CN105203529A - 幽门螺杆菌感染诊断用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有基于醋酸盐的培养缓冲液、尿素以及指示剂的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒以及利用所述试剂盒以提供用于判断是否感染幽门螺杆菌的信息的方法。当利用本发明的试剂盒时，能够以与现有试剂盒水平相比更高的灵敏度和特异性来检测存在于检体中的幽门螺杆菌，因此能够广泛应用于由幽门螺杆菌引起的疾病的早期诊断中。

Description

幽门螺杆菌感染诊断用试剂盒

技术领域

本发明涉及幽门螺杆菌(H.pylori)诊断用试剂盒，更具体地，涉及含有基于醋酸盐的培养缓冲液、尿素和指示剂的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒以及利用所述试剂盒以提供用于判断是否感染幽门螺杆菌的信息的方法。

背景技术

幽门螺杆菌(H.pylori：Helicobacterpylori)是全球约50％以上人口被感染且因与胃癌的相关性而受关注的微生物。临床上发现于胃肠疾病患者的胃中，被认为与胃肠疾病的相关性很大。胃病、十二指肠溃疡并非是临床分类中简单的消化器官疾病，而是由幽门螺杆菌引起的感染性疾病，因此其临床意义重大。所述幽门螺杆菌为弯曲形革兰氏阴性，长约3.5μm，宽约0.5-1.0μm，具有一端带鞘(sheath)的四至六个单极鞭毛，鞭毛根部具有膨胀部，其为微需氧性(microaerophilic)，呈过氧化氢酶(catalase)阴性。不同于其他细菌，其特点为，含有脲酶(urease)，因此，分解胃里的尿素而产生氨。最适宜的氧分压为2-8％，只有在37℃的10％的二氧化碳的条件下培养三至五天以上，才能观察到小菌落。此外，在大气环境中，在室温条件下6小时以内全部死亡，因此很难培养，从而难以用传统的细菌学方法进行研究。此外，幽门螺杆菌是基因多样性的细菌。当用HindIII酶切(限制性内切酶分析(REA：restriction-enzymeanalysis))时，在幽门螺杆菌分离菌株之间，无法观察到相同的REA现象。据说，即使用NotI酶切DNA后通过脉冲场凝胶电泳分析法(pulse-fieldgelelectrophoresis)进行分析，带(band)型相同的菌株也很罕见。两个以不同方法培养的菌体的基因碱基序列，在1500个基因中只有约60％具有预期的功能，约20％具有不被认知的同质基因，而剩余的则不具有目前已确定的相同基因。如此，在幽门螺杆菌菌株之间，基因组的基因序列不同现象，说明幽门螺杆菌是超越目前细菌菌种概念的多样性物种。这种基因多样性和菌株培养的难度，成为在幽门螺杆菌的菌分离鉴定中灵敏度低的原因，而幽门螺杆菌的上述菌株现象，促使提高鉴定幽门螺杆菌的基因水平的必要性。此外，在临床上，还存在很多待解决的有关幽门螺杆菌传染性异议的问题。与西方国家不同，我国患有胃肠疾病的人很多，正常人群中的带菌率为60％至70％，胃炎患者中的带菌率为64％至95％，胃溃疡患者中的带菌率为75％至96％，十二指肠溃疡患者中的带菌率为79％至90％，胃癌患者中的带菌率为40％至60％。目前还不清楚整体呈现较高带菌率但引起胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等分别不同疾病的原因。在这种背景下，根据临床检体，也有可能提出幽门螺杆菌的遗传变异是否是其原因等疑问。

就我国而言，成人中约80％感染了幽门螺杆菌，世界卫生组织(WorldHealthOrganization，以下称WHO)将幽门螺杆菌分类为第I类致癌因子，其与疾病的关系非常密切，但实际很难将其在胃里完全地杀灭。此外，专家认为，由于幽门螺杆菌的菌株之间的变异非常复杂，近期很难期待幽门螺杆菌疫苗。在这种情况下，为了最大限度地提高治疗效果，迫切需要更加准确、快速诊断幽门螺杆菌的方法以及根据该诊断方法尽快治疗。

目前已知的幽门螺杆菌感染诊断方法分为侵入性诊断方法和非侵入性诊断方法，侵入性诊断方法是指使用内视镜采集组织进行检查的方法，非侵入性诊断方法是指不使用内视镜的方法。所述侵入性诊断方法有组织病理诊断法、快速尿素酶试验法(RapidUreaseTest)等，非侵入性诊断方法有血清学诊断法、尿素呼气试验法(UBT：UreaseBreathTest)等。特别是，快速尿素酶试验法是通过检测由幽门螺杆菌大量分泌的脲酶(urease)的活性以诊断是否感染断幽门螺杆菌的方法。这种快速尿素酶试验法能够直接确认是否感染断幽门螺杆菌，其诊断的准确率高，因此正在积极地研究用于有效地实施这种诊断的装置以及方法。

例如，美国专利第4748113号公开了含有脲、抗菌剂、指示剂以及反应水的胃肠疾病诊断用组合物。韩国特许公开第2000-0033013号公开了含有反应缓冲液、尿素以及指示剂的幽门螺杆菌诊断用脲酶反应检测试剂盒。但是，美国专利第4748113号的技术，其被杂菌污染的可能性高，而且只能检测检体中含有的脲酶活性，并且容易变性。韩国特许公开第2000-0033013号的技术，其不易操作液状反应缓冲液，而且由于尿素浓度低，因此显色反应缓慢。

在这种背景下，发明人以提供能够最大限度地降低杂菌污染且容易操作的幽门螺杆菌感染诊断用试剂盒为目的进行研究结果发现，当使用含有基于醋酸盐的缓冲液、适当浓度的尿素以及具有能够确认是否感染幽门螺杆菌的变色范围的指示剂的固体状脲酶反应试剂盒时，具有高特异性和高灵敏度，从而能够诊断是否感染幽门螺杆菌，由此完成了本发明。

发明内容

本发明的一目的在于，提供一种固体状的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒。

本发明的另一目的在于，提供一种通过使用所述试剂盒以提供判断是否感染幽门螺杆菌的信息的方法。

作为用于实现上述目的的一实施方式，本发明提供一种幽门螺杆菌(H.pylori)感染诊断用脲酶反应试剂盒，其含有培养缓冲液、尿素以及可检测pH4.5-6.0范围内的pH变化的指示剂。

本发明中的术语“培养缓冲液(culturebuffermedia)”是指，能够最佳地显示出由幽门螺杆菌分泌产生的脲酶活性，且能够提供最适合增值幽门螺杆菌的环境的缓冲液。用于检测检体中含有的幽门螺杆菌的现有的试剂盒，存在灵敏度低的缺点，这是由于，当检体中含有微量的幽门螺杆菌时，所述幽门螺杆菌分泌产生的脲酶的量也非常少，从而无法准确地检测脲酶活性。为了克服这种现有试剂盒的缺点，发明人通过营造能够使幽门螺杆菌增殖的环境，使检体中含有的幽门螺杆菌增殖，从而增加由此分泌产生的脲酶量，同时，为了便于诊断，营造出能够最佳地显示脲酶活性的环境。发明人对能够营造出满足上述两种条件的环境的缓冲液进行研究结果发现，当使用基于醋酸盐的缓冲液时，能够有效地使幽门螺杆菌增殖的同时，能够最佳地显示出脲酶活性。此时，所述基于醋酸盐的缓冲液的缓冲pH范围，只要能够营造出幽门螺杆菌的增殖环境且营造出能够显示脲酶活性的环境，则并非限定于此，但是优选能够有效地使幽门螺杆菌增殖的pH2.5至3.0的范围内显示缓冲效果的缓冲液。在所述pH范围内，幽门螺杆菌能够有效地增殖，且能够显示出脲酶的最佳活性，除此之外，能够抑制其他杂菌生长。

本发明中的术语“尿素(urea)”是指，化学式为CO(NH₂)₂的无色结晶物质，其分子量为60.047，熔点为132.7℃(1atm)，比重为1.335，是所有哺乳动物和部分鱼类的蛋白质代谢最终分解产物，即有机化合物。一般，在体内蛋白质分解产生氨，由于所述氨具有较强的毒性，长期滞留在体内则产生不利影响，因此肝通过鸟氨酸循环，将氨转化为具有弱毒性的尿素，并将其暂时储存在排泄器官之后排出至体外。在本发明中，所述尿素作为用于检测由幽门螺杆菌分泌产生的脲酶活性的基质使用，其以溶解于所述培养缓冲液中的状态含在本发明的反应试剂盒中。当所述培养缓冲液中含有的尿素浓度过低时，无法正确反映脲酶活性，而浓度过高时，由于尿素在所述培养缓冲液中以结晶状态析出，其结果无法正确反映脲酶活性，因此，确定最佳浓度的结果，优选所述培养缓冲液含有0.5g/dl至0.8g/dl浓度范围的尿素。

本发明中的术语“指示剂(indicator)”是指，在化学反应中用于判断一定状态的试剂，在本发明中，所述指示剂可以为酸碱指示剂(acid-baseindicator)，其用于检测由幽门螺杆菌分泌产生的脲酶分解尿素而产生的氨引起的pH变化。通常认为，幽门螺杆菌能够在强酸性环境的胃肠中生存并增殖的原因是，幽门螺杆菌分泌产生的脲酶将存在于宿主体内的尿素分解成氨，从而将强酸性环境变成弱酸性环境。因此，在强酸性环境下培养疑似感染幽门螺杆菌的检体，并检测所述环境的pH是否从强酸性变成弱酸性，由此能够确定所述检体是否被感染幽门螺杆菌。为了检测这种pH变化，所述培养缓冲液中可以含有指示剂。此时，只要能够检测到由幽门螺杆菌分泌产生的脲酶活性而生成的氨所引起的pH值变化，所述指示剂并不限定于此，但是优选使用可检测从强酸性环境变成弱酸性环境的pH4.5-6.0范围内变化的酸碱指示剂，更优选使用甲基红、氯酚红、2,5-二硝基苯酚、溴甲酚绿等，最优选使用氯酚红。

本发明中的术语“脲酶(urease)”是指，通过分解尿素产生二氧化碳和氨的酶，即酰胺酶(amidase)的一种(图1)。图1是表示由幽门螺杆菌分泌产生的脲酶的反应活性的反应式。所述脲酶发现于各种细菌、酵母、霉菌植物、低等动物等中，作为典型，存在于刀豆中的脲酶具有483kDa的分子量。工业生产的各种酿造物中含有微量尿素，当将所述尿素与酒精一起加热时产生氨基甲酸乙酯，考虑到对食品卫生不利，因此以不生成这种副产物的方式去除尿素为目的使用。所述脲酶在本发明中作为用于确认分泌产生该脲酶的幽门螺杆菌是否存在于目标检体中的标记使用。

另一方面，为了便于操作试剂盒，也可以包括含有琼脂糖的固体状反应培养基，此时，所述琼脂糖的含量并不限定，但是优选其含量在1g/dl至3g/dl的浓度范围内。

根据本发明的一实施例，确认幽门螺杆菌与大肠杆菌不同，虽然能够在强酸性环境以及中性环境下生长，但是无法在碱性环境下生长(表1)，确认作为酸碱指示剂的一种的氯酚红在pH4.5-6.0的范围内变色(图2)，确认能够更有效地进行显示脲酶反应结果的所述指示剂变色的尿素浓度范围为0.5-0.75g/dl(图3)，所述尿素作为所述酶的基质使用，基于这些结果，制备了含有0.054g/dl的醋酸盐、0.298g/dl的氯化钾(KCI)、0.0250g/dl的氯酚红、1.20g/dl的尿素以及1.80g/dl的琼脂糖的固体状幽门螺杆菌检测用试剂盒(图4)。

作为用于实现上述目的的另一实施方式，本发明提供一种提供用于判断是否感染幽门螺杆菌的信息的方法，包括如下步骤：步骤(a)，在所述试剂盒中加入目标检体后培养，以获得培养物；以及步骤(b)，确认所述培养物的色变情况，当发现色变时，判断所述检体中存在幽门螺杆菌。

根据本发明的另一实施例，对以上述方式制备的固体状幽门螺杆菌检测用试剂盒的幽门螺杆菌检测效果进行验证的结果，确认到以下现象：显示出与常用的试剂盒相同水平的灵敏度(表2)，显示出并不检测除幽门螺杆菌以外的脲酶分泌菌株的特异性(表3)，当使用临床检体时，显示出与常用的现有幽门螺杆菌检测用试剂盒相比相对较高的灵敏度和特异性(表4)。此外，确认到当利用本发明的培养缓冲液来冷冻保存检体时，即使解冻，所述检体的活性也不会降低，从而能够有效地检测检体内存在的幽门螺杆菌(表5)。

当利用本发明的试剂盒时，能够以与现有的试剂盒相比高水平的灵敏度和特异性来检测存在于检体中的幽门螺杆菌，因此能够广泛应用于由幽门螺杆菌引起的疾病的早期诊断中。

附图说明

图1是表示由幽门螺杆菌分泌产生的脲酶的反应活性的反应式。

图2是表示根据pH变化而发生的氯酚红指示剂变色程度的照片。

图3是表示根据在含有相互不同浓度尿素的反应液中通过脲酶作用所生成的氨的浓度变化而发生的氯酚红指示剂变色程度的照片。

图4是表示本发明提供的幽门螺杆菌检测用试剂盒的一实施方式的照片。

具体实施方式

以下，通过本发明的实施例进行详细说明。但是这些实施例用于例示说明本发明，本发明的范围并不限定于这此实施例。

实施例1：在酸性反应液中抑制杂菌生长

分别在pH为2.5、6.0、7.2、8.0以及10.0的培养缓冲液(含有0.65g/dl的尿素以及0.9g/dl的琼脂糖凝胶)中分别接种了大肠杆菌BL21(DE3)和幽门螺杆菌，在37℃的条件下培养24小时，之后检测吸光度(OD600)，以比较每个菌株的生长程度(表1)。

【表1】

不同pH条件下的细菌生长程度

如上述表1所示，大肠杆菌BL21(DE3)在极端的pH条件(2.5以及10)下几乎无法生长，而在接近中性pH条件(6.0、7.2以及8.0)下生长，与此相反，幽门螺杆菌在除pH为10的条件之外，在其他所有条件下都能够生长。

由上述结果可知，与大肠杆菌的不同点在于，幽门螺杆菌在低pH条件下也可以生长。

实施例2：确定使氯酚红指示剂变色的pH条件

在pH为1.5、3.0、4.5、6.0、7.5以及9.0的培养缓冲液中添加氯酚红指示剂，比较变色程度(图2)。图2是表示根据pH变化而发生的氯酚红指示剂变色程度的照片。如图2所示，能够确认，在pH4.5-6.0的范围内，氯酚红指示剂的颜色明显地从黄色变成红色。

实施例3：对指示剂变色有效的尿素浓度

在含有0g/dl、0.25g/dl、0.5g/dl、0.75g/dl、1.0g/dl以及1.5g/dl的尿素的培养缓冲液中添加脲酶和氯酚红指示剂，比较变色程度(图3)。图3是表示根据在含有相互不同浓度尿素的反应液中通过脲酶作用所生成的氨的浓度变化而发生的氯酚红指示剂变色程度的照片。如图3所示，能够确认，在0.5g/dl-0.75g/dl范围内，氯酚红指示剂的颜色明显地从黄色变成红色。

实施例4：制备固体状幽门螺杆菌检测用试剂盒

首先，使0.054g/dl的醋酸盐和0.298g/dl的氯化钾(KCI)溶解在1L的蒸馏水中，滴定至pH2.5之后，在其中添加氯酚红以及尿素进行溶解，使最终浓度分别为0.0250g/dl以及1.20g/dl，用过滤器进行过滤，获得2X反应液。

之后，将1.80g/dl浓度的琼脂糖(agarose)溶解于蒸馏水中，进行高压蒸气灭菌(autoclave)后，冷却至45℃，以1：1(v/v)的比例添加所述获得的2X反应液并混合，以制得最终反应液。

在圆周长为28.26mm、总容积为211.56m³的透明塑料材质的孔中各注入0.18ml的所述最终反应液，并在常温下进行固化。固化后，利用聚丙烯材质贴片密封孔部分，以制备幽门螺杆菌检测用试剂盒(图4)。图4是表示本发明提供的幽门螺杆菌检测用试剂盒的一实施方式的照片，图4的a是表示检测含有幽门螺杆菌的阳性检体而显示紫红色或红色的照片，图4的b是表示检测不含有幽门螺杆菌的阴性检体而显示黄色的照片。

因此，当使用本发明的试剂盒时，可以通过颜色变化来容易地判断是否感染幽门螺杆菌。

实施例5：固体状幽门螺杆菌检测用试剂盒的检测能力评价

实施例5-1：灵敏度评价

以0.005U/ml至33.6U/ml的浓度依次稀释来自植物的脲酶，分别获得不同的阳性标准检体，将其添加在实施例4中制得的幽门螺杆菌检测用试剂盒中，对其结果进行比较(表2)。此时，对照群采用了作为常用的幽门螺杆菌检测用试剂盒的CLOTest(Kimberly-Clark公司、美国)。

【表2】

幽门螺杆菌检测用试剂盒的灵敏度评价

+：阳性

-：阴性

如上述表2所示，本发明的幽门螺杆菌检测用试剂盒能够检测出0.01U/ml的脲酶活性，显示出非常高的灵敏度，由此确认其具有与常用试剂盒相同水平的灵敏度。

实施例5-2：特异性评价

欲确认在所述实施例4中制得的幽门螺杆菌检测用试剂盒，在已知的分泌脲酶的各种微生物中，是否能够检测除幽门螺杆菌以外的其他菌株。为此，将分泌幽门螺杆菌以外的脲酶的菌株，即绿脓杆菌(Pseudomonasaeroginosa(ATCC27853))、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis(ATCC12463))、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis(ATCC29212))、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes(ATCC19615)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium(ATCC14028))、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri(ATCC12022))、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae(ATCC6305))、大肠杆菌(Escherichiacoli(ATCC25922))以及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)加入到在实施例4中制得的幽门螺杆菌检测用试剂盒中，对其结果进行了评价。

【表3】

幽门螺杆菌检测用试剂盒的特异性评价

-：阴性

如上述表3所示，确认本发明提供的幽门螺杆菌检测用试剂盒显示出并不检测除幽门螺杆菌以外的脲酶分泌菌株的特异性。

实施例5-3：对临床检体的效果评价

在前来位于仁川广域市的仁荷大学医院附属中心的健康促进中心的人员当中，随意选取了接受内视镜检查的对象332例。与性别以及年龄无关地，采集了活检，并利用作为常用的现有幽门螺杆菌检测用试剂盒、即CLOTest(Kimberly-Clark公司、美国)和在实施例4中制得的幽门螺杆菌检测用试剂盒以及活检测试(BiopsyTest)来测量幽门螺杆菌检测结果，并进行比较(表4)。

【表4】

对临床检体的幽门螺杆菌检测用试剂盒的效果评价

如上表4所示，与作为标准诊断法的活检测试(内视镜检查)相比，本发明提供的试剂盒对阳性检体的灵敏度为96.0％(218/227)，对阴性检体的特异性为97.1％(102/105)。由此能够确认，相对于常用的现有幽门螺杆菌检测用试剂盒的灵敏度(91％)以及特异性(96％)，其灵敏度以及特异性的水平更高。得到这种结果的原因是，相对于只单一检测脲酶的常用的现有幽门螺杆菌检测用试剂盒，本发明的试剂盒能够同时进行幽门螺杆菌的增殖以及脲酶的检测。

实施例5-4：对于冷冻保存的培养缓冲液的效果

首先，将从所述实施例5-3中获得的332例样品用于所述实施例4中制得的固体状幽门螺杆菌检测用试剂盒后，筛选了在120分钟以内显示结果的11个检体(检体编号：BP5、12、23、25、36、37、51、73、103、116以及121)。

然后，使0.054g/dl的醋酸盐和0.298g/dl的氯化钾(KCI)溶解在1L的蒸馏水中，滴定至pH2.5制备培养缓冲液，将所述被筛选的11个检体加入到培养缓冲液中，之后冷冻保存了三天。

之后，解冻所述冷冻保存的样品，将其接种于布鲁氏菌选择性抗生素培养基(含有10％的牛血清、10μg/ml的万古霉素、25μg/ml的萘啶酸以及5μg/ml的两性霉素B的布鲁氏菌培养基(Brucellabroth))中，在37℃且浓度为10％的二氧化碳条件下培养五天。之后，采用在所述实施例5-3中使用的CLOtest(Kimberly-Clark公司、美国)和在实施例4中制得的幽门螺杆菌检测用试剂盒来培养所述培养物，检测600nm波长的吸光度，以比较在每个试剂盒中培养的菌体的增殖水平(表5)。

【表5】

在每个试剂盒中培养的幽门螺杆菌的水平(600nm的吸光度)

如上述表5所示，在所述11检体中，用本发明的试剂盒进行培养时，除两个检体(BP5以及25)之外，其他增值的菌体数量均相对增加。

所述结果表明，当使用含在本发明的试剂盒中的培养缓冲液时，即使将检体冷冻保存后解冻，所述检体的活性也不会降低，从而能够有效地检测存在于检体内的幽门螺杆菌。

Claims (7)

1.一种幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒，

其含有培养缓冲液、尿素以及可检测pH4.5-6.0范围内的pH变化的指示剂。

2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒，

所述培养缓冲液是在pH2.5至3.0的范围内显示缓冲效果的基于醋酸盐的缓冲液。

3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒，

所述尿素的浓度为0.5g/dl至0.8g/dl。

4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒，

所述指示剂是可检测pH4.5至6.0范围内的变化的酸碱指示剂。

5.根据权利要求4所述的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒，

所述酸碱指示剂选自由甲基红、氯酚红、2,5-二硝基苯酚以及溴甲酚绿所组成的组中。

6.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌感染诊断用脲酶反应试剂盒，

进一步含有1g/dl至3g/dl的琼脂糖。

7.一种提供用于判断是否感染幽门螺杆菌的信息的方法，其包括如下步骤：

步骤(a)，在权利要求1至6中任一项所述的脲酶反应试剂盒中加入目标检体后培养，以获得培养物；以及

步骤(b)，确认所述培养物的色变情况，当色变时，判断为所述检体中存在幽门螺杆菌。