JP2011530303A - 黄色ブドウ球菌をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別することができる培養培地 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
さらに、ハローの読取りは、ブロス(液体培地)中では不可能であり、かつハローと培地のコントラストが低下する可能性がある。最後に、コンフルエントなコロニーの場合、ハローを産生するものとそれを産生しないものとを区別するのは困難である。
a)本発明による培養培地に、黄色ブドウ球菌細菌を含有し得る試料を播種すること;及び
b)該培養培地中の黄色ブドウ球菌細菌の増殖に対応する、培養培地中の蛍光、発光または着色の変化を測定すること
からなる工程を含む、方法に関する。
43株の黄色ブドウ球菌および20株のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を、本出願人により市販されているTEMPO(登録商標)システムとともに使用される、ベアド−パーカー+RPF培地(ビオメリュー Ref.:44003)及びオッタビアーニ・アゴスティ寒天培地(OAA)から得られた液体培地に播種することにより検査した。
使用された培地は以下の組成からなる。
− 0.1MのMOPSバッファー pH6.70(6N HClを用いて調整した)
− 基質:4−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−1−リン酸、N−メチル−モルフォリン塩、Biosynth、Ref.M−5717 バッチ20078/1)
上記の培養培地は4−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−1−リン酸を含有しており、増殖と同時に、蛍光の出現による黄色ブドウ球菌の検出を可能にするための栄養基剤と組み合わされる。
108コロニー形成単位(CFU)/mlの初期濃度の、検査される株を、103CFU/mlの最終濃度を得るように、トリプトン塩ブロス中に希釈する。
50μlのこの細菌懸濁液を4mlの培養培地に添加する。細菌の量が50CFU/カードとなるように、全部をTEMPO(登録商標)カードに充填する。
TEMPO(登録商標)カードを37℃で24時間インキュベートする。
103CFU/mlの細菌懸濁液は、50μlの割合でベアド−パーカー+RPF培地に播種するためにも使用する。
この培地を37℃で24時間インキュベートする。
TEMPO(登録商標)カードを用いて得られた結果を、最確数(MPN)の方法に従って、TEMPO(登録商標)システムにより解析する。蛍光の出現は、蛍光4−メチルウンベリフェロンの放出を導くPIPLCの4−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール1−リン酸に対する触媒活性に直接関連する。
ベアド−パーカー+RPF培地上で得られたコロニーを従来通りに測定する。
表1:黄色ブドウ球菌におけるPIPLC活性とコアグラーゼの存在との間の相関関係および各々の方法と関連する数(24h)
表2:ブドウ球菌属におけるPIPLC活性とコアグラーゼの不在の間の相関関係および各々の方法と関連する数(40h)
− 非黄色ブドウ球菌の中で、S46という株だけが、コアグラーゼの存在を示す。この株に対してAPIキットを用いて行なわれた検査は、それが実際には黄色ブドウ球菌であることを示した。
− S45株は、ベアド−パーカー+RPF上では、コアグラーゼ表現型を有するが、TEMPOを用いると、陽性シグナルが観察される。ディッシュからの単離は、バチルス属による試料の汚染を示した。
− 24時間で、2株の黄色ブドウ球菌(S1およびS15)は、陽性シグナルとバックグラウンドノイズの間にわずかな変化を示す。これは、ベアド−パーカー+RPF上のこれらのコロニーの周辺の明るくなったハローの小さい直径と一致する。長期のインキュベーション(40時間)は、シグナル対ノイズ比が正しいことを裏付けた。
− PIPLC活性を、ベアド−パーカー+RPF上でコアグラーゼが陽性である株の各々について検出する。コアグラーゼ陰性株は、S45を除いて、PIPLC活性の陽性シグナルを誘導しない。
こうして得られた結果は、それゆえ、黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ活性とPIPLC活性との間の相関関係をはっきりと示す。
19株のATCCの黄色ブドウ球菌をマイクロプレート中のそれらのPIPLC活性について検査する。これらの検査を、実施例1に記載のOAA培地から得られる培地の成分に様々な濃度で添加される、PIPLCの2つの異なる蛍光性基質:4−メチルウンベリフェリル−ミオ−イノシトール1−リン酸および3−クロロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンミオ−イノシトールリン酸を用いて行なう。
− 4−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール1−リン酸、N−メチル−モルフォリン塩、Biosynth(Ref.M−5717 ロット20078/1)
− 3−クロロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンミオ−イノシトール1−リン酸(PM458.36)
まず、保護されたミオ−イノシトール中間体を、A.V.Rukavishnikov et al.,Chem.Phys.Lipids,89(1997),153-157に従って合成する。
次に、この中間体を、調製された第2の中間体、すなわち、3−クロロ−7−ヒドロキシ−4−メチル−クマリン−ジイソプロピルホスホロアミダイトとカップリングした。所望の産物は、ヨウ化リチウムの存在下におけるカップリング産物の脱メチル化の反応、次のイノシトール部分の脱保護によって得られた(T.O.Zaikova,et al.,Bioconjugate Chem.,12(2001),307−313)。
最終産物のおよび中間体の分子構造をNMRにより解析した。
108(CFU)/mlの初期濃度の、検査される株を、103CFU/mlの最終濃度を得るように、トリプトン塩ブロス中に希釈する。
10μlのこの細菌懸濁液を200μlの培養培地に添加する。各々の株を、GENios(商標)という名の下でTECAN社により市販されているマイクロプレートリーダー中の培地の各々を用いて、37℃で24時間インキュベートした。
播種物を検証するために、10mlの103CFU/mlの各々の細菌懸濁液を、ベアド−パーカー+RPF培地(ビオメリュー Ref.:44003)に播種するために使用する。
マイクロプレートにおいて得られた結果を下記の表3にまとめている。+の表示は、バックグラウンドノイズの少なくとも2倍の蛍光の産生を可能にする株に対応する。−の表示は、培地により放出された、バックグラウンドノイズよりも小さいシグナルに対応する。
従って、黄色ブドウ球菌におけるPIPLC活性は、適切に確認される。
上で提示された結果は、PIPLC活性の測定が黄色ブドウ球菌をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別するための非常に意義あるパラメータであることを裏付けている。
2株の黄色ブドウ球菌、ATCC33592およびATCC700699のPC−PLC活性の動力学を以下に示す培地の存在下においてマイクロプレート中で評価した。次に、マイクロプレートの様々なウェルの各々における蛍光の出現の読取りを動的条件下で行なった。
10CFUの黄色ブドウ球菌、ATCC33592およびATCC700699を上記の培地の存在下においてマイクロプレートのウェル中に植菌した。次に、このマイクロプレートを、TECANリーダー中、37℃でインキュベートし、この2株の黄色ブドウ球菌のPC−PLC活性を、4MU−CP基質の加水分解、すなわち、蛍光の出現の動態の形で評価した。
4MU−CP基質の加水分解後の蛍光の出現の測定を、検査される2株の黄色ブドウ球菌(STA ATCC33592およびSTA ATCC700699)について、植菌されていない対照培地(ベースライン)と比べて、72時間のインキュベーション時間にわたって行なった。
調査された2株の黄色ブドウ球菌のPC−PLC活性の動態は、図1に示すグラフ上に表示されている。
従って、PC−PLCの蛍光性基質、4MU−CPの使用は、黄色ブドウ球菌の検出および識別を可能にする。
Claims (14)
- 黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および/または測定のための特異的培養培地であって、ホスホリパーゼCの少なくとも1つの蛍光性、発色性、または発光性基質を含むことを特徴とする、培地。
- ホスホリパーゼCの基質がホスファチジルイノシトール・ホスホリパーゼC(PIPLC)の基質であることを特徴とする、請求項1に記載の培養培地。
- PIPLCの基質の濃度が0.01〜1g/lであることを特徴とする、請求項2に記載の培養培地。
- PIPLCの基質が、4-ニトロフェニル・ミヨ-イノシトール-1-リン酸、4-メチルウンベリフェリル・ミオ−イノシトール-1-リン酸、3-クロロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン・ミオ-イノシトール-1-リン酸、3-エトキシカルボニル-4-メチルクマリン・ミオ-イノシトール-1-リン酸、3-シアノ-4-メチルクマリン・ミオ-イノシトール-1-リン酸を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項2または3に記載の培養培地。
- ホスホリパーゼCの基質がホスファチジルコリン・ホスホリパーゼC(PCPLC)の基質であることを特徴とする、請求項1に記載の培養培地。
- PCPLCの基質の濃度が0.01〜1g/lであることを特徴とする、請求項5に記載の培養培地。
- PCPLCの基質が、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル・コリンリン酸、3-インドキシル・コリンリン酸、4-メチルウンベリフェリル・コリンリン酸を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項5または6に記載の培養培地。
- コアグラーゼ陰性ブドウ球菌から黄色ブドウ球菌細菌を区別するためのホスホリパーゼCの少なくとも1つの基質の使用。
- 黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および/または測定用の特異的培養培地を調製するためのホスホリパーゼCの少なくとも1つの発色性、蛍光性、または発光性基質の使用。
- 複合試料中の黄色ブドウ球菌細菌を検出および/または同定および/または測定するための、請求項1から7の何れか一項に記載の培養培地の使用。
- 黄色ブドウ球菌細菌を増殖、検出、同定および/または測定する方法であって、
a)請求項1から7の何れか一項に記載の培養培地に、黄色ブドウ球菌細菌を含有する可能性がある試料を播種する工程、及び
b)前記培養培地中の黄色ブドウ球菌細菌の増殖に対応する、前記培養培地中の蛍光、発光または着色のレベルの変化を測定する工程を
を含む、方法。 - 前記播種がされた培養培地を、前記細菌の増殖を可能にするために好適な条件下に置くことからなる中間工程a’)を含む、請求項11に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌を測定する補足的工程を含む、請求項12に記載の方法。
- 生物学的試料が、臨床試料、食品試料または環境試料であることを特徴とする、請求項11から13の何れか一項に記載の方法。
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