的平衡缓冲液A冲洗层析柱，未获得非吸附组分，再采用直线洗脱方式洗50mL至洗脱液B为20％，将吸附组分1、2洗脱下来(图1)。
实施例2：活性组分2跑小分子蛋白胶
分离到的各活性组分2跑小分子蛋白电泳，硝酸银染色后在电泳染色图谱得到组分2为一条单一条带，并显示该蛋白的分子量约为4.6kDa(图2)，命名为MD抗菌蛋白。
实施例3：分离产物MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的抑制效果
采用琼脂平板扩散法检验抑菌活性具体步骤如下：用灭过菌的打孔器(直径10mm)在金黄色葡萄球菌及李斯特菌混菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块，每孔加入50μL分离组分2(MD抗菌蛋白)，并于超净台中吹干后置于37℃培养箱培养12h并观察是抑菌圈(图3、图4)。
实施例4：MD抗菌蛋白的鉴定及信号肽预测
对MD抗菌蛋白进行LC-MS鉴定，比对到一条由93个氨基酸组成的序列：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
实施例5：MD抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度的测定
最小抑菌浓度测定通过微孔稀释法在96孔板中测定，抗菌蛋白采用二倍梯度稀释法。用50mM MES缓冲液(pH＝6)进行梯度稀释。指示菌金黄色葡萄球菌用LB培养基摇培至OD600＝0.5，梯度稀释至105CFU/mL，分别取90μL该菌液于96孔板的2～10孔中，每孔加入10μL各个梯度稀释过的抑菌蛋白。第一孔加入90μL LB和10μL的MES作为阴性空白对照，第十二孔加90μL指示菌菌液和10μLMES缓冲液阳性空白对照，上述过程15min内做完，每株指示菌做三个平行。把96孔板置于37℃培养12～18h，取出后用灭过菌的枪头打匀，用酶标仪测定OD600。以抗菌蛋白浓度为横坐标，以OD600值为纵坐标做曲线，拐点为最小抑菌浓度。通过二倍稀释法，检测到MD抗菌蛋白金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为7.33μg/mL(图5)。
实施例6：pH对抗菌蛋白MD抗菌活性的影响
纯化出来的抗菌蛋白保存在50mM MES-NaOH缓冲液中(pH＝6)。取250μL的抗菌蛋白分别于灭过菌的2mL EP管中，分别加入pH为2(50mM甘氨酸-HCl缓冲液)、4(50mMNaAC-HAC)、6(50mM MES-NaOH)、7(50mM NaH2PO4-NaHPO4)、8(50mMTris-HCl)、9(50mM甘氨酸-NaOH)、10(50mM甘氨酸-NaOH)、11(50mM甘氨酸-NaOH-NaCl)的缓冲液各1.5mL，混匀后室温下作用4h，13,000rpm离心15min，把上清转到3kDa超滤管中，4,100rpm离心至每管250μL，以各个梯度缓冲液为对照用琼脂扩散法在金黄色葡萄球菌混菌板上检验抑菌效果，结果表明MD抗菌蛋白在pH 6～10基本保持稳定且活性好，pH为4和11时虽然有所降低但仍保持一定的活性(图6)。
实施例7：温度对抗菌蛋白MD抗菌活性的影响
将MD抗菌蛋白溶液于40℃、60℃、80℃、100℃条件下分别处理30min以及121℃高压灭菌条件下处理20min；处理后的MD抗菌蛋白溶液冷却后后离心，以未处理的MD蛋白溶液为阳性对照，检测各样品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性；结果表明MD抗菌蛋白受热处理程度的影响较大，当温度小于40℃活性蛋白的抑菌效果基本保持不变，当温度达到60℃抑菌性有略微的降低但仍不明显，当温度升高到80℃以上抑菌效果有明显的降低直至120℃完全失活，说明MD蛋白可耐受一定程度的高温条件(图7)。
Claims (10)
1.海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5，已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016211。
2.海洋芽孢杆菌蛋白MD，其特征在于其是从海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5发酵液上清中分离纯化得到的一种抗菌蛋白，由93个氨基酸组成，序列如下：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
3.如权利要求2所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)活化海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.)MD-5并接种于L B培养基进行发酵培养后，收集发酵液上清；
2)在步骤1)所收集到的发酵液上清中加入硫酸铵至60％的饱和度静置后得混合溶液；
3)将步骤2)所得混合溶液离心，收集的沉淀用水重新溶解，获得含盐的粗蛋白溶液；
4)将步骤3)所得含盐的粗蛋白溶液转移到透析袋中进行透析，除去多余的盐离子，待硫酸铵除干净后，收集除盐后的粗蛋白溶液；
5)将步骤4)所得除盐后的粗蛋白溶液冻干浓缩，去除水相，得到固体的粗蛋白，再用缓冲液将粗蛋白溶解，得重新溶解后的粗蛋白溶液；
6)将步骤5)所得重新溶解后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上进行第一步的分离纯化，洗脱程序为：0％B、3％B、10％B、100％B，根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂平板扩散法在指示菌板上检测各个组分的抑菌活性；
7)将步骤6)获得的具有抗真菌活性的组分继续在季铵盐强阴离子交换色谱柱上进行第二步分离纯化，直线洗脱100mL至洗脱液B比例为13％，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，利用琼脂扩散法追踪各个组分的抑菌活性，同样以金黄色葡萄球菌为指示菌，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度；
8)将步骤7)获得的活性组分再一次用季铵盐强阴离子交换柱进行分离，变换平衡缓冲液A和洗脱液B，直线洗脱50mL至洗脱液B比例为20％，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行离心超滤浓缩，利用琼脂扩散法检验各个组分的抑菌活性，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度；所述平衡缓冲液A的组成为50mM MES，pH 6；所述洗脱液B的组成为50mM MES+1M NaCl，pH6；
9)将步骤8)获得的活性组分进行15％SDS-PAGE电泳，在10kDa以下得到单一条带，再用该组分进行小分子蛋白电泳，在4.6kDa附近得到单一条带，将该组分命名为MD抗菌蛋白。
4.如权利要求3所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述L B培养基按质量百分比的组成为：每100mL液体培养基中含1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，其余为去离子水；
所述发酵培养的条件为28℃、180rpm，发酵培养时间为48h；所述收集发酵液上清可通过8,000rpm离心的方法将所得发酵液中的菌体去除后获得。
5.如权利要求3所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述静置的条件是于4℃下静置过夜；在步骤3)中，所述离心的条件可将混合溶液于10,000rpm、4℃条件下离心30min。
6.如权利要求3所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述透析是用ddH2O，在4℃条件下进行；检验硫酸铵是否透析干净用奈氏试剂。
7.如权利要求3所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述粗蛋白溶液冻干，是先将除盐后的粗蛋白溶液转移到冷冻真空干燥机中于-80℃冻上再放入冻干机中冻干；所述缓冲液采用20mM Tris-HCl，pH 8.1。
8.如权利要求3所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述洗脱液B组成为:20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH 8.1；所述超滤浓缩的条件为4,100rpm、4℃；所述指示菌板为含金黄色葡萄球菌LB固体培养平板，具体步骤如下：指示菌培养基为LB培养基，以1∶100接种金黄色葡萄球菌于37℃摇至OD600为1.0左右，用LB培养基稀释至OD600为0.5，以0.16μL/mL的浓度将稀释好金黄色葡萄球菌接入到琼脂浓度为0.75％灭过菌的LB培养基中，接入温度约为45～50℃为宜，充分混匀后倒板，凝固后用封口膜封口并置于4℃冰箱冷藏备用。
9.如权利要求3所述海洋芽孢杆菌蛋白MD的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述琼脂平板扩散法检验抑菌活性的具体步骤如下：用灭过菌的打孔器在混菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块，每孔加入50μL待检测的组分，并于超净台中吹干后置于37℃培养箱培养12h并观察是否有抑菌圈。
10.如权利要求1所述海洋芽孢杆菌抗菌蛋白MD的鉴定，其特征在于包括以下步骤：
1)将小分子蛋白电泳凝胶上的单一条带切下，用无菌去离子水洗涤；
2)用液相色谱-质谱联用的方法进行检测；
3)以芽孢杆菌Bacillus sp.MD-5全基因组编码蛋白序列为数据库，对检测结果进行数据比对；比对到一条由93个氨基酸组成的多肽序列，其序列为：
MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKITKNNNGTWTAYYEGRKY。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610421332.6A CN105861396B (zh) | 2016-06-13 | 2016-06-13 | 海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610421332.6A CN105861396B (zh) | 2016-06-13 | 2016-06-13 | 海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105861396A true CN105861396A (zh) | 2016-08-17 |
| CN105861396B CN105861396B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=56649310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610421332.6A Active CN105861396B (zh) | 2016-06-13 | 2016-06-13 | 海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105861396B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107460145A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-12-12 | 淮海工学院 | 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01及其抗菌蛋白的分离方法及产品 |
| CN114350549A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-15 | 华南理工大学 | 一种多粘菌素a1生产菌株及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589673A (zh) * | 2013-12-02 | 2014-02-19 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 枯草芽孢杆菌a053及其在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用 |
-
2016
- 2016-06-13 CN CN201610421332.6A patent/CN105861396B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589673A (zh) * | 2013-12-02 | 2014-02-19 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 枯草芽孢杆菌a053及其在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GUO,W., CHEN,Z., CUI,P. AND CHEN,X.: "hypothetical protein SC22_12580 [Bacillus sp. A053]", 《GENBANK: KIH39495.1》 * |
| YAPING WU等: "Isolation and identification of a novel LCI like antibacterial protein from Bacillus sp. MD-5 reveals its potential application in controlling Staphylococcus aureus in food industry", 《FOOD CONTROL》 * |
| 汪世龙编: "《蛋白质化学》", 31 August 2012, 同济大学出版社 * |
| 苗聪秀主编: "《医学细胞生物学》", 30 April 2015, 第二军医大学出版社 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107460145A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-12-12 | 淮海工学院 | 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01及其抗菌蛋白的分离方法及产品 |
| CN107460145B (zh) * | 2017-08-21 | 2020-10-27 | 淮海工学院 | 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01及其抗菌蛋白的分离方法及产品 |
| CN114350549A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-15 | 华南理工大学 | 一种多粘菌素a1生产菌株及其应用 |
| CN114350549B (zh) * | 2021-12-23 | 2023-08-18 | 华南理工大学 | 一种多粘菌素a1生产菌株及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105861396B (zh) | 2023-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zheng et al. | Isolation, partial purification and characterization of a bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus subtilis strain | |
| Wang et al. | Isolation and characterization of an antifungal protein from Bacillus licheniformis HS10 | |
| CN112760253B (zh) | 一种植物乳杆菌、抗菌肽及其应用 | |
| Serkedjieva et al. | Antiinfluenza virus activity of a bacteriocin produced by Lactobacillus delbrueckii | |
| CN102071162A (zh) | 枯草芽孢杆菌lfb112、其产生的细菌素及应用 | |
| CN103695508A (zh) | 金黄色葡萄球菌hi重组蛋白的发酵和纯化工艺 | |
| Lind et al. | Purification of alpha-toxin from Staphylococcus aureus and application to cell permeabilization | |
| CN107460145B (zh) | 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01及其抗菌蛋白的分离方法及产品 | |
| Zhao et al. | Purification, characterization and antibacterial mechanism of bacteriocin from Lactobacillus acidophilus XH1 | |
| CN106701610A (zh) | 一种多粘类芽孢杆菌及其培养方法和应用 | |
| Srinivasan et al. | Purification and characterization of a bacteriocin from Lactobacillus rhamnosus L34 | |
| CN109627299A (zh) | 一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用 | |
| US20230348531A1 (en) | Isolation and purification of bacteriocin produced by lactobacillus sakei and antibacterial use thereof and lactic acid bacteria used | |
| CN105861396A (zh) | 海洋来源芽孢杆菌抗菌蛋白md及其制备方法 | |
| CN104650208B (zh) | 一种鸡源抗菌肽的衍生肽及其制备方法和应用 | |
| CN104017050B (zh) | 一种虫草抗菌肽及其制备方法 | |
| CN103103196A (zh) | 一种修饰的山羊防御素基因及制备方法和应用 | |
| Cho et al. | Purification of a pore-forming peptide toxin, tolaasin, produced by Pseudomonas tolaasii 6264 | |
| CN110746488A (zh) | 一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素pe-zyb1及其应用 | |
| CN103772490A (zh) | 一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN103772494A (zh) | 一种丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| Otto et al. | Utilization of haem from the haptoglobin-haemoglobin complex by Bacteroides fragilis | |
| Möllby et al. | Separation of gamma hemolysin from Staphylococcus aureus Smith 5R | |
| Surovtsev et al. | Purification of bacteriocins by chromatographic methods | |
| Zhu et al. | A novel antimicrobial protein of the endophytic Bacillus amyloliquefaciens and its control effect against Fusarium chlamydosporum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 361005 Fujian Province University of Siming District of Xiamen City Road No. 178 Applicant after: THIRD INSTITUTE OF OCEANOGRAPHY, MINISTRY OF NATURAL RESOURCES Address before: 361005 Fujian Province University of Siming District of Xiamen City Road No. 178 Applicant before: THIRD INSTITUTE OF OCEANOGRAPHY, STATE OCEANIC ADMINISTRATION |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231212 Address after: 272300 Jinwei Road South, Fukang Avenue East, and Shengfa Road North in Zhanghuang Chemical Industry Park, Yutai County, Jining City, Shandong Province (self declared) Patentee after: Shandong Tu Da Chu fertilizer Co.,Ltd. Address before: 361005 Fujian Province University of Siming District of Xiamen City Road No. 178 Patentee before: THIRD INSTITUTE OF OCEANOGRAPHY, MINISTRY OF NATURAL RESOURCES |