CN111363703B - 一株具有抗菌抗氧化活性魏斯氏菌菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2及其应用。融合魏斯氏菌YM5S2于2020年01月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No:19308。本发明中具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2能在体外抑制鼠伤寒沙门菌等肠道病原菌的生长繁殖；且无溶血性，对大部分抗生素敏感，安全性较高，在胃酸和肠道高胆盐环境中生存率高。

Description

一株具有抗菌抗氧化活性魏斯氏菌菌株及应用

所属技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌及其应用。

背景技术

肠道感染是威胁人类肠道健康的主要因素之一。常见的肠道病原菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等。目前，针对肠道病原菌感染常用抗生素治疗，而抗生素的滥用导致细菌的耐药问题日渐严重。研究表明，益生菌在调节肠道菌群平衡、减少病原菌定殖、增强机体免疫机能等方面发挥着重要的作用，有助于预防和治疗肠道病原菌感染。

目前已知的益生菌大多是乳酸菌，常见的乳酸菌有乳杆菌和双歧杆菌，广泛应用于食品行业。魏斯氏菌作为新兴的乳酸菌，目前广泛应用于发酵食品，其作为益生菌使用的报道较少，关于此类菌益生活性的基础研究工作还需要更多的关注。

益生菌的安全性问题受到国内外研究者的广泛关注，多种指标和方法可用于评价益生菌的安全性，诸如溶血性、抗生素抗性等体外评价和动物模型评价。菌株不具有溶血性是成为益生菌的先决条件，当前溶血性评价主要用血平板培养的方法。另一方面，细菌耐药基因转移和多重耐药菌株的出现已成为严重的公共卫生问题，益生菌以活菌状态进入并定殖于人体肠道，需要进行抗生素抗性的安全性评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2及其应用；所述融合魏斯氏菌Weissella confusa是从一名健康成年女性的粪便中分离得到的，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年01 月07日，保藏编号为CGMCC No.19308。

本发明的融合魏斯氏菌YM5S2菌落为圆形，直径0.5mm-2mm，较光滑，乳白色；革兰氏染色阳性；可利用七叶苷、麦芽糖和蔗糖；不能利用纤维二糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇和棉子糖。本发明的融合魏斯氏菌YM5S2通过16S rDNA序列比对分析鉴定，与融合魏斯氏菌亲缘关系最为接近，16S rDNA序列同源性大于99％，根据YM5S2菌株形态特征以及16S rDNA序列比对结果，确定YM5S2为融合魏斯氏菌 (Weissella confusa)，命名为融合魏斯氏菌YM5S2。

本发明还提供了所述具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2抑制肠道病原菌生长、繁殖的应用。

优选地，所述肠道病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌。

进一步的，所述融合魏斯氏菌YM5S2具有抗氧化活性。

进一步的，本发明所述具有益生活性的融合魏斯氏菌YM5S2的单菌落接种到含5％(v/v)绵羊血的 MRS固体培养基上37℃需氧生长时，表现为不具备溶血活性。

进一步的，所述具有益生活性的融合魏斯氏菌YM5S2对抗生素敏感。

优选地，所述抗生素包括头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢拉定、苯唑西林、红霉素、克林霉素、氯霉素、四环素。

进一步的，所述具有益生活性的融合魏斯氏菌YM5S2具有良好的胃肠道耐受性，在胃酸和肠道高胆盐环境中存活率高。

有益效果

1、本发明首先发现魏斯氏菌YM5S2对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌在体外均有良好的抑菌效果；融合魏斯氏菌YM5S2的DPPH自由基清除率为44.65％±6.34％；融合魏斯氏菌YM5S2的羟基自由基清除率为57.73％±1.58％；所述融合魏斯氏菌YM5S2对绝大多数的抗生素都敏感，没有耐药性，安全性较高；融合魏斯氏菌YM5S2在pH 2.0条件下生存率为92.91％±2.36％，在pH2.5条件下生存率为 92.15％±5.06％，在pH 3.0条件下生存率为89.85％±1.08％；融合魏斯氏菌YM5S2在胆盐浓度0.1％条件下生存率为78.54％±4.1％，在胆盐浓度0.3％条件下生存率为117.62％±8.27％，在胆盐浓度0.5％条件下生存率为115.13％±9.1％。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是融合魏斯氏菌YM5S2菌落形态图。

图2是融合魏斯氏菌YM5S2革兰氏染色图。

图3是融合魏斯氏菌YM5S2对病原菌的抑菌圈图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

病原菌拮抗试验

采用打孔法检测融合魏斯氏菌YM5S2对病原菌的拮抗活性。将所述融合魏斯氏菌YM5S2接种于MRS 液体培养基中，37℃恒温培养24h。将含菌液体培养基在12000r/min下离心10min，上清液经0.22μm 滤膜过滤，获得无细胞上清液。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌分别接种于营养肉汤培养基，37℃培养18h作指示菌备用。将100μL指示菌液混入100mL无菌营养肉汤固体培养基，倒入培养皿中。取60μL上述无细胞上清液加入到含指示菌平板的孔(5mm)中，37℃过夜培养后，测量并记录抑菌圈的直径。

融合魏斯氏菌YM5S2对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌在体外均有良好的抑菌效果。其抑菌效果见图3。

实施例2：

抗氧化活性检测

将所述融合魏斯氏菌YM5S2接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h。将含菌液体培养基在 12000r/min下离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤，获得无细胞上清液。

a.DPPH自由基清除活性

取0.4mL的上述无细胞上清液与1.6mL新鲜配制的0.2mM DPPH(乙醇为溶剂)溶液混合，避光反应25分钟。用等量MRS培养基代替无细胞上清液，为对照组。反应后测OD₅₁₇的值，对照组即为A₀，实验组记为A₁。则DPPH自由基清除率为：(A₀-A₁)/A₀×100％。每组试验平行三次。

融合魏斯氏菌YM5S2的DPPH自由基清除率为44.65％±6.34％。

b.羟基自由基清除活性

新鲜配制一反应体系，该反应体系包括水杨酸乙醇溶液(5mM)，硫酸亚铁溶液(5mM)，过氧化氢(3mM)。取1.4mL上述反应体系，与100μL上述无细胞上清液混合。室温反应50分钟后，在12000r/min下离心 2min，取上清液，用紫外分光光度计测OD₅₁₀的值，记为A₁。用等量MRS培养基代替无细胞上清液，为对照组，实验结果记为A₀。则羟基清除率为:(A₀-A₁)/A₀×100％。每组试验平行三次。

融合魏斯氏菌YM5S2的羟基自由基清除率为57.73％±1.58％。

实施例3：

抗生素抗性

根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的试验标准，抗生素抗性采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行评价。将药敏实验结果分成以下三级：耐药(Resistant)、中介(Intermediate)和敏感(Susceptible)。如表1所示，所述融合魏斯氏菌YM5S2对绝大多数的抗生素都敏感，没有耐药性，安全性较高。

表1.融合魏斯氏菌YM5S2的抗生素耐药情况

实施例4：

耐酸性能试验

将融合魏斯氏菌YM5S2接种至MRS液体培养基过夜培养后，取60μL菌液分别接种至3mL pH 2.0、 pH 2.5、pH 3.0(未调节pH为对照)的MRS液体培养基中，过夜培养之后，用紫外分光光度计测OD₆₀₀。每组试验平行三次。

融合魏斯氏菌YM5S2在pH 2.0条件下生存率为92.91％±2.36％，在pH2.5条件下生存率为 92.15％±5.06％，在pH 3.0条件下生存率为89.85％±1.08％。

实施例5：

耐胆盐性能试验

将融合魏斯氏菌YM5S2接种至MRS液体培养基过夜培养后，取60μL菌液分别接种至3mL牛胆盐浓度(质量体积分数比，g/100mL)为0.1％、0.3％、0.5％(不含牛胆盐为对照)的MRS培养基中，过夜培养之后，用紫外分光光度计测OD₆₀₀。每组试验平行三次。

融合魏斯氏菌YM5S2在胆盐浓度0.1％条件下生存率为78.54％±4.1％，在胆盐浓度0.3％条件下生存率为117.62％±8.27％，在胆盐浓度0.5％条件下生存率为115.13％±9.1％。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一株具有抗菌抗氧化活性魏斯氏菌菌株及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

cggcggcgtg ctataatgca agtcgaacgc tttgtggttc aactgatttg aagagcttgc 60

tcagatatga cgatggacat tgcaaagagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggaaacc 120

tacctcttag caggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgtataa caatgacaac 180

cgcatggttg ttatttaaaa gatggttctg ctatcactaa gagatggtcc cgcggtgcat 240

tagctagttg gtaaggtaat ggcttaccaa ggcgatgatg catagccgag ttgagagact 300

gatcggccac aatgggactg agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa 360

tcttccacaa tgggcgaaag cctgatggag caacgccgcg tgtgtgatga agggtttcgg 420

ctcgtaaaac actgttgtaa gagaagaatg acattgagag taactgttca atgtgtgacg 480

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caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag acggttattt aagtctgaag 600

tgaaagccct cagctcaact gaggaattgc tttggaaact ggatgacttg agtgcagtag 660

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gcgaaggcgg ctttctggac tgtaactgac gttgaggctc gaaagtgtgg gtagcaaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccacaccgta aacgatgagt gctaggtgtt tgagggtttc 840

cgcccttaag tgccgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900

ttgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960

aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcccttg acaactccag agatggagcg 1020

ttcccttcgg ggacaaggtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080

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gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgggg 1440

taaccttcgg gagccagccg tctaagtgaa 1470

Claims (3)

1.一株具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2 ，其特征在于，该菌株已于2020年01月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类名为融合魏斯氏菌（Weissellaconfusa），保藏号CGMCC No.19308，具有抗氧化活性，具有胃肠道耐受性，在胃酸和肠道高胆盐环境中存活率高，在pH 2.0条件下生存率为92.91％±2.36％；在胆盐浓度0.5％条件下生存率为115.13％±9.1％。

2.根据权利要求1所述具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2，其特征在于，所述融合魏斯氏菌YM5S2的单菌落接种到MRS固体培养基上37℃需氧生长良好，菌落呈圆形，直径大小0.5mm-2.0mm，较光滑，乳白色；革兰氏染色呈阳性；可（删除）利用七叶苷、麦芽糖和蔗糖，不能利用纤维二糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇和棉子糖；经16S rDNA序列鉴定，YM5S2为融合魏斯氏菌。

3.根据权利要求1所述具有抗菌抗氧化活性的融合魏斯氏菌YM5S2在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌生长、繁殖的菌剂中的应用。

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