WO2018092331A1 - インフルエンザ菌のスクリーニング方法およびスクリーニング用培地 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for detecting hemophilus influenza (Haemophilus influenzae, hereinafter referred to as H. influenzae) and a medium used therefor, and / or H. influenzae, Haemophilus haemolyticus, Haemophilus parainfluenzae (hereinafter referred to as Haemophilus inparainfluenzae, hereinafter). And Haemophilus parahaemolyticus, and a medium used therefor. More specifically, a method and a screening medium capable of easily detecting (screening) the presence or absence of H. influenzae from a subject in which H. influenzae may be present, and / or H.
- the present invention relates to a method capable of discriminating Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus in a specimen in which bacteria and Haemophilus parahemolyticus may be present, and an identification medium.
- Haemophilus influenzae is a Gram-negative gonococci resident in the human nasopharynx, and it is classified into serotypes a to f and non-typable strains due to the difference in antigenicity of the capsular polysaccharide that covers the bacterium.
- Typed. Acapsular strains occupy most of the H. influenzae resident in humans and are often isolated from patients with otitis media, sinusitis, chronic bronchitis, conjunctivitis.
- the causative bacteria of pediatric meningitis and sepsis and adult pneumonia are often b-type capsular strains (Non-patent Document 1).
- chocolate agar medium with improved selectivity by adding chocolate agar medium or bacitracin is used for primary isolation culture of H. influenzae from the test material.
- Haemophilus influenzae requires a sufficient amount of factor X (Hemin or other porphyrin) and factor V (nicotinamide adenine dinucleotide: NAD or its phosphate) for growth, so an enzyme that destroys factor V is present in erythrocytes. It does not grow on sheep blood agar containing abundant sheep blood. On the other hand, since equine blood has a low enzyme content that destroys factor V, Haemophilus influenzae grows on equine blood agar.
- factor X Hemin or other porphyrin
- factor V nicotinamide adenine dinucleotide: NAD or its phosphate
- bacteria are identified by picking out colonies suspected of Haemophilus influenzae from the grown colonies and conducting a confirmation test.
- a confirmation test a test bacterium was applied to a normal agar medium and cultured by placing a disk for X / V factor requirement test, and the test bacterium was divided into four fractionated media (factor X, factor V, factor XV, horse blood, respectively) And a method of examining the porphyrin synthesis ability of the test bacteria (Non-patent Documents 2 and 3, Patent Documents 1, 2 and 3).
- the culture using the sheep blood agar medium is performed in parallel with the culture using the chocolate agar medium or the chocolate agar medium supplemented with bacitracin, and the chocolate agar does not grow on the sheep blood agar medium.
- a colony suspected of Haemophilus influenzae is picked from the colonies that have grown on the medium or the agar medium supplemented with bacitracin, and a confirmation test is performed.
- hemophilus genus bacteria (hemophilus hemolyticus, parainfluenza, hemophilus parahemolyticus, etc.) other than influenza bacteria do not grow on sheep blood agar medium, but grow on chocolate agar medium or chocolate agar medium supplemented with bacitracin, Haemophilus must be identified from the developed Haemophilus spp. Only by its form, and skill is required for the identification.
- confirmation test drugs XV Factor requirement test disk, 4-fractionated medium, porphyrin synthesis ability test drug, etc.
- JP-A-62-155098 Japanese Utility Model Publication No.59-159300 JP 2001-161394 A JP 2001-161396 A
- the present invention has been made in view of the above-described situation, and a method and screening medium that can easily and accurately detect (screening) whether or not Haemophilus influenzae is present in a specimen, and / or in a specimen. It is an object of the present invention to provide a method and an identification medium that can easily and accurately discriminate Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, parahaemophilus and Haemophilus parahaemolyticus.
- the present inventors have added ⁇ -NAD, an antibacterial agent to horse blood agar medium that has not been used in primary isolation culture, and sucrose as a coloring component.
- ⁇ -NAD an antibacterial agent to horse blood agar medium that has not been used in primary isolation culture
- sucrose as a coloring component.
- the bacterial species can be discriminated by the ability to decompose sucrose and the presence or absence of hemolysis of the genus Haemophilus, that is, horse blood as a medium for primary isolation culture
- sucrose and a pH indicator as coloring components
- Haemophilus influenzae (no sucrose decomposition / no hemolysis), Haemophilus haemolyticus (no saccharification / haemolysis), Parainfluenza (with saccharose decomposition / no hemolysis) ), We found that it is possible to identify the Haemophilus para hemo- utility Kas (Yes, there hemolytic decomposition sucrose).
- the present inventors also added a specimen to a medium prepared by adding ⁇ -NAD and an antibacterial agent to a horse blood agar medium, and further adding a galactopyranoside derivative (hereinafter referred to as a Gal derivative) as a coloring component.
- a Gal derivative galactopyranoside derivative
- the bacterial species can be discriminated by the resolution of the Gal derivative of Haemophilus spp. And the presence or absence of hemolysis, that is, ⁇ -NAD and antibacterial agent are added to equine blood agar as a medium for primary isolation culture.
- the visibility of hemolysis and colony color development is improved by adding titanium oxide to the medium to keep the medium color bright, and the addition of sucrose, a pH indicator and a Gal derivative as a coloring component to the medium makes it more accurate.
- the present invention has been completed.
- the present invention has the following configuration. (1) After inoculating a sample on a medium containing at least the following (a), (b), (c) and (d) and capable of growing Haemophilus influenzae, the colony color of the bacteria and the presence or absence of hemolysis A method for screening for Haemophilus influenzae, comprising: confirming. (A) horse blood, (B) ⁇ -NAD or a phosphate thereof, (C) an antibacterial agent, (D) A color forming component having a characteristic of changing the coloration of the colony of Haemophilus influenzae and the color of the colony of Parainfluenza to different colors.
- the antibacterial agent is an antibacterial agent that suppresses the growth of Gram-positive bacteria
- the sugar that is not decomposed by the H. influenzae but that is decomposed by the para H. influenzae to produce an acid is sucrose
- the pH indicator is selected from aniline blue, bromocresol purple, bromothymol blue, phenol red, neutral red and methyl red
- the method for screening for Haemophilus influenzae according to (2), wherein the enzyme color-developing substrate that is not decomposed by Haemophilus influenzae but develops color by being decomposed by Parainfluenza is a galactopyranoside derivative.
- A horse blood, (B) ⁇ -NAD or a phosphate thereof, (C) an antibacterial agent, (D) a coloring component, the coloration of the colony of Haemophilus influenzae and the coloration of the colony of Parainfluenza are different, the coloration of the colonies of Haemophilus haemophilus hemolyticus is the same color, and parainfluenza A coloring component having the property of making the coloration of colonies of fungi and Haemophilus parahemolyticus the same color.
- the antibacterial agent is an antibacterial agent that suppresses the growth of Gram-positive bacteria
- the sugar that is not decomposed by the H. influenzae and Haemophilus hemolyticus but is decomposed by the H. influenzae and Haemophilus parahemolyticus to produce an acid is white sugar
- the pH indicator is selected from aniline blue, bromocresol purple, bromothymol blue, phenol red, neutral red and methyl red
- the enzyme chromogenic substrate that is not degraded by the Haemophilus influenzae and Haemophilus hemolyticus but is decomposed by the Haemophilus parahaemolyticus and Haemophilus parahemolyticus is a galactopyranoside derivative.
- a medium for screening for H. influenzae comprising the following (a), (b), (c) and (d) in a medium capable of growing H. influenzae: (A) horse blood, (B) ⁇ -NAD or a phosphate thereof, (C) an antibacterial agent, (D) A color forming component having a characteristic of changing the coloration of the colony of Haemophilus influenzae and the color of the colony of Parainfluenza to different colors.
- the medium for screening for Haemophilus influenzae according to (7), wherein the coloring component is the following (d1) and / or (d2).
- (D1) a sugar and a pH indicator that are not degraded by Haemophilus influenzae but are decomposed by Parahaemophilus to produce an acid
- (D2) An enzyme chromogenic substrate that is not degraded by Haemophilus influenzae but develops color by being degraded by Parainfluenza.
- the antibacterial agent is an antibacterial agent that suppresses the growth of Gram-positive bacteria
- the sugar that is not decomposed by the H. influenzae but that is decomposed by the para H. influenzae to produce an acid is sucrose
- the pH indicator is selected from aniline blue, bromocresol purple, bromothymol blue, phenol red, neutral red and methyl red
- the medium for screening for H. influenzae according to (8), wherein the enzyme color-developing substrate that is not decomposed by H. influenzae but develops color by being decomposed by P. influenzae is a galactopyranoside derivative.
- a medium for screening for Haemophilus influenzae comprising at least the following components per liter of the medium.
- A Horse blood 10-100 mL
- B ⁇ -NAD 1-100 mg
- C bacitracin 1-800 mg and / or vancomycin 0.5-40 mg
- D 1-40 g of sucrose and 40-400 mg of aniline blue and / or 40-300 mg of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside.
- H. influenzae hemophilus hemolyticus, parainfluenza and hemophilus para, characterized in that the following medium (a), (b), (c) and (d) is contained in a medium in which H. influenzae can grow: A medium for identifying hemolyticus.
- A horse blood, (B) ⁇ -NAD or a phosphate thereof, (C) an antibacterial agent, (D) a coloring component, the coloration of the colony of Haemophilus influenzae and the coloration of the colony of Parainfluenza are different, the coloration of the colonies of Haemophilus haemophilus hemolyticus is the same color, and parainfluenza A coloring component having the property of making the coloration of colonies of fungi and Haemophilus parahemolyticus the same color.
- (D1) a sugar and pH indicator that is not degraded by Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus but is decomposed by Haemophilus parahaemolyticus and Haemophilus parahaemolyticus to produce an acid
- (D2) An enzyme chromogenic substrate that is not decomposed by Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus but develops color by being decomposed by Haemophilus parahaemolyticus and Haemophilus parahaemolyticus.
- the antibacterial agent is an antibacterial agent that suppresses the growth of Gram-positive bacteria
- the sugar that is not decomposed by the H. influenzae and Haemophilus hemolyticus but is decomposed by the H. influenzae and Haemophilus parahemolyticus to produce an acid is white sugar
- the pH indicator is selected from aniline blue, bromocresol purple, bromothymol blue, phenol red, neutral red and methyl red
- the enzyme chromogenic substrate that is not degraded by the Haemophilus influenzae and Haemophilus hemolyticus but is decomposed by the Haemophilus influenzae and Haemophilus parahemolyticus and develops color is a galactopyranoside derivative.
- a medium for distinguishing Haemophilus influenzae, Haemophilus hemolyticus, Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus comprising at least the following components per liter of the medium.
- A Horse blood 10-100 mL
- B ⁇ -NAD 1-100 mg
- C bacitracin 1-2.5 mg and / or vancomycin 0.5-10 mg
- D 1-40 g of sucrose and 40-400 mg of aniline blue and / or 40-300 mg of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside.
- Haemophilus haemophilus, Haemophilus haemolyticus, Haemophilus parahemo, and H. pneumoniae by primary isolation culture which were impossible in the past only by confirming the colony color of the bacteria grown on the medium and the presence or absence of hemolysis, were impossible.
- Easy identification of riticas is possible. Thereby, it is possible to detect (screen) H. influenzae much more easily and accurately than the conventional primary isolation culture method using chocolate agar medium.
- the number of colonies that can be fished for the confirmation test after the separation culture can be reduced, and further, it is not necessary to confirm the presence or absence of hemolysis in the confirmation test.
- the basal medium contains (a) horse blood, (b) ⁇ -NAD or its phosphate, (c) an antibacterial agent, and (d) a coloring component, What added the coloring component which has the characteristic which makes the coloration of the colony of Parainfluenza bacteria a different color can be used as a culture medium of this invention.
- the medium of the present invention contains, as a nutritional component, an ingredient capable of growing Haemophilus influenzae and capable of determining the presence or absence of hemolysis due to Haemophilus spp.
- Factor X and factor V are necessary for the growth of Haemophilus influenzae.
- horse blood is added as a source of factor X, and ⁇ -NAD or its phosphate ⁇ -NAD is added as factor V.
- NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
- ⁇ -NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form.
- Factor V is also present in horse blood.
- ⁇ -NAD or its phosphate is added in addition to horse blood for the purpose of promoting the growth of Haemophilus influenzae.
- the horse blood contained in the medium of the present invention is also used to determine the presence or absence of hemolysis due to Haemophilus spp.
- bacteria that produce hemolysin grow on the medium of the present invention erythrocytes present in the medium are hemolyzed to be transparent, and a transparent hemolysis zone is formed around the colony. Therefore, when hemophilus hemolyticus, hemophilus parahemolyticus, or the like, which is a hemophilus genus producing hemolysin, grows on the medium of the present invention, it is determined that hemolysis is present.
- Haemophilus influenzae, parainfluenza, etc. that do not produce hemolysin grow on the medium of the present invention no hemolysis is formed around the colony, and it is determined that there is no hemolysis.
- the amount of horse blood added can be appropriately selected within a range in which Haemophilus influenzae can grow and the presence or absence of hemolysis by Haemophilus spp. Can be discriminated, but is preferably 10 to 100 mL / L, for example. .
- the additive concentration of factor V can be appropriately selected within the range in which Haemophilus influenzae can grow.
- the additive concentration of ⁇ -NAD is preferably 1 to 100 mg / L.
- the medium of the present invention contains a coloring component having a characteristic that makes the coloration of the colony of Haemophilus influenzae different from that of the parainfluenza colony.
- color-developing components include (1) sugars and pH indicators that are not degraded by Haemophilus influenzae, but are decomposed by Parainfluenza bacteria to produce acids, and / or (2) are not degraded by Haemophilus influenzae.
- the coloring component contained in the culture medium of the present invention makes the coloration of the colony of Haemophilus influenzae different from the coloration of the colony of Parainfluenza, makes the coloration of the Haemophilus haemophilus haemolyticus colony the same color, In addition, it also has the property of making the coloration of the colonies of Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus the same color.
- coloring components include (1) sugars and pH indicators that are not degraded by Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus but are decomposed by Haemophilus parahaemolyticus and Haemophilus parahemolyticus to produce acid, and And / or (2) an enzyme chromogenic substrate that is not degraded by Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus but develops color when decomposed by Haemophilus parahaemolyticus and Haemophilus parahemolyticus.
- the type of sugar used in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as H. influenzae does not have resolution and P. influenzae has resolution.
- sugars include sucrose and mannose.
- sucrose by using sucrose, it is possible to accurately distinguish Haemophilus influenzae (without saccharose decomposition) and Parainfluenza bacterium (with saccharose decomposition).
- sucrose does not have the resolution of Haemophilus haemolyticus
- Haemophilus parahemolyticus is also a saccharide with the resolution, so by using sucrose, hemophilus haemolyticus (no sucrose decomposition) and haemophilus parahemolyticus are used.
- sucrose decomposition can also be identified with high accuracy. These utilize the difference in sucrose degradability by bacteria.
- the added concentration of sucrose is not degraded by Haemophilus influenzae, but is decomposed by Parahaemophilus to produce acid, or not degraded by Haemophilus influenzae and Haemophilus hemolyticus, but degraded by Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus
- the acid can be appropriately selected within the range where the acid is generated.
- the concentration of such sucrose can be, for example, 1 to 40 g / L, more preferably 1 to 20 g / L, and even more preferably 1 to 15 g / L.
- mannose can be added as necessary.
- Mannose is also a saccharide in which Haemophilus influenzae does not have resolution and Parainfluenza has resolution, so that the same effect can be obtained by adding mannose in addition to sucrose.
- the type of pH indicator used in the medium of the present invention is not particularly limited as long as it changes color with a pH change derived from an acid generated by the decomposition of sucrose.
- pH indicators having different neutral colors and acidic colors, aniline blue, bromocresol purple, bromothymol blue, phenol red, neutral red, methyl red and the like can be used.
- Table 1 shows examples of the types of pH indicators and coloration of colonies when sucrose and a pH indicator are added as coloring components.
- sucrose such as Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, etc.
- the addition concentration of the pH indicator is not particularly limited as long as it is a concentration that can change the colony color of the bacteria in accordance with the pH change derived from the acid generated by the decomposition of sucrose.
- aniline blue 40 to 400 mg / L bromocresol Purple 40-120 mg / L, Bromothymol blue 40-80 mg / L, Phenol red 40-120 mg / L, Neutral red 2-4 mg / L, Methyl red 40-80 mg / L, and the like.
- the enzyme coloring substrate used in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it is not decomposed by Haemophilus influenzae but is decomposed by Parainfluenza and develops color.
- an enzyme for example, galactosidase, which is an enzyme that is not expressed in Haemophilus influenzae but expressed in Parainfluenza, is selected, and the enzyme chromogenic substrate is made into a Gal derivative, whereby Haemophilus influenzae (without Gal derivative decomposition) and Parainfluenza ( Can be accurately identified.
- the Gal derivative is not decomposed by Haemophilus haemolyticus but also has the property of being decomposed by Haemophilus parahemolyticus to develop a color.
- Haemophilus haemolyticus (no Gal derivative decomposition) and Haemophilus are used. ⁇ Parahemolyticus (with Gal derivative decomposition) can be identified with high accuracy.
- the Gal derivative used in the medium of the present invention is not particularly limited as long as it is a compound to which a chromophore compound or a fluorescent chromophore compound is bonded so that it can be hydrolyzed by galactosidase.
- the bonded chromophore compound examples include 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl, 5-bromo-3-indoxyl, 4- Indoxyl derivatives such as chloro-3-indoxyl, 6-chloro-3-indoxyl, 6-fluoro-3-indoxyl, 3-indoxyl, 5-iodo-3-indoxyl, N-methylindoxyl, Examples thereof include phenyl derivatives such as 2-chloro-4-nitrophenyl, 2-nitrophenyl, 4-nitrophenyl and 4-aminophenyl, and naphthyl derivatives such as 6-bromo-2-naphthyl.
- fluorescent chromophore compound examples include quinoline derivatives such as 8-hydroxyquinoline, coumarin derivatives such as 4-methylumbelliferyl and 7-hydroxycoumarin-6-yl, 7-bromo-N- (2- Methoxyphenyl) -3-hydroxy-2-naphthalenecarboxamide (naphthol AS-BI), naphthyl derivatives such as 1-naphthyl and 2-naphthyl, and resorufin.
- quinoline derivatives such as 8-hydroxyquinoline
- coumarin derivatives such as 4-methylumbelliferyl and 7-hydroxycoumarin-6-yl
- 7-bromo-N- (2- Methoxyphenyl) -3-hydroxy-2-naphthalenecarboxamide naphthol AS-BI
- naphthyl derivatives such as 1-naphthyl and 2-naphthyl
- resorufin examples include resorufin.
- Table 2 shows specific examples of the enzyme chromogenic substrate and the coloration of the colony when only the Gal derivative, which is the enzyme chromogenic substrate, is added as a chromogenic component.
- the medium of the present invention Haemophilus haemophilus hemolyticus Bacterial colonies that do not degrade the Gal derivative are uncolored, and bacterial colonies that degrade the Gal derivative, such as Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus, develop color of the chromophore compounds released by the degradation. Color based.
- an ultraviolet lamp or the like is used to irradiate ultraviolet light having a wavelength suitable for the fluorescent chromophore compound to the culture medium after culture.
- the Haemophilus influenzae (Gal Derivatives-free / haemolysis), Haemophilus haemolyticus (with no Gal derivative decomposition / haemolysis), Parainfluenza (with Gal derivative decomposition / no hemolysis), Haemophilus parahaemolyticus (with Gal derivative decomposition / haemolysis) Identification is possible.
- the coloration of bacterial colonies can be visually discerned, but since the medium contains horse blood, the color of the medium is dark reddish brown, compared to the case where a pH indicator or a chromophore compound exhibiting red is used.
- the colony color can be easily distinguished when a pH indicator or chromophore compound exhibiting blue, green, purple, yellow or the like is used.
- an insoluble white compound such as titanium oxide
- the addition concentration of titanium oxide is not particularly limited, but can be, for example, 1 to 8 g / L.
- an enzyme chromogenic substrate can be used alone, but two or more enzyme chromogenic substrates can be used in appropriate combination depending on the purpose of detection. Further, for example, it is hydrolyzed by galactosidase such as isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (hereinafter referred to as IPTG) in addition to the enzyme chromogenic substrate. Furthermore, an enzyme substrate that does not develop color can also be used as a hydrolysis reaction accelerator.
- the concentration of the enzyme chromogenic substrate added is not particularly limited as long as it can visually identify the coloration of bacterial colonies by chromophore compounds or fluorescent chromophore compounds released by hydrolysis with galactosidase derived from bacteria grown on the medium.
- the enzyme chromogenic substrate may be 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside 40 to 300 mg / L.
- IPTG 10 to 200 mg / L can be added as a hydrolysis reaction accelerator.
- Example 1 As described above, in the present invention, by adding sucrose and a pH indicator as a coloring component, or by adding only an enzyme chromogenic substrate as a coloring component, Haemophilus influenzae, Haemophilus hemolyticus, Parainfluenza and Hemophilus parahemolyticity are added. It is possible to identify wastes and to detect Haemophilus influenzae, and by using these as coloring components, detection can be performed without missing the Haemophilus influenzae (Examples 1 and 2 shown later). Further, as in Example 3 shown later, by adding a galactose which is an enzyme coloring substrate in addition to sucrose and a pH indicator as coloring components, it is possible to distinguish between influenza and parainfluenza with higher accuracy.
- a galactose which is an enzyme coloring substrate in addition to sucrose and a pH indicator as coloring components
- sucrose is not decomposed and 5-bromo-3-indolyl Bacterial colonies that do not degrade ⁇ -D-galactopyranoside are uncolored, colonize bacteria that degrade sucrose and degrade 5-bromo-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside
- the color is purple and decomposes sucrose but does not decompose 5-bromo-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside
- the colony color of the bacteria is red, but does not decompose saccharose, but 5-bromo-3-indolyl- Bacterial colonies that degrade ⁇ -D-galactopyranoside have a blue color, so that H.
- influenzae (white to grayish white, no hemolysis), Haemophilus hemolyticus (white to grayish white, Hemolysis), parainfluenza (purple, red or blue, without hemolysis), and hemophilus parahemolyticus (purple, red or blue, with hemolysis) can be identified.
- the medium of the present invention containing sucrose, aniline blue and 4-methyl-umbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside as a coloring component does not decompose sucrose and is 4-methyl-umbelliferyl.
- Bacterial colonies that do not degrade - ⁇ -D-galactopyranoside are colorless (no fluorescence), degrade sucrose, and degrade 4-methyl-umbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside
- Bacterial colony color is blue + fluorescent color, decomposes saccharose, but 4-methyl-umbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside does not decompose
- Bacterial colony color is blue (no fluorescence), sucrose decomposes
- the colony color of the bacteria that decompose 4-methyl-umbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside is uncolored + fluorescent coloration, H.
- influenzae (white to grayish white, hemolysis None), Haemophilus haemolyticus (white to grayish white with hemolysis), Parainfluenza (blue + fluorescence, blue (no fluorescence), or no color + fluorescence, no hemolysis), Haemophilus parahemolyticus (blue + Fluorescence development, blue (no fluorescence), or no coloration + fluorescence development / haemolysis can be identified.
- the antibacterial agent contained in the culture medium of the present invention does not interfere with detection (screening) of H. influenzae, identification of H. influenzae, Haemophilus haemolyticus, parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus, and contamination of non-Hemophilus species. It is an antibacterial agent that suppresses growth. Such an antibacterial agent is not particularly limited. For example, it is preferable to add at least one antibacterial agent having an antibacterial spectrum that inhibits the growth of Gram-positive bacteria.
- Antibacterial agents with an antibacterial spectrum that inhibits the growth of Gram-positive bacteria are not particularly limited, but specific examples include polypeptide antibacterial agents such as bacitracin (BC), glycopeptides such as vancomycin (VCM) and teicoplanin (TEIC). Antibacterial agents and the like.
- the antibacterial agent to be added can be only one type, but can also be two or more types. It is also possible to add an antibacterial agent other than an antibacterial agent having an antibacterial spectrum that inhibits the growth of Gram-positive bacteria, or an antifungal agent that inhibits fungal growth.
- the concentration of the antibacterial agent be within a concentration range in which H. influenzae can grow and does not hinder detection of H. influenzae.
- Haemophilus haemolyticus, Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus Haemophilus haemophilus, Haemophilus haemolyticus, Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus can be developed and It is preferable to add an antibacterial agent in a concentration range that does not interfere with the identification of Haemophilus haemolyticus, Parainfluenza, and Haemophilus parahaemolyticus.
- bacitracin when bacitracin is added alone for screening for H. influenzae, 1 to 800 mg is used. / L, when vancomycin is added alone, 0.5-40 mg / L, when both bacitracin and vancomycin are added, bacitracin can be 1-800 mg / L and vancomycin 0.5-40 mg / L .
- bacitracin when bacitracin is added for screening for Haemophilus influenzae, it may be 5 to 800 mg / L, more preferably 10 to 800 mg / L, and most preferably 10 to 300 mg / L. preferable.
- vancomycin When vancomycin is added for screening for Haemophilus influenzae, it can be 1 to 40 mg / L, more preferably 3 to 20 mg / L, and most preferably 3 to 10 mg / L.
- bacitracin when bacitracin is added alone for identification of Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus, 1 to 2.5 mg / L, when vancomycin is added alone, 0.5-10 mg / L, when adding bacitracin and vancomycin together, it is preferable to make bacitracin 1-2.5 mg / L and vancomycin 0.5-10 mg / L, but when adding vancomycin alone 0.5 to 5 mg / L, and when bacitracin and vancomycin are added together, bacitracin 1 to 2.5 mg / L and vancomycin 0.5 to 5 mg / L are more preferable.
- the culture medium of the present invention contains an antibacterial agent for suppressing the growth of contaminants other than the genus Haemophilus. Nevertheless, even if the germs grow, if the colonies of the germs that have grown are [with sucrose decomposition and / or hemolysis], it can be easily determined that they are not H. influenzae. In addition, even if the colony of contaminating bacteria is [no saccharose decomposition / no hemolysis], if the culture using the sheep blood agar medium is performed in parallel with the culture using the medium of the present invention, other than the genus Haemophilus Since the other bacteria grow on the sheep blood agar medium, it can be determined that they are not Haemophilus influenzae.
- the medium of the present invention comprises at least (a) horse blood, (b) ⁇ -NAD or a phosphate thereof, (c) an antibacterial agent, and (d) a coloring component, and the coloration and paralysis of Haemophilus influenzae colonies.
- action which the culture medium of this invention has is that the hemophilus genus microbe can be discriminate
- the medium of the present invention containing the above components and having an action can be used for identification of Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, parainfluenza and Haemophilus parahaemolyticus, screening for Haemophilus influenzae, etc. is there.
- the medium of the present invention is used as a medium for distinguishing Haemophilus haemophilus, Haemophilus haemolyticus, Parahaemophilus and Haemophilus parahemolyticus by utilizing the effect that Haemophilus spp. Can be identified.
- it can be used as a screening medium for H. influenzae by utilizing the action that H. influenzae can be detected.
- the culture medium of the present invention contains hemophilus bacteria such as hemophilus hemolyticus, parainfluenza, hemophilus parahemolyticus, etc. by adjusting the type and concentration of the antibacterial agent used. ) And a case where the growth of other bacteria other than H. influenzae is substantially suppressed. Therefore, the medium for screening for H. influenzae of the present invention includes a medium for detection of H. influenzae and a selection medium for H. influenzae. On the other hand, the culture medium of the present invention can be used as a culture medium for identification of Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, Parainfluenza, and Haemophilus parahemolyticus.
- the basal medium used in the present invention is not particularly limited as long as it is a medium in which Haemophilus spp. Can grow, such as a normal agar medium, a Muller Hinton agar medium, and a tryptosoy agar medium.
- the medium of the present invention can be further added with nutrients, minerals and other components suitable for the growth of Haemophilus as needed.
- the range of the pH of the medium of the present invention is not particularly limited as long as the pH indicator is discolorable in accordance with a pH change derived from an acid generated by the decomposition of sucrose, in which Haemophilus can grow.
- the pH can be about 7 to 8, preferably 7.0 to 8.0. Specifically, it can be set to 7.3 ⁇ 0.3, 7.6 ⁇ 0.3, and the like as in the embodiments described later.
- a medium containing the components shown in Table 3 below per 1 L of the medium can be used to screen for H. influenzae, but a medium containing the ingredients shown in Table 4 below is used. It is more preferable.
- sodium glutamate (0 to 5 g / L) can be used as a nutritional component and mineral component in place of yeast extract and soluble starch.
- sodium glutamate (0 to 5 g / L) can be used in place of yeast extract and soluble starch.
- N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N′-ethanesulfonic acid (hereinafter referred to as HEPES) is used in place of potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate.
- MOPS 3-morpholinopropanesulfonic acid
- ACES N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid
- Good buffer such as (0-10 g / L) can be used.
- HEPES (0-10 g / L) is used instead of potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate.
- Good buffer such as L), MOPS (0 to 10 g / L), ACES (0 to 10 g / L) can be used.
- a medium containing the components shown in Table 5 below per 1 L of the medium is used.
- a medium containing the components shown in Table 6 below it is more preferable to use a medium containing the components shown in Table 6 below.
- sodium glutamate (0 to 5 g / L) can be used as a nutritional component and mineral component in place of the yeast extract and soluble starch, and the present invention shown in Table 6 can be used.
- sodium glutamate (0 to 5 g / L) can be used in place of yeast extract and soluble starch.
- HEPES (0 to 10 g / L), MOPS (0 to 10 g / L), ACES (0 to 10 g) were used instead of potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate.
- HEPES 0.1%
- MOPS potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate Good buffering agents
- (0 to 10 g / L) and ACES 0.1%
- Specimens used in the present invention are not particularly limited as long as the presence of Haemophilus species including Haemophilus influenzae is suspected.
- Specific examples include human pharyngeal wiping fluid, nasopharyngeal wiping fluid, cerebrospinal fluid, otorrhea, and eye oil.
- the form of the medium of the present invention is not particularly limited as long as the presence or absence of hemolysis can be confirmed, such as a solid or sheet-like medium, but from the viewpoint of ease of detection and identification, a solid medium is preferable, and a flat solid medium Is more preferable.
- solidifying agent for the solid medium examples include commonly used ones such as agar and agarose.
- the colony color of all tested H. influenzae was grayish white indicating no saccharolysis and no hemolysis.
- the colony colors of all the H. influenzae tested were grayish white indicating no decomposition of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside, and hemolysis
- all the H. influenzae colony colors tested showed no sucrose degradation and no 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside degradation. The color was grayish white and no hemolysis.
- the color of all tested parainfluenza colonies is sucrose degradation and / or 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside degradation. Since blue was expressed and there was no hemolysis, and E. coli also had a blue colony color and no hemolysis, sucrose, aniline blue and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopira were used as coloring components. It was shown that the medium containing noside had no false positives and could distinguish Haemophilus influenzae from other bacteria with higher accuracy.
- Haemophilus influenzae (gray white / no hemolysis), Haemophilus haemolyticus (gray white / haemolysis), Parainfluenza (blue / no haemolysis), Haemophilus Parahemolyticus (blue, with hemolysis) all grew well, and it was shown that these bacterial species could be identified by colony color and the presence or absence of hemolysis.
- Haemophilus parahaemolyticus Haemophilus haemolyticus, Parainfluenza, and Haemophilus parahemolyticus can be distinguished by colony color and the presence or absence of hemolysis. Kas was a weak growth.
- the medium of any antibacterial agent concentration examined could detect H. influenzae by colony color and the presence or absence of hemolysis.
- the pH indicator is aniline blue or phenol red, inoculated with Haemophilus influenzae, Haemophilus haemolyticus, parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus, and the performance of the medium is examined. It was. The names of the strains used are shown in Table 16.
- Both the medium using aniline blue and the medium using phenol red as a pH indicator can distinguish H. influenzae, Haemophilus haemolyticus, parainfluenza and Haemophilus parahaemolyticus by colony color and the presence or absence of hemolysis. there were.
- Poremedia registered trademark
- sheep blood agar medium Eiken Chemical medium
- conventional method A medium Eiken Chemical medium
- conventional method B medium Becton Dickinson's bacitracin-added medium
- Results are shown in Table 18 below.
- the results with the culture medium of the present invention are expressed as + with hemolysis and-with no hemolysis, and are displayed together with the colony color. Yes.
- the culture medium of the present invention when bacitracin alone is used as the antibacterial agent, vancomycin alone is used, or bacitracin and vancomycin are added together, the H. influenzae, hemophilus hemolyticus due to colony color and the presence or absence of hemolysis It was possible to identify Parainfluenza and Haemophilus parahemolyticus and to detect Haemophilus influenzae.
- the colonies that grew on the conventional method A medium and B medium were all grayish white, and there was no means for distinguishing Haemophilus haemophilus, Haemophilus haemolyticus, parahaemophilus and Haemophilus parahaemolyticus other than its morphology. From this, it was shown that the culture medium of the present invention can detect H. influenzae remarkably easily and accurately as compared with the conventional method.
- the media of the present invention when bacitracin alone is used as an antibacterial agent, vancomycin alone is used, or both bacitracin and vancomycin are added together, a certain inhibitory effect against contaminants other than the genus Haemophilus Among the tested media, in particular, the media of the present invention supplemented with 300 mg / L bacitracin and 10 mg / L vancomycin best suppressed the growth of contaminating bacteria, and extremely easily and accurately detected H. influenzae. It was shown to be possible. Although growth of some of the contaminants was also observed in the culture medium of the present invention, it was easily determined that the contaminants did not belong to the genus Haemophilus because they also grew on the sheep blood agar medium.
- Table 19 shows the identification results using Eiken Chemical's XV multi-disc
- Table 20 shows the identification results using API NH manufactured by Sysmex Biomelieu.
- sucrose addition concentration A medium containing sucrose and aniline blue as coloring components was inoculated with Haemophilus influenzae, Parainfluenza, and Haemophilus haemolyticus, and the concentration of sucrose capable of distinguishing these species was examined.
- the names of the strains used are shown in Table 23.
- the buffer component is phosphate buffer, HEPES, MOPS or ACES, and influenza Bacteria, parainfluenza and Haemophilus haemolyticus were inoculated and the performance of the medium was examined.
- the names of the strains used are shown in Table 26.
- H. influenzae In culture media using any of phosphate buffer, HEPES, MOPS, and ACES as buffer components, it is possible to distinguish H. influenzae, H. influenzae, H. influenzae, and H. pneumoniae by the colony color and the presence or absence of hemolysis. Bacteria could be detected well.
- the method for detecting Haemophilus influenzae according to the present invention and the medium used therefor only confirm the colony color of the bacteria grown on the medium and the presence or absence of hemolysis.
- Haemophilus haemophilus, Haemophilus haemolyticus, parainfluenza and haemophilus para Easy identification of hemolyticus becomes possible.
- the time required for primary isolation culture and confirmation test, the labor involved in operation, and the cost of confirmation test are compared to conventional methods. Significant reduction is possible. Therefore, the method and the medium of the present invention are useful in clinical fields, epidemiological studies, and other wide fields.
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Abstract
本発明は、初代分離培養により、容易かつ正確にインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を検出可能な方法およびそれに用いる培地を提供することを目的とし、具体的には、少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法に関する。 （ａ）ウマ血液、 （ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、 （ｃ）抗菌剤、 （ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
Description
本発明は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae、以下、インフルエンザ菌という。）の検出方法およびそれに用いる培地、並びに／または、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae、以下、パラインフルエンザ菌という。）およびヘモフィルス・パラヘモリティカス（Haemophilus parahaemolyticus）の識別方法およびそれに用いる培地に関するものである。より詳細には、インフルエンザ菌が存在する可能性のある被検体から、インフルエンザ菌の存否を、容易に検出（スクリーニング）できる方法およびスクリーニング用培地、並びに／または、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスが存在する可能性のある検体中の、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを識別できる方法および識別用培地に関する。
インフルエンザ菌は、ヒトの鼻咽腔に常在するグラム陰性桿菌であり、菌を被う莢膜多糖体の抗原性の違いによりa～fの血清型と無莢膜株（non-typable）に型別される。無莢膜株は、ヒトに常在するインフルエンザ菌の多くを占め、中耳炎、副鼻腔炎、慢性気管支炎、結膜炎の患者からしばしば分離される。一方、小児の髄膜炎や敗血症、成人の肺炎の起因菌はb型莢膜株であることが多い（非特許文献１）。
通常、検査材料からのインフルエンザ菌の初代分離培養には、チョコレート寒天培地あるいはバシトラシンを添加して選択性を向上させたチョコレート寒天培地が用いられる。インフルエンザ菌は、発育に十分量のＸ因子（Heminまたは他のポルフィリン）とＶ因子（nicotinamide adenine dinucleotide：ＮＡＤ、またはそのリン酸塩）を必要とするため、Ｖ因子を破壊する酵素が赤血球中に多量に存在するヒツジ血液を含有するヒツジ血液寒天培地には発育しない。一方、ウマ血液はＶ因子を破壊する酵素含有量が少ないため、ウマ血液寒天培地にはインフルエンザ菌が発育する。しかし、発育したインフルエンザ菌のコロニーが微小であるため、ウマ血液寒天培地はインフルエンザ菌の初代分離培養用としては使用されない。そのため、Ｘ因子およびＶ因子を豊富に含有するチョコレート寒天培地がインフルエンザ菌の初代分離培養に用いられている。
初代分離培養後は、発育したコロニーの中からインフルエンザ菌を疑うコロニーを釣菌して確認試験を行うことにより、細菌が同定される。確認試験としては、被験菌を普通寒天培地に塗布し、Ｘ・Ｖ因子要求試験用ディスクを置いて培養する方法、被験菌を4分画培地（それぞれＸ因子、Ｖ因子、ＸＶ因子、ウマ血液を含有している培地）に塗布して培養する方法、被験菌のポルフィリン合成能を調べる方法等がある（非特許文献２および３、特許文献１、２および３）。
初代分離培養時、実際には、チョコレート寒天培地またはバシトラシン添加チョコレート寒天培地を用いた培養と並行して、ヒツジ血液寒天培地を用いた培養が行われ、ヒツジ血液寒天培地に発育せず、チョコレート寒天培地やバシトラシン添加チョコレート寒天培地に発育したコロニーの中からインフルエンザ菌を疑うコロニーを釣菌して確認試験が行われる。しかし、インフルエンザ菌以外のヘモフィルス属菌（ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等）もヒツジ血液寒天培地に発育せず、チョコレート寒天培地やバシトラシン添加チョコレート寒天培地に発育するため、発育したヘモフィルス属菌の中から形態のみによってインフルエンザ菌を識別しなければならず、その識別には熟練した技術が必要とされる。また、初代分離培養により発育した多数のコロニーの中からインフルエンザ菌を疑うコロニー全てを釣菌して確認試験を行うため、熟練した技術に加え、煩雑な作業および多量の確認試験薬（Ｘ・Ｖ因子要求試験用ディスク、4分画培地、ポルフィリン合成能試験薬等）が必要とされる。さらに、コロニーを釣菌する際にはインフルエンザ菌を釣菌し逃す可能性もある。
一方、酵素発色基質を含有するチョコレート寒天培地を用いることにより、細菌の色変化に基づいて微生物を識別する方法が開示され、Ｍａｇ－ｐｈｏｓ（５－ブロモ－６－クロロ－３－インドリルホスフェート）を含有するチョコレート寒天培地を用いることにより、紫色のインフルエンザ菌コロニーが無色の正常痰細菌叢から識別されることが記載されている（特許文献４）。しかし、酵素発色基質を含有するチョコレート寒天培地を用いた場合においても、インフルエンザ菌と同じ酵素分解能を示す細菌とインフルエンザ菌とを形態によって識別するためには熟練した技術を要し、作業効率が悪く、試薬コストが嵩むという問題が依然として残っている。
荒川 宣親，病原体微生物検出情報（IASR），３１，９４－９５，２０１０
長南 正佳ら，臨床検査，５８（１１），１３６２－１３６５，２０１４
山口 育男，微生物検査ナビ，１６４－１６５，２０１３
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、検体中にインフルエンザ菌が存在するか否かを、容易かつ正確に検出（スクリーニング）できる方法およびスクリーニング用培地、並びに／または、検体中のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを、容易かつ正確に識別できる方法および識別用培地を提供することを目的としている。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、従来、初代分離培養には用いられていなかったウマ血液寒天培地にβ－ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分として白糖、pH指示薬を添加して作製した培地に検体を接種して培養後、発育したヘモフィルス属菌の白糖分解能および溶血の有無により菌種が判別可能なこと、すなわち、初代分離培養用の培地としてウマ血液寒天培地にβ－ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分として白糖、pH指示薬を添加して作製した培地を用いることにより、発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、容易にインフルエンザ菌（白糖分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白糖分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（白糖分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（白糖分解有り・溶血有り）の識別が可能になることを見出した。本発明者らは、また、ウマ血液寒天培地にβ－ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分としてガラクトピラノシド誘導体（以下、Ｇａｌ誘導体という。）を添加して作製した培地に検体を接種して培養後、発育したヘモフィルス属菌のＧａｌ誘導体の分解能および溶血の有無により菌種が判別可能なこと、すなわち、初代分離培養用の培地としてウマ血液寒天培地にβ－ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分としてＧａｌ誘導体を添加して作製した培地を用いることにより、発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、容易にインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血有り）の識別が可能になることを見出した。さらに、培地に酸化チタンを添加して培地色を明るく保つことにより溶血とコロニー発色の視認性が向上すること、および培地に発色成分として白糖、pH指示薬およびＧａｌ誘導体を添加することで、より正確な識別が可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなるものである。
（１）少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
（１）少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
（２）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（１）に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。
（３）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（２）に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（２）に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（４）少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。
（５）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（４）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。
（６）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（５）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（５）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（７）インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
（８）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（７）に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。
（９）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（８）に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（８）に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（１０）培地１Ｌあたり以下の成分を少なくとも含有することを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）ウマ血液 １０～１００ｍＬ、
（ｂ）β－ＮＡＤ １～１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １～８００ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５～４０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １～４０ｇ および アニリンブルー ４０～４００ｍｇ、並びに／または ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド ４０～３００ｍｇ。
（ａ）ウマ血液 １０～１００ｍＬ、
（ｂ）β－ＮＡＤ １～１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １～８００ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５～４０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １～４０ｇ および アニリンブルー ４０～４００ｍｇ、並びに／または ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド ４０～３００ｍｇ。
（１１）インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。
（１２）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（１１）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。
（１３）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（１２）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（１２）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（１４）培地１Ｌあたり以下の成分を少なくとも含有することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）ウマ血液 １０～１００ｍＬ、
（ｂ）β－ＮＡＤ １～１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １～２．５ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５～１０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １～４０ｇ および アニリンブルー ４０～４００ｍｇ、並びに／または ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド ４０～３００ｍｇ。
（ａ）ウマ血液 １０～１００ｍＬ、
（ｂ）β－ＮＡＤ １～１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １～２．５ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５～１０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １～４０ｇ および アニリンブルー ４０～４００ｍｇ、並びに／または ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド ４０～３００ｍｇ。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-224892号の開示内容を包含する。
本発明によれば、培地に発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、従来は不可能であった初代分離培養によるインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの容易な識別が可能になる。それにより、チョコレート寒天培地を用いる従来の初代分離培養法に比べて、はるかに容易かつ正確にインフルエンザ菌を検出（スクリーニング）可能になる。また、分離培養後の確認試験のために釣菌するコロニー数を減らすことができ、さらに、確認試験において溶血の有無を確認する必要がないため、4分画培地と比較して安価なＸ・Ｖ因子要求試験用ディスクによる確認試験のみでインフルエンザ菌を同定することが可能になる。その結果、初代分離培養および確認試験を含めた所要時間、操作上の手間および確認試験（Ｘ・Ｖ因子要求試験用ディスク、4分画培地、ポルフィリン合成能試験薬等）にかかるコストを従来に比べて大幅に削減できる上、釣菌し逃しによる偽陰性を無くすことができるという効果ももたらす。
本発明では、少なくとも（ａ）ウマ血液、（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、（ｃ）抗菌剤、並びに（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分を含有し、インフルエンザ菌が発育可能である本発明の培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することによりヘモフィルス属菌の菌種を識別すること、そして、それによりインフルエンザ菌を検出することを特徴とする。実際の培養時には、基礎培地に（ａ）ウマ血液、（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、（ｃ）抗菌剤、並びに（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分、を添加したものを本発明の培地として用いることができる。
本発明の培地は、インフルエンザ菌が発育可能であり、かつ、ヘモフィルス属菌による溶血の有無を判別可能な成分を栄養成分として含有する。インフルエンザ菌の発育のためにはＸ因子およびＶ因子が必要であるが、本発明ではＸ因子の供給源として、ウマ血液を添加し、Ｖ因子としてβ－ＮＡＤまたはそのリン酸塩であるβ－ＮＡＤＰ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）、β－ＮＡＤＰＨ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form）を添加する。Ｖ因子はウマ血液中にも存在するが、本発明では、インフルエンザ菌の発育を促進する目的で、ウマ血液の他にβ－ＮＡＤまたはそのリン酸塩を添加する。
本発明の培地が含有するウマ血液は、ヘモフィルス属菌による溶血の有無を判別するためにも使用される。溶血素を産生する細菌が本発明の培地に発育した場合は、培地中に存在する赤血球を溶血させて透明化し、コロニーの周囲に透明な溶血帯が形成される。そのため、溶血素を産生するヘモフィルス属菌であるヘモフィルス・ヘモリティカス、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等が本発明の培地に発育した場合は、溶血有りと判定される。一方、溶血素を産生しないインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌等が本発明の培地に発育した場合は、コロニーの周囲に溶血帯が形成されないため、溶血無しと判定される。
ウマ血液の添加量は、インフルエンザ菌が発育可能であり、かつ、ヘモフィルス属菌による溶血の有無を判別可能な範囲で適宜選択することができるが、例えば、１０～１００ｍＬ／Ｌとすることが好ましい。一方、Ｖ因子の添加濃度は、インフルエンザ菌が発育可能な範囲で適宜選択することができるが、例えば、β－ＮＡＤの添加濃度を１～１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。β－ＮＡＤの代用として、同等量のβ－ＮＡＤＰ、β－ＮＡＤＰＨを添加することも可能である。
本発明の培地は、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分を含有する。そのような発色成分として具体的には、（１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、並びに／または（２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質、を使用することができる。
さらに、本発明の培地が含有する発色成分は、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有するものでもある。そのような発色成分として具体的には、（１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、並びに／または（２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質、を使用することができる。
本発明の培地で用いられる糖の種類は、インフルエンザ菌が分解能を有さず、パラインフルエンザ菌が分解能を有する糖であれば特に限定されない。そのような糖の例として白糖、マンノース等が挙げられる。例えば、白糖を用いることにより、インフルエンザ菌（白糖分解無し）とパラインフルエンザ菌（白糖分解有り）を精度良く識別することができる。さらに、白糖は、ヘモフィルス・ヘモリティカスが分解能を有さず、ヘモフィルス・パラヘモリティカスが分解能を有する糖でもあるため、白糖を用いることによってヘモフィルス・ヘモリティカス（白糖分解無し）とヘモフィルス・パラヘモリティカス（白糖分解有り）も精度良く識別可能である。これらは、細菌による白糖分解性の違いを利用したものである。白糖の添加濃度はインフルエンザ菌によって分解されず、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する範囲、またはインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによって分解されず、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する範囲で適宜選択することができる。そのような白糖の濃度を、例えば、１～４０ｇ／Ｌとすることができるが、１～２０ｇ／Ｌとすることがより好ましく、１～１５ｇ／Ｌとすることがさらに好ましい。なお、必要に応じて、白糖に加えてマンノースを添加することも可能である。マンノースも、インフルエンザ菌が分解能を有さず、パラインフルエンザ菌が分解能を有する糖であるため、白糖に加えてマンノースを添加しても同等の効果が得られる。
本発明の培地で用いられるpH指示薬の種類は、白糖の分解によって生じる酸に由来するpH変化に伴って変色するものであれば特に限定されない。例えば、中性色と酸性色が異なるpH指示薬、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、メチルレッド等を使用できる。表１に、白糖およびpH指示薬を発色成分として添加する場合のpH指示薬の種類とコロニーの呈色の具体例を示したが、本発明の培地では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス等の、白糖を分解しない細菌のコロニーが無着色である一方で、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等の、白糖を分解して酸を生成する細菌のコロニーは、pH指示薬の変色に基づき着色する。したがって、本発明の培地に発育した細菌のコロニーの呈色を観察することにより、その細菌による白糖の分解の有無を判断でき、これを上述の溶血の有無の判別と組み合わせることにより、インフルエンザ菌（白糖分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白糖分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（白糖分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（白糖分解有り・溶血有り）の識別が可能である。
pH指示薬の添加濃度は、白糖の分解によって生じる酸に由来するpH変化に伴って細菌のコロニー色を変色させうる濃度であれば特に限定されないが、例えば、アニリンブルー４０～４００ｍｇ／Ｌ、ブロモクレゾールパープル４０～１２０ｍｇ／Ｌ、ブロモチモールブルー４０～８０ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド４０～１２０ｍｇ／Ｌ、ニュートラルレッド２～４ｍｇ／Ｌ、メチルレッド４０～８０ｍｇ／Ｌ等とすることができる。
本発明の培地で用いられる酵素発色基質は、インフルエンザ菌によっては分解されず、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色するものであれば特に限定されない。酵素として、例えば、インフルエンザ菌では発現せず、パラインフルエンザ菌で発現する酵素であるガラクトシダーゼを選択し、酵素発色基質をＧａｌ誘導体とすることで、インフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解無し）とパラインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解有り）を精度良く識別することができる。Ｇａｌ誘導体は、ヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されず、ヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する特性も有しており、Ｇａｌ誘導体を使用することによってヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解無し）とヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解有り）も精度良く識別可能である。
本発明の培地で用いられるＧａｌ誘導体は、ガラクトシダーゼによって加水分解されうるように発色団化合物または蛍光発色団化合物が結合している化合物であれば、特に限定されない。結合している発色団化合物の具体例としては、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドキシル、５－ブロモ－６－クロロ－３－インドキシル、５－ブロモ－３－インドキシル、４－クロロ－３－インドキシル、６－クロロ－３－インドキシル、６－フルオロ－３－インドキシル、３－インドキシル、５－ヨード－３－インドキシル、Ｎ－メチルインドキシル等のインドキシル誘導体、２－クロロ－４－ニトロフェニル、２－ニトロフェニル、４－ニトロフェニル、４－アミノフェニル等のフェニル誘導体、６－ブロモ－２－ナフチル等のナフチル誘導体等が挙げられる。また、蛍光発色団化合物の具体例としては、８－ヒドロキシキノリン等のキノリン誘導体、４－メチルウンベリフェリル、７－ヒドロキシクマリン－６－イル等のクマリン誘導体、７－ブロモ－Ｎ－（２－メトキシフェニル）－３－ヒドロキシ－２－ナフタレンカルボキシアミド（ナフトールAS－BI）、１－ナフチル、２－ナフチル等のナフチル誘導体、レゾルフィン等が挙げられる。
表２に、酵素発色基質であるＧａｌ誘導体のみを発色成分として添加する場合の酵素発色基質の種類とコロニーの呈色の具体例を示したが、本発明の培地では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解しない細菌のコロニーは無着色であり、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解する細菌のコロニーは、分解により遊離した発色団化合物の発色に基づき着色する。また、酵素発色基質として蛍光発色団化合物が結合しているＧａｌ誘導体を使用する場合は、紫外線ランプ等を使用して、蛍光発色団化合物に適した波長の紫外線を培養後の培地にあてることにより、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解しない細菌のコロニーは蛍光を発せず、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解する細菌のコロニーは蛍光色を呈する。したがって、本発明の培地に発育した細菌のコロニーの呈色を観察することにより、その細菌によるＧａｌ誘導体の分解の有無を判断でき、これを溶血の有無の判別と組み合わせることにより、インフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血有り）の識別が可能である。
本発明では、細菌のコロニーの呈色を目視で判別できるが、培地がウマ血液を含有するため、培地の色が暗赤褐色であり、赤色を呈するpH指示薬や発色団化合物を使用した場合よりも青、緑、紫、黄色等を呈するpH指示薬や発色団化合物を使用した場合の方がコロニー色の判別が容易である。一方、本発明の培地に、さらに、酸化チタン等の不溶性白色化合物を添加することにより、培地色が明るい色になり、赤色のコロニーを含めて、視認性が向上するため、判別をより容易に行えるようになる。酸化チタンの添加濃度は特に限定されないが、例えば、１～８ｇ／Ｌとすることができる。
本発明では、酵素発色基質を単独で用いることも可能であるが、検出目的に応じて２種以上の酵素発色基質を適宜組み合わせて用いることも可能である。また、例えば、酵素発色基質に加えて、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside、以下、ＩＰＴＧという。）等の、ガラクトシダーゼによって加水分解されても発色しない酵素基質を加水分解反応促進剤として使用することもできる。酵素発色基質の添加濃度は、培地に発育した細菌に由来するガラクトシダーゼによる加水分解によって遊離した発色団化合物または蛍光発色団化合物による細菌のコロニーの呈色を目視で識別できる濃度であれば特に限定されない。そのような濃度は、当業者であれば、適宜設定可能であるが、例えば、酵素発色基質を５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド４０～３００ｍｇ／Ｌとすることができ、さらに、加水分解反応促進剤としてＩＰＴＧ１０～２００ｍｇ／Ｌを添加することができる。
上述のとおり、本発明では、白糖およびpH指示薬を発色成分として添加すること、または酵素発色基質のみを発色成分として添加することにより、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別や、インフルエンザ菌の検出が可能であり、これらを発色成分として用いることによってインフルエンザ菌を見逃すこと無く検出することができる（後に示す実施例１および２）。また、後に示す実施例３の様に、発色成分として白糖、pH指示薬に加えて酵素発色基質であるＧａｌ誘導体を添加することによって、より高い精度でインフルエンザ菌とパラインフルエンザ菌を識別可能になる。なお、実施例では、白糖を分解する細菌のコロニーの呈色とＧａｌ誘導体を分解する細菌のコロニーの呈色がともに青色である組み合わせのみを示したが、本発明では、白糖を分解せず、かつ酵素発色基質を分解しない細菌のコロニーが無着色である一方で、白糖を分解する細菌のコロニーと酵素発色基質を分解する細菌のコロニーはいずれも着色するため、本発明の培地に添加するpH指示薬とＧａｌ誘導体をどのように組み合わせても、インフルエンザ菌と他のヘモフィルス属菌との識別が可能である。例えば、白糖、ニュートラルレッドおよび５－ブロモ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを発色成分として含有する本発明の培地では、白糖を分解せず、かつ、５－ブロモ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニーは無着色であり、白糖を分解し、かつ、５－ブロモ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニー色は紫色、白糖を分解するが、５－ブロモ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニー色は赤色、白糖を分解しないが、５－ブロモ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニーは青色を呈するため、インフルエンザ菌（白～灰白色・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白～灰白色・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（紫色、赤色または青色・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（紫色、赤色または青色・溶血有り）の識別が可能になる。また、白糖、アニリンブルーおよび４－メチル－ウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを発色成分として含有する本発明の培地では、白糖を分解せず、かつ、４－メチル－ウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニーは無着色（蛍光なし）であり、白糖を分解し、かつ、４－メチル－ウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニー色は青色＋蛍光発色、白糖を分解するが、４－メチル－ウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニー色は青色（蛍光なし）、白糖を分解しないが、４－メチル－ウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニー色は無着色＋蛍光発色であるため、インフルエンザ菌（白～灰白色・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白～灰白色・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（青色＋蛍光発色、青色（蛍光なし）、または無着色＋蛍光発色・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（青色＋蛍光発色、青色（蛍光なし）、または無着色＋蛍光発色・溶血有り）の識別が可能になる。
本発明の培地が含有する抗菌剤は、インフルエンザ菌の検出（スクリーニング）や、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別を妨げず、ヘモフィルス属以外の夾雑菌の発育を抑制する抗菌剤である。そのような抗菌剤は特に限定されないが、例えば、グラム陽性菌の発育を阻止する抗菌スペクトルを持つ抗菌剤を少なくとも１種類、添加することが好ましい。グラム陽性菌の発育を阻止する抗菌スペクトルを持つ抗菌剤は特に限定されないが、具体例としては、バシトラシン（BC）等のポリペプチド系抗菌剤、バンコマイシン（VCM）、テイコプラニン（TEIC）等のグリコペプチド系抗菌剤等が挙げられる。添加する抗菌剤は１種類のみとすることも可能であるが、２種類以上とすることも可能である。また、グラム陽性菌の発育を阻止する抗菌スペクトルを持つ抗菌剤以外の抗菌剤を添加することや、真菌の増殖を阻止する抗真菌剤をさらに添加することも可能である。
インフルエンザ菌のスクリーニングのためには、抗菌剤の添加濃度をインフルエンザ菌が発育可能かつインフルエンザ菌の検出を妨げない濃度範囲とすることが好ましい。一方、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別のためには、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスが発育可能かつインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別を妨げない濃度範囲で抗菌剤を添加することが好ましい。そのような濃度範囲は、当業者であれば本発明の実施例を参考にして適宜設定することができるが、例えば、インフルエンザ菌のスクリーニングのためにバシトラシンを単独で添加する場合は、１～８００ｍｇ／Ｌ、バンコマイシンを単独で添加する場合は、０．５～４０ｍｇ／Ｌ、バシトラシンとバンコマイシンを共に添加する場合は、バシトラシン１～８００ｍｇ／Ｌおよびバンコマイシン０．５～４０ｍｇ／Ｌとすることができる。また、インフルエンザ菌のスクリーニングのためにバシトラシンを添加する場合に、５～８００ｍｇ／Ｌとすることもできるが、１０～８００ｍｇ／Ｌとすることがより好ましく、１０～３００ｍｇ／Ｌとすることが最も好ましい。インフルエンザ菌のスクリーニングのためにバンコマイシンを添加する場合に、１～４０ｍｇ／Ｌとすることもできるが、３～２０ｍｇ／Ｌとすることがより好ましく、３～１０ｍｇ／Ｌとすることが最も好ましい。一方、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別のためにバシトラシンを単独で添加する場合は、１～２．５ｍｇ／Ｌ、バンコマイシンを単独で添加する場合は、０．５～１０ｍｇ／Ｌ、バシトラシンとバンコマイシンを共に添加する場合は、バシトラシン１～２．５ｍｇ／Ｌおよびバンコマイシン０．５～１０ｍｇ／Ｌとすることが好ましいが、バンコマイシンを単独で添加する場合は、０．５～５ｍｇ／Ｌ、バシトラシンとバンコマイシンを共に添加する場合は、バシトラシン１～２．５ｍｇ／Ｌおよびバンコマイシン０．５～５ｍｇ／Ｌとすることがより好ましい。
上述のとおり、本発明の培地は、ヘモフィルス属以外の夾雑菌の発育を抑制するための抗菌剤を含有する。それにも関わらず夾雑菌が発育した場合でも、発育した夾雑菌のコロニーが［白糖分解有りおよび／または溶血有り］であれば、インフルエンザ菌でないことが容易に判断可能である。また、仮に、夾雑菌のコロニーが［白糖分解無し・溶血無し］である場合でも、本発明の培地を用いた培養と並行して、ヒツジ血液寒天培地を用いた培養を行えば、ヘモフィルス属以外の夾雑菌はヒツジ血液寒天培地にも発育するため、インフルエンザ菌でないことが判断できる。したがって、ヒツジ血液寒天培地に発育せず、本発明の培地に発育した細菌におけるコロニー色および溶血の有無を確認することによりインフルエンザ菌の検出（スクリーニング）や、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別が可能である。
本発明の培地は、少なくとも（ａ）ウマ血液、（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、（ｃ）抗菌剤、並びに（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地である。本発明の培地が有する作用は、培地に発育した細菌のコロニー色および溶血の有無によりヘモフィルス属菌の識別が可能であり、それにより、インフルエンザ菌の検出が可能であるというものである。以上の成分を含有し、作用を有する本発明の培地の使用用途は、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別、インフルエンザ菌のスクリーニング等とすることが可能である。換言すれば、本発明の培地は、ヘモフィルス属菌の識別が可能であるという作用を利用して、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地として使用することができ、また、インフルエンザ菌の検出が可能であるという作用を利用して、インフルエンザ菌のスクリーニング用培地として使用することができる。すなわち、本発明の培地は、用いる抗菌剤の種類、濃度等を調節することによって、インフルエンザ菌以外の夾雑菌（ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等のヘモフィルス属菌を含む）が発育する場合とインフルエンザ菌以外の夾雑菌の発育がほぼ抑制される場合を想定することができる。そのため、本発明のインフルエンザ菌スクリーニング用培地には、インフルエンザ菌の検出用培地およびインフルエンザ菌の選択培地が包含される。一方、本発明の培地をインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地とすることも可能である。
本発明で用いられる基礎培地は、普通寒天培地、ミュラーヒントン寒天培地、トリプトソイ寒天培地等のヘモフィルス属菌が発育可能な培地であれば特に限定されない。
本発明の培地は、必要に応じて、ヘモフィルス属菌の発育に適した栄養成分、ミネラル分、その他の成分をさらに添加することも可能である。
本発明の培地のpHの範囲は、ヘモフィルス属菌が発育可能であり、白糖の分解によって生じる酸に由来するpH変化に伴って、pH指示薬が変色する範囲であれば特に限定されない。使用するpH指示薬にもよるが、例えば、pH指示薬としてアニリンブルーを使用する場合は、pHを７～８程度とすることができ、７．０～８．０とすることが好ましい。具体的には、後に示す実施例の様に、７．３±０．３、７．６±０．３等とすることができる。
本発明では、インフルエンザ菌をスクリーニングするために、具体的に、培地１Ｌあたり以下の表３に示す成分を含有する培地を用いることができるが、以下の表４に示す成分を含有する培地を用いることがより好ましい。
以上の表３に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えて栄養成分、ミネラル成分としてグルタミン酸ナトリウム（０～５ｇ／Ｌ）を用いることができ、表４に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えてグルタミン酸ナトリウム（０～５ｇ／Ｌ）を用いることができる。また、表３に示した本発明の培地において、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという。）（０～１０ｇ／Ｌ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという。）（０～１０ｇ／Ｌ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（以下、ＡＣＥＳという。）（０～１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができ、表４に示した本発明の培地においては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＨＥＰＥＳ（０～１０ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０～１０ｇ／Ｌ）、ＡＣＥＳ（０～１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができる。
一方、本発明では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを識別するために、具体的に、培地１Ｌあたり以下の表５に示す成分を含有する培地を用いることができるが、以下の表６に示す成分を含有する培地を用いることがより好ましい。
以上の表５に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えて栄養成分、ミネラル成分としてグルタミン酸ナトリウム（０～５ｇ／Ｌ）を用いることができ、表６に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えてグルタミン酸ナトリウム（０～５ｇ／Ｌ）を用いることができる。また、表５に示した本発明の培地において、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＨＥＰＥＳ（０～１０ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０～１０ｇ／Ｌ）、ＡＣＥＳ（０～１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができ、表６に示した本発明の培地においては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＨＥＰＥＳ（０～１０ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０～１０ｇ／Ｌ）、ＡＣＥＳ（０～１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができる。
本発明で使用される検体は、インフルエンザ菌をはじめとするヘモフィルス属菌の存在が疑われるものであれば特に限定されない。ヒトの咽頭拭い液、鼻咽頭拭い液、髄液、耳漏、眼脂等が具体例として挙げられる。
本発明の培地の形態は、固形、シート状培地等、溶血の有無が確認できる形態であれば特に限定されないが、検出や識別のしやすさ等の観点から、固形培地が好ましく、平板固形培地の形態がより好ましい。
固形培地の固化剤としては、寒天、アガロース等通常使用されているものが挙げられる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
（発色成分として白糖およびpH指示薬を含有する培地を用いたインフルエンザ菌の検出）
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
（１）培地の準備
以下の表７に示した培地成分１を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
以下の表７に示した培地成分１を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表８に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表８に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
（発色成分としてガラクトピラノシド誘導体を含有する培地を用いたインフルエンザ菌の検出）
発色成分として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
発色成分として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
（１）培地の準備
以下の表９に示した培地成分２を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
以下の表９に示した培地成分２を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
実施例１と同様とした。
（３）細菌の接種と培養
実施例１と同様とした。
実施例１と同様とした。
（４）結果
結果を表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
（発色成分として白糖、pH指示薬およびガラクトピラノシド誘導体を含有する培地を用いたインフルエンザ菌の検出）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
（１）培地の準備
以下の表１０に示した培地成分３を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
以下の表１０に示した培地成分３を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
実施例１と同様とした。
（３）細菌の接種と培養
実施例１と同様とした。
実施例１と同様とした。
（４）結果
結果を以下の表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を以下の表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
表１１に示した様に、実施例１の培地では、試験したすべてのインフルエンザ菌のコロニー色が白糖分解無しを表す灰白色であり、溶血は無しであった。また、実施例２の培地では、試験したすべてのインフルエンザ菌のコロニー色が、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドの分解無しを表す灰白色であり、溶血無しであり、実施例３の培地では、試験したすべてのインフルエンザ菌のコロニー色が、白糖分解無し、かつ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド分解無しを表す灰白色であり、溶血無しであった。このことから、発色成分として白糖、アニリンブルーのみを含有する培地（実施例１）、発色成分として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドのみを含有する培地（実施例２）、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地（実施例３）のいずれを用いても、インフルエンザ菌を見逃すこと無く検出できることが示唆された。さらに実施例３の培地では、試験したすべてのパラインフルエンザ菌のコロニーの色が、白糖分解有りおよび／または５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド分解有りを表す青色であり、溶血は無し、大腸菌もコロニー色が青色、溶血無しであったことから、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地は偽陽性が無く、より高い精度でインフルエンザ菌とその他の細菌を識別可能であることが示された。
（インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１４に記載した。
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１４に記載した。
（１）培地の準備
以下の表１２に示した培地成分４を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
以下の表１２に示した培地成分４を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシン（BC）およびバンコマイシン（VCM）を以下の表１３に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシン（BC）およびバンコマイシン（VCM）を以下の表１３に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を以下の表１４に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を以下の表１４に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
バシトラシン２．５ｍｇ／Ｌおよび／またはバンコマイシン５ｍｇ／Ｌを添加した培地では、インフルエンザ菌（灰白色・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（灰白色・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（青色・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（青色・溶血有り）がいずれも良好に発育し、コロニー色および溶血の有無によってこれらの菌種を識別可能であることが示された。一方、バンコマイシン１０ｍｇ／Ｌを単独で添加した培地では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカスをコロニー色および溶血の有無によって識別可能であるものの、ヘモフィルス・パラヘモリティカスが弱い発育であった。なお、表１４に示したとおり、検討した何れの抗菌剤濃度の培地も、コロニー色および溶血の有無によってインフルエンザ菌を検出可能であった。
（pH指示薬の検討）
発色成分として白糖およびpH指示薬のみを含有する培地において、pH指示薬をアニリンブルーまたはフェノールレッドとし、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１６に記載した。
発色成分として白糖およびpH指示薬のみを含有する培地において、pH指示薬をアニリンブルーまたはフェノールレッドとし、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１６に記載した。
（１）培地の準備
pH指示薬をアニリンブルー100mg/Lまたはフェノールレッド120mg/Lとする以外は実施例１と同様とした。
pH指示薬をアニリンブルー100mg/Lまたはフェノールレッド120mg/Lとする以外は実施例１と同様とした。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表１５に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表１５に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を以下の表１６に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を以下の表１６に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
pH指示薬としてアニリンブルーを用いた培地もフェノールレッドを用いた培地も、ともに、コロニー色および溶血の有無によってインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを良好に識別可能であった。
（抗菌剤の検討および従来法との比較）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地において、抗菌剤の種類を変えて、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカスおよびその他の社内保存菌を接種し、培地の性能を調べた。さらに、ポアメディア（登録商標）羊血液寒天培地（栄研化学製培地）、従来のヘモフィルス属分離培養用の培地である従来法Ａ培地（栄研化学製培地）および従来法Ｂ培地（ベクトン・ディキンソン社製バシトラシン添加培地）を用意し、同様の細菌を接種して比較した。なお、使用した菌株名は表１８に記載した。
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地において、抗菌剤の種類を変えて、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカスおよびその他の社内保存菌を接種し、培地の性能を調べた。さらに、ポアメディア（登録商標）羊血液寒天培地（栄研化学製培地）、従来のヘモフィルス属分離培養用の培地である従来法Ａ培地（栄研化学製培地）および従来法Ｂ培地（ベクトン・ディキンソン社製バシトラシン添加培地）を用意し、同様の細菌を接種して比較した。なお、使用した菌株名は表１８に記載した。
（１）本発明の培地の準備
実施例４と同様とした。
実施例４と同様とした。
（２）本発明の培地へのβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシン（BC）およびバンコマイシン（VCM）を以下の表１７に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシン（BC）およびバンコマイシン（VCM）を以下の表１７に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地および比較用の各培地（羊血液寒天培地、従来法Ａ培地、従来法Ｂ培地）に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地および比較用の各培地（羊血液寒天培地、従来法Ａ培地、従来法Ｂ培地）に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を以下の表１８に示す。本発明の培地による結果は、溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示し、従来法Ａ培地、Ｂ培地およびポアメディア羊血液寒天培地の結果は、コロニー色により表示している。
結果を以下の表１８に示す。本発明の培地による結果は、溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示し、従来法Ａ培地、Ｂ培地およびポアメディア羊血液寒天培地の結果は、コロニー色により表示している。
本発明の培地では、抗菌剤として、バシトラシン単独を用いた場合、バンコマイシン単独を用いた場合、バシトラシンおよびバンコマイシンを共に添加した場合のいずれにおいても、コロニー色および溶血の有無によるインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別と、インフルエンザ菌の検出が可能であった。それに対して、従来法Ａ培地およびＢ培地に発育したコロニーはいずれも灰白色であり、形態以外にインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを識別する手段がなかった。このことから、本発明の培地は、従来法に比べて顕著に容易かつ正確にインフルエンザ菌を検出可能であることが示された。
また、本発明の培地では、抗菌剤として、バシトラシン単独を用いた場合、バンコマイシン単独を用いた場合、バシトラシンおよびバンコマイシンを共に添加した場合のいずれにおいても、ヘモフィルス属以外の夾雑菌に対する一定の抑制効果が認められ、試験した培地の中では、特に、バシトラシン300mg/Lおよびバンコマイシン10mg/Lを添加した本発明の培地が最も良好に夾雑菌の発育を抑制し、極めて簡易に精度良くインフルエンザ菌を検出可能であることが示された。なお、本発明の培地においても一部の夾雑菌の発育が認められたが、夾雑菌は、羊血液寒天培地にも発育したため、ヘモフィルス属菌でないことが容易に判断可能であった。
（咽頭拭い液検体による検討）
健常者５名の咽頭を綿棒で擦過し、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する本発明の培地に接種して培養後、発育したコロニーを釣菌して栄研化学製ＸＶマルチディスク‘栄研’（登録商標）、シスメックス・ビオメリュー社製アピ（登録商標）ＮＨにより細菌の同定を行った。なお、同定試験の方法はそれぞれの添付文書に従った。
健常者５名の咽頭を綿棒で擦過し、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する本発明の培地に接種して培養後、発育したコロニーを釣菌して栄研化学製ＸＶマルチディスク‘栄研’（登録商標）、シスメックス・ビオメリュー社製アピ（登録商標）ＮＨにより細菌の同定を行った。なお、同定試験の方法はそれぞれの添付文書に従った。
（１）本発明の培地の準備
実施例４と同様とした。
実施例４と同様とした。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
実施例１と同様とした。
（３）検体の接種と培養
健常者５名の咽頭を綿棒で擦過した後、（１）、（２）で調製した培地に接種し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
健常者５名の咽頭を綿棒で擦過した後、（１）、（２）で調製した培地に接種し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
栄研化学製ＸＶマルチディスクによる同定結果を以下の表１９、シスメックス・ビオメリュー社製アピＮＨによる同定結果を表２０に示す。
栄研化学製ＸＶマルチディスクによる同定結果を以下の表１９、シスメックス・ビオメリュー社製アピＮＨによる同定結果を表２０に示す。
本発明の培地で灰白色に呈色したコロニーはすべて同一のコロニー形態・溶血無しであり、青色に呈色したコロニーはすべて溶血無しであった（データは示していない）。灰白色・溶血無しのうちの１コロニーと、青色・溶血無しのコロニーのうち、優勢に発育した１コロニーを代表として釣菌してＸＶマルチディスクによる同定を行った結果、灰白色・溶血無しのコロニーはＸＶ要求性であることからインフルエンザ菌であると確認された。一方、青色・溶血無しのコロニーはＶ要求性であることからパラインフルエンザ菌であると確認された（表１９）。また、同様に、灰白色・溶血無しの１コロニーと青色・溶血無しのコロニーのうち、優勢に発育した１コロニーを代表としてシスメックス・ビオメリュー社製アピＮＨにより同定した結果、灰白色に呈色したコロニーは99.9％の信頼度でインフルエンザ菌であると同定され、青色に呈色したコロニーは99.1％の信頼度でパラインフルエンザ菌であると同定された（表２０）。このことから、本発明の培地は、初代分離培養により高精度にインフルエンザ菌とパラインフルエンザ菌を識別し、インフルエンザ菌を検出可能であることが示唆された。
（白糖添加濃度の検討）
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、これらの菌種を識別可能な白糖濃度を調べた。なお、使用した菌株名は表２３に記載した。
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、これらの菌種を識別可能な白糖濃度を調べた。なお、使用した菌株名は表２３に記載した。
（１）培地の準備
以下の表２１に示した培地成分５を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
以下の表２１に示した培地成分５を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表２２に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ－ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表２２に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を表２３に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を表２３に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
表２３に示した様に、白糖添加濃度 １から４０ｇ／Ｌの範囲においてコロニー色および溶血の有無によるインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスの識別が可能であり、また、インフルエンザ菌の検出が可能であった。
（アニリンブルー添加濃度の検討）
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、これらの菌種を識別可能なアニリンブルー濃度を調べた。なお、使用した菌株名は表２５に記載した。
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、これらの菌種を識別可能なアニリンブルー濃度を調べた。なお、使用した菌株名は表２５に記載した。
（１）培地の準備
以下の表２４に示した培地成分６を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
以下の表２４に示した培地成分６を秤量し、以下の（２）でβ－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例８と同様とした。
実施例８と同様とした。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を表２５に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を表２５に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
表２５に示した様に、アニリンブルー添加濃度４０から４００ｍｇ／Ｌの範囲においてコロニー色および溶血の有無によるインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスの識別が可能であり、また、インフルエンザ菌の検出が可能であった。
（緩衝剤の検討）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地において、緩衝成分をリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳまたはＡＣＥＳとし、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表２６に記載した。
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを含有する培地において、緩衝成分をリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳまたはＡＣＥＳとし、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表２６に記載した。
（１）培地の準備
緩衝成分をリン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌおよびリン酸水素二カリウム４ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ ５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ５ｇ／ＬまたはＡＣＥＳ ５ｇ／Ｌとする以外は実施例４と同様とした。
緩衝成分をリン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌおよびリン酸水素二カリウム４ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ ５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ５ｇ／ＬまたはＡＣＥＳ ５ｇ／Ｌとする以外は実施例４と同様とした。
（２）β－ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
実施例１と同様とした。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
（４）結果
結果を表２６に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
結果を表２６に示す。溶血有りを＋、溶血無しを－と表し、コロニー色とともに表示している。
緩衝成分としてリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳおよびＡＣＥＳのいずれを用いた培地においても、コロニー色および溶血の有無によってインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを良好に識別可能であり、また、インフルエンザ菌を良好に検出可能であった。
本発明のインフルエンザ菌の検出方法およびそれに用いる培地は、培地に発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、初代分離培養によるインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの容易な識別が可能になる。従来法に比べて、はるかに容易かつ正確にインフルエンザ菌を検出可能になり、その結果、初代分離培養および確認試験を含めた所要時間、操作上の手間および確認試験にかかるコストを従来に比べて大幅に削減可能である。そのため、本発明の方法および培地は、臨床現場や疫学研究その他の幅広い領域において有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (14)
- 少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。 - 前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする請求項１に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。 - 前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする請求項２に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。 - 少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Haemophilus haemolyticus）、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカス（Haemophilus parahaemolyticus）の識別方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。 - 前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする請求項４に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。 - 前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする請求項５に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。 - インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。 - 前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする請求項７に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。 - 前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする請求項８に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。 - 培地１Ｌあたり以下の成分を少なくとも含有することを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）ウマ血液 １０～１００ｍＬ、
（ｂ）β－ＮＡＤ １～１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １～８００ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５～４０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １～４０ｇ および アニリンブルー ４０～４００ｍｇ、並びに／または ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド ４０～３００ｍｇ。 - インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β－ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。 - 前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする請求項１１に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。 - 前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする請求項１２に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。 - 培地１Ｌあたり以下の成分を少なくとも含有することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）ウマ血液 １０～１００ｍＬ、
（ｂ）β－ＮＡＤ １～１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １～２．５ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５～１０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １～４０ｇ および アニリンブルー ４０～４００ｍｇ、並びに／または ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド ４０～３００ｍｇ。
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