CN104212725A - 提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法，具体地说是一种利用保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌与红景天组培苗共培养，提高红景天苷和酪醇含量的方法。方法步骤：真菌培养及培养物制备；真菌培养物与红景天组培苗共培养；培养条件：光照12-16小时，温度25-28℃，湿度70-75％；非光照12-8小时，温度18-23℃，湿度75-80％；交替培养10-30d，获得红景天苷和酪醇含量高的红景天组培苗。红景天苷最高含量可达2.56mg/g，酪醇最高含量可达15.48mg/g。该方法操作简单，成本低，是在低海拔条件下提高红景天组培苗红景天苷和酪醇含量的有效方法。

Description

提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养，具体地说属于一种利用真菌与红景天组培苗共培养，提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法。

背景技术

红景天为景天科(Crassulaceae)、景天属(Rhodiola sp.)的多年生肉质草本或亚灌木植物。一般生长在海拔2000米以上的高山地带，是我国使用近千年的传统药用植物。我国2010年《药典》记载的药用红景天基原植物为大花红景天(R.crenulata)，其功效和主治为“益气活血，通脉平喘，用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘。”目前，红景天主要用于大脑缺氧等多方面的临床治疗；作为保健品、化妆品等的添加物也被大量使用，需求量逐年上升。

红景天主要的化学成分包括苯乙烷类(红景天甙，酪醇)，苯丙醇类(洛塞林，肉桂醇甙，松香)和单萜类(络塞定)等化合物，其中，最主要的活性成分为红景天苷和酪醇。

目前，红景天的使用以野生植物为主，栽培供应为辅，这使得野生资源的保护面临严峻考验，然而，栽培则面临着几个重要挑战：①仅局限于高海拔地区，低海拔条件下的栽培未见报道；②与野生材料相比，活性成分含量严重偏低；③栽培过程中出现植物叶片变形、扭曲等变态、变种现象。近些年来，科研人员在低海拔条件下，对红景天组织培养进行了积极的探索，取得较大进步，但面临的主要问题仍然是红景天苷和酪醇等活性成分含量偏低。

截止目前，依靠传统方法无法解决红景天人工培养方面面临的严重问题。值得注意的是，随着植物菌根生物学技术的发展，人们发现许多植物的健康生长和成分积累，不仅与其周围的环境因子相关，而且与其根际或内生菌密切相关。本发明则是通过公开1株与红景天关系密切的真菌，通过与大花红景天共培养，促进组培苗红景天苷和酪醇含量的快速积累，该方法突破传统手段，操作简单，成本低，是在低海拔条件下提高红景天组培苗红景天苷和酪醇含量的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够促进大花红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量提高的真菌，将它与大花红景天组培苗共培养，能促进红景天有效成分红景天苷和酪醇含量的提高。

本发明的另一目的在于提供利用这株真菌提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法。该方法，且工艺简单，成本低，生产周期短。

本发明的技术步骤是通过培养真菌，获得真菌培养物，与大花红景天组培苗共培养，使大花红景天组培苗获得更高的红景天苷和酪醇含量。

本发明提供的一株真菌ZPRa-R-1经鉴定为Phialocephala fortinii(红松头霉菌)，这株真菌于2014年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9347，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

培养特性：在PDA培养基上培养，菌落中央隆起，呈灰黑色，边缘颜色更深，毛状边缘，气生菌丝发达，为短絮状，无明显可见分泌物，菌落背面为黑色。将直径为0.5cm的菌饼接种于PDA培养基上，生长10天的菌落直径为4.25cm。显微观察表明，该菌不产分生孢子，菌丝有隔，具分支现象，为暗色，有隔，粗、细菌丝并存，菌丝介于0.8μm～4.5μm,粗、细菌丝相连，培养时间越长，菌丝越粗，颜色越深。

本发明提供的一种提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法，包括如下步骤：

1)真菌培养及培养物制备

将保藏编号CGMCC No.9347的真菌在PDA平板上活化，在25℃-30℃条件下恒温培养，菌落长至3～5cm左右的旺盛状态时，作为接种菌种，或用下列方法进行培养物制备：

配制PDA液体培养基，将150-200mL装入500mL的三角瓶，121℃灭菌，冷却；无菌条件下，将5～6片直径为0.5～1.0cm的菌饼接入，在25℃-30℃，转速180～250r/min条件下暗培养4～8d，停止培养后，纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，将菌丝冷冻干燥，研成粉末；将发酵液旋转蒸发成膏状物，待用；

2)真菌培养物与红景天组培苗共培养

将PDA平板上生长的CGMCC No.9347的真菌菌饼直接接种于MS培养基(含0.3～1mg/L TDZ,0.3～1mg/L NAA)，与红景天组培苗共生长；或者

将液体发酵制备的菌丝粉末或发酵液膏状物，按1～4g︰1L＝真菌制备物︰MS培养基(含0.3～1mg/L TDZ,0.3～1mg/L NAA)的比例，加入到MS培养基，121℃灭菌，冷却，接种红景天组培苗；培养条件：光照12-16小时，温度25-28℃，湿度70-75％；非光照12-8小时，温度18-23℃，湿度75-80％；交替培养，培养10-30d，收苗，干燥、粉碎，获得红景天苷和酪醇含量提高的红景天组培苗。

与现有技术相比本发明的优点和效果：

本发明采用保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌与红景天组培苗共培养，能明显提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇的含量，红景天苷最高含量可达2.56mg/g，酪醇最高含量可达15.48mg/g。该方法操作简单，成本低，是在低海拔条件下提高红景天组培苗红景天苷和酪醇含量的有效方法。

具体实施方式

实施例中真菌ZPRa-R-1即为保藏编号CGMCC No.9347的真菌。

实施例1

(1)将真菌ZPRa-R-1活化并培养至旺盛状态，将5块直径为0.5cm的菌饼接入到装有200mL PDA液体培养基的500mL的三角瓶中，在28℃，转速为200r/min条件下，暗培养5天，四层纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，弃菌丝，将发酵液旋转蒸发成膏状物，待用。

按照2g︰1L＝发酵液膏状物︰MS培养基(含0.5mg/L TDZ,0.5mg/L NAA)的比例，将真菌发酵液膏状物加入MS培养基，制成真菌和红景天组培苗共生培养基，121℃灭菌，冷却后，接种健康大花红景天组培幼苗。

(2)空白对照：不添加真菌培养物，用MS培养基(含0.5mg/L TDZ,0.5mg/L NAA)直接培养大花红景天组培幼苗。

(3)阴性对照：不接入真菌，采用与“(1)”同样的方法制作PDA培养基膏状物，按照2g︰L＝发酵液膏状物︰MS培养基(含0.5mg/L TDZ,0.5mg/L NAA)的比例，将膏状物加入MS培养基，121℃灭菌，冷却后，接种大花红景天组培幼苗。

以上组培幼苗按光照和非光照二个时段进行交替培养：①光照14小时，温度27℃，湿度为72％；②非光照10小时，温度22℃，湿度为78％。交替培养20d，收苗，干燥，粉碎，提取，按2010年《药典》P144页记载的HPLC方法测定含量，与对照相比，菌-苗共生的红景天中红景天苷和酪醇含量大大提高。具体结果见表1.

实施例2

采用固体培养菌直接与组培苗共生，提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇的含量。

(1)将真菌ZPRa-R-1活化并培养至旺盛状态，待用。

(2)用灭菌并冷却的MS培养基(含0.5mg/L TDZ,0.5mg/L NAA)接种健康大花红景天组培幼苗。无菌条件下，将旺盛状态的真菌ZPRa-R-1接种到紧靠组培苗的培养基上，使得真菌与红景天组培幼苗共生生长，按二个时段设置培养条件：①光照14小时，温度27℃，湿度为72％；②非光照10小时，温度22℃，湿度为78％。培养时间为20d，收苗，干燥，粉碎，提取，按2010年《药典》P144页记载方法进行测定，结果表明，相比于对照，菌-苗共生的红景天中红景天苷和酪醇含量有较大提高。具体结果见表1.

实施例3

将真菌ZPRa-R-1活化并培养至旺盛状态，将6块直径为1.0cm的菌饼接入到装有150mLPDA液体培养基的500mL的三角瓶中，在30℃，转速为250r/min条件下，暗培养8d，四层纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，弃菌丝，将发酵液旋转蒸发成膏状物，待用。

按照4g︰1L＝发酵液膏状物︰MS培养基(含1mg/L TDZ,1mg/L NAA)的比例，将真菌膏状物加入MS培养基，制成真菌培养物和大花红景天苗共生培养基，121℃灭菌，冷却后，接种大花红景天组培幼苗。

按二个时段进行培养条件设置：①光照16小时，温度28℃，湿度为75％；②非光照8小时，温度23℃，湿度为80％。培养时间为30d，收苗，干燥，粉碎，提取，按2010年《药典》P144页记载方法进行测定，结果表明，相比于对照，菌-苗共生的红景天中红景天苷和酪醇含量有较大提高。具体结果见表1.

实施例4

将真菌ZPRa-R-1活化并培养至旺盛状态，将5块直径为0.8cm的菌饼接入到装有180mLPDA液体培养基的容积为500mL的三角瓶中，在25℃，转速为180r/min条件下，暗培养4d，四层纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，弃菌丝，将发酵液旋转蒸发成膏状物，待用。

按照1g︰1L＝发酵液膏状物：MS培养基(含0.3mg/L TDZ,0.3mg/L NAA)的比例，将真菌膏状物加入MS培养基，制成真菌培养物和大花红景天苗共生培养基，接种大花红景天组培幼苗。

按二个时段进行培养条件设置：①光照12小时，温度25℃，湿度为70％；②非光照12小时，温度18℃，湿度为75％。培养时间为10d，收苗，干燥，粉碎，提取，按2010年《药典》P144页记载方法进行测定，结果表明，相比对照，菌-苗共生的红景天中红景天苷和酪醇含量有较大提高。具体结果见表1.

实施例5

将真菌ZPRa-R-1活化并培养至旺盛状态，将5块直径为0.5cm的菌饼接入到装有200mLPDA液体培养基的500mL的三角瓶中，在26℃，转速150r/min条件下，暗培养6d，四层纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，弃发酵液，将菌丝冷冻干燥，研碎成粉末，待用。

按照3g︰1L＝菌丝干粉︰MS培养基(含0.7mg/L TDZ,0.6mg/L NAA)的比例，将真菌菌丝粉末加入MS培养基，制成真菌培养物和大花红景天苗共生培养基，121℃灭菌，冷却后，接种健康大花红景天组培幼苗。

按二个时段进行培养条件设置：①光照15小时，温度26℃，湿度为73％；②非光照9小时，温度20℃，湿度为78％。培养时间为20d，收苗，干燥，粉碎，提取，按2010年《药典》P144页记载方法进行测定，结果表明，相比于对照，菌-苗共生的红景天中红景天苷和酪醇含量有较大提高。具体结果见表1。

表1.真菌促进大花红景天提高红景天苷和酪醇含量

Claims (5)

1.一种真菌菌株，特征在于其保藏编号为CGMCC No.9347。

2.一种提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将保藏编号CGMCC No.9347的真菌在PDA平板上活化，在25℃-30℃条件下恒温培养，菌落长至3～5cm的旺盛状态时，备用；

2)将PDA平板上生长的CGMCC No.9347的真菌菌饼直接接种于MS培养基，所述的MS培养基含0.3～1mg/L TDZ,0.3～1mg/L NAA，与红景天组培苗共生长；培养条件：光照12-16小时，温度25-28℃，湿度70-75％；非光照12-8小时，温度18-23℃，湿度75-80％；交替培养10-30d，收苗，干燥、粉碎，获得红景天苷和酪醇含量高的红景天组培苗。

3.一种提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将保藏编号CGMCC No.9347的真菌在PDA平板上活化，在25℃-30℃条件下恒温培养，菌落长至3～5cm的旺盛状态时，用下列方法进行培养物制备：

配制PDA液体培养基，将150-200mL装入500mL的三角瓶，121℃灭菌，冷却；无菌条件下，将5～6片直径为0.5～1.0cm的所述真菌的菌饼接入三角瓶，在25℃-30℃，转速180～250r/min条件下暗培养4～8d，停止培养后，纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，将菌丝冷冻干燥，研成粉末，备用；

2)将液体发酵制备的菌丝粉末，按1～4g︰1L＝真菌制备物︰MS培养基的比例，加入到MS培养基，121℃灭菌，冷却，接种红景天组培苗；培养条件：光照12-16小时，温度25-28℃，湿度70-75％；非光照12-8小时，温度18-23℃，湿度75-80％；交替培养10-30d，收苗，干燥、粉碎，获得红景天苷和酪醇含量高的红景天组培苗；所述的MS培养基含0.3～1mg/L TDZ,0.3～1mg/L NAA。

4.一种提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将保藏编号CGMCC No.9347的真菌在PDA平板上活化，在25℃-30℃条件下恒温培养，菌落长至3～5cm左右的旺盛状态时，用下列方法进行培养物制备：

配制PDA液体培养基，将150-200mL装入500mL的三角瓶，121℃灭菌，冷却；无菌条件下，将5～6片直径为0.5～1.0cm的所述真菌的菌饼接入三角瓶，在25℃-30℃，转速180～250r/min条件下暗培养4～8d，停止培养后，纱布过滤，将菌丝和发酵液分离，将发酵液旋转蒸发成膏状物，备用；

2)将液体发酵制备的发酵液膏状物，按1～4g︰1L＝真菌制备物︰MS培养基的比例，加入到MS培养基，121℃灭菌，冷却，接种红景天组培苗；培养条件：光照12-16小时，温度25-28℃，湿度70-75％；非光照12-8小时，温度18-23℃，湿度75-80％；交替培养10-30d，收苗，干燥、粉碎，获得红景天苷和酪醇含量高的红景天组培苗；所述的MS培养基含0.3～1mg/L TDZ,0.3～1mg/L NAA。

5.如权利要求2、3或4所述的一种提高红景天组培苗中红景天苷和酪醇含量的方法，其特征在于，所述的红景天组培苗中的红景天为大花红景天。