CN102119221A - 能够区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基 - Google Patents

能够区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的选择性培养基，所述培养基的特征在于其包含至少一种磷脂酶C的荧光、显色或发光底物。所述培养基允许区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌。

Description

能够区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基
本发明总体上涉及微生物分析领域。更具体地，本发明涉及用于生长、检测、鉴定和/或计数葡萄球菌的选择性培养基，该培养基允许区分金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与凝固酶阴性葡萄球菌。
葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌或者葡萄球菌是许多医院感染的原因，并代表了重要的医院难题。这些细菌都是革兰氏阳性球菌(cocci)，其通过引发血浆凝固的蛋白凝固酶的产生的区别而分为两大类。因此存在凝固酶阴性葡萄球菌与凝固酶阳性葡萄球菌的区分，凝固酶阴性葡萄球菌的主要代表是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，凝固酶阳性葡萄球菌的主要代表是以致病力著称的金黄色葡萄球菌。葡萄球菌广泛存在于环境以及人和动物的皮肤和粘膜中。规律地从这些宿主脱落使得它们广泛分布于自然界中(水、土壤、空气、食品、物体)，医院环境要求严格的卫生措施和隔离病人来限制表皮菌株的散播。因此，金黄色葡萄球菌代表了80％至90％临床环境下分离的葡萄球菌，是引起许多医院环境感染的主要人病原体，这些感染例如著名的医院性肺炎、外科伤口感染、烧伤感染、异物感染(心脏瓣膜、髋假体、夹具等)以及全身性感染或败血病，它们通常归咎于使用血管内导管或者其他感染部位的细菌散播。
葡萄球菌，尤其是金黄色葡萄球菌在食品领域也形成相当的危害。事实上，金黄色葡萄球菌的某些菌株能产生肠毒素，消费者摄入之后会导致中毒，引起恶心、腹痛，尤为严重的是反复呕吐，常伴随腹泻。
因此，葡萄球菌食物中毒代表了一种细菌来源的食物中毒的主要形式。
通常通过动物和人，无论是病人或健康携带者，通过未消毒奶(乳腺炎)，通过空气和污染的表面或者接触了食物和健康或感染的携带者的设备来散播。
因此，食物中葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌的检测和鉴定构成了主要的公共卫生挑战。
在用于检测、鉴定和计数葡萄球菌属细菌的培养基中，分为非选择性培养基，如哥伦比亚(Columbia)培养基或胰胨豆胨琼脂；以及选择性培养基如Chapman琼脂、Baird-Parker琼脂。金黄色葡萄球菌根据其形态特征及其溶血谱也可以在血琼脂中检测，但是这个方法不是非常灵敏和特异的，即使在在食品工业中有所使用，也使用很少。心脑肉汤也经常用于葡萄球菌的研究。
特异性细菌学培养基促进某些微生物的生长，并限制其他微生物的生长。它们含有至少一种除靶病原体以外的微生物的抑制剂。抑制剂的效果必须保持限制于所关注的微生物，因为所述所关注的微生物在它们产生的食品制品可以被破坏。用甘露醇作为底物的Chapman琼脂相当于普通营养物基质的高盐培养基，通过pH指示剂来检测其发酵。所述pH指示剂可以是有色指示剂或荧光指示剂。Baird-Parker培养基相当于高营养物基质，其添加了亚碲酸钾和氯化锂，这是常用于生长金黄色葡萄球菌的选择性试剂。氯化锂是肠球菌抑制剂。其他化学物质可以与亚碲酸钾和氯化钠或氯化锂组合：硫酸铵、山梨酸、甘氨酸、多粘菌素B。
然而，分析食品基质的潜在产毒性葡萄球菌呈现出特别的难题，这限制了为临床实践开发的方法的实际应用。事实上，通常推荐的培养基还允许未被视为食品污染剂的凝固酶阴性葡萄球菌的生长和根据所要求表型特征的检测。
对于Baird-Parker+RPF(兔血浆+牛纤维蛋白原)培养基，其是根据ISO6888-1和6888-2标准的参考培养基，普遍发现存在某些缺陷。
首先是难以辨认(lecture)和灵敏度：可能出现假阴性，这是由于这样的事实，即金黄色葡萄球菌的某些菌株不在该培养基上显现，或者呈现出非常弱且延缓的凝固酶，这提示存在凝固酶阴性葡萄球菌。而且，由于基质的干扰也可能观察到假阴性结果：事实上，为了计数金黄色葡萄球菌的低水平污染，进行样品的最小稀释(1/10)，这由于基质化合物的存在而导致难以辨认晕圈(例如奶和/或乳制品的样品：酪蛋白的白色掩盖揭示凝固酶的晕圈)。
Baird-Parker+RPF培养基需要组合凝血酶的来源和纤维蛋白溶酶原的来源。后者获得自动物的血液，这导致供给的可靠性问题(质量、数量等)。
而且，不可能在肉汤(液体培养基)中辨认晕圈，并且晕圈与培养基之间的对比可能会减弱。在融合菌落的情况下，难以区分产生晕圈与不产生晕圈的菌落。
其次，可能存在特异性问题：当存在大量附属菌群(例如芽孢杆菌(Bacillus spp))时，这种类型的培养基可以出现假阳性结果。以下就是这种情况，例如对于计数以木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)为发酵剂的某些肉制品(干香肠)和乳制品(Munster型乳酪)中的金黄色葡萄球菌。因此，Baird Parker+RPF培养基中出现的晕圈所环绕的黑色菌落，这是金黄色葡萄球菌在该培养基中的正常特征，但事实上是由木糖葡萄球菌菌株(产生黑色菌落而无晕圈)与产生浑浊的芽孢杆菌(Bacillus)的某些菌株的邻近生长，这可以鉴定为琼脂上的晕圈。
在可选择的方法中，例如显色培养基，由于凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌之间很高的相似性，没有培养基能够非常特异性地区分这两组细菌。事实上，意图区分凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的这种类型培养基所应用的区分概念(即或多或少是特异性的底物和/或糖，与抑制系统组合)通常很复杂，且没有提供良好的区分效果，特别是对于含有不同且大量微生物菌群的食品样品。
缺乏用于区分凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌(或者甚至其他菌种)的特异性的底物或糖意味着使用“攻击性”选择/抑制系统，这可能改变或抑制所涉及的金黄色葡萄球菌的生长或酶活性，从而可能导致获得假阴性结果。
在轻微污染的情况下，由于避免基质相互作用所要求的稀释也可能获得假阴性结果：例如，使用3MTM Petrifilm TM葡萄球菌表达计数板(Staph Express Count Plate)时，乳制品中存在的高水平磷酸酶所导致的粉红色。
相反地，基于底物降解或者糖发酵的培养基对金黄色葡萄球菌的特异性不高，而且抑制系统的选择性不足，因而导致获得假阳性结果。
最后，某些培养基基于使用两种底物来保证最优地区分金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌及其他菌种。应用这一概念增加了培养基的成本却没有提供足够的特异性，特别是在获得自食品的样品的情况下。
磷脂酶C类的酶存在于大量的微生物中是已知且有文献描述的。
在磷脂酶C中，已经纯化和表征了来自金黄色葡萄球菌的磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC)(Phosphatidylinositol-Specifc Phospholipase C from Staphylococcus aureus，METHODS IN ENZYMOLOGY，1981-Vol.71)。
这种酶还已经描述为可能是金黄色葡萄球菌的致病因子(JOURNALOF CLINICAL MICROBIOLOGY，Nov.1989，p.2451-2454-Vol.27，No.11and INFECTION AND IMMUNITY，Dec.1993，p.5078-5089-Vol.61，No.12)。而且，还公开了评价允许金黄色葡萄球菌中活性PIPLC最大产生的条件的体外研究(Marques et al.；Growth in Acidic Media Increases Production of Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C by Staphylococcus aureus；CURRENT MICROBIOLOGY Vol.25(1992)，pp.125-128)。
文献EP-0 970 239 B1描述了允许检测各种微生物所分泌的PIPLC的新显色底物。一方面，给出的实施例描述了所述的各种底物的制备，另一方面证明了使用该方法的最优条件(例如底物/酶的浓度、推荐的诱导物等)。然而，该文献没有描述允许检测葡萄球菌的培养基。
文献EP-1 506 309 B1描述了用于检测能够产生PIPLC的微生物的培养基，所述培养基含有至少一种荧光化合物和至少一种显色化合物的组合，当它们接触PIPLC时分别能够产生荧光和颜色。该培养基描述为允许检测各种菌种而不添加抑制剂，例如单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、伊氏利斯特氏菌(Listeria ivanovii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、金黄色葡萄球菌、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、梭菌(Clostridium)种、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、念珠菌(Candida)种和曲霉菌(Aspergillus)种。然而，该文献中没有描述自身意图用于检测金黄色葡萄球菌的培养基。唯一描述的培养基涉及单核细胞增生利斯特氏菌和蜡状芽孢杆菌群(Bacillus group cereus)的检测。而且，看起来葡萄球菌种尤其是金黄色葡萄球菌在所有描述的培养基中都不生长。
文献EP-0 949 266 B1描述了对细菌活性，尤其是利斯特氏菌(Listeria)属的细菌活性的指示剂PIPLC特异性的底物。所述底物含有至少一种能够产生颜色或荧光的化合物。唯一描述的培养基涉及单核细胞增生利斯特氏菌的检测。而且，葡萄球菌种尤其是金黄色葡萄球菌由于它们的抑制在所有描述的培养基中都不生长。
和其他磷脂酶C一样，磷脂酰胆碱磷脂酶C(PCPLC)也被描述存在于包括金黄色葡萄球菌在内的各种细菌中(J.G.Songer，Trends in Microbiology，Volume 5，Number 4，April 1997，pp.156-161(6))。
文献EP-1 219 628描述了用于检测和鉴定微生物的新显色底物。这些底物是对PCPLC具有特异性的底物。然而，该文献没有描述用于检测和鉴定金黄色葡萄球菌的底物，也没有描述特定的培养基。
因此看起来，尽管超过25年前表征了金黄色葡萄球菌的PIPLC，并鉴定了在该菌种的致病力中的潜在作用，但是还没有描述对金黄色葡萄球菌的检测和/或计数特异性的培养基，其基于使用至少一种对PIPLC特异性的显色、荧光或发光底物，并允许区分这一物种与葡萄球菌的其他种，所描述的培养基上金黄色葡萄球菌菌株的抑制使得它们不可能用于这样的应用。而且，没有文献描述了对PCPLC特异性的显色、荧光或发光底物在用于检测或计数金黄色葡萄球菌的特异性培养基中的用途，所述底物的用途允许区分这一物种与葡萄球菌的其他种。
考虑到上文所述的现有技术状态所面临的问题，本发明的重要目的之一是提供促进葡萄球菌生长的培养基以用于检测和/或鉴定和/或计数该葡萄球菌，并且允许区分金黄色葡萄球菌与葡萄球菌的其他种。
本发明的另一目的是提供限制假阳性结果，尤其是由于凝固酶阴性葡萄球菌的假阳性结果产生的培养基。
本发明的另一目的是提供通过使用减少的抑制系统而允许更好地覆盖靶细菌的培养基，尤其在低污染水平的情况下。
本发明的另一目的是提供通过使用一种特异性底物而允许简单的辨认和解释的培养基。
本发明的另一目的是提供允许自动辨认的培养基。
最后，本发明最后的目的是提供这样的培养基，其由于降低的选择性而促进金黄色葡萄球菌的生长，从而可以缩短返回结果的时间。
本发明所实现的目的首先涉及用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌的特异性培养基，所述培养基的特征在于其包含至少一种磷脂酶C的显色、荧光或发光底物。
“底物”是指能够直接或间接产生由于微生物的酶活性或代谢活性的可检测信号的任何分子。
值得注意的是，底物可以是酶底物，即可以由酶代谢为允许直接或间接检测微生物的产物的底物。
值得注意的是，该底物包含对要检测的酶活性特异性的第一部分和充当标记物的第二部分，下文称之为标记物部分。该标记物部分是显色、荧光、发光的。优选地，本发明所用的底物是荧光的。我们可以提及香豆素衍生物，尤其是7-羟基香豆素、萘酚、试卤灵、荧光素。
对于本发明的意义，该底物可以是磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC)的底物。这种情况下，培养基中PIPLC底物的浓度为0.01至1g/l。
优选地，PIPLC的底物取自包含下列化合物的组：4-硝基苯基肌醇-1-磷酸酯、4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯(4-Méthylumbelliférylmyo-inositol-1-phosphate)、3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-乙氧羰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-氰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯。
根据一替代选择，底物可以是磷脂酰胆碱磷脂酶C(PCPLC)的底物。这种情况下，培养基中PCPLC底物的浓度为0.01至1g/l。
优选地，PCPLC的底物取自包含下列化合物的组：5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸胆碱、3-吲哚氧基磷酸胆碱、4-甲基伞形酮酰磷酸胆碱(4-methylumbelliferyl choline-phosphate)。
在优选的实施方案中，本发明的培养基为液体形式。事实上，这种形式尤其适合于食品中的微生物分析，其可以要求将固体样品混合于培养基中的步骤以允许释放所述样品中可能存在的微生物。
然而，该培养基也可以是固体形式(例如基于琼脂的培养基)。与液体培养基相同，磷脂酶C(PIPLC或PCPLC)的底物可以存在于这些固体培养基中并允许检测、鉴定或甚至计数金黄色葡萄球菌。
或者，本发明的培养基还可以包含使得可以检测靶微生物的不同于磷脂酶C活性的酶活性或代谢活性的底物，例如酯酶(尤其是脂肪酶或磷酸酶)凝固酶或α-葡糖苷酶活性。对于直接检测，该底物可以结合充当荧光或显色标记物的部分。对于间接检测，本发明的培养基还可以包含pH指示剂，该pH指示剂对底物消耗所引起的pH改变敏感，并揭示靶微生物的生长。所述pH指示剂可以是生色团或荧光团。
根据第一实施方案，本发明的选择性培养基用于食品的微生物检查。优选地，其用于生长和计数乳制品中的金黄色葡萄球菌。
根据第二实施方案，本发明的选择性培养基用于环境的微生物监测。“环境”是指空气样品、水样品或来自表面的样品。在来自表面的样品中，在引起医院感染的凝固酶阳性葡萄球菌中，本发明的目的可以在医院环境中的金黄色葡萄球菌的检测中发现具体应用。
根据最后的实施方案，本发明的选择性培养基用于检测和/或鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌的临床分析。
有利地，本发明的选择性培养基还包含抗性的标记物，例如金黄色葡萄球菌菌株对甲氧西林的抗性的测试在本发明的范围内。
本发明的另一目的涉及至少一种磷脂酶C的显色、荧光或发光底物用于区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的用途。
所述用途不限于培养基的制备。事实上，完全可以想到制备鉴定试剂，其具有一种或多种磷脂酶C(PIPLC或PCPLC)的底物且允许鉴定金黄色葡萄球菌。所述试剂可以用于本申请人所销售的产品，例如VITEK卡、API
Figure BPA00001329507500072
或者RAPiDEC
Figure BPA00001329507500073
生化测试试剂盒。
本发明的另一目的涉及至少一种磷脂酶C的底物用于制备用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌的特异性培养基的用途。
本发明的另一目的涉及本发明的培养基用于检测和/或鉴定和/或计数复杂样品中的金黄色葡萄球菌的用途。
最后，本发明最后的目的涉及用于检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用可能含有金黄色葡萄菌的样品接种本发明培养基；
(b)测量所述培养基中荧光、发光或颜色的变化，所述变化对应于所述培养基中金黄色葡萄球菌的生长。
有利地，本发明的方法包括中间步骤a’)由将接种的培养基置于适合允许金黄色葡萄球菌生长的条件下组成。
根据具体的实施方案，本发明的方法可以包括计数靶微生物的补充步骤。所述计数步骤优选根据最大可能数(MPN)法进行。该方法解释于本申请人的专利EP1 105 457。
优选地，生物样品是临床样品、食物样品或环境样品。
最后应当指出，本发明目的的应用并不仅限于单一类型的支持物(support)。事实上，用于体外诊断领域的所有类型的支持物都适合使用：微量培养板、微型管、微吸盘(microcupule)、毛细管等。
以下提供的实施例结合图1的目的是示例本发明，而不意图进行任何形式的限制。它们使得更容易理解本发明。
图1显示荧光随时间的测量，这反映了金黄色葡萄球菌的两种菌株的PC-PLC(卵磷脂酶)酶活性。
实施例1：金黄色葡萄球菌中PIPLC活性与凝固酶存在之间的相关性的研究-TEMPO系统/Baird-Parker+RPF(BP+RPF)培养基的比较
使用本申请人销售的TEMPC
Figure BPA00001329507500081
系统，通过接种Baird-Parker+RPF培养基(bioMérieux Ref.：44003)和源自Ottaviani Agosti琼脂培养基(OAA)，测试金黄色葡萄球菌的43种菌株和凝固酶阴性葡萄球菌的20种菌株。
源自OAA的培养基
所用培养基的组成如下
  成分   浓度g/l
  酵母提取物   5
  胃化动物组织蛋白胨(Biothione)   5
  植物蛋白胨(Biosoyase)   5
  Biotrypcase   5
  丙酮酸钠   2
  葡萄糖   0.01
  甘油磷酸镁   1
  NaCl   5
  LiCl   5
  MgCl2   1
  MgSO4   0.5
  MOPS酸性缓冲液   14.7
  MOPS碱性缓冲液   7
  4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯   0.4
-0.1M MOPS缓冲液pH值6.70(用6N HCl调节)
-底物：4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯，N-甲基-吗啉盐，Biosynth Ref.M-5717批次20078/1)
上述培养基含有4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯，其与营养物基质组合以允许在生长金黄色葡萄球菌的同时通过荧光的出现检测金黄色葡萄球菌。
Figure BPA00001329507500082
将初始浓度为108菌落形成单位(CFU)/ml的测试菌株在胰蛋白胨盐肉汤中稀释，以获得103CFU/ml的最终浓度。将50μl该细菌悬浮液加入4ml培养基中。整体装入TEMPO
Figure BPA00001329507500091
卡中，从而细菌的量是50CFU/卡。
将TEMPO卡在37℃下孵育24小时。
Baird-Parker+RPF培养基的接种和孵育
将50μl 103 CFU/ml的细菌悬浮液也用于接种Baird-Parker+RPF培养基。
将该培养基在37℃下孵育24小时。
结果
根据最大可能数(MPN)法，通过TEMPO
Figure BPA00001329507500093
系统分析TEMPO卡获得的结果。荧光的出现直接与PIPLC对4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯的催化活性有关，这导致释放荧光4-甲基伞形酮。
常规计数在Baird-Parker+RPF培养基上获得的菌落。
下文的表1和表2总结了两种方法获得的结果：
表1：金黄色葡萄球菌中PIPLC活性与凝固酶存在之间的相关性以及每种方法相关的计数(24h)
Figure BPA00001329507500095
Figure BPA00001329507500101
表2：葡萄球菌(Staphyloccocus spp)中PIPLC活性的不存在与凝固酶的不存在之间的相关性以及每种方法相关的计数(40h)
Figure BPA00001329507500102
Figure BPA00001329507500111
-所有测试的金黄色葡萄球菌菌株24h孵育后在Baird-Parker+RPF培养基上显现。它们都具有凝固酶。
-在非金黄色葡萄球菌的葡萄球菌中，只有菌株S46表现出存在凝固酶，用API试剂盒在该菌株上进行的测试证明其实际上是金黄色葡萄球菌。
-S45菌株在Baird-Parker+RPF上具有凝固酶表型，但用TEMPO观察到阳性信号。从平皿分离证明样品被芽孢杆菌污染。
-在24h时，金黄色葡萄球菌的两种菌株(S1和S15)在阳性信号与背景噪声之间表现出轻微的变化。这符合Baird-Parker+RPF上围绕这些菌落的发光晕圈的小直径。延长的孵育(40小时)确认信噪比是正确的。
-检测了在Baird-Parker+RPF上对凝固酶阳性的每种菌株的PIPLC活性。除S45以外，凝固酶阴性菌株不诱导PIPLC活性的阳性信号。
因此，获得的结果清楚地证明了金黄色葡萄球菌的凝固酶活性与PIPLC活性之间的相关性。
实施例2：在微量培养板上用2种不同的PIPLC底物分析金黄色葡萄球菌的PIPLC活性
在微量培养板中测试了的金黄色葡萄球菌ATCC的19种菌株的PIPLC活性。测试用PIPLC的两种不同荧光底物进行：4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯和3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇磷酸酯，以不同浓度添加到实施例1所述的源自OAA培养基的培养基成分中。
Figure BPA00001329507500121
-4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯，N-甲基-吗啉盐，Biosynth(Ref.M-5717批次20078/1)
-3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯(PM 458.36)
3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯的合成
首先根据A.V.Rukavishnikov et al.，Chem.Phys.Lipids，89(1997)，153-157合成受保护的肌醇中间产物。
然后将该中间产物与制备的第二中间产物偶联，即3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素-二异丙基亚磷酰胺(3-chloro-7-hydroxy-4-méthyl-coumarine-diisopropylphosphoroamidite)。通过偶联产物在碘化锂的存在下的去甲基化以及随后的肌醇部分的去保护的反应来获得期望的产物(T.O.Zaikova，et al.，Bioconjugate Chem.，12(2001)，307-313)。
通过NMR分析最终产物和中间产物的分子结构。
微量培养板的接种和孵育
将初始浓度为108(CFU)/ml的测试菌株在胰蛋白胨盐肉汤中稀释，以获得103CFU/ml的最终浓度。
将10μl该细菌悬浮液加入200μl培养基中。于37℃下，在TECAN公司销售的名为GENiosTM的酶标仪中用每种培养基将每种菌株孵育24小时。
接种体的验证
为了验证接种体，将10ml的103CFU/ml的每种细菌悬浮液用于接种Baird-Parker+RPF培养基(bioMérieux Ref.：44003)。
结果
下文的表3总结了微量培养板获得的结果。+号对应于允许产生背景噪声至少两倍的的荧光的菌株。-号对应于培养基所发出的弱于背景噪声的信号。
表3
Figure BPA00001329507500141
在测试的金黄色葡萄球菌ATCC的19种菌株中，只有1种无论使用何种底物均未给出任何PIPLC信号(ATCC49775)。17种在4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯的存在下表现出PIPLC活性，18种在3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯的存在下表现出PIPLC活性。
因此合适地证实了金黄色葡萄球菌的PIPLC活性。
而且，应当指出，总共在金黄色葡萄球菌的109种菌株(在Baird-Parker+RPF培养基上显示为凝固酶阳性)和凝固酶阴性葡萄球菌的26种菌株上进行了PIPLC活性的测量。获得的结果总结于下文的表4中：
表4
Figure BPA00001329507500142
以上结果证实PIPLC活性的测量对于区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌是非常相关的参数。
实施例3：微量培养板中金黄色葡萄球菌PC-PLC(卵磷脂酶)活性的分析(图1)
于微量培养板中，在下文给出的培养基的存在下，评价金黄色葡萄球菌的两种菌株ATCC 33592和ATCC 700699的PC-PLC活性的动力学。然后在动力学条件下辨认微量培养板各个孔的每一个中的荧光的出现。
1、培养基
所用培养基的组成如下，pH 7.2：
  化合物   浓度g/l
  酵母提取物   5
  马铃薯蛋白胨   2
  Rhodorsil   0.4
  硫酸锰   1
  丙酮酸钠   2
  甘油磷酸镁   1
  组氨酸   3
  NaCl   5
  HEPES碱性缓冲液   13.8
  HEPES酸性缓冲液   11.92
  4-甲基伞形酮酰磷酸胆碱(4MU-CP)   0.4
  粘菌素   0.01
4MU-CP由Biosynth公司生产，参考号M-5528
2.测定
在上述培养基的存在下，将10CFU的金黄色葡萄球菌ATCC 33592和ATCC 700699接种于微量培养板的孔中。然后将微量培养板于37℃下在TECAN酶标仪中孵育以评价金黄色葡萄球菌的两种菌株的PC-PLC活性，表示为4MU-CP底物的水解动力学的形式，即荧光的出现。
3、结果及解释
对于测试的金黄色葡萄球菌的两种菌株(STA ATCC 33592和STA ATCC 700699)比未接种的对照培养基(基线)，在72h的孵育时间内，进行4MU-CP底物水解后出现的荧光的测量。
研究的金黄色葡萄球菌的两种菌株的PC-PLC活性的动力学图示于图1中。
因此，PC-PLC的荧光底物，4MU-CP的使用允许检测和区分金黄色葡萄球菌。

Claims (14)

1.用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的特异性培养基，所述培养基特征在于其包含至少一种磷脂酶C的荧光、显色或发光底物。
2.根据权利要求1的培养基，其特征在于所述磷脂酶C的底物是磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC)的底物。
3.根据权利要求2的培养基，其特征在于所述PIPLC的底物的浓度为0.01至1g/l。
4.根据权利要求2或3的培养基，其特征在于所述PIPLC的底物取自包含下列化合物的组：4-硝基苯基肌醇-1-磷酸酯、4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯、3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-乙氧羰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-氰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯。
5.根据权利要求1的培养基，其特征在于所述磷脂酶C的底物是磷脂酰胆碱磷脂酶C(PCPLC)的底物。
6.根据权利要求5的培养基，其特征在于所述PCPLC的底物的浓度为0.01至1g/l。
7.根据权利要求5或6的培养基，其特征在于所述PCPLC的底物取自包含下列化合物的组：5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸胆碱、3-吲哚氧基磷酸胆碱、4-甲基伞形酮酰磷酸胆碱。
8.至少一种磷脂酶C的底物用于区分金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与凝固酶阴性葡萄球菌的用途。
9.至少一种磷脂酶C的显色、荧光或发光底物用于制备用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的特异性培养基的用途。
10.根据权利要求1至7的培养基用于检测和/或鉴定和/或计数复杂样品中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的用途。
11.用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用可能含有金黄色葡萄菌的样品接种根据权利要求1至7中任一项的培养基；
(b)测量所述培养基中荧光、发光或颜色水平的变化，所述变化对应于所述培养基中金黄色葡萄球菌的生长。
12.根据前述权利要求的方法，其包括中间步骤a’)由将接种的培养基置于适合允许所述细菌生长的条件下组成。
13.根据前述权利要求的方法，其包括计数金黄色葡萄球菌的补充步骤。
14.根据权利要求11至13的方法，其特征在于生物样品是临床样品、食物样品或环境样品。
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