CN102450157B

CN102450157B - 蛹虫草的固态发酵方法

Info

Publication number: CN102450157B
Application number: CN 201010526060
Authority: CN
Inventors: 边银丙; 陈乃维; 周红英
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2030-10-26
Also published as: CN102450157A

Abstract

本发明属于应用真菌技术领域。具体涉及一种蛹虫草(Cordyceps militaris)真菌的固体发酵工艺。本发明是针对虫草子实体人工栽培蛹生物量比例低、原料利用率不高，固体发酵产物品质不稳定等问题，提供了一种食用安全、品质稳定的固体发酵新工艺。其特征是使用液体菌种蛹虫草(Cordyceps militaris)BYB-08(保藏号为：CCTCC NO：M207091)，以小麦、燕麦、大米、酵母浸出粉为培养基，经浸泡、预糊化、快速冷却、离散液添加等工艺改良培养基性状；经接种、发酵，烘干后，制得的固体发酵产物。本发明制备工艺流程简单、清晰，为保健食品加工或原料药制备提供了品质稳定且可安全食用的蛹虫草发酵产物，符合天然、健康、可多元化开发的要求。

Description

蛹虫草的固态发酵方法

技术领域

本发明属于药用真菌固态发酵技术领域，具体涉及一种蛹虫草菌丝体固态发酵方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种药用真菌，在中医学上应用历史悠久。我国是最早认识和利用虫草的国家，特别是冬虫夏草是我国特产的名贵中药材，与人参、鹿茸齐名，在国内外享有盛誉。近年来，随着人们对虫草的滋补保健功效和多种药用价值的认识，其开发利用研究倍受关注，并在药理、有效成分及人工栽培等各方面取得了很大的进展。实验证明北冬虫夏草与冬虫夏草功效相近，也具有多方面药理作用。国内外研究结果表明，蛹虫草具有多种的生物活性作用，尤其是能够有效地抑制肿瘤和病毒。随着研究的深入，关于虫草素、虫草多糖等生物活性物质作用和功效的证据越来越多，其作用机制也逐渐明晰。2009年3月18日，卫生部发布2009年第三号公告，批准蛹虫草为新资源食品，这为蛹虫草产业在食品加工领域的应用敞开了大门。

经国内外多年研究发现，蛹虫草所含多种生物活性物质，虫草素、虫草酸、腺苷虫草素、虫草多糖和超氧化物歧化酶(SOD)等，具有抗菌、抗肿瘤、抗血小板凝结、改善和提高记忆力、调节机体免疫能力、镇静和镇痛等功能。《新华本草纲要》记载蛹虫草的功效为：“全草味甘，性平，有益肾肺、补精髓、止血化痰”。实验证明北冬虫夏草与冬虫夏草功效相近，也具有多方面药理作用，临床上已应用于多种癌症、慢性支气管炎以及肾病的治疗。在国内外保健食品行业，利用蛹虫草开发的功能性食品备受消费者青睐，已经有大量蛹虫草产品上市。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，根据蛹虫草固态发酵的特点，采用新的固态发酵工艺，制作一种蛹虫草固态发酵产物，使其达到“品质稳定、食用安全、口感较佳、易于深加工”的要求。本发明制作的蛹虫草固态发酵产物具有工艺新颖、成本低、周期短、品质稳定、食用安全、流程标准、易于加工的特点，使整个生产流程达到了商业化应用的要求。由于发明内容的安全性与品质稳定性，可多元化应用于保健食品、调味剂、原料药乃至成品药剂的生产等。

本发明通过以下技术方案实现：

一种蛹虫草固态发酵产物，其步骤包括液体菌种制备、原料浸泡、原料预糊化、离散、灭菌、固态发酵和干燥。所述的蛹虫草固态发酵产物具有类似食用菌的鲜香味，具体步骤如下：

1、液体菌种制备

液体菌种制备所用的培养基：

葡萄糖20g，大豆肽粉2g，安琪酵母浸粉FM8022g，补充水份至1000mL，调pH至6.5～7.5。

1)平皿制备：挑取试管蛹虫草菌株BYB-08(该菌株已于2007年6月29日送交武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M207091，该菌株的信息已记载在先的发明专利申请(申请号：200810101715.0)中，公开号为：CN101245361，公开日：2008年8月20日)菌丝的末端接种于平皿中央，置于25℃下避光培养10d，反复3～5次直至获得健壮菌丝。提纯与复壮后的菌丝接种到装有琼脂培养基的平皿，25℃避光培养15d，光照培养5d，5℃下3d内使用。

2)摇瓶培养：无菌条件下在上述步骤1)获得的菌丝边缘打孔，孔径为0.8cm。每个三角瓶接入一块蛹虫草菌株BYB-08菌丝块，在转速为100～110r/min的摇床上于25℃下恒温培养6d后，终止培养，得到蛹虫草菌株BYB-08种子培养液，于5℃下贮藏3d内使用；

3)放大培养：将步骤2)的BYB-08种子培养液接种至发酵罐作放大培养，按质量比3％接种BYB-08种子培养液，调整通气量至1.0m3/h，维持罐压为1.1～1.15MPa，发酵温度为25℃，转速为150r/min，发酵时间为108～114h，至菌丝量对数生长期的末期终止培养(菌丝干重含量：15g/L～16g/L)，得到蛹虫草BYB-08固态发酵用的液体菌种，于5℃下贮藏3d内使用。

2、发酵原料制备：

按质量比取小麦、大米、燕麦、安琪酵母浸粉FM802分别1.00∶1.02∶1.12∶0.20制作固态发酵培养基。

1)取1.00份的小麦常温下用3份的水浸泡48h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，补充0.8份的水，置于100℃蒸煮30～40min，直到无水渗出；

2)取1.02份的大米加1.1份的水于50℃下浸泡30min，置于100℃蒸煮10～20min，直到无水渗出；迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，采用手动或机械分散，使物料散开；

3)取1.12份的燕麦常温下加3份的水浸泡12h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，补充0.4份的水，置于100℃蒸煮10～20min，直到无水渗出；迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，手动或机械分散，使物料散开。

4)将上述1)，2)和3)的物料与0.2份安琪酵母浸粉FM802混匀，分装入500mL发酵瓶中，每瓶装料150g(湿重)，于121℃下高压蒸汽灭菌30min～45min。

3、固态发酵：

将步骤1所述的蛹虫草BYB-08液体菌种5mL接种至发酵瓶，震荡摇匀，于23～25℃条件下避光培养，至第4天，再次震荡摇匀使物料颗粒散开，至第7天，再用200lux光照强度的散射光进行光照刺激；14～17天后，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵，所得即为蛹虫草BYB-08固态发酵培养产物；

4、培养产物干燥

将上述步骤3获得的产物用手动或机械分散并进行干燥处理，干燥温度由40℃逐渐升温至60℃，烘干至产物的含水量小于10～15％为第一阶段，再升温至80℃继续烘干至产物含水量小于5％，冷却，在无菌条件下真空包装，所得即为蛹虫草固态发酵产物干品。

其中：步骤(2)所述的离散液按体积之比：大豆油脂为1％，无水乙醇为15％，饮用水为84％。

本发明具有以下积极效果：

1、本发明的产品具有成本低、发酵周期短，原料利用率高等优点。

2、本发明制得的蛹虫草固态发酵产物具有稳定而优良的加工特性，品质稳定、并且具有很高的食用安全性。

3、提高了粮食的附加值。通过固态发酵技术，将普通小麦、大米、燕麦转化为含有生物活性成分且具有特殊鲜味的物质，既增加了风味又使其具有一定的保健作用。

4、本发明所使用的原料普遍，发酵产物稳定品质、安全性高，加工特性优良非常有利于多元化地开发深加工产品，可以进一步开发成保健食品或经提纯开发成原料药。

本发明与专利公开号03133807.0、200510014467.2、200610117997.4、200610117998.9、200610102104.9、200910197957.9等专利文献与鲁璐等发表的非专利文献的主要技术特征和实施效果的比较见表1：

表1本发明与现有技术的区别

附图说明

图1：读格法计算菌丝生长面积示意图。

图2：原料的交互作用对蛹虫草菌丝生长的影响。图2A显示燕麦、大米的交互作用对蛹虫草菌丝生长面积的影响；图2B显示安琪酵母浸粉FM802与大米的交互作用对蛹虫草菌丝生长面积的影响；图2C显示燕麦、安琪酵母浸粉FM802的交互作用对菌丝生长面积的影响。

图3：离散液的添加量对大米、燕麦蒸煮后结块率的影响。

具体实施方式

实施例1：固态发酵配方的优化

(1)Box-Behnken法设计配方

利用Design-Expert 7.16软件进行Box-Behnken试验设计，每个因素设三个水平，中心点有五个重复。试验中小麦，大米和燕麦粉碎后过80目筛，每种配方重复10瓶，25℃下培养10d，采用读格计算菌丝生长面积(见图1)，将10次重复的结果输入spss17.0，计算平均值及标准误差。

(2)配方试验结果

其中：

X₁：大米与小麦的质量比值；

X₂：燕麦与小麦的质量比值；

X₃：酵母浸粉与小麦的质量比值；

Y：培养10d后，菌丝的覆盖面积。

表2Box-Behnken配方设计及试验结果

以菌丝生长面积为响应指标，将试验结果用Design-Expert7.1.6软件进行二次多元回归分析。回归诊断表明：决定系数R²为0.9906，且p＜0.01，极显著。这表明方程拟合度与准确度均很高，可以进行预测。常数项与各因子(X_n)回归分析结果如表3所示：

表3模型回归系数的分析

从表3可以看出，X₂、X₃、X₁X₂、X₁ ²、X₂ ²对菌丝生长面积影响极显著(p＜0.01)；X₁X₃对菌丝生长面积影响显著(p＜0.05)；X₁、X₂X₃、X₃ ²对菌丝生长面积影响不显著(p＞0.05)。菌丝生长面积对实际值自变量X₁、X₂和X₃的二次多元方程如下：

Y＝2.655+27.185X₂+17.360X₃-3.170X₁X₂-6.700X₁X₃-5.801X₁ ²-10.961X₂ ²

(3)二次响应面优化Box-Behnken试验结果

根据(1)的试验结果，X₁、X₂、X₃之间的交互作用对Y(菌丝生长面积)的影响(见附图2)如下：

X₁(大米对小麦的比值)与X₂(燕麦对小麦的比值)对Y(菌丝生长面积)的交互作用极显著。

X₁(大米对小麦的比值)与X₃(安琪酵母浸粉FM802对小麦的比值)对Y(菌丝生长面积)交互作用显著。

X₂(燕麦对小麦的比值)与X₃(安琪酵母浸粉FM802对小麦的比值)对Y(菌丝生长面积)的交互作用不显著，所以可以忽略它们之间的交互作用。

利用design-expert 7.1.6软件(国际上通用试验优化软件)的Optimization功能分析得出理论的最优化结果为：大米、燕麦、安琪酵母浸粉FM802与小麦之间的质量比值为：1.02∶1.12∶0.20。即是蛹虫草固态发酵最佳原料配方为(按重量计)：小麦1份、大米1.02份、燕麦1.12份、安琪酵母浸粉FM8020.20份。

实施例2：原料制备工艺的优化

固态发酵要求培养料为颗粒状，摇动不成团或少量小团；原料颗粒饱满，无胀裂，无糊状，无干裂；透气、松散，使菌丝体能够迅速附着原料颗粒。通过对离散液添加2％～10％的比较(见附图3)，最终确定的预处理工艺为：①取1.00份的小麦常温下用3份的水浸泡48h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，补充0.8份的水，置于100℃蒸煮，蒸煮时间为30～40min，直到无水渗出；②取1.02份的大米加1.1份的水于50℃下浸泡30min，置于100℃蒸煮，蒸煮时间为10～20min，直到无水渗出；迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，手动或机械分散，使物料散开；③取1.12份的燕麦常温下加3份的水浸泡12h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，补充0.4份的水，置于100℃蒸煮，蒸煮10～20min，直到无水渗出；迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，手动或机械分散，使物料散开。④将上述①、②、③的物料与0.2份安琪酵母浸粉FM802混匀，分装入500mL发酵瓶中，每瓶装料150g(湿重)，于121℃下高压蒸汽灭菌30min～45min。

实施例3：蛹虫草菌株BYB-08固态发酵产物的制备

1、菌种提纯与复壮

琼脂培养基：葡萄糖20g，大豆肽粉2g，安琪酵母浸粉FM8022g，食用琼脂20g，加水至1000mL，混合，调pH至6.5～7.5，将培养基加热至完全溶化，在121℃下灭菌30min，备用；

提纯与复壮：挑取保藏的试管蛹虫草菌株BYB-08(保藏号为：CCTCC NO：M207091，专利公开号为：CN101245361)接种到装有琼脂培养基的平皿，25℃避光培养5～7d后，挑取菌丝体尖端进行转接，重复3～5次，直到获得健壮菌丝体。提纯与复壮后的菌丝接种到装有琼脂培养基的平皿，25℃避光培养15d，光照培养5d。

2、液体菌种制备

1)液体菌种制备所用的培养基配方如下：

葡萄糖20g，大豆肽粉2g，安琪酵母浸粉FM8022g，补充水份至1000mL，pH6.5～7.5。其中：大豆肽粉(购自湖北省武汉市合中生化制造有限公司)符合中华人民共和国国家标准GBT 22492-2008；安琪酵母浸粉FM802(购自湖北宜昌安琪酵母股份有限公司)符合中华人民共和国国家标准GBT 23530-2009；食用葡萄糖(购自河北圣雪葡萄糖有限公司)符合中华人民共和国国家标准GBT 20880-2007。

2)摇瓶培养：无菌条件下，在经上述步骤(1)获得的健壮菌丝尖端用打孔器打孔，孔径为0.8cm。每个三角瓶接入一块蛹虫草菌株BYB-08菌丝块，在转速为100～110r/min的摇床上于25℃下恒温培养6d，终止培养，得到蛹虫草菌株BYB-08种子培养液，于5℃下贮藏3d内使用；

3)放大培养：将步骤2)的BYB-08种子培养液接种至发酵罐直接作放大培养，按质量比3％接种BYB-08种子培养液，调整通气量至1.0m³/h，维持罐压为1.1～1.15MPa，控制发酵温度为25℃，转速为150r/min，发酵时间为108～114h，至菌丝量对数生长期的末期终止培养(菌丝干重含量：15g/L～16g/L)，得到蛹虫草BYB-08固态发酵用的液体菌种，于5℃下贮藏备用；

3、发酵原料制备：

按质量比将小麦、大米、燕麦和安琪酵母浸粉FM802分别取1.00∶1.02∶1.12∶0.20。其中：小麦(面粉加工专用，产地中国山西生运城地区)符合中华人民共和国国家标准GB1351-2008；燕麦(产地河北省张家口地区)符合中华人民共和国农业部标准NY/T 892-2004；大米(粳米，产地安徽省五河地区)符合中华人民共和国国家标准GB 1354-2009；安琪酵母浸粉FM802(湖北宜昌安琪酵母股份有限公司)符合中华人民共和国国家标准GBT 23530-2009；离散液按照质量体积之比大豆油脂为1％，无水乙醇为15％，饮用水为84％。

1)取1.00份的小麦常温下加3份的水浸泡48h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，再补水0.8份，置100℃下蒸煮30～40min，直到无水渗出。

2)取1.02份的大米加1.1份的水于50℃下浸泡30min，置100℃下蒸煮10～20min，直到无水渗出，迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，采用手动或机械是物料分散。

3)取1.12份燕麦于常温下加3份的水浸泡12h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，再补充0.4份的水，置100℃下蒸煮10～20min，直到无水渗出，迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，采用手动或机械使物料分散。

4)将步骤1)-3)所述的的物料与0.2份安琪酵母浸粉FM802混匀，分装入500mL发酵瓶中，每瓶装料150g，于121℃下高压蒸汽灭菌30min～45min，备用。

4、固态发酵：

将步骤2所述的蛹虫草BYB-08液体菌种5mL接种至发酵瓶，震荡摇匀，于23～25℃条件下避光培养，至第4天，再次震荡摇匀使物料颗粒散开，至第7天，再用200lux光照强度的散射光进行光照刺激；14～17天后，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵，所得即为蛹虫草BYB-08固态发酵培养产物；

5、培养产物干燥：

将步骤4获得的产物用手动或机械分散并进行干燥处理，干燥温度由40℃逐渐升温至60℃，烘干至产物的含水量小于10～15％为第一阶段，再升温至80℃继续烘干至产物含水量小于5％(为第二阶段)，冷却，在无菌条件下真空包装，所得即为蛹虫草固态发酵产物干品。

其中：步骤3所述的离散液按体积之比计，大豆油脂为1％，无水乙醇为15％，饮用水为84％。

实施例4：虫草素含量的稳定性检验

采样4个不同批次，每个批次随机抽取5个发酵瓶样本检测虫草素，总共计20次检测。检测结果输入spss17.0软件，进行组间比较(见表3)。

表4虫草素含量的稳定性检验

由表4可以看出不同生产批次之间虫草素含量没有显著差异(p＞0.05)，经20次检测，测得发酵料中虫草素含量为1.87±0.024mg/g。检验结果说明在本发明的工艺条件下，虫草素的产生具有很高的稳定性与一致性。

实施例5：蛹虫草固态发酵产物的品质检验

将实施例3获得的固态发酵产物进行品质检验，除虫草多糖与虫草素自行检测外，其他项目均送湖北省疾病预防控制中心检验，结果见表5。

表5蛹虫草固态发酵产物的理化指标检测结果

注：表5参考标准值来源

NYT 1330-2007绿色食品方便主食品

GB 2761-2005食品中真菌毒素限量

NY 861-2004粮食(含谷物、豆类、薯类)及制品中铅、镉、铬、汞、硒、砷、铜、锌等八种元素限量

表中参考标准值为以上标准中的最高要求值。

“-”：没有国家相关标准约束。

由表5的检测结果可以看出，本发明获得的蛹虫草固态发酵产物重金属含量、黄曲霉毒素B₁、菌落总数低于了国家食品安全标准的限定值。主要活性成分虫草多糖与虫草素含量处于已报道值的中等偏上水平。由此可以说明，从原料的选择到加工过程，本发明都达到了食品安全标准，而且活性物质含量稳定，符合安全、保健和绿色的要求。

Claims

1.一种食用级蛹虫草固体发酵方法，其特征在于下列步骤：

(1)液体菌种制备：

液体菌种制备所用的培养基配方如下：

葡萄糖20g，大豆肽粉2g，安琪酵母浸粉FM802 2g，补充水份至1000mL，pH6.5～7.5；

1)制平皿：挑取试管蛹虫草菌株BYB-08菌丝的末端接种于平皿中央，置于25℃下全避光下培养，反复数次直至获得健壮菌丝；

2)摇瓶培养：无菌条件下在步骤1)的健壮菌丝尖端用打孔器打孔，孔径为0.8cm，每个三角瓶接入一块蛹虫草菌株BYB-08的菌丝块，在转速为100～110r/min的摇床上于25℃下恒温培养6d后，终止培养，得到蛹虫草菌株BYB-08种子培养液，于5℃下贮藏，3天内使用完毕；

3)放大培养：按质量比3％接种步骤2)的BYB-08种子培养液至发酵罐直接作放大培养，调整发酵罐的通气量至1.0m³/h，维持罐压为1.1～1.15MPa，发酵温度为25℃，转速为150r/min，发酵时间为108～114h，至菌丝对数生长期的末期，终止培养，使菌丝干重含量为15g/L～16g/L，得到蛹虫草固态发酵用的液体菌种，于5℃下贮藏，3天内使用完毕；

(2)发酵原料制备：

按质量比取小麦、大米、燕麦、安琪酵母浸粉FM802分别为1.00∶1.02∶1.12∶0.20制作固态发酵培养基的原料：

1)取1.00份的小麦常温下加3份的水浸泡48h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，再补水0.8份，置100℃下蒸煮30～40min，直到无水渗出；

2)取1.02份的大米加1.1份的水于50℃下浸泡30min，置100℃下蒸煮10～20min，直到无水渗出，迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，采用手动或机械使物料分散；

3)取1.12份燕麦于常温下加3份的水浸泡12h，中途换水一次，最后清洗并沥干水份，再补充0.4份的水，置100℃下蒸煮10～20min，直到无水渗出，迅速冷却至55℃以下，加入5％离散液，采用手动或机械使物料分散；

4)将步骤1)-3)所述的物料与0.2份安琪酵母浸粉FM802混匀，分装入500mL发酵瓶中，每瓶装料150g，于121℃下高压蒸汽灭菌30min～45min，备用；

(3)固态发酵：

将步骤(1)所述的蛹虫草BYB-08液体菌种5mL接种至发酵瓶，震荡摇匀，于23～25℃条件下避光培养，至第4天，再次震荡摇匀使物料颗粒散开，至第7天，再用200lux光照强度的散射光进行光照刺激；14～17天后，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵，所得即为蛹虫草BYB-08固态发酵培养产物；

(4)培养产物干燥：

将步骤(3)获得的产物用手动或机械分散并进行干燥处理，干燥温度由40℃逐渐升温至60℃，烘干至产物的含水量10～15％为第一阶段，再升温至80℃继续烘干至产物含水量小于5％，冷却，在无菌条件下真空包装，所得即为蛹虫草固态发酵产物干品；

其中：步骤(2)所述的离散液按体积之比计，大豆油脂为1％，无水乙醇为15％，饮用水为84％。