ES2250516T3 - Procedimiento de identificacion de listeria monocytogenes y medio de cultivo. - Google Patents
Procedimiento de identificacion de listeria monocytogenes y medio de cultivo.Info
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Abstract
Uso de un sustrato para la identificación directa de bacterias patógenas Listeria monocytogenes, caracterizado porque el sustrato está escindido por una actividad esterasa, diferente de la actividad fosfolipasa C, específica del fosfatidilinositol (PI-PLC), actividad esterasa que es específica de Listeria monocytogenes y que comprende una parte diana constituida por un ácido graso que tiene una cadena carbonada de longitud comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono.
Description
Procedimiento de identificación de Listeria
monocytogenes y medio de cultivo.
La presente invención se refiere a un sustrato
cromógeno que permite la identificación directa de bacterias
patógenas del género Listeria, y más concretamente de la
especie Listeria monocytogenes.
La invención se refiere igualmente a la
asociación de dos sustratos, uno sensiblemente específico de la
especie Listeria monocytogenes y el otro específico o no del
género Listeria. Se refiere igualmente a un medio de cultivo
que contiene este sustrato o esta combinación de sustratos. Se
refiere finalmente a un procedimiento de identificación que usa
dichos medios de cultivo.
Desde hace muchos años, se usan sustratos
particulares para permitir la determinación de la presencia o de la
ausencia de actividades enzimáticas características de
microorganismos. Por la elección de sustratos, según haya reacción
o no, es posible de caracterizar la naturaleza de un grupo de
microorganismos o diferenciar cepas y/o especies de un género
microbiano dado.
Los sustratos sintéticos de enzimas, como los
usados en la presente invención, están constituidos por dos
partes, una primera parte específica de la actividad enzimática que
se va a revelar, en lo sucesivo denominada parte diana, y una
segunda parte que hace las veces de marcador, en lo sucesivo
denominada parte marcador.
Estos sustratos particulares pueden ser
fluorescentes o cromógenos. De hecho, es la segunda parte marcador
o el producto de su reacción con uno o varios compuestos más, ver a
este respecto la solicitud de patente PCT/FR99/00781 depositada a
nombre de la solicitante, la que es fluorescente o cromógena,
cuando ya no está asociada a la primera parte diana.
El aislamiento y la identificación de la bacteria
Listeria monocytogenes es un problema importante de la
vigilancia de la higiene agroalimentaria y de la bacteriología
médica. Entre las bacterias del género Listeria sólo se
conoce la especie Listeria monocytogenes como patógena para
el hombre. Puede engendrar listeriosis, a veces mortal (del 25 al
30% de los casos) entre personas inmunodeprimidas, niños de corta
edad o mujeres embarazadas. Las otras especies de Listeria
no son patógenas o sólo lo son para los animales. Tal es el caso
principalmente de Listeria ivanovii.
Incluso aunque los riesgos de listeriosis humana
han retrocedido en la mayor parte de los países desarrollados en
las últimas décadas, la sociedad moderna exige cada vez más
seguridad que, si se remite a casos esporádicos, no puede tolerar
las epidemias.
Ahora bien, en Francia, por ejemplo, la política
de control de riesgos privilegia la consecuencia (índice de
contaminación en los productos transformados) sobre el antecedente
(contaminación de las ganaderías). Por esto, entre el 15 y el 60%
de las carcasas de aves, entre el 3 y el 36% de las carcasas de
cerdos y entre el 7 y el 28% de las carcasas de bovinos estarán
contaminados por Listeria.
En el marco del diagnóstico de afecciones
bacterianas en el hombre, es importante así distinguir claramente
Listeria monocytogenes de las otras bacterias del género
Listeria spp. que no son patógenas.
La detección y el aislamiento de Listeria
spp. Se realizan clásicamente con medios de cultivo selectivos.
Los medios selectivos Palcam (Van Netten y col., J. Food
Microbiol. (1988), 6, pág. 187-188) y
Oxford (Curtis y col., Lett. Appl. Microbiol. (1989),
8, pág. 85-98) son los usados más
habitualmente. Estos medios permiten la detección de todas las
especies del género Listeria spp. Así, las colonias típicas
observadas deben someterse a continuación a pruebas de
identificación suplementarias, como pruebas microscópicas y/o
bioquímicas y/o inmunológicas y/o genéticas, de forma que se
verifique la pertenencia a la especie Listeria
monocytogenes.
Ahora bien, estas manipulaciones suplementarias
aumentan la duración y el coste de los análisis. Necesitan una
multitud de reactivos y la intervención de personal cualificado.
Además, como la extracción de las colonias sometidas a la
identificación es aleatoria, las manipulaciones suplementarias son
a menudo fuente de error o, al menos, causa de una menor precisión
y fiabilidad de los resultados. Tal es el caso, en particular,
cuando en el medio de aislamiento las colonias de Listeria
monocytogenes son muy minoritarias con respecto a otras
colonias formadas por las otras especies de Listeria.
La patente
EP-B-0.496.680, otorgada a la
solicitante, describe un procedimiento de análisis bacteriológico
para diferenciar la especie Listeria monocytogenes de otras
bacterias del género Listeria. Según este procedimiento, se
usa un medio de identificación que comprende un sustrato cromógeno
o fluorógeno susceptible de estar hidrolizado por una enzima
denominada glicina-aminopeptidasa. El medio usado
puede igualmente contener en su caso un sustrato de fermentación
y/o un sustrato reducible y/o un sustrato hidrolizable por vía
enzimática, como el sustrato de
\alpha-manosidasa, cuya transformación química
permite caracterizar la especie Listeria presente en la
muestra que se va a analizar.
Esta técnica muy interesante presenta un
inconveniente importante que reside en el hecho de que la especie
Listeria monocytogenes es la única que no tiene actividad
enzimática glicina-aminopeptidasa. Por tanto, es
posible detectar todo el género Listeria, con excepción de
la especie Listeria monocytogenes, que es patógena. La
detección de Listeria monocytogenes por una actividad
negativa no es, por tanto, fácil, ya que el uso de una prueba
negativa carece de especificidad en caso de mutante o si las otras
especies están presionadas y no responden con una actividad
normal.
El artículo "Separation of pathogenic and
apathogenic Listeria-monocytogenes by 3
in-vitro reaction", Groves, R.D. y col.,
Journal of Clinical Microbiology, vol 5, nº 6, 1977, describe el
uso de sustancias que se activan por su escisión por una enzima
específica, pero no el uso de sustratos de esterasas.
El artículo "Enhance haemolysis agar EHA an
improved selective and differential medium for isolation of
Listeria monocytogenes", Cox L.J. y col., Food Microbiology
(Londres), Vol. 8, Nº 1, 1998, que se refiere a un método que
permite aislar las bacterias del género Listeria
monocytogenes, no describe ni sugiere el uso de sustratos de
esterasas.
El documento FR-2.687.028
describe un medio de cultivo destinado a la puesta de relieve de
bacterias del género Salmonella y no Listeria
monocytogenes.
El artículo "Comparison of five typing
methods for the epidemiological study of Listeria
monocytogenes", Kerouaton y col., International Journal of
Food Microbiology, vol 43, Nº 1-2, describe métodos
que permiten discriminar entre varias cepas de Listeria
monocytogenes pero que no permiten identificar específicamente
la presencia de Listeria monocytogenes.
En el artículo "Haemolysins and extra
cellular enzymes of Listeria-monocytogenes and
Listeria-ivanovii", Barclay R. y col.,
Journal of Medical Microbiology, Vol 30, Nº 2, 1989, se describe el
uso de sustratos de esterasas para detectar bacterias del género
Listeria pero no permite distinguir entre Listeria
monocytogenes y Listeria ivanovii.
Además, se sabe usar medios cromogénicos que
permiten detectar la actividad \beta-glucosidasa
específica del género Listeria.
Así, las patentes de Estados Unidos Nº 5.962.251
y EE.UU. 5.364.767 describen un método para la identificación de
microorganismos que comprende dos cromógenos pero no describe el
uso de sustrato de esterasas para la identificación de Listeria
monocytogenes.
Además, para una discriminación más precisa que
usa igualmente medios cromogénicos, es posible diferenciar las
especies Listeria monocytogenes y Listeria ivanovii
de las otras Listeria para la puesta de relieve de la
actividad fosfolipasa C específica del fosfatidilinositol
(PI-PLC).
En efecto, se ha demostrado que la
PI-PLC es secretada en el medio de cultivo por
ciertas especies del género Listeria como Listeria
monocytogenes y Listeria ivanovii
(Leimeister-Wächter y col., Mol. Microbiol. (1991)
5(2), pág. 361-366; J. Mengaud y col., Mol.
Microbial. (1991) 5(2), pág. 367-372; y
Goldfine y col., Infection and Immunity (1992) 60(10), pág.
4059-4067). Se sabe igualmente que es posible
identificar estas dos especies gracias a procedimientos indirectos
(Notermans y col., App. and Env. Microbiology (1991), vol.
57 nº 9, pág. 2666-2670.
La solicitud de patente
WO-A-99/04.032 describe un medio de
cultivo que contiene un sustrato cromógeno específico de
Listeria monocytogenes y de Listeria ivanovii; se
trata de un derivado del fosfatidilinositol, como la sal de amonio
del
5-bromo-4-cloro-3-indolil-mio-inositol-1-fosfato,
que permite una detección directa de estas dos especies, es decir,
en una etapa, y así su diferenciación de las otras especies de
Listeria.
El uso de la PI-PLC para la
detección bacteriológica se recoge igualmente en los documentos
siguientes:
- WO-A-98/38.332,
que se refiere esencialmente a un método y una prueba de detección
de la PI-PLC por mediación de un sustrato escindido
por dicha enzima, siendo cromógeno uno de los residuos del sustrato
y que permite la identificación de Listeria patógenas, y
- WO99/48.899, que propone un compuesto
fluorógeno con base de 4-metilumbeliferona que
permite la detección de una actividad enzimática, la
PI-PLC, presente en numerosas Clostridium
species, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Bacillus thuringiensis e igualmente Listeria
monocytogenes.
Este último documento pone de manifiesto el hecho
de que la actividad enzimática fosfolipasa C no es específica de
Listeria monocytogenes, ya que está presente igualmente en
otras especies, entre ellas otra Listeria, es decir,
Listeria ivanovii.
Sin embargo, hay que advertir que los sustratos
cromogénicos de esterasa son más sencillos de sintetizar y menos
caros que los de PI-PLC. Además, es ventajoso usar
un sustrato cromogénico antes que un sustrato natural, ya que la
detección a simple vista es más fácil: puesta de relieve de
colonias coloreadas en vez de la revelación de un halo alrededor de
las colonias. Esta ventaja se encuentra en los cultivos
plurimicrobianos: cada colonia tiene su color específico, mientras
que el halo puede extenderse a dos colonias diferentes.
La presente invención tiene por objeto proponer
un método de detección que permite la diferenciación de la especie
Listeria monocytogenes de todas las otras especies de
Listeria. Este resultado se obtiene por detección de al
menos una actividad metabólica, que no se había usado hasta el
presente para la detección de Listeria y por diferenciación
de Listeria monocytogenes de otras especies del género
Listeria. Se trata de una actividad esterasa que se expresa
intensamente mediante Listeria monocytogenes y muy
débilmente por las otras especies del mismo género, y por otra
parte, al menos una actividad presente en la totalidad o parte de
las Listeria, como osidasa o fosfatasa o aminopeptidasa, que
permite aumentar el contraste de coloración entre Listeria
monocytogenes y las otras especies del mismo género. Así, es
posible separar Listeria monocytogenes de Listeria
ivanovii y Listeria innocua, que son las especies
aisladas más frecuentemente y cuyas características enzimáticas son
muy próximas a las de Listeria monocytogenes.
A tal efecto, la presente invención se refiere al
uso de un sustrato para la identificación directa de bacterias
patógenas Listeria monocytogenes, que se caracteriza porque
el sustrato es escindido por una actividad esterasa, diferente de
la actividad fosfolipasa C, específica del fosfatidilinositol
(PI-PLC), actividad esterasa que es específica de
Listeria monocytogenes, y porque comprende una parte diana
constituida por un ácido graso que tiene una cadena carbonada de
longitud comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono.
Así, si la actividad PI-PLC es
una actividad esterasa, Listeria ivanovii es negativa a
esterasa mientras que es positiva a PI-PLC y puede,
por tanto, confundirse con Listeria monocytogenes. Al
contrario de la técnica anterior y de la detección de la
PI-PLC que no permite diferenciar Listeria
monocytogenes de otras Listeria, la presente invención
permite una detección más específica de Listeria
monocytogenes.
Según una forma de realización preferente, la
actividad esterasa es una actividad enzimática específica, es
decir, que escinde la unión éster entre la parte marcador y la
parte diana que constituyen el sustrato.
Según una forma de realización preferente, la
unión escindida es una unión éster entre una función alcohol
soportada por la parte marcador y un ácido orgánico que constituye
la parte diana.
Según una forma de realización preferente, la
parte marcador está constituida por un cromógeno como, por
ejemplo, un indoxilo que puede estar constituido por uno de los
siguientes constituyentes:
-
5-bromo-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-cloro-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-bromo-3-indoxilo.
Según una forma de realización preferente, la
parte diana está constituida por un ácido graso que tiene una
cadena carbonada de longitud comprendida entre 4 y 10 átomos de
carbono.
Preferentemente, el sustrato está constituido por
butirato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
o decanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
Según una variante de realización, el sustrato se
acopla a al menos otro sustrato que permite detectar al menos otra
actividad enzimática poseída por la totalidad o parte de las
especies de Listeria.
En el caso de que haya dos sustratos, el sustrato
que permite detectar la actividad esterasa, con excepción de la
enzima PI-PLC, tiene una coloración diferente de la
del otro sustrato que permite detectar una actividad enzimática
diferente de la actividad esterasa definida anteriormente.
Según una forma de realización preferente, la
otra actividad enzimática poseída por la totalidad o parte de las
especies de Listeria es una actividad osidasa, fosfatasa o
aminopeptidasa.
Preferentemente, la parte marcador del otro
sustrato es con base de:
-
5-bromo-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-cloro-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-bromo-3-indoxilo.
En lo que se refiere al
6-cloro-3-indoxilo,
una molécula de este tipo esta particularmente bien descrita en la
patente US-A-5.364.767, en la que se
asocia esencialmente a la
N-acetil-\beta-D-galactosaminida,
a la
N-acetil-\beta-D-glucosaminida,
al butirato, al octanoato, a la sal de fosfato
p-toluidina, al sulfato o a la
\beta-D-glucopiranosida. Puede
estar igualmente en la base de
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo.
Según una variante de realización, el otro
sustrato está constituido por:
-
5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
o
-
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
o
-
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido,
o
-
6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida,
o
-
6-cloro-3-indolil-\alpha-D-manósido,
o
-
6-cloro-3-indolilfosfato.
La presente invención se refiere igualmente al
uso de un medio de reacción, para la identificación directa de
Listeria monocytogenes, que usa al menos un sustrato, como
el definido anteriormente.
Más concretamente, el sustrato que permite
detectar la actividad esterasa, diferente de la actividad
PI-PLC, tiene una concentración comprendida entre
20 mg/l y 3 g/l, o preferentemente entre 50 mg/l y 1 g/l, o
preferentemente entre 100 y 600 mg/l, o aproximadamente de 250
mg/l.
Más concretamente, el medio comprende al menos
otro sustrato que permite detectar otra actividad como, por
ejemplo, una actividad osidasa, fosfatasa o aminopeptidasa, que
tiene una concentración comprendida entre 10 mg/l y 500 mg/l,
preferentemente entre 50 y 300 mg/l, y más preferentemente aún
entre 100 y 200 mg/l.
El medio es preferentemente un medio agar o
líquido.
Según una variante de realización, el medio
comporta un medio que permite discriminar Listeria
monocytogenes de Listeria welshimeri y Listeria
seeligeri, es decir:
- adición de al menos un hidrato de carbono
acidificado (por ejemplo xilosa y/o D-tagatosa) por
Listeria welshimeri y Listeria seeligeri y no por
Listeria monocytogenes,
- adición de al menos un hidrato de carbono
acidificado por Listeria monocytogenes y en su caso
Listeria innocua y/o Listeria ivanovii y/o
Listeria grayii,
- adición de al menos un sustrato que permite
revelar una actividad osidasa (\beta-maltosidasa)
y/o fosfatasa y/o aminopeptidasa
(L-glicina-aminopeptidasa)
especifica(s) al menos de Listeria welshimeri y
Listeria seeligeri pero no de Listeria monocytogenes,
o
- adición de al menos un sustrato natural de
fosfolipasa (PLC), como fosfatidilinositol (PI) y/o
fosfatidilcolina (PC).
Según una forma de realización particular, el
medio comporta un medio selectivo que permite discriminar
Listeria monocytogenes de al menos las especies
siguientes:
- Staphylococcus aureus,
- Bacillus thuringiensis,
- Enterococcus faecalis,
- Escherichia coli,
- Pseudomonas aeruginosa, y
- Candida albicans.
Según una forma de realización preferente, el
medio selectivo está constituido por al menos uno de los compuestos
siguientes:
- Cloruro de litio,
- Ceftazidima,
- Anfotericina B,
- Fosfomicina, y/o
- Colistina.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento de identificación de bacterias patógenas de la
especie Listeria monocytogenes, que comprende:
- la siembra de una muestra susceptible de
contener las bacterias patógenas en un medio de cultivo, como el
definido anteriormente,
- la incubación del medio de cultivo sembrado con
la muestra, y
- la determinación de la presencia de dichas
bacterias patógenas por el color y la intensidad característicos
del o de los sustratos.
Según una variante de realización, dicha muestra,
susceptible de contener bacterias patógenas, se enriquece
previamente antes de sembrarse en un medio de cultivo, como el
definido anteriormente.
Según otra variante de realización del
procedimiento, se efectúa la determinación de la presencia de
dichas bacterias patógenas, por el color y la intensidad
característicos del o de los sustratos, después de 18 a 24 horas de
incubación.
Finalmente, la invención propone un uso de un
sustrato constituido por una parte diana, como la definida
anteriormente, y una parte inhibidora para inhibir específicamente
Listeria monocytogenes cuando se libera la parte
inhibidora.
La presente invención se refiere, pues,
esencialmente a la identificación de la especie Listeria
monocytogenes patógena para el hombre con respecto a las otras
especies del género Listeria.
La actividad enzimática esterasa es un buen
identificador de la especie Listeria monocytogenes frente a
las otras especies del género Listeria, con excepción de la
actividad esterasa más específica denominada
PI-PLC.
Así, el estado la técnica descrito anteriormente
pone de relieve la falta de especificidad de la
PI-PLC, que es específica de un tipo de lípidos,
entre las especies Listeria monocytogenes y Listeria
ivanovii, por ejemplo. La PI-PLC hidroliza los
derivados de fosfatidilinositol entre el glicerol y el fosfato
inorgánico. En el caso de un sustrato cromogénico, la enzima corta
entre el marcador y el fosfato inorgánico unido al inositol, según
se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las esterasas, usadas en la presente invención,
hidrolizan los lípidos que contienen uno o varios ácidos grasos,
cuya longitud de cadena está comprendida preferentemente entre 7 y
10 átomos de carbono. Estas esterasas hidrolizan las uniones éster
entre un alcohol y un ácido graso orgánico, como se describe a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Experimento
1
Los sustratos cromogénicos de esterasa probados
son:
- octanoato de
5-bromo-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como Blue-C8,
- nonanoato de
5-bromo-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como Blue-C9, y
- decanoato de
5-bromo-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como Blue-C10.
Se realiza una solución madre de cada sustrato a
40 g/l en una mezcla del 40% de dimetilsulfóxido y el 60% de
monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20). Se añade un
volumen suficiente a tres medios de tipo Columbia en sobrefusión
para obtener una concentración final en sustrato de 250 mg/l. Los
microorganismos obtenidos de la recogida colección de la
solicitante o de la colección ATCC se han sembrado en este medio
por aislamiento en tres discos a partir de una suspensión a 0,5
McFarland. Se han incubado las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se
han examinado visualmente las colonias formadas después de 24 y 48
horas de incubación. Se ha anotado la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 1 siguiente:
| Medio | con Blue-C8 | con Blue-C9 | con Blue-C10 | ||||
| Cepas | TI | C | I | C | I | C | I |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris | 1 | gris | 1 | gris | 0,5 |
| ATCC 19115 | 48 h | gris | 2 | gris | 2 | gris | 1 |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris | 1 | gris | 1 | gris | 0,5 |
| ATCC 19117 | 48 h | gris | 2 | gris | 1,5 | gris | 1 |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris | 1,5 | gris | 1 | gris | 1 |
| 092 | 48 h | gris | 2,5 | gris | 2 | gris | 2 |
| Listeria innocua | 24 h | gris | 0,3 | - | - | - | - |
| 166 | 48 h | gris | 1 | gris | 0,5 | gris | 0,5 |
| Listeria innocua | 24 h | gris | 0,3 | - | - | - | - |
| ATCC 33090 | 48 h | gris | 0,5 | gris | 0,3 | gris | 0,3 |
| Listeria innocua | 24 h | - | - | - | - | - | - |
| 171 | 48 h | gris | 0,3 | gris | 0,3 | gris | 0,3 |
| Listeria seeligeri | 24 h | - | - | - | - | - | - |
| 011 | 48 h | gris | 0,5 | gris | 0,5 | gris | 0,5 |
| Listeria welshimeri | 24 h | gris | 0,5 | gris | 0,5 | - | - |
| 078 | 48 h | gris | 1 | gris | 1 | gris | 0,5 |
| Listeria grayi | 24 h | - | - | - | - | - | - |
| ATCC 19120 | 48 h | - | - | - | - | - | - |
| Listeria ivanovii | 24 h | - | - | - | - | - | - |
| 018 | 48 h | - | - | - | - | - | - |
| Listeria ivanovii | 24 h | - | - | - | - | - | - |
| 025 | 48 h | - | - | - | - | - | - |
En la tabla 1 anterior, como en las tablas que
seguirán, C representa la coloración de las colonias después de
incubación, I representa la intensidad de esta coloración, el
símbolo "-" es sinónimo una ausencia de color o de intensidad,
y finalmente TI define el tiempo de incubación. Debe observarse que
la intensidad de la coloración es una escala arbitraria pero que es
común al conjunto de las muestras biológicas y los medios
sometidos a prueba. Esta escala es válida para este experimento y
para todos los experimentos que seguirán. Puede definirse de la
forma siguiente:
- 0 corresponde a ausencia de actividad,
- 0,1 corresponde a la presencia de una traza de
coloración,
- 0,5 corresponde a la presencia de una
coloración muy pálida,
- 1 corresponde a la presencia de una coloración
nítida de intensidad débil,
- 1,5 corresponde a la presencia de una
coloración intermedia entre las coloraciones 1 y 2,
- 2 corresponde a la presencia de una coloración
franca de intensidad media,
- 2,5 corresponde a la presencia de una
coloración intermedia entre las coloraciones 2 y 3,
- 3 corresponde a la presencia de una coloración
intensa,
- 3,5 corresponde a la presencia de una
coloración intermedia entre las coloraciones 3 y 4,
- 4 corresponde a la presencia de una coloración
muy intensa.
Sólo las cepas de L. monocytogenes, L.
innocua, L. seeligeri y L. welshimeri presentan una
coloración gris, por lo que estas cepas expresan una actividad
esterasa. Es posible subrayar, sea cual sea la longitud de cadena
del ácido graso estudiada, que en términos de intensidad hay una
desviación de aproximadamente 1 unidad entre las cepas de L.
monocytogenes que presentan las intensidades máximas y las cepas
de L. innocua, L. welshimeri y L. seeligeri que
presentan las intensidades mínimas.
No obstante, a continuación se estudiarán sólo
los sustratos obtenidos de octanoato y de nonanoato.
Además, se puede observar que sólo las cepas de
Listeria monocytogenes presentan una coloración a 24 horas.
Por tanto, es posible diferenciar Listeria monocytogenes de
otras especies de Listeria en función de la temperatura de
incubación.
Experimento
2
Los sustratos cromogénicos de esterasa sometidos
a prueba son:
- octanoato de
5-bromo-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como Blue-C8,
- octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como X-C8,
- octanoato de
6-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como Rosa-C8, y
- octanoato de
5-bromo-6-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como Magenta-C8.
Se prepara une solución madre de cada sustrato a
40 g/l en una mezcla del 40% de dimetilsulfóxido y el 60% de Tween
20. Se añade un volumen suficiente a cuatro medios de tipo Columbia
en sobrefusión para obtener una concentración final en sustrato de
250 mg/l. Los microorganismos obtenidos de la colección de la
solicitante o de la colección ATCC se han sembrado en este medio
por aislamiento en tres discos a partir de una suspensión a 0,5
McFarland. Se han incubado las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se
han examinado visualmente las colonias formadas después de 24 y 48
horas de incubación. Se ha anotado la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 2 siguiente:
| Medio | con Blue-C8 | con X-C8 | con Rosa-C8 | con Magenta-C8 | |||||
| Cepas | TI | C | I | C | I | C | I | C | I |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris | 1 | turquesa | 2,5 | rosa | 0,5 | violeta | 2 |
| ATCC 19115 | 48 h | gris | 2 | turquesa | 3 | rosa | 1 | violeta | 3 |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris | 1 | turquesa | 2 | rosa | 0,5 | violeta | 1,5 |
| ATCC 19117 | 48 h | gris | 2 | turquesa | 3 | rosa | 1 | violeta | 3,5 |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris | 1,5 | turquesa | 3 | rosa | 1,5 | violeta | 3 |
| 092 | 48 h | gris | 2,5 | turquesa | 3,5 | rosa | 2 | violeta | 3 |
| Listeria innocua | 24 h | gris | 0,3 | turquesa | 0,3 | - | - | violeta | 2 |
| 166 | 48 h | gris | 1 | turquesa | 0,5 | rosa | 0,3 | violeta | 3 |
| Listeria innocua | 24 h | gris | 0,3 | turquesa | 0,3 | - | - | violeta | 1 |
| ATCC 33090 | 48 h | gris | 0,5 | turquesa | 0,5 | rosa | 0,5 | violeta | 2 |
| Listeria innocua | 24 h | - | - | - | - | - | - | violeta | 0,5 |
| 171 | 48 h | gris | 0,3 | turquesa | 0,3 | rosa | 0,3 | violeta | 3 |
| Listeria ivanovii | 24 h | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 018 | 48 h | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Listeria ivanovii | 24 h | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 025 | 48 h | - | - | - | - | - | - | - | - |
Con independencia del sustrato usado, la
desviación de intensidad entre las cepas de Listeria
monocytogenes y Listeria innocua se conserva. Esta
desviación es, sin embargo, más significativa para los marcadores
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo
y
5-bromo-3-indoxilo.
El mejor contraste y las intensidades más altas
se obtienen con el marcador que da la coloración turquesa: el
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo.
Experimento
3
Los sustratos cromogénicos de esterasa sometidos
a prueba son:
- acetato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como X-C2,
- acetato de 3-indolilo, en lo
sucesivo referido como Y-C2,
- butirato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como X-C4,
- octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como X-C8,
- octanoato de
5-bromo-6-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como M-C8, y
- octanoato de
6-cloro-3-indolilo,
en lo sucesivo referido como R-C8.
Estos sustratos se han liofilizado en cúpulas de
tipo galerías API (marca registrada). Antes del uso, los sustratos
contenidos en estas cúpulas se ponen en solución por adición de un
medio de inoculación de tipo medio Columbia sin agar. Los
microorganismos obtenidos de la colección de la solicitante o de la
colección ATCC se han sembrado en estas cúpulas a partir de una
suspensión a 2 McFarland. Se han incubado las galerías a 37ºC
durante 8 horas. Se han examinado visualmente las colonias formadas
después de 4, 6 y 8 horas de incubación.
Se ha anotado la intensidad de coloración de
estas colonias. Los resultados se presentan en la tabla 3
siguiente:
| Medio | X-C2 | Y-C2 | X-C4 | X-C8 | M-C8 | R-C8 | |
| Cepas | TI | I | I | I | I | 1 | 1 |
| Listeria monocytogenes | 4 h | 3 | 3 | 1 | - | - | - |
| ATCC 19115 | 6 h | 4 | 4 | 2 | 1 | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 3 | 1,5 | 0,5 | - | |
| Listeria monocytogenes | 4 h | 3 | 4 | 2 | - | - | - |
| 092 | 6 h | 4 | 4 | 2 | 1 | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 3 | 1,5 | 0,5 | - | |
| Listeria innocua | 4 h | 4 | 3 | 0,5 | - | - | - |
| 171 | 6 h | 4 | 3 | 1 | - | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 2 | - | - | - | |
| Listeria innocua | 4 h | 3 | 3 | 0,5 | - | - | - |
| 166 | 6 h | 4 | 3 | 1 | - | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 2 | - | - | ||
| Listeria welshimeri | 4 h | 3 | 3 | 0,5 | - | - | - |
| 023 | 6 h | 4 | 4 | 1 | - | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 2 | - | - | - | |
| Listeria seeligeri | 4 h | 3 | 3 | 0,5 | - | - | - |
| 011 | 6 h | 3 | 3 | 1 | 0,5 | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 2 | 0,5 | - | - | |
| Listeria ivanovii | 4 h | 3 | 3 | 0,5 | - | - | - |
| 418 | 6 h | 3 | 4 | 1 | - | - | - |
| 8 h | 4 | 4 | 2 | - | - | - | |
| Listeria grayi | 4 h | 2 | 3 | 0,5 | |||
| ATCC 19120 | 6 h | 2 | 4 | 1 | - | - | - |
| 8 h | 3 | 4 | 2 | - | - | - |
En medio líquido, los sustratos que poseen una
longitud de cadenas inferior a 4 átomos de carbono no son
discriminantes para diferenciar las diferentes especies de
Listeria entre sí. Por el contrario, en las condiciones
operativas sometidas a prueba, los sustratos X-C4 y
X-C8 permiten obtener un contraste de coloración
entre L. monocytogenes, por una parte, y las otras especies del
género, por otra. En efecto, sólo L. welshimeri y L.
seeligeri presentan también coloraciones, pero estas
coloraciones son muy débiles. Es posible imaginar "un umbral de
positividad" de la prueba igual a 1. Para intensidades
inferiores a 1, la cepa sometida a prueba se considerará negativa
para la prueba; para intensidades superiores a 1, la cepa sometida
a prueba será positiva. Así, en el caso presente, se trataría de
una cepa de L. monocytogenes.
Experimento
4
Se sometieron a prueba diferentes parejas de
sustratos cromogénicos de esterasa y de sustratos cromogénicos de
osidasa, que son los siguientes:
- octanoato de
5-bromo-3-indolilo y
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
que corresponde a la pareja 1,
- octanoato de
5-bromo-3-indolilo y
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido,
correspondiente a la pareja 2,
- octanoato de
5-bromo-3-indolilo y
6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida,
que corresponde a la pareja 3,
- octanoato de
5-bromo-3-indolilo y
6-cloro-3-indolil-\alpha-D-manósido,
correspondiente a la pareja 4,
- nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
y
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
que corresponde a la pareja 5,
- nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
y
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido,
correspondiente a la pareja 6,
- nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
y
6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida,
que corresponde a la pareja 7, y
- nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
y
6-cloro-3-indolil-\alpha-D-manósido,
correspondiente a la pareja 8.
Se realiza una solución madre de cada sustrato de
esterasas a 40 g/l en una mezcla del 40% de dimetilsulfóxido y el
60% de Tween 20. Además, se prepara en el dimetilsulfóxido una
solución madre de cada sustrato de osidasas. Se añade un volumen
suficiente de la solución madre del sustrato de esterasa, adaptado
a cada una de las parejas descritas anteriormente, a ocho medios
de tipo Columbia en sobrefusión, para obtener una concentración
final en sustrato de 250 mg/l. Paralelamente, se añade también un
volumen suficiente del sustrato de osidasas, adaptado a cada una de
las parejas descritas anteriormente, a estos ocho medios, para
obtener una concentración final comprendida entre 100 y 200 mg/l
según el sustrato. En este medio se han sembrado los
microorganismos obtenidos de la colección de la solicitante o de la
colección ATGC se han sembrado por aislamiento en tres discos a
partir de una suspensión a 0,5 McFarland. Se han incubado las cajas
a 37ºC durante 48 horas. Se han examinado visualmente las colonias
formadas después de 24 y 48 horas de incubación.
Se ha anotado la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 4 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Con independencia de las parejas de sustratos
estudiadas, hay una diferencia de coloración entre las cepas de
Listeria monocytogenes y las cepas de Listeria
innocua y Listeria ivanovii.
El mejor contraste se obtiene con el nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
y un sustrato de osidasa, con independencia de la actividad diana,
con base de
6-cloro-3-indolilo.
A priori, es posible acoplar todos los diferentes tipos de
sustratos de esterasa y de osidasa, ya se trate de
\alpha-osidasas o de
\beta-osidasas.
Sin embargo, se puede observar que los mejores
resultados se obtienen con
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida
y
6-cloro-3-indolil-\alpha-D-manósido.
Experimento
5
En un medio agar, tipo Columbia, en sobrefusión
se han añadido sucesivamente dos soluciones madres de dos
sustratos: octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(X-C8) (concentración final en el medio: 250 mg/1)
y fosfato de
6-cloro-3-indolilo
(Rosa P) (concentración final en el medio 750 mg/l). La solución
madre de octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
se ha preparado como en los ejemplos precedentes, y la de fosfato
de
6-cloro-3-indolilo
se ha realizado a 50 g/l en dimetilsulfóxido.
En este medio se han sembrado microorganismos
obtenidos de la colección de la solicitante o de la colección ATCC
por aislamiento en tres discos a partir de una suspensión a 0,5
McFarland. Se han incubado las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se
han examinado visualmente las colonias formadas después de 24 y 48
horas de incubación.
Se ha anotado la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 5 siguiente:
| Medio | X-C8 y Rosa P | ||
| Cepas | TI | C | I |
| Listeria monocytogenes | 24 h | gris azul | 2 |
| ATCC 19115 | 48 h | gris azul | 3 |
| Listeria monocytogenes | 24 h | azul | 2 |
| 092 | 48 h | gris azul | 3 |
| Listeria innocua | 24 h | gris rosa | 0,5 |
| 166 | 48 h | gris rosa | 2 |
| Listeria innocua | 24 h | rosa | 0,5 |
| 171 | 48 h | rosa | 1,5 |
| Listeria ivanovii | 24 h | gris rosa | 0,5 |
| 022 | 48 h | gris rosa | 3 |
| Listeria welshimeri | 24 h | gris azul | 3 |
| 081 | 48 h | gris azul | 3 |
| Listeria seeligeri | 24 h | gris azul | 0,5 |
| 011 | 48 h | gris azul | 2 |
| Listeria grayi | 24 h | gris | 0,5 |
| ATCC 19120 | 48 h | gris | 1 |
El estudio simultáneo de estas dos actividades
permite la separación de dos grupos de Listeria, por una
parte, L. monocytogenes, L. seeligeri y L. welshimeri
y, por otra, L. grayi, L. innocua y L. ivanovii. Este
sistema de detección puede mejorarse actuando sobre la formulación
del medio, como se expondrá en el experimento 6, en el que es
posible separar L. monocytogenes de todas las otras especies
del género Listeria.
Experimento
6
La pareja de sustratos cromogénicos de esterasa y
de sustratos cromogénicos de osidasa sometida a prueba es la
siguiente: octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
y
6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida
La preparación de medios y soluciones madres de
sustrato se ha realizado como en los ejemplos precedentes. Este
medio de base se ha dividido en cuatro medios en los que se añaden
respectivamente:
- 40 g/l de xilosa correspondiente al medio
1,
- 40 g/l de tagatosa correspondiente al medio
2,
- una mezcla de 45 g/l de hidratos de carbono con
30 g/l de xilosa y 15 g/l de tagatosa correspondiente al medio
3,
- una mezcla de 65 g/l de hidratos de carbono con
35 g/l de xilosa y 30 g/l de tagatosa correspondiente al medio
4.
En estos medios se han sembrado microorganismos
obtenidos de la colección de la solicitante por aislamiento en tres
discos a partir de una suspensión a 0,5 McFarland. Se han incubado
las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se han examinado visualmente las
colonias formadas después de 24 y 48 horas de incubación.
Se ha anotado la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 6 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La adición de hidratos de carbono en altas
concentraciones (superiores o iguales a 40 g/l) permite la
distinción de L. monocytogenes de todas las otras especies
de Listeria y únicamente a partir de un criterio de color.
No obstante, se ha demostrado que era posible obtener una
distinción entre especies que usan concentraciones más débiles que
pueden ir hasta 10 g/l, como prueba el contenido de la patente
FR-B-2.708.285. Sin embargo, a
diferencia de esta patente, los solicitantes tienen un cambio de
color por inhibición de una actividad enzimática, y no un color
derivado diferente del color de base del marcador.
Experimento
7
El medio de base de tipo Columbia contiene:
- octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
a 250 mg/l aportado por una solución madre en una mezcla del 40% de
dimetilsulfóxido y el 60% de monolaurato de polioxietilenosorbitán
(Tween 20),
-
5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-N-acetilglucosaminida
a 150 mg/l aportado por una solución madre en DMSO,
- xilosa a 10 g/l y tagatosa a 5 g/l, y
- una mezcla selectiva definida como sigue:
cloruro de litio a 5 g/l, ceftazidima a 20 mg/l, anfotericina B a
4 mg/l, fosfomicina a 10 mg/l y colistina a 5 mg/l.
Se han sembrado en este medio microorganismos
obtenidos de la colección de la solicitante por aislamiento en tres
discos a partir de una suspensión a 0,5 McFarland. Se han incubado
las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se han examinado visualmente las
colonias formadas después de 24 y 48 horas de incubación. Se ha
anotado la coloración de estas colonias, así como la intensidad de
esta coloración. Los resultados se presentan en la tabla 7
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| Medio | sin agentes selectivos | con agentes selectivos | |||
| Cepas | TI | C | I | C | I |
| Listeria monocytogenes | 24 h | azul | 1 | azul | 1 |
| 028 | 48 h | azul | 3 | azul | 3 |
| Listeria monocytogenes | 24 h | azul | 2 | azul | 2 |
| 023 | 48 h | azul | 3,5 | azul | 3 |
| Listeria innocua | 24 h | malva | 1,5 | malva | 1 |
| 036 | 48 h | malva | 3 | malva | 2 |
| Listeria ivanovii | 24 h | rosa | 1 | - | - |
| 018 | 48 h | rosa | 2 | malva | 1 |
| Listeria welshimeri | 24 h | turquesa | 1 | turquesa | 1 |
| 081 | 48 h | turquesa | 3 | turquesa | 2 |
| Staphylococcus aureus | 24 h | verde | 2 | - | - |
| 029 | 48 h | verde | 3,5 | - | - |
| Bacillus thuringiensis | 24 h | turquesa | 0,5 | - | - |
| 072 | 48 h | turquesa | 1 | - | - |
| Enterococcus faecalis | 24 h | turquesa | 0,5 | - | - |
| 117 | 48 h | turquesa | 1 | - | - |
TABLA 7
(continuación)
| Medio | sin agentes selectivos | con agentes selectivos | |||
| Cepas | TI | C | I | C | I |
| Escherichia coli | 24 h | incoloro | - | - | - |
| 006 | 48 h | incoloro | - | - | - |
| Pseudomonas aeruginosa | 24 h | verde | 0,5 | - | - |
| 003 | 48 h | verde | 2 | - | |
| Candida albicans | 24 h | turquesa | 0,5 | - | - |
| 077 | 48 h | turquesa | 1 | - | - |
En la tabla 7 anterior, C representa el color de
las colonias después de incubación, I representa la intensidad de
esta coloración, el símbolo "-" es sinónimo de una ausencia de
crecimiento, y finalmente TI define el tiempo de incubación. Debe
observarse que la intensidad de la coloración es una escala
arbitraria, pero que es común al conjunto de las muestras
biológicas y de los medios sometidos a prueba.
Es posible subrayar que, en presencia de agentes
selectivos, la totalidad de bacterias y levaduras que interfieren
sometidas a prueba (es decir, distintas de Listeria) no
presentan crecimiento y, por tanto, están inhibidas. La presencia
de agentes selectivos no modifica los colores de cepas de
Listeria sometidas a prueba.
Este experimento demuestra igualmente que,
incluso sin agentes selectivos, es posible la diferenciación entre
Listeria monocytogenes, por una parte, y las bacterias y
levaduras que interfieren sometidas a prueba, es decir, que
incluyen las otras Listeria, por otra, lo cual no sucede con
los sustratos y los medios de cultivo o de reacción descritos en la
técnica anterior.
Claims (22)
1. Uso de un sustrato para la identificación
directa de bacterias patógenas Listeria monocytogenes,
caracterizado porque el sustrato está escindido por una
actividad esterasa, diferente de la actividad fosfolipasa C,
específica del fosfatidilinositol (PI-PLC),
actividad esterasa que es específica de Listeria
monocytogenes y que comprende una parte diana constituida por
un ácido graso que tiene una cadena carbonada de longitud
comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono.
2. Uso de un sustrato, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la actividad esterasa es una actividad
enzimática específica, es decir, que escinde la unión éster entre
la parte marcador y la parte diana que constituyen el sustrato.
3. Uso de un sustrato, según la reivindicación 2,
caracterizado porque la unión escindida es una unión éster
entre una función alcohol soportada por la parte marcador y un
ácido orgánico que constituye la parte diana.
4. Uso de un sustrato, según la reivindicación 3,
caracterizado porque la parte marcador está constituida por
un cromógeno como, por ejemplo, un indoxilo que puede estar
constituido por uno de los siguientes constituyentes
-
5-bromo-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-cloro-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-bromo-3-indoxilo.
5. Uso de un sustrato, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la parte diana está constituida por un
ácido graso que tiene una cadena carbonada de longitud comprendida
entre 4 y 10 átomos de carbono.
6. Uso de un sustrato, según la reivindicación 4,
caracterizado porque está constituido por butirato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
o decanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
7. Uso de un sustrato, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el sustrato
está acoplado a al menos otro sustrato que permite detectar al
menos otra actividad enzimática poseída por la totalidad o parte de
las especies de Listeria.
8. Uso de sustratos, según la reivindicación 7,
caracterizados porque el sustrato que permite detectar la
actividad esterasa, con excepción de la enzima
PI-PLC, tiene una coloración diferente de la del
otro sustrato que permite detectar una actividad enzimática
diferente de la actividad esterasa definida anteriormente.
9. Uso de sustratos, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizados porque la otra
actividad enzimática poseída por la totalidad o parte de las
especies de Listeria es una actividad osidasa, fosfatasa o
aminopeptidasa.
10. Uso de sustratos, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizados porque la parte
marcador del otro sustrato está constituida con base de:
-
5-bromo-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-cloro-3-indoxilo,
o
-
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo,
o
-
6-bromo-3-indoxilo.
11. Uso de sustratos, según la reivindicación 10,
caracterizados porque el otro sustrato está constituido
por
-
5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
o
-
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
o
-
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido,
o
-
6-cloro-3-indolil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida,
o
-
6-cloro-3-indolil-\beta-D-manósido,
o
-
6-cloro-3-indolilfosfato.
12. Uso de un medio de reacción para la
identificación directa de Listeria monocytogenes, que usa al
menos un sustrato escindido por una actividad esterasa, diferente
de la actividad fosfolipasa C, específica del fosfatidilinositol
(PI-PLC), actividad esterasa que es específica de
Listeria monocytogenes y que comprende una parte diana
constituida por un ácido graso que tiene una cadena carbonada de
longitud comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono.
13. Uso de un medio, según la reivindicación 12,
caracterizado porque el sustrato permite detectar una
actividad esterasa, diferente de la actividad
PI-PLC, a una concentración comprendida entre 20
mg/l y 3 g/l, o preferentemente entre 50 mg/l y 1 g/l, o
preferentemente entre 100 y 600 mg/l, o preferentemente
aproximadamente de 250 mg/l.
14. Uso de un medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque comprende al
menos otro sustrato que permite detectar otra actividad, como una
actividad osidasa, fosfatasa o aminopeptidasa, a una concentración
comprendida entre 10 mg/l y 500 mg/l, preferentemente entre 50 y
300 mg/l, y más preferentemente aún entre 100 y 200 mg/l.
15. Uso de un medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque el medio es
un medio agar o líquido.
16. Uso de un medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque comporta un
medio que permite discriminar Listeria monocytogenes de
Listeria welshimeri y Listeria seeligeri, es
decir:
- adición de al menos un hidrato de carbono
acidificado (por ejemplo xilosa y/o D-tagatosa) por
Listeria welshimeri y Listeria seeligeri y no por
Listeria monocytogenes, o
- adición de al menos un hidrato de carbono
acidificado por Listeria monocytogenes y en su caso Listeria
innocua y/o Listeria ivanovii y/o Listeria grayii;
o
- adición de al menos un sustrato que permite
revelar una actividad osidasa (\beta-maltosidasa)
y/o fosfatasa y/o aminopeptidasa
(L-glicina-aminopeptidasa)
específica al menos de Listeria welshimeri y Listeria
seeligeri pero no de Listeria monocytogenes, o
- adición de al menos un sustrato natural de
fosfolipasa (PLC), como, por ejemplo, fosfatidilinositol (PI) y/o
fosfatidilcolina (PC).
17. Uso de un medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque comporta un
medio selectivo que permite discriminar Listeria
monocytogenes de al menos las especies siguientes:
- Staphylococcus aureus;
- Bacillus thuringiensis;
- Enterococcus faecalis;
- Escherichia coli;
- Pseudomonas aeruginosa; y
- Candida albicans.
18. Uso de un medio, según la reivindicación 17,
caracterizado porque el medio selectivo está constituido por
al menos uno de los compuestos siguientes:
- Cloruro de litio;
- Ceftazidima;
- Anfotericina B;
- Fosfomicina; y/o
- Colistina.
\newpage
19. Procedimiento de identificación de bacterias
patógenas de la especie Listeria monocytogenes, que
comprende
- la siembra de una muestra susceptible de
contener las bacterias patógenas en un medio de cultivo, que usa al
menos un sustrato escindido por una actividad esterasa, diferente
de la actividad fosfolipasa C, específica del fosfatidilinositol
(PI-PLC), actividad esterasa que es específica de
Listeria monocytogenes y que comprende una parte diana
constituida por un ácido graso que tiene una cadena carbonada de
longitud comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono;
- la incubación del medio de cultivo sembrado con
la muestra, y
- la determinación de la presencia de dichas
bacterias patógenas por el color y la intensidad característicos
del o de los sustratos.
20. Procedimiento, según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha muestra, susceptible de contener
bacterias patógenas, está enriquecida previamente antes de sembrarse
en un medio de cultivo, que usa al menos un sustrato escindido por
una actividad esterasa, diferente de la actividad fosfolipasa C,
específica del fosfatidilinositol (PI-PLC),
actividad esterasa que es específica de Listeria
monocytogenes y que comprende una parte diana constituida por
un ácido graso que tiene una cadena carbonada de longitud
comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono.
21. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque se efectúa la
determinación de la presencia de dichas bacterias patógenas, por el
color y la intensidad característicos del o de los sustratos,
después de 18 a 24 horas de incubación.
22. Uso in vitro de un sustrato escindido
por una actividad esterasa, diferente de la actividad fosfolipasa
C, específica del fosfatidilinositol (PI-PLC),
actividad esterasa que es específica de Listeria
monocytogenes y que comprende una parte diana constituida por
un ácido graso que tiene una cadena carbonada de longitud
comprendida entre 4 y 20 átomos de carbono, y de una parte
inhibidora para inhibir específicamente Listeria
monocytogenes cuando se libera la parte inhibidora.
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